KR20190132836A

KR20190132836A - 능동적 약물흡수형 소수성 채널 개량 페리틴 약물 전달체

Info

Publication number: KR20190132836A
Application number: KR1020180057880A
Authority: KR
Inventors: 정용원; 안병준
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2018-05-21
Filing date: 2018-05-21
Publication date: 2019-11-29
Also published as: KR102064812B1

Abstract

본 발명은 페리틴 중쇄(ferritin heavy chain) 중쇄 단량체 및 E-헬릭스 절단 페리틴(E-helix truncated ferritin) 중쇄 단량체를 포함하는 페리틴 변형체(ferritin variant) 단백질, 약물전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 페리틴 변형체 단백질을 이용하는 경우, 다양한 약물에 대하여 능동적 약물 로딩이 가능하고 높은 로딩 효율로 약물을 로딩할 수 있으며, pH에 민감하게 반응하여 약물을 방출하므로 단백질 기반의 약물전달체로서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

능동적 약물흡수형 소수성 채널 개량 페리틴 약물 전달체{Hydrophobic channel engineered ferritin drug carriers with active drug loading ability}

본 발명은 능동적 약물 흡수가 가능한 소수성 채널 개량 페리틴 단백질, 특히 페리틴 중쇄(ferritin heavy chain) 단량체 및 E-헬릭스 절단 페리틴(E-helix truncated ferritin) 중쇄를 포함하는 페리틴 변형체(ferritin variant) 단백질, 약물전달체 또는 이의 제조방법에 관한 것이다.

인간 페리틴(human ferritin)은 암 세포에 대한 내재적 또는 획득 가능한 표적화 능력(targeting ability)과, 약물 로딩을 위한 중공형 케이지 구조(hollow cage structure)로 인하여 무독성의 단백질-기반 약물 전달을 위한 새로운 플랫폼으로 각광받고 있다. 그러나, 아직까지 페리틴의 내강(cavity) 내에 높은 수준의 약물을 봉입하고, 신속하게 세포 내로 약물을 방출하기 위하여 신뢰할만한 전략은 여전히 부족한 실정이다.

지금까지 다양한 종류의 약물 전달 제제가 개발되었지만, 캐리어 물질의 독성 및 면역원성과 같은 원치 않는 부작용으로 인해 임상적 치료법에 사용될 수 있는 제제는 매우 제한적이다. 따라서 생물학적으로 상용성이 있는 단백질-기반 캐리어는 안전한 전달용 베지클로서의 높은 잠재력으로 인해 주목을 받고 있다.

인간 페리틴은 표적 약물 전달에 대해 여러 가지 바람직한 특징을 갖는 유망한 캐리어 단백질이다. 페리틴은 세포 내부와 외부에 모두 존재하는 유비쿼터스 철 저장 단백질이다. 페리틴은 24개의 서브유닛으로 이루어진 단백질로, 가역적으로 자가-조립하여 중공형의 케이지 구조를 이룰 수 있다. 약물과 조영제를 포함하는 다양한 분자들은 페리틴의 내강에 성공적으로 담지될 수 있다. 또한, 암을 표적화(targeting)하는 기능성 부분(functional moiety)은 유전적 및 화학적 변형에 의해 페리틴 단백질에 추가될 수 있다. 흥미롭게도, 변형되지 않은 완전한 페리틴도 많은 암 세포에서 종종 과발현 되는 트랜스페린 수용체에 잠재적으로 결합함으로써 내재적으로(intrinsically) 암세포를 표적으로 할 수 있다. 그러나 다른 대부분의 전달 캐리어와 마찬가지로, 높은 수준의 약물 로딩과 약물 방출의 조절을 위해 잘 정의된 전략의 부족은 페리틴 나노케이지의 임상적 적용(translation)을 위한 주요 장애물이다. 여러 가지 종류의 약물들이 페리틴 내에 봉입된 바 있지만, 높은 산성 또는 페리틴이 변성된 조건에서 약물을 첨가하여 단백질 분해 및 재조립(dis-/re-assembly)을 수행한다. 그러나 이러한 방법은 약물의 로딩 효율이 낮고 단백질과 약물에 잠재적 손상을 입힐 수 있다.

따라서 상기한 약물 로딩효율과 약물 방출 조절의 편이성이 개선된 신규한 단백질 기반의 약물전달체의 개발이 필요한 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

Yan et al., PNAS October 14, 2014. 111 (41) 14900-14905;

본 발명자들은 약물 로딩 효율과 약물 방출 조절의 편이성이 개선된 단백질 기반의 약물전달체를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 페리틴 중쇄와 E-헬릭스가 절단된 페리틴을 혼합한 뒤 분해시킨 후, 이들 간에 재조립을 유도하면 넓은 내강을 가지는 페리틴 변형체가 생성됨을 확인하였다. 또한, 이렇게 제조된 페리틴 변형체는 다양한 약물을 높은 효율로 로딩할 수 있으며, 로딩된 약물은 pH 감응적으로 방출됨을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 페리틴 중쇄(ferritin heavy chain) 단량체 및 E-헬릭스 절단 페리틴(E-helix truncated ferritin) 중쇄 단량체를 포함하는 페리틴 변형체(ferritin variant) 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 페리틴 변형체 단백질을 포함하는 약물전달체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 페리틴 변형체 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 페리틴 중쇄(ferritin heavy chain) 단량체 및 E-헬릭스 절단 페리틴(E-helix truncated ferritin) 중쇄 단량체를 포함하는 페리틴 변형체(ferritin variant) 단백질을 제공한다.

본 명세서에서 용어, “페리틴(ferritin)”은 고도로 균일하고 단 분산된 나노 입자의 합성을 위한 고유 케이지형 나노 플랫폼으로 이용 될 수 있는 유비쿼터스 철 저장 단백질이다. 인간 페리틴은 총 24 개의 중쇄(H) 서브유닛과 경쇄(L) 서브유닛으로 구성되어 있으며, 이 서브유닛들은 12 nm의 외경 및 8 nm의 캐비티(cavity) 직경을 가진 구형 쉘 구조로 조립된다. 이 쉘 구조는 페리하이드라이트(ferrihydrite)의 형태로 약 4500 개의 철 원자를 수용 할 수 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 페리틴 중쇄는 인간의 페리틴 중쇄이다. 또한 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 인간 페리틴 중쇄는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 E-헬릭스 절단 페리틴은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함한다.

또한, 본 발명에서 상기 페리틴 변형체 단백질은 총합 24-머(24-mer)의 상기 페리틴 중쇄 단량체 및 E-헬릭스 절단 페리틴 중쇄 단량체를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 페리틴 중쇄 단량체 및 상기 E-헬릭스 절단 페리틴 단량체는, 페리틴 중쇄로 이루어진 페리틴 및 E-헬릭스 절단 페리틴 중쇄로 이루어진 페리틴이 각각 pH 9 이상의 염기성 조건에서 분해되어 생성될 수 있다.

본 발명자들은 단백질 분해 없이 간단한 배양으로 다양한 Fe (II)-약물 복합체를 안정적이고 적극적으로 로딩할 수 있는 새로운 채널 개방형 페리틴 변형체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 페리틴 변형체는 인간 중쇄(heavy-chain) 페리틴(HF)의 단량체 및 E-helix-절단 페리틴(F160, E-helix-truncated HF) 단량체를 혼합함으로써 제조된다.

금속 이온과 결합하는 페리틴의 자연적인 특성은 종래 페리틴 내에 다양한 종류의 금속 또는 금속-결합 제제를 봉입하는데 사용되었다. 기존의 페리틴을 이용한 금속이온-결합 제제는 간단한 인큐베이션에 의해 금속 이온을 변형된 페리틴 내로 로딩할 수 있었다. 그러나, 페리틴은 금속-약물 봉입화(encapsulation) 과정에서 불안정하여, 이 과정에서 거의 3분의 2의 인큐베이션 된 단백질이 손실된다는 문제가 있다. 또한, 종래 페리틴의 친수성(3-fold) 및 소수성(4-fold) 채널은 포어(pore)가 너무 작아서 대부분의 약물이 봉입되지 않았다. 때때로 페리틴 내부로 약물이 흡수(uptake)되기도 하였으나, 약물 흡수를 위한 명확한 경로가 없으므로 페리틴의 약물 로딩 효율을 대단히 낮았다.

이러한 점을 바탕으로, 본 발명자들은 페리틴의 3차 구조와 기능을 잃지 않으면서도 페리틴에 대한 명확한 약물 흡수(uptake) 경로를 도입할 수 있다면 페리틴의 금속-약물 복합체에 대한 능동적인 포획 능력을 최대한 활용할 수 있을 것으로 기대하였다. 이는 철 이온 뿐만이 아니라 그 밖의 금속-상호 작용 가능한 화합물(metal-interactable compound)에도 확장될 수 있는 전략이다.

더 큰 포어(pore)를 가진 페리틴을 제작하기 위해, 본 발명자들은 페리틴 C-말단의 채널-형성 E-헬릭스를 제거함으로써 페리틴의 4-폴드(4-fold) 채널을 확장시켰다.

페리틴 단백질의 확장된 공극에 대해 자세히 설명하기 위해, 본 발명자들은 고분해능 저온-전자 현미경(cyo-electron microscopy, cryoEM)을 사용하여 E-helix가 절단된 페리틴(E-helix-truncated ferritin) (1-160 잔기, F160)의 첫 번째 원자 분해 구조(first atomic electron structure)를 결정하였다(도 2 및 도 3 참조). 본 발명의 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 E-헬릭스 절단된 페리틴(E-helix-truncated ferritin, F160)은 전장 인간 페리틴(full length human ferritin)과 유사한 24-머(24-mer)의 나노케이지(nanocage)를 형성한다. 상기 F160은 4-폴드 축마다 18 Å 언저리의 직경을 가진 6개의 구멍(hole)을 포함한다. 상기 F160의 단량체(monomer)는 야생형(Cα RMSD: 0.6 Å )과 실질적으로 다르지 않지만, F160 케이지의 직경은 야생형(PDB : 4Y08)의 직경에 비하여 바깥 쪽으로 약 2 Å 정도 더 확대되어 있다(도 1의 (c) 및 (d) 참조). F160에서 이 E-helix의 결실과, 4-폴드 축 주위의 계면에서 이들의 상호 작용의 상실은 페리틴 모노머의 밀집된 패킹(packing)을 약화시키고 불안정하게 하여 구조적 팽창을 유도하는 것으로 예측된다.

본 발명자들은 F160에 의한 능동적인 약물 흡수를 시험하고자, 인간 페리틴(HF)과 F160을 모두 독소루비신(doxorubicin, DOX)-금속 착물과 혼합하였다. 그러나, 인간 페리틴(HF)과 F160은 모두 금속 착물을 처리하는 과정 동안 침전되기 쉬웠다. 약물 흡수를 위한 F160의 넓은 공극(pore)에도 불구하고, F160의 확장된 cryoEM 구조에 나타낸 바와 같이 F160은 충분한 구조적 안정성 및 능동적인 약물 봉입(encapsulation)을 위한 금속 결합/침착능을 갖지 못하였다. 따라서, 본 발명자들은 다음으로 부분적으로 개방된 4-fold 채널만을 가진 본 발명의 페리틴 변형체(nicked-ferritin)를 제작하게 되었다(도 4 참조).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 페리틴 중쇄(ferritin heavy chain) 단량체 및 E-헬릭스 절단 페리틴(E-helix truncated ferritin) 중쇄 단량체를 조립하는 단계를 포함하는 페리틴 변형체(ferritin variant) 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 페리틴 중쇄 단량체 및 상기 E-헬릭스 절단 페리틴 단량체는, 각각의 페리틴 중쇄로 이루어진 페리틴 및 E-헬릭스 절단 페리틴 중쇄로 이루어진 페리틴이 pH 9 이상의 염기성 조건에서 분해되어 생성될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고 페리틴 중쇄 단량체 및 상기 E-헬릭스 절단 페리틴 단량체이면 충분하다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 페리틴 변형체 단백질의 제조방법:

(a) pH 9 이상의 염기성 조건에서 페리틴 중쇄를 포함하는 페리틴 및 E-헬릭스 절단 페리틴을 포함하는 페리틴을 혼합하는 단계; 및

(b) 상기 혼합물의 pH를 8 이하로 낮추는 단계.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 페리틴 중쇄 단량체 및 E-헬릭스 절단 페리틴 중쇄 단량체의 혼합비율은 10:1 내지 1:10, 10:1 내지 1:5, 10:1 내지 1:3, 10:1 내지 1:2, 10:1 내지 1:1이고, 보다 구체적으로는 5:1 내지 1:10, 5:1 내지 1:5, 5:1 내지 1:3, 5:1 내지 1:2, 5:1 내지 1:1이다. 보다 더 구체적으로는 3:1 내지 1:10, 3:1 내지 1:5, 3:1 내지 1:3, 3:1 내지 1:2, 3:1 내지 1:1이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 페리틴 중쇄 서브 유닛 및 E-헬릭스 절단 페리틴의 혼합비율이 5:1 내지 1:5를 벗어나는 범위 내에서는 조립이 잘 이루어지지 않는다. 따라서 상기 혼합비율은 5:1 내지 1:5의 범위 인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 혼합비율이 3:1 내지 1:3의 범위 내이며, 가장 바람직하게는 3:1 내지 1:1 또는 2:1 내지 1:1의 범위 내이다.

도 4에 나타낸 바와 같이, HF 및 F160은 pH 의존적으로 분해 및 재조립되어 본 발명의 닉-페리틴(Nicked-HF)을 형성한다(도 4, a 참조). 본 발명자들은 HF와 F160를 HF:F160 = 1:1 또는 2:1의 비율로 혼합한 HF/F160 혼합물을 본 발명의 페리틴 변형체(nicked-ferritin, nicked-HF)로 재조립시키기 전후에 15% SDS PAGE로 분석하였다. 도 4의 b에 나타낸 바와 같이, E-헬릭스 절단된 페리틴(F160)의 서브유닛은 부분적으로 분해된 HF 속에 포함되어 안정한 페리틴 변형체(nicked-ferritin, nicked-HF)를 형성한다. 보다 구체적으로 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)에서 24 개의 서브 유닛 중 약 20-30 %는 E-헬릭스가 제거된 F160으로부터 유래한 것이다(도 4의 b).

본 발명의 실시예에서 본 발명자들은 HF와 F160을 HF:F160을 1:1 내지 2:1의 혼합비율로 혼합하고, pH 11.4에서 중성(pH 7.2)으로 pH를 변화시키면서, 중성 MOPS 완충액 하에서 하룻밤 인큐베이션을 진행함으로써 본 발명의 페리틴 변형체(닉-페리틴, nicked ferritin)를 제조하였다(도 4, a).

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 페리틴 변형체 단백질(Nicked-HF)는 그 내강(cavity) 내에 약물을 담지한다. 여기에서 상기 약물은 약물 자체 또는 금속이온-약물 복합체(complex)의 형태로 페리틴 변형체 단백질 내부에 담지된다.

본 명세서에서, 용어 “봉입(encapsulation)”, “로딩(loading)”, “흡수(uptake)”, “담지”, “내재화(internalization)”는 서로 대체되거나, 혼용될 수 있다. 상기 용어들은 모두 본 발명의 페리틴 변형체 단백질, 또는 이를 포함하는 약물전달체가 약물, 조영제 등 그밖의 물질을 해당 단백질 또는 약물전달체의 외부로부터 이들의 내강(cavity)으로 포함시키는 모든 상태를 의미한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 금속이온은 Cu(II), Fe(II)로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속이온이다.

본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 상기 약물은 커큐민(curcumin), 퀘르세틴(quercetin), 및 미톡산트론(mitoxantrone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약물이다.

또한, 본 발명의 페리틴 변형체 단백질은 pH 감응적으로 그 내강에 담지한 약물을 방출한다. 특히 본 발명의 페리틴 변형체 단백질은 pH 5 이하의 조건에서 구조가 분해(disassembly)되기 시작된다. 그 결과 본 발명의 페리틴 변형체 단백질은pH 5 이하의 조건에서 그 내강에 담지한 약물을 방출한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 페리틴 중쇄(ferritin heavy chain) 단량체 및 E-헬릭스 절단 페리틴(E-helix truncated ferritin) 중쇄 단량체를 포함하는 페리틴 변형체(ferritin variant) 단백질을 포함하는 약물전달체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 페리틴 변형체 단백질, 또는 약물전달체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 페리틴 변형체 단백질, 또는 이를 포함하는 약물전달체가 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 비강내 투여, 점막내 투여, 경막 내 투여, 복강내 투여, 안구내 투여 등으로 투여할 수 있으며, 구체적으로는 정맥내 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-1000 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명자들은 상술한 바와 같이, 본 발명의 페리틴 변형체 또는 이를 포함하는 약물전달체가 주변 pH 조건에 감응하여 약물을 방출할 수 있음을 확인하고자, 야생형 HF, F160, 및 본 발명의 페리틴 변형체(nicked-HF)에 대하여, 동적광산란법(dinamic light scattering)을 통하여 pH에 따른 입도를 분석하였다. 또한, 4% 네이티브 PAGE 분석을 통하여 pH에 따른 분자량을 측정하였다. 그 결과, 야생형 HF는 pH 11.4에서도 전체 케이지 구조를 유지하는 반면, F160은 케이지 구조를 상실하였다(도 5의 a). 또한, F160은 pH 11.4에서 응집될 가능성이 높음을 확인하였다(도 5의 b). HF는 pH 7에서 원래의 나노케이지 구조 (pH 11.4 → pH 7) 로 재조립 될 수 있지만 재조립 된 HF는 원래의 HF와 다른 pH 의존적 안정성을 나타낸다(도 5의c vs. 도 4의 c). 도 4의 c에 나타낸 바와 같이 HF와 F160, nicked-HF는 pH 7부터 pH 2 까지의 산성조건에서 각각 pH 3, pH 6, pH 5 부터 분해되기 시작한다.

즉, 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)는 pH 6에서 안정적이었고 pH 4-5 이하에서만 분해됨을 확인하였다(도 7 참조). 따라서, 본 발명의 페리틴 변형체를 약물전달체로 사용하는 경우, 약물전달체가 pH 5 이하인 조건(예컨대 세포 내 엔도리소좀)에 도달하면, 약물전달체로부터 로딩 된 약물이 방출된다. 세포 내 엔도리소좀의 경우, 리소좀 탈출(endolysosmal escape)이 이루어지며, 이는 세포 내 약물전달체로서의 가장 바람직한 성질 중 하나이기 때문에, 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)는 강력한 pH-반응성을 가진 스마트 단백질 약물전달체로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)는 단백질 분해효소 K(proteinase K)에 대해 분해 내성(안정성)을 나타내며, 균일한 케이지 구조를 가진다(도 6, c: 음성-염색 TEM 이미지).

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 약물전달체는 약물을 약물 그 자체 또는 철 이온 및 약물의 복합체(Fe-drug complex)의 형태로 담지한다.

도 8a 및 도 8b에 따르면, 독소루비신(DOX)과 철 이온은 1:1 복합체를 형성한다. 또한, 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)는, 야생형의 HF와 E-헬릭스가 절단된 F160과는 달리, 매우 높은 수준의 Fe(II)-컨쥬게이트 DOX (Fe-DOX, 1 : 1 = Fe(II):DOX)를 간단한 인큐베이션을 통하여 봉입할 수 있다(표 1; 본 발명의 페리틴 변형체에 의한 능동적 약물 로딩).

[a] 독소루비신 (DOX), 커큐민 (Curc), 퀘르세틴 (Q). [b]페리틴 내 정량적 약물의 봉입화 수, [c] 약물 로딩, 탈염 및 투석 후 단백질 회수율. [d] 400 배 초과 된 Fe (II)로 프리블로킹(preblocking). 1 s.d. (n = 3).

본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)는 Fe-Dox 복합체를 내강으로 흡수한다. 반면, 야생형 HF는 Fe-DOX 복합체의 흡수를 위한 큰 포어(pore)를 갖지 않으므로 Fe-Dox 복합체의 흡수율이 매우 낮다. 드러나, 야생형 HF는 Fe(II)에 대한 강한 흡수력이 있어 Fe(II)-DOX 복합체을 해리시키고, Fe(II)만을 흡수한다.

보다 구체적으로 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)는 평균적으로 121 개의 Fe-DOX 분자를 안정적으로 봉입(내재화)할 수 있다. 위 121개라는 Fe-DOX 분자의 흡수 개수는 종래 대부분의 분해/재조립 방법에 의한 페리틴 단백질이 제공할 수 있는 것 이상의 봉입 용량에 해당한다. 또한, 본 발명의 페리틴 변형체는 철이온 및 약물의 복합체와의 인큐베이션 이후, 회수율이 우수하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 페리틴 변형체 단백질의 70 % 이상이 Fe-DOX 로딩 및 투석 후에 회수되었다. 그러나, HF 및 F160은 Fe-DOX 복합체를 봉입시키지 못하고 침전되었다(도 9).

본 발명자들은 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF) 내부로의 Fe-DOX 복합체의 봉입(encapsulation)을 증명하기 위하여, Fe-DOX가 로딩된 페리틴 변형체(Nicked-HF)의 cryoEM 밀도 맵을 4.3 Å의 전체 해상도로 얻었다 (도 10 및 도 11).

도 10 및 도 11에 따르면, 본 발명의 페리틴 변형체(nicked-HF) 케이지 내부에 Fe-Dox가 로딩된다는 사실이 CryoEM 및 밀도맵에 의해 입증된다. 구체적으로 24-meric ferritin의 EM 밀도 이외에, 케이지 내부에서 하나의 추가적 밀도가 명확하게 확인되었으며, 이것은 약물 캐리어 내부에 로딩된 DOX를 처음으로 EM 시각화(EM-visualization)한 것이다. 대략 3 nm 타원체 밀도가 약 3 개의 페리틴 단량체 주변에 위치했고, 이것은 여러 개의 Fe(II) 결합 잔기를 포함한다(도 12). 페리틴의 Fe(II) 결합잔기 중에서도 E28 및 E108 아미노산이 Fe(II) 이온의 로딩에 중요한 역할을 한다는 점이 표 1에서 확인된다. Fe(II) 결합 잔기 중 2 개(E28, E108)가 돌연변이 되었을 때, Nicked-HF는 Fe-DOX 흡수 능력을 완전히 상실하였으며, 이는 Nicked-HF 내부에 Fe-DOX 복합체가 로딩된다는 점을 추가적으로 뒷받침한다(표 1).

페리틴 변형체(Nicked-HF) 내의 DOX 로딩 수준은 추가시킨 Fe-DOX의 양을 단순히 변화시킴으로써 쉽게 제어 할 수 있다(도 13). 그러나 페리틴 변형체(Nicked-HF):Fe-DOX 복합체의 비율이 1:300을 넘어서는 과량의 Fe-DOX가 추가되면, 페리틴 변형체(Nicked-HF)의 침전을 유발한다. 마찬가지로 Nicked-HF를 과량의 Fe(II)와 전-배양하자 침전에 의한 단백질 회수가 저조했을 뿐만 아니라 약물 흡수가 크게 감소하였다(표 1, [d]).

즉, Fe-DOX 복합체의 혼합비율을 증가시킬수록 본 발명의 페리틴 변형체에 로딩되는 Fe-Dox의 양이 증가하므로, 본 발명의 페리틴 변형체는 능동적 약물 흡수능력이 우수하고, 약물 혼합비율을 조절함으로써 약물 로딩의 비율을 손쉽게 조절할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 페리틴 변형체에 로딩한 Fe(II)-DOX 복합체는 DOX가 페리틴 변형체로부터 유리되더라도, 약물로딩에 사용된 Fe(II) 이온은 페리틴 내부에서 유지된다. 구체적으로 Fe(II)-DOX 복합체와 페리틴 변형체에 봉입된 Fe(II)-DOX 복합체는 형광이 나타나지 않지만, 자유 DOX(free DOX)는 형광이 나타난다. Fe(II)-DOX 복합체를 봉입시킨 페리틴 변형체에 화학적 산화제(예컨대 H₂O₂)를 처리하면 페리틴 변형체로부터 자유 DOX가 유리되어 형광이 나타난다. 즉, Fe(II)와 착물을 형성하던 약물만 방출되고, 금속이온인 Fe(II)는 페리틴 내부에 유지되는 것이다.

본 발명자들은 또한 금속 이온-매개 DOX 흡수를 목적으로 Cu(II)도 조사하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)는 Cu(II)-DOX 복합체를 이용하여도 능동적인 Dox의 흡수가 가능함을 확인하였다. 그러나 약물로딩 효율 및 페리틴 단백질의 안정성은 Fe(II)에 비하여 떨어짐을 알 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 약물전달체는 커큐민(curcumin) 또는 퀘르세틴(quercetin)을 로딩한다. 상기 커큐민과 퀘르세틴은 약물전달체 내 약물의 수용성이 낮고 체내에서 생체이용률이 낮기 때문에 사용이 크게 방해 받는다. 이에 따라 위 두 화합물에 대한 몇 가지 합성 전달 물질(synthetic delivery materials)이 보고되었다. 최근에 커큐민도 분해/재조립 방법으로 페리틴 나노케이지에 봉입되었지만 약 14 개의 분자만 로딩되었다. Fe(II) 적정을 사용하는 흡광도 스펙트럼은 두 화합물의 명확한 금속 결합을 나타낸다(도 16 및 도 17).

도 18은 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)의 능동적인 커큐민 로딩을 설명하는 도이다. (a)는 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)와 각각 자유 커큐민(free curcumin) 및 Fe-Curc 복합체와의 혼합물 용액을 나타낸 도이다. (b)는 자유 커큐민과 배양된 각 페리틴(HF, F160, Nicked-HF)과의 탈염 정제과정을 나타낸 도이다. (c)는 Fe-Curc 복합체 (Fe:Curc = 1:1 혼합비율)와 배양된 각 페리틴(HF, F160, Nicked-HF)의 탈염 정제과정을 나타낸 도이다. 100 배 과량의 Curc 화합물이 각 페리틴에 첨가되었다.

도 18에 나타낸 바와 같이, DOX와 마찬가지로, Fe(II)-커큐민은 단순 인큐베이션에 의해 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)에 안정적으로 그리고 능동적으로 로딩되었고, 반면에 커큐민 분자는 적게(26 개) 로딩되었다(표 1 및 도 18).

도 19는 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)의 능동적인 퀘르세틴 로딩을 설명하는 도이다. (a)는 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)와 각각 자유 퀘르세틴(free quercetin) 및 Fe-퀘르세틴 복합체와의 혼합물 용액을 나타낸 도이다. (b)는 자유 퀘르세틴과 배양된 각 페리틴(HF, F160, Nicked-HF)과의 탈염 정제과정을 나타낸 도이다. (c)는 Fe-퀘르세틴 복합체 (Fe:Q = 1:1 혼합비율)와 배양된 각 페리틴(HF, F160, Nicked-HF)의 탈염 정제과정을 나타낸 도이다. 600 배 과량의 퀘르세틴 화합물이 각 페리틴에 첨가되었다.

흥미롭게도, 커큐민 분자의 경우, 더 많은 수가 채널-결실된 F160으로 내재화되었다. 퀘르세틴의 경우, Fe(II)가 없는 현저한 수준의 유리 분자(free molecule)가 모든 페리틴 변형체에 적극적으로 봉입되었다(도 19). 그럼에도 불구하고, 매우 높은 용량의 Fe(II)-퀘르세틴 (440 분자 이상)은 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)에만 안정적으로, 그리고 능동적으로 로딩되었다.

따라서, 상기 결과로부터 페리틴에 의한 약물 로딩 활성의 화합물 의존적 변화에도 불구하고, 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)에 대한 Fe(II)에 의해 매개되는 적극적 로딩은 세 가지 모든 시약에 매우 효과적임을 확인하였다.

도 20은 pH-반응성 약물 캐리어로서의 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)를 나타낸 도이다. 도 20의 (a)는 다양한 pH 조건에서 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)로부터의 DOX 방출 양태를 나타낸 도이다. (b)는 HeLa 및 MCF-7 세포주에 대한 자유 DOX 및 Fe-DOX-Nicked-HF의 세포독성을 나타낸 도이다. (c)는 HeLa 세포에서 Fe-DOX가 로딩된 FITC-Nicked-HF를 처리했을 때 시간에 따른 FITC-표지-Nicked-HF (녹색), DOX (적색) 및 DPAI (파란색)의 공 초점 이미지를 나타낸 도이다.

본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)로부터의 Fe-DOX의 pH-의존적 방출 패턴은 분리를 탈염시킨 후에 과량의 완충 용액에 대해 단백질-약물 용액을 투석하여 모니터링 하였다. 중성 탄산염(carbonate) 또는 MOPS 완충 조건 하에서, 로딩 된 Fe-DOX의 70-80 %는 25 시간 이상 단백질 내에서 안정하게 유지되었다 (도 20a). 그러나 거의 모든 DOX 분자는 pH 반응성 약물 방출에 5 시간 내에 pH 4에서 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)로부터 방출되었고, 이는 pH-반응성 약물 방출로서 이상적이다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 Fe-DOX가 로딩된 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)의 세포 독성을 검사하였다. 결과는 도 20에 나타내었다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 본 실험 조건 하에서 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF) 내부의 Fe-DOX는 HeLa와 MCF-7 세포에 대해 자유 DOX(free DOX) 만큼 독성을 나타내어 자유 DOX 만큼 약물방출 특성이 우수함을 확인하였다(도 20b).

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 페리틴 변형체는 세포에 대한 독성을 나타내지 않는다. 도 21은 약물로딩하지 않은 본 발명의 페리틴 변형체(empty ferritin variants)의 (a) HeLa 세포 및 (b) MCF-7 세포에 대한 세포독성을 나타낸 도이다. 여기에서 Fe-Nicked-HF는 Fe-DOX 복합체 대신 자유 Fe(II)가 사용 된 것을 제외하고는 Fe-DOX-Nicked-HF와 유사하게 준비되었다. 에러바, 1 s.d. (n = 4). 도 21에 나타낸 바와 같이, 약물 로딩하지 않은 페리틴 변형체는 실험 조건에서 세포에 독성이 없었지만 페리틴 단백질은 10 μg/mL를 초과하는 높은 농도에서 세포의 성장을 저해하였다.

따라서, 도 20a에 나타낸 바와 같이, 봉입된 DOX의 빠른 pH 반응성 방출은 세포에 대한 높은 독성의 원인이 될 수 있다. 그러나, 약물이 로딩되지 않은 페리틴 변형체(empty ferritin variant)들 중 시험된 세포에 독성이 있는 것은 없었으므로, 본 발명의 페리틴 변형체를 약물전달체로 사용하는 경우 세포 독성이 없으므로 안전성이 우수함을 확인하였다(도 21).

도 22는 트랜스페린과 함께 DOX-로딩된 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)의 HeLa 세포에 대한 세포 독성을 나타낸 도이다. 구체적으로 DOX가 로딩된 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF, [ferritin]=0.16 μg/mL; [DOX]=0.03 μg/mL)를 다양한 경쟁비를 가진 경쟁적인 트랜스페린으로 처리하면, DOX-Nicked-HF의 세포 독성이 약간 낮아졌다(도 22).

또한, 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)에 의한 DOX의 효과적인 세포 전달은 직접적으로 모니터링되었다. 도 23에 나타낸 바와 같이, Nicked-HF는 세포에 명확하게 표적화되었으며, 핵에서 DOX 시그널의 축적은 1시간 이내에 보였다. 흥미롭게도, 이 DOX의 핵 내 축적은 자유 DOX보다 빨랐다. HF의 신속한 핵 편재 특성은 DOX의 신속한 핵 축적을 설명할 수 있을지 모른다.

결론적으로 본 발명자들은 활성 Fe(II)에 의해 매개되는 약물 봉입화 및 pH 반응성 버스트 약물 방출 기능을 가진 새로운 페리틴 약물전달체를 개발하였다. 페리틴의 4-폴드 채널에 대한 최소한의 변형만으로, 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)는 페리틴의 금속 결합 및 암 표적 성질을 유지하면서 적극적/누적적인 약물 로딩 및 약화 된 pH 안정성에 대한 확장된 경로를 특징적으로 가진다. F160과 DOX-로딩된 페리틴 변형체(Nicked-HF)의 첫 번째 cryoEM 구조는 새로운 페리틴 전달체 개발을 위한 4-fold 채널 기술의 잠재력을 강력하게 뒷받침한다. 간단한 배양을 통한 높은 수준의 자발적 약물 로딩은 페리틴 약물 운반체의 효능을 상당히 향상시킨다. 더욱이, 현재의 전략은 커큐민과 퀘르세틴으로 입증된 것처럼 많은 약물과 약물 후보에 대해 안전한 전달 방법을 제공할 수 있다.

본 발명은 페리틴 중쇄(ferritin heavy chain) 단량체 및 E-헬릭스 절단 페리틴(E-helix truncated ferritin) 중쇄 단량체를 포함하는 페리틴 변형체(ferritin variant) 단백질, 약물전달체 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 페리틴 변형체 단백질을 이용하는 경우, 다양한 약물에 대하여 능동적 약물 로딩이 가능하고 높은 로딩 효율로 약물을 로딩할 수 있으며, pH에 민감하게 반응하여 약물을 방출하므로 단백질 기반의 약물전달체로서 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 4-fold 채널-nicked 인간 페리틴 나노케이지의 엔지니어링 과정을 도식적으로 나타낸 도이다.
도 2는 E-helix-truncated F160의 CryoEM 구조를 나타낸 도이다. 도 2 (a)는 F160의 3차원적 재구성 지도이다. (b)는 F160의 원자 모델이다. (c)와 (d) 는 E-helix가 절단된 페리틴 F160 과 F160의 모노머 (d)를 야생형 인간 페리틴 HF(자홍색)와 중첩시킨 도이다. F160의 cryoEM 지도 및 피팅된 좌표는 단백질 데이터 은행 및 전자 현미경 데이터 밴드에 기탁되었다(PDB ID : 5XB1, EMDB ID : EMD-6714).
도 3은 인간 페리틴 변형체 F160의 단일 입자 cryoEM 구조를 나타낸 도이다. 도 3의 (a)는 E-helix-절단 인간 중쇄 페리틴 F160의 대표적 cryoEM 현미경 사진이고, (b)는 도 2 (a)의 푸리에 변환도이다. (c)는 윈도우 크기가 180 Å인 2차원 클래스 평균의 갤러리(Scale bar, 2 nm)이다. (d)는 4-폴드 채널 대칭 축을 따라 서로 다른 레벨에서 확인한 밀도 맵의 단면(Scale bar, 2 nm)이다. (e)는 최종 3차원 재구성에 포함된 모든 입자의 오일러 각 분포를 나타낸다. (f)는 로컬 해상도로 채색된 최종 3차원 밀도 맵이며, (g)는 네 개의 헬릭스 (αA, αB, αC 및 αD)의 정제된 원자 모델은 해당하는 cryoEM 밀도맵과 들어 맞음을 나타낸다. (h)는 RELION에서 후-처리 전(파란색)과 후(빨간색)의 두 개의 독립으로 정제된 하프 맵 간의 푸리에 쉘 계수(Fourier shell coefficient, FSC) 곡선이다. (i)는 교차-확인을 위한 FSC 곡선이다: 모델 vs. 누적 맵(녹색), 모델 vs. 하프 맵 1(시험 정제에서 사용됨, 빨간색), 모델 vs. 하프 맵 2(시험 정제에서 사용 안 됨, 파란색).
도 4는 Nicked-HF의 제조과정을 나타낸 도이다. 도 4의 (a)는 HF 및 F160의 pH 의존적인 분해 및 재조립에 의한 본 발명의 닉-페리틴(Nicked-HF)의 제작과정을 나타낸 모식도이고, (b)는 HF와 F160를 HF:F160 = 1:1 또는 2:1의 비율로 혼합한 HF/F160 혼합물의 닉-페리틴으로의 재조립 전후를 15% SDS PAGE 분석으로 나타낸 도이다. (c)는 다양한 pH 조건에서의 페리틴 변형체의 4% 네이티브 PAGE 분석을 나타낸 도이다. (c)의 빨간색 화살표는 단백질 나노케이지가 분해되기 시작하는 pH 조건을 나타낸다.
도 5는 재조립 된 ferritin의 동적 광 산란 및 PAGE 데이터이다. (a) pH 11.4에서 HF(녹색), pH 11.4에서 F160(파란색) 및 pH 7에서의 Nicked-HF (빨간색)의 DLS 데이터. (b) 4% 네이티브 PAGE 데이터: pH 7 및 pH 11.4에서의 HF F160, 및 pH 11.4 에서 pH 7에서 재조립된 단백질 (c) pH 11.4 에서 pH 7에서 재조립된 HF의 다른 pH 조건에서의 4% 네이티브 PAGE 데이터.
도 6은 (a) HF, (b) F160, (c) Nicked-HF, 및 (d) Nicked-HF (E28H, E108K)의 음성-염색 TEM 이미지들이다(Scale bars 20 nm).
도 7은 페리틴 변형체의 pH- 및 단백질 분해 효소 K-에 대한 안정성을 설명하는 도이다. 구체적으로 (a)는 HF, F160 및 Nicked-HF의 네이티브 PAGE 데이터이고 (b)는다른 pH 조건에서 HF, F160 및 Nicked-HF의 동적 광산란 데이터이다. (c)는 페리틴 변형체(Nicked-HF)의 단백질 분해효소 K 분해에 대한 안정성을 확인하고자 0.25 mg/mL의 페리틴 단백질을 표시된 시간 동안 10 % (w/w) proteinase K로 처리하고 4 % 네이티브 겔로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a 내지 도 8c는 독소루비신(DOX)과 철 이온의 1 : 1 복합체 형성을 설명하는 도이다. 도 8a는 Fe (II)-DOX 화합물의 제안된 화학 구조이다. 도 8b는 [Fe]/[DOX] 비율 증가에 따른 DOX 흡수 스펙트럼을 나타낸 도이다. 도 8c는 [Fe]/[DOX] 비율 증가에 따른 480 nm 및 600 nm에서의 흡수값을 나타낸다. (주 : Fe-DOX 착물 형성의 포화 점은 ~ [Fe]/[DOX] = 1이다.)
도 9는 Fe-DOX 복합체 배양 중 페리틴 변형체의 단백질 안정성을 설명하는 도이다. (a)는 200 배 초과의 Fe-DOX 복합체와 함께 각각의 페리틴(HF, F160, Nicked-HF)을 2 시간 인큐베이션 한 후 12000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하여 불안정한 페리틴을 침전시킨 결과를 나타낸 도이다. (b)는 단백질 침전물을 제거하기 위한 여과 후, 수용성 페리틴 단백질을 PD-10 칼럼을 탈염시킴으로써 로딩되지 않은 금속-DOX 복합체로부터 분리하는 과정이다. 수용성 페리틴 내에 봉입화 된 DOX 복합체는 탈염 정제 과정에서 쉽게 시각화된다. (c)는 HF, F160, 페리틴 변형체(Nicked-HF)와 Fe-DOX가 로딩된 페리틴 변형체(Nicked-HF)를 탈염 시킨 후, 그리고 느슨하게 결합 된 Fe-DOX의 추가 제거를 위한 탈염 및 추가 투석 20 시간 후의 네이티브 겔 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 Fe-DOX-로딩된 Nicked-HF의 CryoEM 구조를 나타낸 도이다. 도 10의 (a)는 윈도우 크기가 18 nm인 대표적인 2차원 클래스 평균을 나타낸다(Scale bar, 2 nm). (b)는 Sliced EM 밀도 지도를 나타낸다 (PDB ID : 5YI5, EMDB ID : EMD-6830).
도 11은 Fe-Dox가 로딩된 Nicked-HF의 단일입자 cryoEM을 나타낸 도이다. (a)는 Fe-DOX가 로딩 된 Nicked-HF의 대표적인 cryoEM 현미경 사진이다. (b)는 (a)의 초기 현미경 사진에 대한 푸리에 변환을 나타낸 도이다. (c)는 창 크기가 180 Å 인 2 차원 클래스 평균 갤러리를 나타낸 도이다(스케일 바, 2 nm). (d)는 4-폴드 채널 대칭축을 따라 상이한 레벨에서 밀도 맵을 통해 슬라이스 한 결과를 나타낸 도이다(스케일 바, 2 nm). (e)는 최종 3 차원 재구성에 포함 된 모든 입자의 오일러 각 분포를 나타낸 도이다. (f)는 로컬 해상도로 채색된 최종 3 차원 밀도지도를 나타낸다. (g)는 4 개의 헬릭스 (αA, αB, αC 및 αD)의 정제된 원자 모델이 상응하는 cryoEM 밀도와 매칭됨을 나타낸다. (h)는 Fe-DOX가 로딩 된 페리틴 변형체(Nicked-HF)의 3D 분류를 나타낸다. 3D 분류의 첫 번째 라운드에서 선택된 3 개의 클래스가 동그라미로 표시되며 추가 구체화에 사용되었다. (i)는 RELION의 후-처리(post-processing) 전 (파란색)과 후 (빨간색)의 두 개의 독립적으로 정제 된 하프 맵 간의 FSC(Fourier Shell Coefficient) 곡선을 나타낸 도이다. (j)는 교차 유효성 확인을 위한 FSC 곡선을 나타낸 도이다: 모델 대비 합계 지도(summed map) (녹색), 모델 대 하프 맵 1 (정제 시험에서 사용됨, 빨간색), 모델 대 하프 맵 2 (정제 시험에서 사용되지 않음, 파란색).
도 12는 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)에서 Fe(II)-DOX와 세 개의 페리틴 모노머 사이의 상호 작용 인터페이스 (왼쪽)와 클로즈업 뷰(오른쪽)를 나타낸 도이다. 도 12에는 2 개의 중요한 Fe(II) 결합 잔기(E28 및 E108)가 표시되었다.
도 13은 페리틴 변형체(Nicked-HF)에 의한 Fe-DOX의 자발적 흡수를 나타내는 도이다. 구체적으로 Fe-DOX 복합체의 다양한 혼합 비율 하에서의 약물 로딩, 탈염, 및 투석 후 페리틴 변형체(Nicked-HF) 단백질의 회수율(a) 및 정량적인 약물 봉입화 수(b)를 나타낸다. 평균값은 그래프 막대 위에 표시되었다. 1 s.d. (n = 4).
도 14는 H₂O₂가 첨가 된 것과 첨가되지 않은 경우의 자유 DOX, Fe(II)-DOX 복합체, 및 페리틴 변형체(Nicked-HF) 내의 Fe(II)-DOX 복합체의 DOX 형광 이미지를 나타낸 도이다.
도 15는 페리틴 변형체의 능동적인 Cu(II)-DOX 봉입화를 나타낸 도이다. (a)는 200 배 초과의 Cu-DOX 복합체와 함께 각각의 페리틴(HF, F160, Nicked-HF)을 2 시간 인큐베이션 한 후 12000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하여 불안정한 페리틴을 침전시켰다. (b)는 단백질 침전물을 제거하기 위한 여과 후, 수용성 페리틴 단백질을 PD-10 칼럼을 탈렴시킴으로써 로딩되지 않은 금속-DOX 복합체로부터 분리하는 과정이다. 약물 로딩, 탈염 및 투석 후 각 페리틴(HF, F160, Nicked-HF)의 단백질 회수율(c) 및 (d) 정량적 약물 봉입화 수(d)를 나타낸다. 평균값은 그래프 막대 위에 표시된다. 에러바, 1 s.d. (n = 3).
도 16은 커큐민과 철이온 복합체 형성을 설명하는 도이다. (a)는 [Fe]/[Curc] 비율 증가에 따른 커큐민의 흡수 스펙트럼을 나타낸다. (b)는 [Fe]/[Curc] 비율 증가에 따른 435 nm와 500 nm에서의 흡수 값을 나타낸다. 커큐민 구조는 도 16의 (a) 상단에 표시되었다. (주 : Fe-Curc 복합체 형성의 포화점은 ~ [Fe]/[Curc] = 1이다.
도 17은 퀘르세틴과 철이온 복합체 형성을 설명하는 도이다. (a)는 [Fe]/[Q] 비율 증가에 따른 퀘르세틴의 흡수 스펙트럼을 나타낸다. (b)는 [Fe]/[Q] 비율 증가에 따른 380 nm와 500 nm에서의 흡수 값을 나타낸다. 퀘르세틴의 구조는 도 17의 (a) 상단에 표시되었다. (주 : Fe-Qurecetin 복합체 형성의 포화점은 ~ [Fe]/[Q] = 2이다
도 18은 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)의 능동적인 커큐민 로딩을 설명하는 도이다. (a)는 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)와 각각 자유 커큐민(free curcumin) 및 Fe-Curc 복합체와의 혼합물 용액을 나타낸 도이다. (b)는 자유 커큐민과 배양된 각 페리틴(HF, F160, Nicked-HF)과의 탈염 정제과정을 나타낸 도이다. (c)는 Fe-Curc 복합체 (Fe:Curc = 1:1 혼합비율)와 배양된 각 페리틴(HF, F160, Nicked-HF)의 탈염 정제과정을 나타낸 도이다. 100 배 과량의 Curc 화합물이 각 페리틴에 첨가되었다.
도 19는 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)의 능동적인 퀘르세틴 로딩을 설명하는 도이다. (a)는 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)와 각각 자유 퀘르세틴(free quercetin) 및 Fe-퀘르세틴 복합체와의 혼합물 용액을 나타낸 도이다. (b)는 자유 퀘르세틴과 배양된 각 페리틴(HF, F160, Nicked-HF)과의 탈염 정제과정을 나타낸 도이다. (c)는 Fe-퀘르세틴 복합체 (Fe:Q = 1:1 혼합비율)와 배양된 각 페리틴(HF, F160, Nicked-HF)의 탈염 정제과정을 나타낸 도이다. 600 배 과량의 퀘르세틴 화합물이 각 페리틴에 첨가되었다.
도 20은 pH-반응성 약물 캐리어로서의 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)를 나타낸 도이다. (a)는 다양한 pH 조건에서 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)로부터의 DOX 방출 양태를 나타낸 도이다. (b)는 HeLa 및 MCF-7 세포주에 대한 자유 DOX 및 Fe-DOX-Nicked-HF의 세포독성을 나타낸 도이다. (c)는 HeLa 세포에서 Fe-DOX가 로딩된 FITC-Nicked-HF를 처리했을 때 시간에 따른 FITC-표지-Nicked-HF (녹색), DOX (적색) 및 DPAI (파란색)의 공 초점 이미지를 나타낸 도이다.
도 21은 약물로딩하지 않은 본 발명의 페리틴 변형체(empty ferritin variants)의 (a) HeLa 세포 및 (b) MCF-7 세포에 대한 세포독성을 나타낸 도이다. Fe-Nicked-HF는 Fe-DOX 복합체 대신 자유 Fe(II)가 사용 된 것을 제외하고는 Fe-DOX-Nicked-HF와 유사하게 준비되었다. 에러바, 1 s.d. (n = 4). (주: 약물로딩하지 않은 페리틴 변형체는실험 조건에서 세포에 독성이 없었지만 페리틴 단백질은 10 μg/mL를 초과하는 높은 농도에서 세포의 성장을 저해하였다.)
도 22는 트랜스페린과 함께 DOX-로딩된 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)의 HeLa 세포에 대한 세포 독성을 나타낸 도이다. 구체적으로 DOX가 로딩 된 본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF, [ferritin]=0.16 μg/mL; [DOX]=0.03 μg/mL)를 다양한 경쟁비를 가진 경쟁적인 트랜스페린으로 처리한 결과를 나타낸 도이다. 에러바, 1 s.d. (n = 3).
도 23은 (a) HeLa 및 (b) MCF-7 세포에 자유 DOX 또는 Fe-DOX-Nicked-HF 처리시 시간에 따른 DOX (적색) 및 DPAI (파란색)의 공초점 이미지를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

방법 및 재료(Methods & Materials)

독소루비신 염산염(Doxorubicin hydrochloride, DOX), 커큐민(curcumin, Curc), 퀘르세틴(quercetin, Q), 황산 암모늄 철(II) 육수화물(ammonium iron (II) sulfate hexahydrate) 및 염산(hydrochloric acid, HCl)은 시그마-알드리치사에서 구입하였다. MOPS 유리산[3-(N-Morpholino) propane sulfonic acid, MOPS free acid]과 500 mM EDTA 용액은 LPS 솔루션 (대전, 한국)에서 구입하였다. 황산구리(II) (copper(II) sulfate)는 알파 에사르(Alfa Aesar)에서 구입하였다. DPBS(Dulbecco 's phosphate buffered saline)는 인비트로젠-깁코(Invitrogen-Gibco, USA)에서 구입하였다. 세포 생존력 시험을 위해, MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]를 시그마-알드리치사로부터 구입 하였다.

페리틴의 제작(Preparation of Ferritins)

페리틴 변형체 단백질의 아미노산 서열은 서열목록 제1서열 및 제2서열로 제공된다. 인간 중쇄 페리틴 (human H-chain ferritin, HF)과 E-헬릭스-절단 HF (E-helix-truncated HF, F160) 유전자를 NdeI 및 XhoI의 제한 효소를 통해 pET-21a 플라스미드 (Novagen)에 클로닝 하였다. 단백질은 대장균 BL21 (DE3) 세포에서 발현되었다. 형질전환 된 세포는 OD600=0.6이 될 때까지 37 ℃에서 성장하였고, 단백질은 1 mM IPTG(isoprophyl-delta-D-thiogalactopyranoside)에 의해 유도되었다. IPTG 유도 후 야생형 페리틴은 37 ℃에서 4 시간 동안 발현되었고, F160은 20ºC에서 하룻밤 동안 유도되었다. 발현 유도된 세포를 Tris pH 7.2 및 150 mM NaCl에서 초음파 처리한 후, 용해물(lysate)을 12000 rpm에서 15 분간 원심 분리하고 그 상등액을 60 ℃에서 10 분간 배양하였다. 열에 약한 다른 단백질은 응집되어 제거되었다. 열 안정성이있는 페리틴 단백질을 Nicked-HF 조제에 직접 사용하거나 Superose 6 10/300 GL 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피로 추가 정제하였다. 단백질을 Tris pH 7.2 및 150 mM NaCl에 보관하였다. 단백질 농도는 Bradford 분석법으로 측정하였다.

본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-Ferritin)의 제조

본 발명의 페리틴 변형체(Nicked-HF)는 1:1 또는 2:1 (HF:F160)의 비율로, 부분적으로 또는 완전히 해리된(dissociated) HF 및 F160 서브 유닛을 1 mg/mL 내지 5 mg/mL 범위의 단백질 농도 범위에서 혼합함으로써 제조되었다. 이 단백질 혼합물의 pH를 1 M NaOH를 적가하여 pH 11.4로 상승시키고, 생성된 혼합물을 37 ℃에서 30 분간 더 배양 하였다. 이 혼합물에 1 M HCl을 적가하여 pH를 7.8로 빠르게 변화시킴으로써 재조립시킨 후, 37 ℃에서 10 분 동안 약하게 반전(inverting)하여 배양하였다. 이어서, 이 혼합물을 0.2 ㎛ 주사기 필터로 여과하고, 3.5 kDa slide-A-lyzer 투석 카세트 G2 (Thermo scientific)으로 4 ℃에서 pH 7.2 MOPS 완충액 (50 mM MOPS pH 7.2, 150 mM NaCl)으로 투석하였다. 마지막으로, Nicked-HF 혼합물을 0.2 μm 주사기 필터로 다시 여과하였다. 성공적으로 조립된 Nicked-HF는 Tris-HCl (25 mM, pH 8.3)을 러닝 버퍼(running buffer)로 하여 4 % Native PAGE로 검사하였다.

Fe(II)-DOX 복합체 형성(Fe(II)-DOX complex formation)

DMSO 중의 10 mM DOX 및 물 중의 200 mM 철 이온을 각각 개별적으로 제조하였다. DOX와 Fe (II)의 결합 비율을 조사하기 위해, 다양한 농도의 Fe(II) 용액을 DOX 용액에 첨가하고 자외선 흡수를 모니터링 하였다. Fe(II)-DOX 복합체를 5% DMSO 용액에서 제조하였다. 커큐민과 퀘르세틴의 Fe(II) 복합체도 유사하게 제조되었다. 독소루비신(Doxorubicin)과 커큐민(curcumin)은 이들 화합물의 형광으로 정량화되었고, 퀘르세틴(quercetin)은 퀘르세틴의 흡광도로 정량화되었다. Cu(II)-DOX 복합체 (1:2=DOX:Cu(II))도 유사하게 제조되었다.

페리틴 변형체에의 능동적 약물 봉입(Active drug encapsulation on ferritin variants)

다양한 농도의 Fe-DOX (100 μL, 5 % DMSO)를 페리틴(1 mL, 0.6 mg/mL)에 넣고 실온에서 2 시간 동안 약하게 반전(inverting)시켰다. DMSO 농도는 DOX 로딩 효율에 영향을 미치지 않고 다양하게 변화시킬 수 있다. 이 혼합물을 봉입되지 않은 Fe-DOX 및 침전된 단백질을 제거하기 위하여 PD-10 탈염 칼럼(GE healthcare)에 넣었다. 또한 약하게 결합된 약물을 추가로 제거하기 위하여 탈염된 단백질을 과량의 완충액에 대해 4℃에서 20 시간 동안 투석하였다. 용출된 용액을 단백질 정량을 위하여 브래드포드(Bradford) 분석으로 검사하였다. 페리틴에서 DOX 농도를 결정하기 위해 약물 로딩된 페리틴 용액을 5 mM EDTA가 함유된 pH 2의 PBS 용액에 넣고 형광 스펙트럼을 496 nm 여기 및 592 nm 방출로 모니터링 하였다. Fe(II)-커큐민과 Fe(II)-퀘르세틴 복합체도 페리틴 변형체에 유사하게 봉입화되었다. 페리틴 내의 커큐민 농도를 정량하기 위하여, 단백질 용액을 50 mM EDTA를 포함하는 90% DMSO에 첨가하였고, 이를 통해 Fe-Curc 복합체로부터의 커큐민의 최적 형광 회수(recovery)를 관찰하였다. 형광 스펙트럼은 458 ㎚ 여기 및 534 ㎚ 방사로 모니터링 하였다. 페리틴 내의 퀘르세틴 농도를 정량하기 위하여, 단백질 용액을 50 mM EDTA를 포함하는 80% DMSO에 첨가 하였다. 흡수 스펙트럼은 380 nm에서 모니터링 하였다. 약물 방출 시험을 위해, 약물 함유 페리틴을 다양한 pH 조건 완충액 (아세테이트, 카보네이트, MOPS 완충액 및 150 mM NaCl)에 대해 투석 (3.5 kDa 투석 카세트)하고, 보유된 약물은 상기와 같은 방법으로 모니터링 하였다.

음성 염색 투과전자현미경(Negative-Stain Transmission Electron Microscopy)

음성 염색 TEM 이미지를 위하여, FPLC로 정제된 페리틴과 Fe-DOX로 봉입된 Nicked-HF를 탄소 코팅 그리드(200 mesh)에 2 분간 흡착시켰다. 단백질은 TEM 분석 전에 2% 우라닐 아세테이트 (Electron Microscopy Sciences)로 30 초 동안 염색되었다. 이미지는 120 kV에서 작동하는 FEI Eagle 4Kx4K CCD 카메라가 장착 된 Tecnai T12 Bio-TWIN 투과 전자 현미경을 사용하여 획득되었다.

저온-전자현미경 분석(CryoEM analysis)

산화 그래핀 분산액 (Graphene oxide dispersion) (Sigma)을 물에서 0.2 mg/mL로 희석하고 300 g에서 30 초 동안 원심분리시켜 응집체를 제거 하였다. Quantifoil (Quantifoil Cu 400 mesh R1.2 / 1.3 holey grids, Quantifoil Micro tools)의 탄소면을 30 초 동안 글로우 방전(glow-discharge)시켰고 4 μL의 그래핀 현탁액을 6 분 동안 그리드에 로딩시켰다. 이후 그리드는 여과지를 사용하여 블로팅 (blotting)하고 물 20 μL 로 3 회(그래핀 면에 두 번, 뒷면에 한 번씩) 세척하였다. 5분간 건조 후, 산화 그래핀으로 덮인 그리드에 2 μL의 페리틴 F160 단백질 (0.1 mg/mL)을 적용하고 30 초간 배양하였다. 그런 다음 그리드를 9 초 동안 블로팅하고 Vitrobot Mark IV (FEI)를 사용하여 액상 에탄(ethane)에서 4 ℃ 100 % 습도의 급랭 동결시켰다. 시편(specimen)은 전계 방출 소스 (field emission source, FEI)가 장착 된 Titan Krios 투과 전자 현미경으로 이미징되었으며 300 kV의 가속 전압에서 작동되었다. Falcon II direct electron detector (FEI)를 사용하여 현미경사진(미세그래프, micropraph)을 기록하였다. 표본의 총 선량은 Å2 ekd 60e- 였고 총 노출 시간은 1.8 초를 픽셀 당 1.3973Å의 보정된 픽셀 크기로 30 서브 프레임에 걸쳐 나누어졌다. 이미지는 -0.5 μm에서 -3.5 μm 범위의 디 포커스로 기록되었다. 그리드-준비 및 이미지-수집을 위한 동등한 조건을 Fe-DOX-Nicked-HF에 적용하였다.

이미지 처리(Image processing)

각 이미지의 동영상 프레임은 선량 보정과 함께 MOTINCORR2를 사용하여 드리프트 보정을 받고, CTFFIND4를 사용하여 CTF (contrast transfer function) 매개 변수를 결정하였다. 모든 후속 이미지 처리 단계는 128 픽셀의 입자 상자 크기와 150 Å의 마스크 디 미터를 사용하여 RELION 2.0을 사용하여 수행되었습니다. 처음에는 ~5,000까지의 입자를 수동으로 F160에 대해 선택하고 참조가 없는 2차원 분류를 수행하였다. 10 개의 대표적인 2차원 클래스 평균이 자동-입자 선택(automated particle picking)을 위한 템플릿으로 선택되었다. 1,383 개의 현미경 사진에서 총 623,510 개의 자동 선택된 입자를 참조가 없는 2차원 분류를 통해 가양성 및 결함 입자를 제거하였다. 3D 처리를 위해 팔면체 (O) 대칭을 적용하고 인간 페리틴 중쇄 (PDB : 4Y08)의 결정 구조로부터 얻어진 60Å 저역 통과 필터링된 맵(map)을 초기 모델로 사용 하였다. 568,716 개의 선택된 입자는 3차원 분류 과정을 거쳐 ~ 429,135 입자의 균질한 세트를 얻었다. 결과로 도출된 맵(map)은 'gold standard' FSC = 0.143 푸리에 쉘 상관관계 기준에 따라 3.0Å의 추정 해상도로 정제되었다.

Fe-DOX-Nicked-HF 복합체의 경우, 567 개의 현미경 사진에서 215,763 개의 입자가 자동으로 추출되었고 2D 분류 후에는 106,295 개의 입자가 선택되었다. 3D 처리를 위해, F160 맵은 60 Å의 저역통과 필터 이후 초기 모델로 사용되었다. 3D 분류는 대칭성을 나타내지 않고 수행되었고, 정의된 구조와 페리틴 내부의 여분의 밀도를 갖는 4 개의 분류 중 3 개의 분류가 선택되었다. 80,451 개의 입자를 풀링하고, 정제하여 전체 해상도 4.3Å의 최종 맵을 만들었다. 보정된 FSC가 계산되기 전에, 최종 데이터 세트는 소프트 마스크가 계산되어 두 개의 하프 맵에 적용되는 '후 처리'의 대상이 되었다. 온도 인자 추정 및 맵 선명화 또한 자동화된 절차를 사용하여 후 처리 단계에서 수행되었다. 최종 해상도는 보정된 FSC 곡선에서 FSC=0.143 기준을 사용하여 추정되었다. 로컬 해상도는 Blocres를 사용하여 원시 밀도 맵(unbinned and unsharpened raw density map)에서 추정되었습니다.

모델 제작(Model building)

F160의 경우, 인간 페리틴 중쇄 (PDB : 4Y08)의 결정 구조는 C 말단 E-helix를 결실시킨 후 처음에 UCSF Chimera를 사용하여 EM 맵에 도킹되었다. 모델은 Coot를 사용하여 육안 검사를 한 후 EM 밀도 맵에 맞게 수동으로 조정했다. 실제 공간에서의 구형 정제(global refinement) 및 최소화는 PHENIX에서 모듈 'phenix. real_space_refine’로 처리되었다. Fe-DOX-Nicked-HF 복합체의 모델은 그서의 EM 맵과 유사하게 제작되었다.

인 비트로 세포 연구( In vitro cell study)

인간의 자궁 경부암 (HeLa) 세포주는 DMEM(Dulbecco 's Modified Eagles 'Medium, HyClone, USA)에서 유지되었으며, 인간 유방선암종 (MCF-7) 세포주는 RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute Medium, Gibco, USA)을 95% 습도, 5% CO₂대기에서 37℃에서 배양하였다. 두 배지 모두 10% 우태아 혈청 (FBS, HyClone, USA)과 1% 페니실린-스트렙토 마이신 (Gibco, USA)으로 보충 하였다. 유리 페리틴, 약물 로딩된 페리틴 및 유리 약물(free drug)의 세포 독성은 HeLa 및 MCF-7과 같은 암 세포주에 대한 테트라졸륨(tetrazolium) 기반 열량 분석 (MTT 분석)에 의해 평가되었습니다. 간단히, 세포를 96 웰 플레이트에 1 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 접종하고 24 시간 동안 배양 하였다. 세포를 다양한 약물 및 단백질 샘플로 처리하고, 배지에서 72 시간 동안 배양 하였다. 그런 다음 5 mg / mL MTT 용액을 가하고 추가 4 시간 동안 배양했다. 배지를 조심스럽게 제거하고 DMSO를 각 웰에 첨가하여 보라색 포르 마잔 결정을 용해시켰다. 흡수는 마이크로 플레이트 분광 형광 측정기 (Varioskan Flash, Thermo scientific)를 사용하여 570 nm에서 측정 하였다. 형질 감염 시스템에 노출되지 않은 대조 (처리되지 않은) 세포의 상대 백분율을 100 % 세포 생존 능력을 나타내기 위해 사용 하였다. HeLa 및 MCF-7 세포를 8- 웰 플레이트에서 웰 당 1 x 10⁴ 세포로 유리 커버 슬립 상에 시딩하였다. 24시간 배양 후 DOX와 DOX-로딩된 페리틴을 세포에 첨가 한 후 37 ℃에서 지정된 시간 동안 추가로 배양 하였다. 처리된 세포를 차가운 DPBS로 2회 세척하고 실온에서 30 분 동안 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정시켰다. 고정시킨 세포가 있는 커버 슬립을 DAPI(Vector Labs)를 포함하는 Vectashield anti-fade 마운팅 미디움과 함께 슬라이드 글라스에 마운팅하고 DOX와 형광 표지 Nicked-HF를 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (confocal laser scanning microscope, CLSM)을 사용하여 관찰하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Hydrophobic channel engineered ferritin drug carriers with active drug loading ability <130> PN180047 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human heavy cahin ferritin (HF) <400> 1 Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 20 25 30 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 50 55 60 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro 115 120 125 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys 130 135 140 Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly 145 150 155 160 Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu 165 170 175 Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser 180 <210> 2 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E-helix truncated HF (F160) <400> 2 Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 20 25 30 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 50 55 60 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro 115 120 125 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys 130 135 140 Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly 145 150 155 160

Claims

페리틴 중쇄(ferritin heavy chain) 단량체 및 E-헬릭스 절단 페리틴(E-helix truncated ferritin) 중쇄 단량체를 포함하며, 소수성 채널이 개량된 페리틴 변형체(ferritin variant) 단백질.
제 1 항에 있어서, 상기 페리틴 중쇄는 인간의 페리틴 중쇄인 것을 특징으로 하는 페리틴 변형체 단백질.
제 1 항에 있어서, 상기 페리틴 변형체 단백질은 총합 24-머(24-mer)의 상기 페리틴 중쇄 단량체 및 E-헬릭스 절단 페리틴 중쇄 단량체를 포함하는 것을 특징으로 하는 페리틴 변형체 단백질.
제 1 항에 있어서, 상기 페리틴 중쇄 단량체 및 E-헬릭스 절단 페리틴 중쇄 단량체는 1:10 내지 10:1의 혼합 비율로 포함되는 것을 특징으로 하는 페리틴 변형체.
제 1 항에 있어서, 상기 인간 페리틴 중쇄 단량체는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 페리틴 변형체 단백질.
제 1 항에 있어서, 상기 E-헬릭스 절단 페리틴 중쇄 단량체는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 페리틴 변형체 단백질.
제 1 항에 있어서, 상기 페리틴 변형체 단백질은 그 내강(cavity) 내에 약물을 담지하는 것을 특징으로 하는 페리틴 변형체 단백질.
제 7 항에 있어서, 상기 페리틴 변형체 단백질은 상기 약물을 약물 또는 금속이온-약물 복합체(complex)의 형태로 담지하는 것을 특징으로 하는 페리틴 변형체 단백질.
제 8 항에 있어서, 상기 금속이온은 Cu(II) 및 Fe(II)로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속이온인 것을 특징으로 하는 페리틴 변형체 단백질.
제 7 항에 있어서, 상기 약물은 커큐민(curcumin), 퀘르세틴(quercetin), 및 미톡산트론(mitoxantrone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약물인 것을 특징으로 하는 페리틴 변형체 단백질.
제 1 항에 있어서, 상기 페리틴 변형체 단백질은 pH 감응적으로 그 내강에 담지한 약물을 방출하는 것을 특징으로 하는 페리틴 변형체 단백질.
제 1 항에 있어서, 상기 페리틴 변형체 단백질은 pH 5 이하의 조건에서 그 내강에 담지한 약물을 방출하는 것을 특징으로 하는 페리틴 변형체 단백질.
제 1 항에 있어서, 상기 페리틴 변형체 단백질은 단백질 분해효소 K(proteinase K)에 대한 분해내성을 가지는 것을 특징으로 하는 페리틴 변형체 단백질.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 페리틴 변형체 단백질을 포함하는 약물전달체.
페리틴 중쇄(ferritin heavy chain) 단량체 및 E-헬릭스 절단 페리틴(E-helix truncated ferritin) 중쇄 단량체를 조립하는 단계를 포함하는 페리틴 변형체(ferritin variant) 단백질의 제조방법.
제 15 항에 있어서, 상기 페리틴 중쇄 단량체 및 상기 E-헬릭스 절단 페리틴 단량체는, 각각의 페리틴 중쇄로 이루어진 페리틴 및 E-헬릭스 절단 페리틴 중쇄로 이루어진 페리틴이 pH 9 이상의 염기성 조건에서 분해되어 생성되는 것을 특징으로 하는 페리틴 변형체 단백질.
다음 단계를 포함하는 페리틴 변형체 단백질의 제조방법:
(a) pH 9 이상의 염기성 조건에서 페리틴 중쇄를 포함하는 페리틴 및 E-헬릭스 절단 페리틴을 포함하는 페리틴을 혼합하는 단계; 및
(b) 상기 혼합물의 pH를 8 이하로 낮추는 단계.