WO2022235059A1 - 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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WO2022235059A1
WO2022235059A1 PCT/KR2022/006352 KR2022006352W WO2022235059A1 WO 2022235059 A1 WO2022235059 A1 WO 2022235059A1 KR 2022006352 W KR2022006352 W KR 2022006352W WO 2022235059 A1 WO2022235059 A1 WO 2022235059A1
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binding
protein
ferritin
pharmaceutical composition
immune checkpoint
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PCT/KR2022/006352
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이지원
이보람
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating lung cancer.
  • cancer requires a very difficult and complex treatment.
  • the methods currently used for cancer treatment include surgery, radiation therapy, and chemotherapy. If the cancer has not metastasized to other sites and is localized, cancer can be treated through surgery to remove the cancer. However, since cancer metastasis occurs in more than 70% of cancer patients, adjuvant treatment regimens must be combined.
  • the adjuvant treatment therapies radiation therapy to kill cancer cells is performed using high-energy radiation.
  • the proliferation of cancer cells is inhibited when the cancer cells are irradiated with radiation, so that new cancer cells cannot be generated and cancer cells. prevent further division.
  • this method has a problem in that there is a side effect that affects not only cancer cells but also normal cells.
  • Chemotherapy is an adjuvant treatment that uses drugs to kill cancer cells after surgery with the aim of killing invisible cancer cells.
  • the chemotherapy has a problem in that side effects such as vomiting, diarrhea, and hair loss follow.
  • Immunotherapy is a method of treating cancer using the patient's immune response, and can even prevent cancer.
  • Cancer immunotherapy like the principle of a vaccine, is a treatment method in which cancer-specific immune cells are activated by administering an antigen that causes tumor formation, and then the activated immune cells specifically attack cancer in the body.
  • cancer-specific antigen is administered into the body even if the patient does not have cancer.
  • the inactivated immune cells are activated as cancer-specific memory immune cells to specifically attack cancer cells when cancer occurs.
  • cancer-specific antigens Tumor-associated antigen
  • TAA Tumor-associated antigen
  • TSA Tumor-specific antigen
  • neo-antigens which are found in various tumor types such as lung cancer and kidney cancer, but mainly found in lung cancer and melanoma, are antigens newly generated by potential gene activity or DNA mutations in cancer patients. Therefore, this antigen is very important in the production of a 'customized cancer vaccine' based on the patient's individual genetic information.
  • Non-Patent Document 1 Polymers are widely used as carriers of cancer-specific antigens in the body, and when cancer antigens are immobilized on the surface of polymers for delivery of cancer-specific antigens in the body, the cancer-specific antigens must be exposed to the particle surface through chemical bonding. . However, there is still a limit in the portion for uniformly exposing the cancer-specific antigen to the particle surface at a high density.
  • cancer immunotherapy Compared to conventional anticancer treatment methods, cancer immunotherapy has low side effects because it uses the patient's immune system, and the therapeutic effect can last for a long time by forming immune memory. It has the advantage of having few side effects. In addition, due to the recent clinical success cases of cancer patients with recurrent or anticancer drug resistance, cancer immunotherapy is receiving explosive attention enough to be selected as Breakthrough of the year 2013 by Science.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating lung cancer comprising a protein capable of binding to an immune checkpoint molecule.
  • An object of the present invention is to provide a method for treating lung cancer using the above composition.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating lung cancer comprising a ferritin protein in which a molecule capable of binding to an immune checkpoint molecule is fused to an external surface.
  • the protein may be a spherical protein formed by self-assembly of 24 ferritin monomers fused with a molecule capable of binding to the immune checkpoint molecule.
  • a molecule capable of binding an immune checkpoint molecule may be fused to at least one of the interior of at least one of the ⁇ -helices of the ferritin monomer or between adjacent ⁇ -helices.
  • Molecules capable of binding an immune checkpoint molecule may be fused to the N-terminus or C-terminus of the ferritin monomer.
  • Molecules capable of binding an immune checkpoint molecule may be fused inside the A helix, B helix, C helix, D helix or E helix of the ferritin monomer.
  • Molecules capable of binding immune checkpoint molecules may be fused to loops A-B, loop B-C, loop C-D or loop D-E of the ferritin monomer.
  • the molecule capable of binding to the immune checkpoint molecule may be fused between the N-terminus and the A helix or between the E helix and the C-terminus of the ferritin monomer.
  • the protein may be mutated so that binding to the human transferrin receptor is reduced.
  • the protein may be one in which amino acids 15, 16, 23, 82, 84, 117, 120 or 124 in the sequence of SEQ ID NO: 1 are substituted with alanine, glycine, valine or leucine.
  • the ferritin protein may have a binding affinity (K) to the transferrin receptor, satisfying Equation 1 below:
  • the binding ability to the transferrin receptor may be binding to the human transferrin receptor.
  • the immune checkpoint molecules are Her-2/neu, VISTA, 4-1BBL, Galectin-9, Adenosine A2a receptor, CD80, CD86, ICOS, ICOSL, BTLA, OX-40L, CD155, BCL2, MYC, PP2A, BRD1, BRD2 , BRD3, BRD4, BRDT, CBP, E2F1, MDM2, MDMX, PPP2CA, PPM1D, STAT3, IDH1, PD1, CTLA4, PD-L1, PD-L2, LAG3, TIM3, TIGIT, BTLA, SLAMF7, 4-1BB, OX -40, ICOS, GITR, ICAM-1, BAFFR, HVEM, LFA-1, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, LAIR1, 2B4, CD2, CD3, CD16, CD20, CD27, CD28, CD40L, CD48, CD52, EGFR It may be any one selected from the group consisting of
  • the molecule capable of binding to the immune checkpoint molecule may be a ligand or a fragment of a ligand having binding affinity to the immune checkpoint molecule, a receptor or a fragment of a receptor, an antibody or an antibody fragment including an antigen binding region (CDR).
  • CDR antigen binding region
  • the ferritin may be a human ferritin heavy chain.
  • the ferritin protein may be present in an aqueous fraction of 40% or more in the E. coli production system.
  • the protein of the present invention has excellent binding ability to immune checkpoint molecules.
  • the protein of the present invention enables T cells to kill cancer cells by preventing immune checkpoint molecules from inactivating T cells.
  • the proteins of the invention can fuse molecules that bind to a variety of immune checkpoint molecules.
  • the protein of the present invention is capable of binding to various immune checkpoint molecules.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer of the present invention has excellent anticancer efficacy.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a basic vector for preparing wild type (native) human ferritin heavy chain (huHF) and mutant human ferritin heavy chain protein.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a vector for producing huHF_Mutant1-dual and a view confirming the production of the ferritin protein.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a vector for producing huHF_Mutant1-h_smPD1 and a diagram confirming the production of the ferritin protein.
  • 11 is a result of evaluation of binding affinity to human transferrin receptor of huHF_Mutant1-dual and huHF_Mutant2-dual.
  • 13 and 14 are results of evaluation of binding ability between NK cells and cancer cells according to huHF_mutant1-dual treatment.
  • 16 is a schematic diagram of the LLC1 lung cancer animal model preparation and tumor suppression experiment.
  • 17 and 18 are tumor growth inhibition evaluation results according to huHF_mutant1-dual treatment.
  • 19 to 21 are avidity evaluation results for the lung cancer cell line A549 of huHF_mutant1-dual.
  • 22 is an evaluation result of tumor growth inhibition in an animal model of LLC1 lung cancer when huHF_mutant1-dual or a combination thereof with an anticancer agent is used.
  • 23 and 24 show a schematic diagram of a vector for producing a ferritin protein in which a foreign peptide is fused to a helix and protein production results.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating lung cancer, comprising a ferritin protein fused with an immune checkpoint molecule and a molecule capable of binding to an external surface thereof.
  • Ferritin may be ferritin from humans, animals and microorganisms.
  • Human ferritin is composed of a heavy chain (21 kDa) and a light chain (19 kDa), and exhibits the property of forming spherical nanoparticles through the self-assembly ability of the monomers constituting the ferritin.
  • Ferritin can form a self-assembly having a spherical three-dimensional structure by gathering 24 monomers.
  • the outer diameter is about 12 nm and the inner diameter is about 8 nm.
  • the structure of the ferritin monomer is a form in which five ⁇ -helix structures, namely, A helix, B helix, C helix, D helix, and E helix, are sequentially connected, and each ⁇ -helix structure called a loop consists of a polypeptide. It contains a portion of the atypical polypeptide to which it is linked.
  • the loop is a region that is not structurally broken even when a peptide or a small protein antigen is inserted into ferritin.
  • a peptide-ferritin fusion protein monomer in which a peptide such as an epitope is located in a ferritin monomer can be prepared.
  • the loop connecting the helix A and the helix B is A-B loop
  • the loop connecting the helix B and helix C is loop B-C
  • the loop connecting the helix C and helix D is C-D loop
  • the loop connecting the helix D and E is D-E. called loop.
  • the ferritin may be a ferritin heavy chain, specifically, a human ferritin heavy chain.
  • the human ferritin heavy chain may be a protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 derived from humans, and in the present specification, the ferritin may be used interchangeably with 'human ferritin heavy chain' or 'huHF'.
  • the ferritin protein may be a ferritin monomer. Accordingly, it may be a ferritin heavy chain monomer or a human ferritin heavy chain monomer.
  • Ferritin self-assembles several of its monomers to form an organized structure or pattern.
  • the ferritin protein of the present invention is a nanoscale particle.
  • 24 ferritin monomers fused with a molecule capable of binding to an immune checkpoint molecule may be self-assembled to form a ferritin protein.
  • the ferritin protein may be globular.
  • the particle diameter may be 8 to 50 nm. More specifically, it may be 8 nm to 50 nm, 8 nm to 45 nm, 8 nm to 40 nm, 8 nm to 35 nm, 8 nm to 30 nm, 8 nm to 25 nm, 8 nm to 20 nm, and 8 nm to 15 nm.
  • the ferritin protein is a fusion of a molecule capable of binding to an immune checkpoint molecule on an external surface. As long as the molecule capable of binding to the immune checkpoint molecule is fused to the outer surface of the ferritin protein, it is not necessary that the molecule capable of binding the immune checkpoint molecule is fused to all ferritin monomers constituting the ferritin protein.
  • a molecule capable of binding an immune checkpoint molecule may be fused to at least one ferritin monomer among the 24 ferritin monomers.
  • all 24 ferritin monomers can be fused with molecules capable of binding to immune checkpoint molecules.
  • One or two or more types of molecules capable of binding to an immune checkpoint molecule may be fused to each ferritin monomer constituting the ferritin protein.
  • Each ferritin monomer constituting the ferritin protein may be fused with molecules capable of binding to different immune checkpoint molecules.
  • Each ferritin monomer constituting the ferritin protein may be fused with different molecules capable of binding to the same immune checkpoint molecule.
  • Immune checkpoint molecules bind to T cells and inactivate them.
  • Such immune checkpoint molecules include, for example, Her-2/neu, VISTA, 4-1BBL, Galectin-9, Adenosine A2a receptor, CD80, CD86, ICOS, ICOSL, BTLA, OX-40L, CD155, BCL2, MYC, PP2A, BRD1, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT, CBP, E2F1, MDM2, MDMX, PPP2CA, PPM1D, STAT3, IDH1, PD1, CTLA4, PD-L1, PD-L2, LAG3, TIM3, TIGIT, BTLA, SLAMF7, 4- 1BB, OX-40, ICOS, GITR, ICAM-1, BAFFR, HVEM, LFA-1, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, LAIR1, 2B4, CD2, CD3, CD16, CD20, CD27, CD28, CD40L, CD48
  • the molecule capable of binding to the immune checkpoint molecule may be a ligand or a fragment of a ligand having binding affinity to the immune checkpoint molecule, a receptor or a fragment of a receptor, an antibody or a fragment of an antibody comprising an antigen binding site (CDR).
  • CDR antigen binding site
  • Molecules capable of binding immune checkpoint molecules may be fused to any ferritin monomer as long as they can be exposed on the outer surface of the ferritin protein. Molecules capable of binding to immune checkpoint molecules are fused at positions that do not interfere with self-assembly of ferritin monomers.
  • Molecules capable of binding to immune checkpoint molecules can be fused inside the ferritin monomer to change the structure of the ferritin protein.
  • the internally indented part may protrude to the outside by fusion of molecules capable of binding to the immune checkpoint molecule. It can be incorporated into the interior by fusion of a molecule capable of binding with the .
  • the molecule capable of binding to the immune checkpoint molecule is preferably fused to a position where the ferritin protein reduces binding to the human transferrin receptor or interferes with the binding to the human transferrin receptor.
  • a molecule capable of binding to an immune checkpoint molecule is not limited to a specific range in its structure, molecular weight, and amino acid length.
  • a molecule capable of binding an immune checkpoint molecule may be, for example, a ligand, antibody, or fragment thereof whose amino acid length is 25aa or less. More specifically, the amino acid length is 25aa or less, 24aa or less, 23aa or less, 22aa or less, 21aa or less, 20aa or less, 19aa or less, 18aa or less, 17aa or less, 16aa or less, 15aa or less, 14aa or less, 13aa or less, 12aa or less, 11aa or less or less, 10aa or less, 9aa or less, 8aa or less, 7aa or less, 6aa or less, 5aa or less.
  • the amino acid may have a length of 3aa or more, 4aa or more, 5aa or more, 6aa or more, 7aa or more, 8aa or more, 9aa or more, 10aa or more.
  • the fusion site of the molecule capable of binding with the immune checkpoint molecule is not limited to a specific position, for example, inside the ⁇ -helix of the ferritin monomer (A helix, B helix, C helix, D helix, or E helix), between adjacent ⁇ -helices. , N-terminus, C-terminus, A-B loop, B-C loop, C-D loop, D-E loop, between N-terminus and A helix, between E helix and C-terminus, inside helix, and the like.
  • the protein of the present invention is a ferritin monomer within the ⁇ -helix (A helix, B helix, C helix, D helix, or E helix), between adjacent ⁇ -helices, N-terminal, C-terminal, A-B loop, It may further include a foreign peptide fused to the B-C loop, C-D loop, D-E loop, between the N-terminus and the A helix, between the E helix and the C-terminus, inside the helix, and the like.
  • the foreign peptide may be a pharmacologically active peptide.
  • the ferritin protein is designed to bind to an immune checkpoint molecule, it is preferable that it does not bind well to the transferrin receptor.
  • the ferritin protein satisfies the following Equation 1 for the transferrin receptor:
  • the binding force may be, for example, binding to the human transferrin receptor.
  • the K value of Equation 1 is 10 nM or more, 20 nM or more, 30 nM or more, 40 nM or more, 50 nM or more, 60 nM or more, 70 nM or more, 80 nM or more, 90 nM or more, 100 nM or more, 110 nM or more, 120 nM or more, 125 nM or more, 125 nM or more, 150 nM or more, 200nM or more, 210nM or more, 220nM or more, 230nM or more, 240nM or more, 250nM or more, 260nM or more, 270nM or more, 280nM or more, 290nM or more, 300nM or more, 350nM or more, 400nM or more, 450nM or more, 500nM or more, 550nM or more, 600 nM or more, 700 nM or more, 800 nM or more, 900 nM or more, 1000 nM
  • the upper limit may be, for example, 100000nM, 90000nM, 80000nM, 70000nM, 60000nM, 50000nM, 10000nM, 9000nM, 8000nM, 7000nM, 6000nM, 5000nM, etc., but is not limited thereto.
  • the binding force (K) to the transferrin receptor is measured in the equilibrium state of the binding reaction between the ferritin protein (A) of the present invention and the transferrin receptor.
  • concentration of the ferritin protein at equilibrium ([P]), the concentration of the transferrin receptor ([T]), and the concentration of the complex of the protein of the present invention and the transferrin receptor ([PT]) can be measured by various known methods. .
  • the ferritin protein may fuse a molecule capable of binding with an immune checkpoint molecule to a site involved in binding to the transferrin receptor in order to lower the binding force to the transferrin receptor.
  • the molecule capable of binding to an immune checkpoint molecule may be fused to the B-C loop and the A helix portion of the ferritin protein of the present invention.
  • the ferritin protein may be mutated so that binding to the human transferrin receptor is reduced.
  • amino acids 15, 16, 23, 82, 84, 117, 120 or 124 in the sequence of SEQ ID NO: 1 may be substituted with alanine, glycine, valine or leucine.
  • the ferritin protein may be produced in a microorganism expressing a sequence encoding the protein.
  • Microorganisms known in the art may be used without limitation.
  • it may be E. coli, specifically BL21 (DE3), but is not limited thereto.
  • the ferritin protein of the present invention has a high rate of lysis in the cytoplasm in the microbial production system. It is easy to separate/purify and utilize.
  • the ferritin protein may be prepared, for example, in an E. coli system for producing it in a state in which the water-soluble fraction ratio of the total protein is 40% or more. Specifically, it may be 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more.
  • the upper limit may be, for example, 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, or the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to a carrier or diluent that does not significantly stimulate the organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered component.
  • the pharmaceutically acceptable carrier in the present invention can be used by mixing one component or one or more components among saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and these components, Other conventional additives such as antioxidants, buffers and bacteriostatic agents may be added as necessary to form an injection suitable for injection into tissues or organs.
  • a target organ-specific antibody or other ligand may be used in combination with the carrier so as to act specifically on the target organ.
  • composition of the present invention may further include a filler, an excipient, a disintegrant, a binder or a lubricant.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the pharmaceutical composition may be an injection formulation, and may be administered intravenously, but is not limited thereto.
  • the term “effective amount” refers to an amount necessary to delay the onset or progression of a specific disease to be treated or to promote it entirely.
  • the composition may be administered in a pharmaceutically effective amount. It is apparent to those skilled in the art that a suitable total daily amount of the pharmaceutical composition can be determined by a treating physician within the scope of sound medical judgment.
  • a specific pharmaceutically effective amount for a specific patient is the specific composition, including the type and extent of the response to be achieved, whether or not other agents are used if necessary, the patient's age, weight, general health status, sex It is preferable to apply differently depending on various factors including diet, administration time, administration route and secretion rate of the composition, treatment period, drugs used together or concurrently with a specific composition, and similar factors well known in the pharmaceutical field.
  • the pharmaceutical composition may be accompanied by instructions associated with packaging in a form instructed by a government agency in charge of the manufacture, use and sale of drugs, if necessary, and the instructions are in the form of a composition or human or human. It indicates the approval of a private interest organization for administration to animals, and may be, for example, a label approved by the US Food and Drug Administration for the prescription of a drug.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include an anticancer agent, or may be administered in combination with an anticancer agent.
  • anticancer agent any substance having anticancer activity may be used without limitation, and known anticancer agents may also be used.
  • the anti-cancer agent may be a chemo-cancer agent, a targeted anti-cancer agent, or an immuno-cancer agent.
  • the chemotherapy is not limited thereto, but may be an alkylating agent, a microtuble inhibitor, an antimetbolite, or a topoisomerase inhibitor.
  • the alkylating agent is mechlorethamine, cyclophosphamide, ifosfamide, melphalan, chlorambucil, thiotepa, altretamine ), procarbazine, busulfan, streptozocin, carmustine, iomustine, dacarbazine, cisplatin, carboplatin ( carboplatin), but may be oxaliplatin (oxaliplatin), but is not limited thereto.
  • the microtubule inhibitor may be docetaxel (docetaxel), vinblastine (vinblastine), oncobin (Oncovin), vinorelbine (vinorelbine), but is not limited thereto.
  • the antagonist is fluorouracil, capecitabine, cytarabine, gemcitabine, fludarabine, methotrexate, pemetrexed, It may be mercaptopurine (mercaptopurine), but is not limited thereto.
  • the topoisomerase inhibitor may be hycamtin, camptosar, vepesid, taxol, bleomycin, adriamycin, or cerubidine. , but not limited thereto.
  • Targeted anticancer agents include, but are not limited to, trastuzumab, pertuzumab, panitumumab, cetuximab, bevacizumab, ramucirumab, aflibercept, rituximab, obinutuzumab, daratumumab, denosumab, ibrutinib, dasatinib, Nilotinib, imatinib, bosutinib, osimertinib, erlotinib, gefitinib, nintedanib, sunitinib , sorafenib, cabozantinib, lenvatinib, regorafenib, axitinib, pazopanib, cabozantinib, tra Metinib (trametinib), dabrafenib (dabrafenib), abemaciclib (abemac
  • the immuno-cancer agent is not limited thereto, but may be an immune checkpoint inhibitor, an immune cell therapeutic agent (CAR-T), an antibody drug conjugate (ADC), a dual antibody, an anti-cancer virus, or an anti-cancer vaccine.
  • CAR-T immune cell therapeutic agent
  • ADC antibody drug conjugate
  • the checkpoint inhibitor may be a PD-1 antibody, a PD-L1 antibody, a CTLA-4 antibody, a TIM3 antibody, or a LAG3 antibody.
  • the PD-1 antibody may be pembrolizumab, nivolumab, or cemiplimab
  • the PD-L1 antibody is atezolizumab, avelumab, or durvallu. It may be durvalumab, but is not limited thereto.
  • the CTLA-4 antibody may be ipilimumab or tremelimumab
  • the TIM3 antibody may be MBG452
  • the LAG3 antibody may be BMS-986016 or LAG525, but is not limited thereto.
  • the immune cell therapeutic agent may be tisagenlecleucel or axicabtagene ciloleucel, but is not limited thereto.
  • the ADC is gemtuzumab-ozogamicin, brentuximab vedotin, trastuzumab emtansine, inotuzumab ozogamicin, eribulin mesylate ( eribulin mesylate), but is not limited thereto.
  • the double antibody may be blinatumomab
  • the anticancer virus may be talimogene laherparepvec
  • the anticancer vaccine may be sipuleucel-T,
  • the present invention is not limited thereto.
  • the anticancer agent may be an anticancer agent for lung cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or may be administered in combination with other therapeutic agents, and may be administered simultaneously, separately or sequentially with a conventional anticancer agent. and may be administered single or multiple. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the present invention provides a method for treating lung cancer using the above ferritin protein. All of the above descriptions regarding the ferritin protein apply as it is to the ferritin protein as an active ingredient in the cancer treatment method of the present application.
  • the treatment method of the present invention comprises administering the ferritin protein of the present invention to a subject suffering from lung cancer.
  • the individual suffering from lung cancer may be an animal suffering from lung cancer, specifically, a mammal suffering from lung cancer, and more specifically, a human suffering from lung cancer.
  • the protein may be administered in a therapeutically effective amount.
  • the term "administration” means introducing the composition of the present invention to a patient by any suitable method, and the administration route of the composition of the present invention is through various routes, either oral or parenteral, as long as it can reach the target tissue. may be administered.
  • Intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration or rectal administration may be administered, but is not limited thereto.
  • the method of the present invention may further comprise administering an anticancer agent to the subject.
  • any substance having anticancer activity may be used without limitation, for example, the anticancer agent exemplified above may be used.
  • the anticancer agent may be administered simultaneously, separately or sequentially with the ferritin protein.
  • huHF is a globular protein nanoparticle (12 nm) composed of 24 monomers, each of which is composed of a total of 5 ⁇ -helix.
  • the present inventors induce mutations in the amino acid sequence that binds to the transferrin receptor of the huHF monomer through gene cloning, so that huHF_Mutant1 (Q15A, D16A, R23A, F82A, Q84A), huHF_Mutant2 (Q15A, D16A, R23A, F82A, Q84A, E117A, K120A, D124A) were obtained.
  • the antibody CDR3 peptide and domain were inserted through gene cloning into the loop between the ⁇ -helix of huHF_Mutant1 and 2 (BC loop in huHF 5T to 176G; 92D/93W based on the PDB 3AJO sequence; 92D/93W) and the C-terminus to secure the delivery system. .
  • E. coli strain BL21 [(fhuA2 [lon] ompT gal [dcm] ⁇ hsdS)] was transformed with the expression vector prepared above, respectively, and kanamycin-resistant transformants were selected.
  • Transformed E. coli was cultured in flasks (250 mL Erlenmeyer flasks, 37 °C, 150 rpm) containing 50 mL of Luria-Bertani (LB) medium (containing 100 mg L-1 kanamycin). When the medium turbidity (OD 600) reached about 0.5-0.7, Isopropyl- ⁇ -Dthiogalactopyanosid (IPTG) (1.0 mM) was injected to induce expression of the recombinant gene.
  • LB Luria-Bertani
  • the cultured E. coli was centrifuged at 4,500 rpm for 10 minutes to recover the cell precipitate and suspended in 5 ml of a disruption solution (10 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, 10 mM EDTA). and crushed using an ultrasonic crusher (Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT, USA). After crushing, centrifugation was performed at 13,000 rpm for 10 minutes to separate the supernatant and insoluble aggregates. The separated supernatant was used for subsequent experiments.
  • the supernatant obtained in Example 2 was purified through a three-step process. First, 1) Ni 2+ -NTA affinity chromatography using the binding of histidine and nickel fused to the recombinant protein was performed, 2) the recombinant protein was concentrated and a fluorescent substance was attached through buffer exchange, and 3) finally fluorescence was performed. In order to separate only the self-assembled protein nanoparticles to which the material is attached, sucrose gradient ultracentrifugation was performed. The detailed description of each step is as follows.
  • E. coli cultured in the same manner as specified above was recovered, the cell pellet was resuspended in 5 mL lysis buffer (pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole), and a sonicator was used to disrupt cells.
  • the lysed cell solution was centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes to separate only the supernatant, and then each recombinant protein was separated using a Ni 2+ -NTA column (Qiagen, Hilden, Germany) (washing buffer: pH 8.0, 50 mM).
  • sodium phosphate, 300 mM NaCl, 80 mM imidazole / elution buffer pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 200 mM imidazole).
  • huHF_Native, huHF_Mutant1-h_smPD1, and huHF_Mutant1-dual particles were subjected to Ni2 +- NTA affinity chromatography, and 3 ml of the eluted recombinant protein was placed in an ultracentrifugal filter (Amicon Ultra 100K, Millipore, Billerica, MA) at 5,000 g on the column. Centrifugation was performed at 5,000 g until 1 ml of the solution remained. After that, in order to attach the fluorescent material FITC (fluorescein isothiocyanate), the protein particles were buffer exchanged with sodium bicarbonate (0.1 M, pH 8.5) buffer, and the fluorescent material was attached at room temperature for 12 hours.
  • FITC fluorescent material
  • sucrose solution for each concentration is placed in an ultraclear 13.2ml tube (Beckman) from the solution with the highest concentration.
  • ultra-high speed centrifugation was performed at 35,000 rpm at 4° C. for 16 hours (Ultracentrifuge L-90k, Beckman). After centrifugation, the upper layer (20-25% sucrose solution part) was carefully replaced with a pipette using an ultracentrifugal filter and PBS buffer as described in 2).
  • BL21 competent cells were transformed with various expression vectors based on pCM (Tac promoter).
  • a single colony was inoculated into LB liquid medium (50 mL) supplemented with 100 mg/L of kanamycin and cultured at 37° C. and 130 rpm in a shaking incubator.
  • the turbidity/optical density at 600 nm reached 0.5
  • the expression of the target protein was induced through administration of 1 mM IPTG.
  • the cells in the culture medium were spun-down through centrifugation (13000 rpm, 10 minutes), and the cell pellet was collected and resuspended in 10 mM Tris-Hcl (pH 7.4) buffer. .
  • Resuspended cells were ruptured using a Branson Sonifier (Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT). After sonication, the supernatant containing soluble protein and aggregates containing insoluble protein were separated by centrifugation (13000 rpm, 10 min). It was confirmed through SDS-PAGE analysis of the separated soluble and insoluble protein fractions ( FIGS. 2 and 3 ).
  • TEM transmission electron microscope
  • Example 3 The lung cancer cell targeting efficiencies of huHF_Native, huHF_Mutant1-h_smPD1, and huHF_Mutant1-dual proteins prepared in Example 3 to which the fluorescent material is attached were compared.
  • the fluorescence intensity was measured in LLC1 mouse lung cancer and A549 human lung cancer cells. After reacting the protein at a concentration of 1400 for 2 hours, the fluorescence signal was compared to confirm the lung cancer cell targeting efficiency ( FIGS. 4 and 5 ). It was confirmed that the antibody showed significantly higher targeting efficiency than the antibody.
  • huHF_Native huHF_Mutant1-h_smPD1, and huHF_Mutant1-dual proteins prepared in Example 3 against LLC1 mouse lung cancer and A549 human lung cancer
  • LLC1 mouse lung cancer and A549 human lung cancer cells were incubated with proteins at a certain concentration interval for 2 hours. After the reaction, the fluorescence antibody binding to the His tag of the protein was reacted for 1 hour, and the fluorescence signal was compared to confirm the targeting efficiency ( FIGS. 5 and 6 ).
  • the concentration of 50% cell fraction can be considered as Kd, and it was confirmed that it exhibited a 50-fold or more good targeting ability compared to the antibody (Table 4).
  • 11 is an evaluation/comparison of the binding force of huHF_mutant1-dual and huHF_mutant2-dual to hTfR. Referring to this, in the case of huHF_mutant2-dual, even when the concentration was increased to 10000 nM, it was not saturated, indicating that the binding force to hTfR was further reduced. can be checked If the expected saturation point is selected and the binding force Kd value is calculated, it will be about 4400 nM.
  • A549 a human lung cancer cell line, was labeled with CFSE, a fluorescent substance. 10 6 cells were reacted with CFSE at a concentration of 5 ⁇ M in an incubator at 37° C. for 20 minutes, washed with PBS, and cultured for one day by diluting 10 5 cells in 2 ml culture media in a 2 ml cell plate.
  • NK cells were labeled using an NK 1.1 antibody-PE antibody.
  • A549 a human lung cancer cell line, was labeled with CFSE, a fluorescent substance. 10 6 cells were reacted with CFSE at a concentration of 5 ⁇ M in an incubator at 37° C. for 20 minutes, washed with PBS, and cultured for one day by diluting 10 4 cells in 200 ⁇ l culture media in a 96 well plate.
  • the reaction solution was reacted in an incubator for 30 minutes, and then the ratio of cells exhibiting CFSE fluorescence and DAPI fluorescence was analyzed with FACS equipment (FIG. 14). Referring to this, it can be confirmed that the binding ability of NK cells to A549 cells is increased during huHF_mutant1-dual treatment.
  • NK cells were labeled with the NK 1.1 antibody-PE antibody.
  • reaction solution was reacted in an incubator for 48 hours, and the toxicity ability according to the sample was verified with FACS equipment. The degree of cell death was analyzed with 7-AAD.
  • the ratio of NK cells to cancer cells and the toxic ability of NK cells according to the sample were analyzed ( FIG. 15 ). Referring to this, it can be confirmed that the apoptosis ability of A549 cells of NK cells is increased during huHF_mutant1-dual treatment.
  • Tecentriq is a monoclonal antibody that binds to PD-1 or PD-L1 used for the treatment of lung cancer, etc.
  • mAb-mTIGIT is a monoclonal antibody that binds to murine TIGIT.
  • a tumor model was formed by subcutaneously transplanting LLC1 into C57BL/6 by 5*10 5 each.
  • the tumor size was measured and classified for each individual, and the same size was adjusted for each group.
  • the sample was intravenously injected through the caudal vein every 3 days, and the tumor size was measured for each individual to compare the tumor growth inhibition efficacy (FIG. 16).
  • FIG. 17 shows the tumor size by date in each experimental group, and FIG. 17 shows the tumor size on day 22 in each experimental group. Referring to this, in the case of huHF_mutant-dual, it can be confirmed that the effect is excellent because the tumor size is the smallest despite treatment with a smaller dose.
  • target cells immunodeficiency cells, cancer cells
  • the sample drug, antibody (anti-mouse PD-L1 antibody (BE0101), anti-mouse TIGIT antibody (BE0274), anti-human PD-L1 (BE0285))
  • the control group 100 ⁇ l of FACS buffer (0.1%BSA + 0.01% sodium azide in PBS) was treated (3hr, room temperature).
  • Fluorescence antibody (anti his tag antibody-PE(SC-8036PE), anti-IgG antibody-PE(PE goat F(ab')2 anti-rat (IgG) secondary antibody(ab7010), PE F(ab')2) -goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody (12-4010-82)) was treated (2 hr, room temperature).
  • a tumor model was formed by subcutaneously transplanting LLC1 into C57BL/6 by 5*10 5 each.
  • the sample was intravenously injected through the caudal vein every 3 days (in the case of the G2 group, every 6 days), and the tumor size was measured for each individual to compare the tumor growth inhibition efficacy (FIG. 22).
  • Ab-1 was injected at a concentration of 30 nmol/kg, huHF_mutant-dual was 30 nmol/kg, and Vac was 10 nmol/kg.
  • the huHF_mutant-dual treatment group has excellent tumor growth inhibition ability, and exhibits a more excellent effect when combined with a vaccine.
  • An expression vector for protein production was constructed in the same manner as in Example 1, except that the vector schematic diagrams in FIGS. 23 and 24 were used, and proteins were biosynthesized and purified by the methods described in Examples 2 and 3.
  • the huHF structure is smoothly formed even when a foreign peptide is inserted (fusion) in the middle of the D helix and in the middle of the E helix as well as the loop between the A-E helix of huHF.
  • BL21 (DE3) competent cells were transformed with various pT7-7-based expression vectors.
  • a single colony was inoculated in LB liquid medium (50 mL) to which 100 mg/L of ampicillin was added and cultured at 37°C and 130 rpm in a shaking incubator.
  • the turbidity/optical density at 600 nm reached 0.5
  • the expression of the target protein was induced through administration of 1 mM IPTG.
  • the cells in the culture medium were spun-down through centrifugation (13000 rpm, 10 minutes), and the cell pellet was collected and resuspended in 10 mM Tris-Hcl (pH 7.4) buffer. .
  • Resuspended cells were ruptured using a Branson Sonifier (Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT). After sonication, the supernatant containing soluble protein and aggregates containing insoluble protein were separated by centrifugation (13000 rpm, 10 min). Solubility was analyzed by SDS-PAGE analysis of the separated soluble and insoluble protein fractions. That is, the target protein bands stained with Coomassie were scanned with a densitometer (Duoscan T1200, Bio-Rad, Hercules, CA) to quantify the proportion of soluble fractions. Specifically, using the scanned SDS-PAGE gel image, 'Quantity One' program 'Volume Rect. After setting the band thickness and background value with 'Tool', the sum of soluble and insoluble protein fractions was set to 100% using 'Volume Analysis Report' and solubility was quantified.

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Abstract

본 발명은 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합된 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 단백질은 외부 표면에 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합됨으로써 면역 관문 억제제로 사용될 수 있다.

Description

폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
현대에 들어 의학 기술이 발달하면서 치료가 불가능한 병은 거의 없어졌지만 암은 다른 질병 치료와는 달리 매우 힘들고 복잡한 치료가 요구되고 있다. 현재 암 치료에 사용되고 있는 방법은 크게 수술, 방사선 치료 및 화학적 치료가 있다. 암이 다른 부위로 전이되지 않고 국소적으로 발병한 경우, 암 제거 수술을 통해 암을 치료할 수 있다. 그러나 암 환자의 70% 이상에서 암 전이가 발생하기 때문에 보조적인 치료 요법이 병행되어야 한다.
상기 보조 치료 요법 중 하나로 고 에너지 방사선을 이용하여 암 세포를 죽이는 방사선 치료가 수행되는데, 상기 방사선 치료법은 암 세포에 방사선을 조사할 때 암 세포의 증식이 억제되어 새로운 암 세포가 생성되지 못하고 암 세포가 더 이상 분열하지 못하게 한다. 그러나 이 방법은 암 세포뿐만 아니라 정상 세포에도 영향을 끼친다는 부작용이 존재하는 문제점이 있다.
화학적 치료 요법은 수술 후에 약물을 사용하여 암 세포를 죽이는 보조 치료법으로 눈에 보이지 않는 암 세포를 죽이기 위한 목적으로 수행된다. 그러나 상기 화학적 치료 요법은 구토, 설사, 탈모 등의 부작용이 뒤따른다는 문제가 있다.
이러한 부작용들을 최소화하고자 최근 면역치료 방법이 대두되고 있다. 면역치료 방법은 환자의 면역 반응을 이용하여 암을 치료하는 방법으로서, 암의 예방까지도 꾀할 수 있다. 암 면역치료는 백신의 원리와 같이 종양 형성의 원인이 되는 항원을 투여하여 암에 특이적인 면역세포들을 활성화시킨 후, 활성화된 면역세포들이 체내에서 암을 특이적으로 공격하게 하는 치료 방법이다. 또한, 암에 걸리지 않았더라도 암에 특이적인 항원을 체내에 투여함으로써 비활성화의 면역세포를 암 특이적 기억 면역세포로 활성화하여 암이 발병되었을 때 암 세포를 특이적으로 공격할 수 있게 한다.
암 면역치료를 위해서는 면역세포들이 밀집되어 있는 림프절로 암 특이적 항원(종양 연관 항원(Tumor-associated antigen; TAA, 종양 특이 항원(Tumor-specific antigen; TSA))을 운반하는 것이 중요하다. 특히 종양 특이 항원 중, 폐암, 신장암과 같은 다양한 종양 타입에서 발견되지만 주로 폐암 및 흑색종에서 발견되는 신생항원(neo-antigen)은 암 환자 개인의 잠재적 유전자 활성 혹은 DNA 부분의 변이에 의해 새롭게 생성되는 항원으로서, 이 항원은 환자 개인의 유전정보를 바탕으로 '맞춤형 암 백신'을 제작하는데 있어 매우 중요하다.
그러나 암 특이적 항원 자체만을 림프절로 운반하려는 종래의 시도는 그다지 효과적이지 못했다. 종양 항원 자체만으로는 종양 항원의 길이가 다소 짧고, 종양 항원 특이 면역세포를 증폭 및 활성화하기 위한 종양 항원 제시 효율이 현저히 낮아 종양 항원 특이 면역 유도 효율도 현저히 낮았기 때문이다 (비특허문헌 1). 이러한 암 특이적 항원의 체내 운반체로서 고분자들이 많이 사용되고 있으며, 암 특이적 항원의 체내 운반을 위해 고분자의 표면에 암 항원을 고정시키는 경우, 입자 표면에 암 특이적 항원을 화학적 결합을 통해 노출시켜야 한다. 그러나, 입자 표면에 암 특이적 항원을 고밀도로 균일하게 노출시키는 부분에 있어서 아직까지 한계가 있는 실정이다.
암 면역 치료는 종래의 항암 치료방법과 비교하여 환자의 면역체계를 이용하기 때문에 부작용이 낮고, 면역 기억 형성으로 치료 효과가 장기간 지속될 수 있으며, 종양 항원 특이적 인식 원리에 의해 일반 세포에는 영향력이 낮아 부작용이 거의 없는 장점이 있다. 또한 최근 재발성 혹은 항암제 저항성을 갖는 암 환자들에 대한 임상 성공사례들로 인해 암 면역치료는 사이언스지(Science)가 Breakthrough of the year 2013으로 선정할 만큼 폭발적인 주목을 받고 있다.
또한, 면역관문인자인 PD-1(Programmed cell death protein 1)/PD-L1(PD1 ligand) 중화 항체 치료제의 경우, 흑색종 및 폐암에서 반응률 20-30% 이상의 임상결과를 도출하고 있어 향후 수년 내에 암 면역 치료는 암의 표준 치료로 임상 현장에 사용될 가능성이 높다. 그러나, 면역관문 인자인 PD1/PD-L1 또는 CTLA4 특이적인 면역 활성 억제 차단 항체들은 면역세포의 활성 자체를 근본적으로 증진시킬 수 없고, 항체의 긴 체내 잔류시간 및 항체의 Fc 도메인 부분 때문에 발생하는 자가면역질환 등의 부작용이 발생하며, 동물세포 시스템의 항체 제작 및 정제로 인한 고가의 생산 비용과 더불어 높은 소모량으로 인해 항체치료 비용이 높아 경제적 측면에서의 단점 또한 존재하는 실정이다.
본 발명은 면역 관문 분자에 결합할 수 있는 단백질을 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 위의 조성물을 사용하는 폐암의 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 외부 표면에 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합된 페리틴 단백질을 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 단백질은 상기 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합된 페리틴 단량체 24개가 자기 조립되어 이루어진 구형의 단백질일 수 있다.
면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체의 α-헬릭스 중 적어도 하나의 내부, 또는 인접한 α-헬릭스들 사이 중 적어도 하나에 융합될 수 있다.
면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.
면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체의 A 헬릭스, B 헬릭스, C 헬릭스, D 헬릭스 또는 E 헬릭스 내부에 융합될 수 있다.
면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체의 A-B루프, B-C루프, C-D루프 또는 D-E루프에 융합될 수 있다.
상기 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체의 N-말단과 A 헬릭스 사이 또는 E 헬릭스와 C-말단 사이에 융합될 수 있다.
상기 단백질은 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력이 떨어지도록 돌연 변이된 것일 수 있다.
상기 단백질은 서열번호 1의 서열에서 15번, 16번, 23번, 82번, 84번, 117번, 120번 또는 124번 아미노산이 알라닌, 글라이신, 발린 또는 류신으로 치환된 것일 수 있다.
상기 페리틴 단백질은 트랜스페린 수용체에 대한 결합력(K)이 다음 수학식 1을 만족할 수 있다:
[수학식 1]
K ≥10 nM
(식 중, K [P][T]/[PT]이고, 여기서 [P]는 페리틴 단백질과 트랜스페린 수용체와의 결합 반응의 평형 상태에서의 페리틴 단백질의 농도를 나타내고, [T]는 상기 평형 상태에서의 트랜스페린 수용체의 농도를 나타내며, [PT]는 상기 평형 상태에서의 페리틴 단백질과 트랜스페린 수용체의 복합체의 농도를 나타냄).
상기 트랜스페린 수용체에 대한 결합력은 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력일 수 있다.
상기 면역 관문 분자는 Her-2/neu, VISTA, 4-1BBL, Galectin-9, Adenosine A2a receptor, CD80, CD86, ICOS, ICOSL, BTLA, OX-40L, CD155, BCL2, MYC, PP2A, BRD1, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT, CBP, E2F1, MDM2, MDMX, PPP2CA, PPM1D, STAT3, IDH1, PD1, CTLA4, PD-L1, PD-L2, LAG3, TIM3, TIGIT, BTLA, SLAMF7, 4-1BB, OX-40, ICOS, GITR, ICAM-1, BAFFR, HVEM, LFA-1, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, LAIR1, 2B4, CD2, CD3, CD16, CD20, CD27, CD28, CD40L, CD48, CD52, EGFR family, AXL, CSF1R, DDR1, DDR2, EPH receptor family, FGFR family, VEGFR family, IGF1R, LTK, PDGFR family, RET, KIT, KRAS, NTRK1 및 NTRK2으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 상기 면역 관문 분자에 대해 결합력이 있는 리간드 또는 리간드의 단편, 수용체 또는 수용체의 단편, 항체 또는 항원 결합부위(CDR)를 포함하는 항체의 단편일 수 있다.
본 발명에서 페리틴은 인간 페리틴 중쇄일 수 있다.
상기 페리틴 단백질은 대장균 생산 시스템에서 40% 이상이 수용성 분획으로 존재할 수 있다.
본 발명의 단백질은 면역 관문 분자에 대한 결합력이 우수하다.
본 발명의 단백질은 면역 관문 분자가 T 세포를 불활성화시키지 못하도록 함으로써 T세포가 암세포를 사멸할 수 있도록 한다.
본 발명의 단백질은 다양한 면역 관문 분자에 결합하는 분자를 융합할 수 있다.
본 발명의 단백질은 다양한 면역 관문 분자에 결합 가능하다.
본 발명의 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 항암 효능이 우수하다.
도 1은 wild type(native) 인간 페리틴 중쇄(huHF) 및 mutant 인간 페리틴 중쇄 단백질을 제조하는 기본 벡터의 모식도이다.
도 2는 huHF_Mutant1-dual을 제조하는 벡터의 모식도 및 그 페리틴 단백질의 제조를 확인할 수 있는 도면이다.
도 3은 huHF_Mutant1-h_smPD1을 제조하는 벡터의 모식도 및 그 페리틴 단백질의 제조를 확인할 수 있는 도면이다.
도 4는 페리틴 단백질의 마우스 폐암 세포주 LLC1에 대한 표적능 평가 결과이다.
도 5는 페리틴 단백질의 인간 폐암 세포주 A549에 대한 표적능 평가 결과이다.
도 6은 페리틴 단백질의 마우스 폐암 세포주 LLC1에 대한 표적능 평가 결과이다.
도 7은 페리틴 단백질의 인간 폐암 세포주 A549에 대한 표적능 평가 결과이다.
도 8 및 9는 각각 huHF_native-h_smPD1, huHF_Mutant1-h_smPD1의 인간 transferrin receptor에 대한 결합력 평가 결과이다.
도 10은 huHF_Mutant1-dual의 인간 transferrin receptor에 대한 결합력 평가 결과이다.
도 11은 huHF_Mutant1-dual, huHF_Mutant2-dual의 인간 transferrin receptor에 대한 결합력 평가 결과이다.
도 12는 huHF_mutant1-dual 처리에 따른 NK 세포와 암 세포 간의 결합능 평가 결과이다.
도 13 및 14는 huHF_mutant1-dual 처리에 따른 NK 세포와 암 세포 간의 결합능력 평가 결과이다.
도 15는 huHF_mutant1-dual 처리에 따른 NK 세포의 암세포 사멸능 평가 결과이다.
도 16은 LLC1 폐암 동물 모델 제조 및 종양 억제 실험 개요도이다.
도 17 및 18은 huHF_mutant1-dual 처리에 따른 종양 성장 억제 평가 결과이다.
도 19 내지 21은 huHF_mutant1-dual의 폐암 세포주 A549에 대한 avidity 평가 결과이다.
도 22는 huHF_mutant1-dual 또는 이와 항암제의 병용시의 LLC1 폐암 동물 모델에서의 종양 성장 억제 평가 결과이다.
도 23 및 24는 헬릭스 내부에 외래 펩타이드가 융합된 페리틴 단백질을 제조하는 벡터의 모식도 및 단백질 생산 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 외부 표면에 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합된 페리틴 단백질을 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
페리틴(Ferritin)은 인간, 동물 및 미생물 유래의 페리틴일 수 있다.
인간 페리틴은 중쇄(heavy chain, 21 kDa)와 경쇄(light chain, 19 kDa)로 구성되며, 상기 페리틴을 이루고 있는 단량체의 자가조립 능력을 통해 구형의 나노입자를 형성하는 특성을 나타낸다. 페리틴은 24개의 단량체가 모여 구 형상의 입체 구조를 갖는 자기조립체를 형성할 수 있다.
인간 페리틴의 경우 외경은 약 12 nm이고 내경은 약 8 nm이다. 페리틴 단량체의 구조는 5개의 α-헬릭스 구조, 즉 A 헬릭스, B 헬릭스, C 헬릭스, D 헬릭스 및 E 헬릭스가 순차적으로 연결된 형태이며, 루프(loop)라 불리는 각각의 α-헬릭스 구조의 폴리펩타이드를 연결하는 비정형 폴리펩타이드 부분을 포함한다.
루프는 페리틴에 펩타이드 또는 작은 단백질 항원 등이 삽입되더라도 구조적으로 망가지지 않는 지역(region)이다. 여기에 펩타이드를 클로닝을 이용하여 융합시킴으로써 페리틴의 단량체에 에피토프 등의 펩타이드가 위치한 펩타이드-페리틴 융합 단백질 단량체를 제조할 수 있다. A 헬릭스와 B 헬릭스를 연결하는 루프를 A-B루프, B 헬릭스와 C 헬릭스를 연결하는 루프를 B-C루프, C 헬릭스와 D 헬릭스를 연결하는 루프를 C-D루프, D 헬릭스와 E 헬릭스를 연결하는 루프를 D-E루프라 한다.
페리틴의 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank Accession No. NM_000146, NM_002032 등).
페리틴은 페리틴 중쇄일 수 있으며, 구체적으로, 인간 페리틴 중쇄일 수 있다. 인간 페리틴 중쇄는 사람으로부터 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질일 수 있으며, 본 명세서에서 상기 페리틴 은 '인간 페리틴 중쇄' 또는 'huHF'와 혼용되어 사용될 수 있다.
페리틴 단백질은 페리틴 단량체일 수 있다. 이에, 페리틴 중쇄 단량체일 수 있고, 인간 페리틴 중쇄 단량체일 수 있다.
페리틴은 그 단량체 수 개가 자기 조립되어 조직적인 구조 또는 패턴을 형성한다. 본 발명의 페리틴 단백질은 나노 스케일의 입자이다. 예컨대 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합된 페리틴 단량체 24개가 자기 조립되어 페리틴 단백질을 형성할 수 있다.
페리틴 단백질은 구형일 수 있다. 구형인 경우 예컨대 그 입경이 8 내지 50nm일 수 있다. 보다 구체적으로, 8nm 내지 50nm, 8nm 내지 45nm, 8nm 내지 40nm, 8 nm 내지 35nm, 8nm 내지 30nm, 8nm 내지 25nm, 8nm 내지 20nm, 8nm 내지 15nm일 수 있다.
페리틴 단백질은 외부 표면에 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합된 것이다. 페리틴 단백질의 외부 표면에 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합되어 있기만 하면 페리틴 단백질을 이루는 모든 페리틴 단량체에 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합되어 있을 필요는 없다.
예컨대 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합된 페리틴 단량체 24개가 자기 조립되어 페리틴 단백질을 형성할 때, 24개의 페리틴 단량체 중 적어도 1개의 페리틴 단량체에 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합되어 있으면 된다. 페리틴 단백질 외부 표면의 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자의 밀도를 높이기 위해 24개의 페리틴 단량체 모두에 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자를 융합시킬 수 있다.
페리틴 단백질을 이루는 각 페리틴 단량체에는 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 1종 또는 2종 이상 융합될 수 있다. 페리틴 단백질을 이루는 각 페리틴 단량체는 서로 다른 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합되어 있을 수 있다. 페리틴 단백질을 이루는 각 페리틴 단량체는 동일 면역 관문 분자와 결합 가능한 서로 다른 분자가 융합되어 있을 수 있다.
면역 관문 분자(Immune checkpoint molecule)는 T세포에 결합하여 T세포를 불활성화시키는 역할을 한다. 이러한 면역 관문 분자는 예를 들면 Her-2/neu, VISTA, 4-1BBL, Galectin-9, Adenosine A2a receptor, CD80, CD86, ICOS, ICOSL, BTLA, OX-40L, CD155, BCL2, MYC, PP2A, BRD1, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT, CBP, E2F1, MDM2, MDMX, PPP2CA, PPM1D, STAT3, IDH1, PD1, CTLA4, PD-L1, PD-L2, LAG3, TIM3, TIGIT, BTLA, SLAMF7, 4-1BB, OX-40, ICOS, GITR, ICAM-1, BAFFR, HVEM, LFA-1, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, LAIR1, 2B4, CD2, CD3, CD16, CD20, CD27, CD28, CD40L, CD48, CD52, EGFR family, AXL, CSF1R, DDR1, DDR2, EPH receptor family, FGFR family, VEGFR family, IGF1R, LTK, PDGFR family, RET, KIT, KRAS, NTRK1, NTRK2 등일 수 있다.
면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 면역 관문 분자에 대해 결합력이 있는 리간드 또는 리간드의 단편, 수용체 또는 수용체의 단편, 항체 또는 항원 결합부위(CDR)를 포함하는 항체의 단편일 수 있다.
면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단백질의 외부 표면에 노출될 수 있다면 페리틴 단량체 어느 곳에 융합되어도 괜찮다. 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체가 자기 조립되는데 방해가 되지 않는 위치에 융합된다.
면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 페리틴 단량체 내부에 융합되어 페리틴 단백질의 구조가 바뀔 수 있다. 페리틴 단량체의 각 구성 부분 중 내부로 함입되어 있는 부분이 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자의 융합에 의해 외부로 돌출될 수 있고, 반대로 페리틴 단량체의 각 구성 부분 중 외부로 돌출되어 있던 부분이 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자의 융합에 의해 내부로 함입되게 될 수 있다.
면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단백질이 인간 트랜스페린 수용체와의 결합력을 떨어뜨리거나 인간 트랜스페린 수용체와의 결합력에 방해가 되는 위치에 융합되는 것이 바람직하다.
면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 그 구조, 분자량 및 아미노산 길이가 특정한 범위의 것으로 한정되지 않는다.
면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 예컨대 그 아미노산 길이가 25aa 이하인 리간드, 항체 또는 이들의 단편일 수 있다. 보다 구체적으로 아미노산의 길이가 25aa 이하, 24aa 이하, 23aa 이하, 22aa 이하, 21aa 이하, 20aa 이하, 19aa 이하, 18aa 이하, 17aa 이하, 16aa 이하, 15aa 이하, 14aa 이하, 13aa 이하, 12aa 이하, 11aa 이하, 10aa 이하, 9aa 이하, 8aa 이하, 7aa 이하, 6aa 이하, 5aa 이하일 수 있다. 또한 예컨대 그 아미노산의 길이가 3aa 이상, 4aa 이상, 5aa 이상, 6aa 이상, 7aa 이상, 8aa 이상, 9aa 이상, 10aa 이상일 수 있다.
면역 관문 분자와 결합 가능한 분자의 융합 위치는 특정한 위치로 제한되지 않으며, 예컨대 페리틴 단량체의 α-헬릭스 내부(A 헬릭스, B 헬릭스, C 헬릭스, D 헬릭스, 또는 E 헬릭스), 인접한 α-헬릭스들 사이, N-말단, C-말단, A-B루프, B-C루프, C-D루프, D-E루프, N-말단과 A 헬릭스 사이, E 헬릭스와 C-말단 사이, 헬릭스 내부 등에 융합될 수 있다.
또한, 본 발명의 단백질은 페리틴 단량체의 α-헬릭스 내부(A 헬릭스, B 헬릭스, C 헬릭스, D 헬릭스, 또는 E 헬릭스), 인접한 α-헬릭스들 사이, N-말단, C-말단, A-B루프, B-C루프, C-D루프, D-E루프, N-말단과 A 헬릭스 사이, E 헬릭스와 C-말단 사이, 헬릭스 내부 등에 융합된 외래 펩타이드를 더 포함할 수 있다. 외래 펩타이드는 약리 활성 펩타이드 일 수 있다.
페리틴 단백질은 면역 관문 분자와 결합하도록 설계되어 있으므로 트랜스페린 수용체에 대해서는 잘 결합하지 않는 것이 바람직하다. 예컨대 페리틴 단백질은 트랜스페린 수용체에 대하여 다음 수학식 1을 만족한다:
[수학식 1]
K ≥10nM
(식 중, K [P][T]/[PT]이고, 여기서 [P]는 페리틴 단백질과 트랜스페린 수용체와의 결합 반응의 평형 상태에서의 페리틴 단백질의 농도를 나타내고, [T]는 상기 평형 상태에서의 트랜스페린 수용체의 농도를 나타내며, [PT]는 상기 평형 상태에서의 페리틴 단백질과 트랜스페린 수용체의 복합체의 농도를 나타냄).
상기 결합력은 예를 들면 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력일 수 있다.
수학식 1의 K 값이 10nM 이상, 20nM 이상, 30nM 이상, 40nM 이상, 50nM 이상, 60nM 이상, 70nM 이상, 80nM 이상, 90nM 이상, 100nM 이상, 110nM 이상, 120nM 이상, 125nM 이상, 125nM 초과, 150nM 이상, 200nM 이상, 210nM 이상, 220nM 이상, 230nM 이상, 240nM 이상, 250nM 이상, 260nM 이상, 270nM 이상, 280nM 이상, 290nM 이상, 300nM 이상, 350nM 이상, 400nM 이상, 450nM 이상, 500nM 이상, 550nM 이상, 600nM 이상, 700nM 이상, 800nM 이상, 900nM 이상, 1000nM 이상이다. 수학식 1의 K값이 클수록 트랜스페린 수용체에 대한 결합력이 떨어지는 것이다. 그 상한은 예를 들면 100000nM, 90000nM, 80000nM, 70000nM, 60000nM, 50000nM, 10000nM, 9000nM, 8000nM, 7000nM, 6000nM, 5000nM 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
트랜스페린 수용체에 대한 결합력(K)은 본 발명의 페리틴 단백질(A)과 트랜스페린 수용체와의 결합 반응의 평형 상태에서 측정된다. 평형 상태에서의 페리틴 단백질의 농도([P]), 트랜스페린 수용체의 농도([T]) 및 본 발명의 단백질과 트랜스페린 수용체의 복합체의 농도([PT])는 공지된 다양한 방법으로 측정될 수 있다.
페리틴 단백질은 트랜스페린 수용체에 대한 결합력을 낮추기 위해 트랜스페린 수용체와의 결합에 관여하는 부위에 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자를 융합시킬 수 있다. 예컨대 본 발명의 페리틴 단백질의 B-C루프 및 A 헬릭스 부분에 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 위치하도록 상기 분자를 융합시킬 수 있다.
페리틴 단백질는 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력이 떨어지도록 돌연 변이된 것일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 서열에서 15번, 16번, 23번, 82번, 84번, 117번, 120번 또는 124번 아미노산이 알라닌, 글라이신, 발린 또는 류신으로 치환된 것일 수 있다.
페리틴 단백질은 해당 단백질을 코딩하는 서열을 발현하는 미생물 내에서 제조되는 것일 수 있다.
미생물은 당 분야에 공지된 미생물이 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면 대장균일 수 있고, 구체적으로는 BL21(DE3)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
미생물 시스템으로 단백질을 제조하는 경우에 얻어지는 단백질이 세포질에 용해된 상태로 존재해야 분리/정제가 용이하다. 많은 경우 제조된 단백질이 봉입체(inclusion body) 등으로 응집된 상태로 존재한다. 본 발명의 페리틴 단백질은 미생물 생산 시스템에서 세포질에 용해된 비율이 높게 나타난다. 분리/정제 및 활용이 용이하다.
페리틴 단백질은 예를 들면 이를 제조하는 대장균 시스템에서 전체 단백질 중 수용성 분획비율이 40% 이상인 상태로 제조될 수 있다. 구체적으로, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상일 수 있다. 그 상한은 예를 들면 100%, 99%, 98%, 97%, 96% 등일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에서의 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여, 조직 또는 장기에 주입하기에 적합한 주사제의 형태로 제형화할 수 있다. 또한, 등장성 멸균 용액, 또는 경우에 따라 멸균수나 생리 식염수를 첨가하여 주사 가능한 용액이 될 수 있는 건조 제제(특히 동결 건조제제)로 제형화할 수도 있다. 또한, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 또는 활택제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 약학 조성물은 주사 제형일 수 있으며, 정맥내 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "유효량"은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나, 전적으로 증진시키는데 필요한 양을 의미한다.
본 발명에서 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 약학 조성물의 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다.
본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 약학적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적인 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 필요에 따라 약물의 제조, 사용 및 판매를 관장하는 정부 기관에 의해 지시된 형태로 포장과 연계된 지시서가 수반될 수 있으며, 상기 지시서는 조성물의 형태 또는 인간이나 동물 투여에 관하여 사익 기관의 승인을 나타내고 있고, 예를 들어, 약물의 처방에 대하여 미국 식품의약국에서 승인된 표지일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 항암제를 더 포함하거나, 항암제와 병용투여될 수 있다.
항암제는 항암 활성을 갖는 모든 물질이 제한 없이 사용될 수 있으며, 공지된 항암제도 사용 가능하다.
예를 들어, 항암제는 화학항암제, 표적항암제, 또는 면역항암제일 수 있다.
화학항암제는 이에 한정되지는 않으나, 알킬화제(alkylating agent), 미세소관 억제제(microtuble inhibitor), 대사길항제(antimetbolite), 또는 토포이소머라아제 억제제(topoisomerase inhibitor)일 수 있다.
상기 알킬화제는 메클로르에타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로람부실(chlorambucil), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 프로카바진(procarbazine), 부설판(busulfan), 스트렙토조신(streptozocin), 카르무스틴(carmustine), 이오무스틴(iomustine), 다카바진(dacarbazine), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 미소세관 억제제는 도세탁셀(docetaxel), 빈블라스틴(vinblastine), 온코빈(Oncovin), 비노렐빈(vinorelbine)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 대사길항제는 플루오로유라실(fluorouracil), 카페시타빈(capecitabine), 시타라빈(cytarabine), 젬시타빈(gemcitabine), 플루다라빈(fludarabine), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉시드(Pemetrexed), 메르캅토퓨린(mercaptopurine)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 토포이소머라아제 억제제는 하이캄틴(hycamtin), 캠토사(camptosar), 베페시드(vepesid), 탁솔(taxol), 블레오마이신(bleomycin), 아드리아마이신(adriamycin), 세루비딘(cerubidine)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
표적항암제는 이에 한정되지는 않으나, 트라스투주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab), 파니투무맙(panitumumab), 세툭시맙(cetuximab), 베바시주맙(bevacizumab), 라무시루맙(ramucirumab), 애플리버셉트(aflibercept), 리툭시맙(rituximab), 오비누투주맙(obinutuzumab), 다라투무맙(daratumumab), 데노수맙(denosumab), 이브루티닙(ibrutinib), 다사티닙(dasatinib), 닐로티닙(nilotinib), 이마티닙(imatinib), 보수티닙(bosutinib), 오시머티닙(osimertinib), 엘로티닙(erlotinib), 제피티닙(gefitinib), 닌테다닙(nintedanib), 수니티닙(sunitinib), 소라페닙(sorafenib), 카보잔티닙(cabozantinib), 렌바티닙(lenvatinib), 레고라페닙(regorafenib), 액시티닙(axitinib), 파조파닙(pazopanib), 카보잔티닙(cabozantinib), 트라메티닙(trametinib), 다브라페닙(dabrafenib), 아베마시클립(abemaciclib), 팔보시클립(palbociclib), 레날리도마이드(lenalidomide), 록소리티닙(ruxolitinib), 알렉티닙(alectinib), 크리조티닙(crizotinib), 올라파립(olaparib) 또는 베네토클락스(venetoclax)일 수 있다.
면역항암제는 이에 한정되지는 않으나, 면역관문억제제, 면역세포 치료제(CAR-T), ADC(antibody drug conjugate), 이중항체, 항암 바이러스, 또는 항암백신일 수 있다.
상기 면역관문억제제는 PD-1 항체, PD-L1 항체, CTLA-4 항체, TIM3 항체 또는 LAG3 항체일 수 있다. 상기 PD-1 항체는 펨브로리주맙(pembrolizumab), 니볼루맙(nivolumab), 세미플리맙(cemiplimab)일 수 있고, 상기 PD-L1 항체는 아테졸리주맙(atezolizumab), 아벨루맙(avelumab), 더발루맙(durvalumab)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 CTLA-4 항체는 이필리무맙(ipilimumab), 트레멜리무맙(tremelimumab)일 수 있고, 상기 TIM3 항체는 MBG452일 수 있으며, LAG3 항체는 BMS-986016, LAG525일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 면역세포 치료제는 티사젠렉류셀(tisagenlecleucel), 애시카브타겐실루셀(axicabtagene ciloleucel)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 ADC는 젬투주맙 오조가미신(gemtuzumab-ozogamicin), 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 트라스투주맙 엠탄신(trastuzumab emtansine), 이노츠맵 오조감신(inotuzumab ozogamicin), 에리불린 메실산염(eribulin mesylate)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 이중항체는 블리나투모맙(blinatumomab)일 수 있고, 상기 항암 바이러스는 탈리모진 라헤르파렙벡(talimogene laherparepvec)일 수 있으며, 상기 항암백신은 시풀루셀-T(sipuleucel-T)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
항암제는 폐암에 대한 항암제일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 항암제와 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 용어 "동시에(simultaneously)"는 달리 특정하지 않는 한, 동시에 발생하거나 수행됨을 의미하며, 용어 "별도로(separately)"는 달리 특정하지 않는 한, 서로 떨어지게 유지되는 것을 의미한다. 또한, 용어 ""순차적으로(sequentially)"는 달리 특정하지 않는 한, 규칙적인 시퀀스 또는 순서에 의해 특징됨을 의미하며, 순차적 투약 요법은 사간 추출물을 포함한 조성물의 투여 전, 동시, 또는 후에 항암제를 포함한 조성물의 투여를 포함할 수 있지만, 두 조성물 모두는 규칙적인 시퀀스 또는 순서로 투여될 것이다. 순차적 투여는 본 발명에 기술된 조성물들의 일시적으로 분리된 투여를 지칭한다.
본 발명은 이상의 페리틴 단백질을 사용하는 폐암의 치료 방법을 제공한다. 이상의 페리틴 단백질에 관하여 설명된 사항은 모두 본원의 암 치료 방법의 유효성분으로서의 페리틴 단백질에 그대로 적용된다.
본 발명의 치료 방법은 폐암에 걸린 대상에 본원의 페리틴 단백질을 투여하는 단계를 포함한다.
폐암에 걸린 개체는 폐암에 걸린 동물, 구체적으로 폐암에 걸린 포유류일 수 있고, 보다 구체적으로는 폐암에 걸린 인간일 수 있다.
단백질은 치료상 유효량으로 투여될 수 있다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 또는 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 상기 개체에 항암제를 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다.
항암제로는 항암 활성을 갖는 모든 물질에 제한 없이 사용될 수 있고, 예를 들면 앞서 예시한 항암제를 사용할 수 있다.
항암제는 상기 페리틴 단백질과 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
1. 단백질 제조용 발현 벡터 구성
huHF는 24개의 단량체로 구성된 구형 단백질 나노입자(12 nm)로서 각 단량체는 총 5개의 α-helix로 구성되어 있다. 본 발명자는 유전자 클로닝을 통해 huHF 단량체의 transferrin receptor와 결합하는 아미노산 서열에 돌연변이를 유도하여 표 1의 huHF_Mutant1(Q15A, D16A, R23A, F82A, Q84A), huHF_Mutant2(Q15A, D16A, R23A, F82A, Q84A, E117A, K120A, D124A)를 확보하였다. huHF_Mutant1 및 2의 α-helix 사이 loop(PDB 3AJO sequence 기준 huHF 5T 내지 176G 중 BC loop; 92D/93W)와 C-말단 중 선택된 위치에 항체 CDR3 펩타이드 및 도메인을 유전자 클로닝을 통해 삽입하여 전달체를 확보하였다.
하기 표 2의 서열을 사용하였고, 하기 도 1 내지 3, 표 3의 벡터 모식도에 따라 PCR을 수행하여 huHF_Mutant1-dual (BC loops, C-말단), huHF_Mutant2-dual (BC loops, C-말단), huHF_Mutant1-h_smPD1 (C-말단)를 제조하였다. 제작된 모든 플라즈미드 발현 벡터는 아가로스 젤에서 정제한 다음, 완전한 DNA 시퀀싱을 통해 서열을 확인하였다.
명칭 서열번호
huHF_Native 1
huHF-Mutant1 2
huHF-Mutant2 3
명칭 서열번호
huHF-αPD-L1 4
huHF αTIGIT 5
huHF-h_smPD1 6
Linker1 7
Linker2 8
Linker3 9
단백질 발현 벡터
huHF_Native NH2-NdeI-huHF-αPD-L1 HCDR3-HindIII-COOH
huHF_Mutant1-dual BC(92D/93W): NH2-NdeI-huHF_Mutant1-[αPD-L1 HCDR3]- huHF_Mutant1- αTIGIT HCDR3-HindIII-COOH
huHF_Mutant2-dual BC(92D/93W): NH2-NdeI-huHF_Mutant2-[αPD-L1 HCDR3]-huHF- αTIGIT HCDR3-HindIII-COOH
huHF_Mutant1-h_smPD1 NH2-NdeI-huHF_Mutant1-Linker2-h_smPD1-HindIII-COOH
2. 단백질의 생합성
대장균 균주 BL21[(fhuA2 [lon] ompT gal [dcm] △hsdS)]를 상기 제조된 발현벡터로 각각 형질 전환하고, 카나마이신-저항성 형질 전환체를 선택하였다. 형질 전환된 대장균을 50 mL의 Luria-Bertani (LB) 배지(100 mg L-1카나마이신 함유)를 함유하는 플라스크(250 mL Erlenmeyer flasks, 37 ℃, 150 rpm)에서 배양하였다. 배지 탁도(O.D 600)가 약 0.5-0.7에 도달할 때, IPTG (Isopropyl-β-Dthiogalactopyranosid) (1.0 mM)을 주입하여 재조합 유전자의 발현을 유도하였다.
20 ℃에서 16~18 시간 배양한 후, 배양한 대장균을 4,500 rpm으로 10분간 원심 분리하여 균체 침전물을 회수하고 5 ㎖의 파쇄 용액(10 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5, 10 mM EDTA)에 현탁하여 초음파 파쇄기(Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT, USA)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄한 후 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다. 분리된 상등액을 추후 실험에 이용하였다.
3. 단백질의 정제
상기 실시예 2에서 획득한 상등액을 3단계의 과정을 거쳐 정제하였다. 먼저 1) 재조합 단백질에 융합된 히스티딘과 니켈의 결합을 이용한 Ni2+-NTA affinity 크로마토그래피를 진행한 후, 2) 재조합 단백질을 농축하고 버퍼 교환을 통하여 형광물질을 부착하였으며, 3) 마지막으로 형광물질이 부착된 자가 조립된 단백질 나노입자만을 분리하기 위하여 수크로스 구배 초원심분리(ultracentifugation)를 진행하였다. 각 단계별 상세한 기재는 아래와 같다.
1) Ni2+-NTA affinity 크로마토그래피
재조합 단백질을 정제하기 위하여 상기 명시된 동일한 방법으로 배양된 대장균을 회수하여 그 세포 펠렛을 5 mL 라이시스 버퍼(pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole)에 재부유하고 초음파 파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포액을 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 그 상등액만 분리한 후 각 재조합 단백질을 Ni2+-NTA 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 각각 분리하였다 (세척 버퍼: pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 80 mM imidazole / 용출 버퍼: pH 8.0, 50 mM sodium phosphate, 300mM NaCl, 200 mM imidazole).
2) 농축과 버퍼교환 및 형광물질 부착과정
FACS를 위하여 huHF_Native, huHF_Mutant1-h_smPD1, huHF_Mutant1-dual 입자는 Ni2+-NTA affinity 크로마토그래피를 거쳐 용출된 3ml의 재조합 단백질을 Ultracentrifugal filter (Amicon Ultra 100K, Millipore, Billerica, MA) 에 담아 5,000 g로 컬럼 위에 1ml 의 용액이 남을 때까지 5,000 g 로 원심 분리를 진행하였다. 그 후에 형광 물질인 FITC(플루오레세인이소티오시안산염)를 부착하기 위하여 단백질 입자를 sodium bicarbonate (0.1 M, pH 8.5) 버퍼로 버퍼교환을 해주었고, 상온에서 12시간 형광물질을 부착하였다.
3) 수크로스 구배 초고속 원심 분리
PBS(2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, 2 mM KH2PO4, 10mM Na2HPO4, pH7.4) 버퍼에 수크로스를 농도별로 각각 첨가하여 40%, 35%, 30%, 25%, 20%의 수크로스를 포함하는 용액을 각각 준비한 후 초고속 원심 분리용 튜브 (ultraclear 13.2ml tube, Beckman)에 각 농도별 (40~20%) 수크로스 용액을 농도가 높은 용액부터 2 ml씩 담은 다음, 준비된 자가조립용 버퍼에 존재하는 재조합 단백질 용액을 1ml 채운 후 35,000rpm으로 16시간 동안 4℃로 초고속 원심 분리를 시행하였다(Ultracentrifuge L-90k, Beckman). 원심 분리 후 조심스럽게 파이펫을 이용하여 위 층 (20-25% 수크로스 용액 부분)을 2)에 명시된 바와 같이 ultracentrifugal filter와 PBS 버퍼를 이용하여 재조합 단백질의 버퍼를 교체해 주었다.
4. 단백질의 수용성 분획 확인
pCM(Tac promoter) 기반 각종 발현 벡터를 BL21 competent cell을 형질전환 (transformation)시켰다. 단일 콜로니를 카나마이신 100 mg/L이 첨가된 LB 액체 배지(50 mL)에 접종하여 진탕 배양기 (shaking incubator)에서 37℃, 130 rpm의 조건에서 배양하였다. 탁도(turbidity/optical density at 600 nm)가 0.5에 도달하면, IPTG 1 mM 투여를 통해 타겟 단백질의 발현을 유도하였다. 이후 20℃에서 12~16 시간 배양 후, 배양액 속의 세포들은 원심분리(13000 rpm, 10 분)을 통하여 spun-down되고, 세포 펠릿을 수거하여 10 mM Tris-Hcl (pH 7.4) 버퍼에 재부유시켰다. 재부유된 세포들은 Branson Sonifier (Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT)를 이용하여 파열되었다. 음파처리 후, 용해성 단백질을 포함한 상층액과 불용성 단백질을 포함한 응집체들은 원심분리(13000 rpm, 10 분)로 분리되었다. 분리된 용해성, 불용성 단백질 분획의 SDS-PAGE 분석을 통해 확인하였다(도 2, 도 3).
5. 단백질의 조립 검증
실시예 3에서 제작한 각각의 단백질의 정제된 재조합 단백질 나노입자의 구조 분석을 위하여 투과전자현미경 (TEM) 재조합 단백질을 촬영하였다. 먼저 염색하지 않은 정제한 단백질 샘플을 탄소 코팅된 구리 전자 현미경 그리드(grids) 올린 후 자연 건조하였다. 단백질의 염색된 이미지를 얻기 위해, 자연 건조된 샘플을 포함하는 전자 현미경 그리드를 2% (w/v) 수성 우라닐 아세테이트 용액과 함께 10분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 증류수로 3-4회 세척하였다. 단백질 이미지를 Philips Technai 120 kV 전자 현미경을 이용하여 관찰한 결과, 각각의 입자들이 구형의 나노입자를 형성함을 확인하였다.
6. 제조된 단백질들의 폐암 세포 표적능 검증
실시예 3에서 제작한 형광물질이 부착된 huHF_Native, huHF_Mutant1-h_smPD1, huHF_Mutant1-dual 단백질의 폐암 세포 표적능 효율을 비교하였다.
실시예 3에서 제작한 형광물질이 부착된 huHF_Native, huHF_Mutant1-h_smPD1, huHF_Mutant1-dual 단백질의 LLC1 쥐 폐암 및 A549 인간 폐암에 대한 표적능 효율을 비교하기 위하여 LLC1 쥐 폐암 및 A549 인간 폐암 세포에 형광 세기가 1400인 농도로 2시간 단백질을 반응시킨 후 형광 시그널을 비교하여 폐암 세포 표적능 효율을 확인하였다(도 4, 5). 항체에 비해 월등히 높은 표적능 효율을 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 3에서 제작한 huHF_Native, huHF_Mutant1-h_smPD1, huHF_Mutant1-dual 단백질의 LLC1 쥐 폐암 및 A549 인간 폐암에 대한 표적능 효율을 비교하기 위하여 LLC1 쥐 폐암 및 A549 인간 폐암 세포에 일정 농도 구간으로 단백질을 2시간 반응시킨 후, 단백질의 His tag과 결합하는 형광 항체를 1시간 반응시켜 형광 시그널을 비교하여 표적능 효율을 확인하였다(도 5, 6). 50% cell fraction 농도를 Kd로 여길 수 있는데, 항체에 비해 50배 이상의 좋은 표적능을 나타냄을 확인하였다(표 4).
구분 표적능
antibody Human 889~2223
Mouse 985~2463
huHF_Mutant1-dual Human 44~89
Mouse 46~93
7. 단백질의 transferrin receptor에 대한 결합력 측정
상기 실시예에서 제조한 단백질들의 Native형태와 Mutant의 human transferrin receptor에 대한 결합력을 비교하였다.
먼저, human transferrin receptor-Fc tag standard를 high-binding 96 well plate에 2μg/ml로 100㎕씩 4℃ overnight 부착하였다.
그리고, PBST(PBS+Tween0.05%) 200㎕로 3번 washing 해주었다. SuperBlcokTM(PBS) Blocking Buffer (thermo cat#37515) 100㎕씩 1시간 상온에서 blocking 과정을 수행하였다.
그리고, PBST(PBS+Tween0.05%) 200㎕로 3번 washing 해주었다. 상기 실시예에서 제조한 단백질들을 농도 구간별로 100㎕씩 4℃ overnight 처리하였다.
그리고, PBST(PBS+Tween0.05%) 200㎕로 3번 washing 해주었다. hexa-His tag에 특이적으로 결합하는 항체(mouse anti His tag antibody, Hisprobe)를 1/1000로 PBST에 희석하여 이를 100㎕씩 1시간 상온에서 처리해주었다.
그리고, PBST(PBS+Tween0.05%) 200㎕로 3번 washing 해주었다. 쥐 항체에 특이적으로 결합하는 항체(goat anti mouse igG antibody-HRP)를 1/1000로 PBST에 희석하여 이를 100㎕씩 1시간 상온에서 처리해주었다.
그리고, PBST(PBS+Tween0.05%) 200㎕로 3번 washing 해주었다. HRP와 반응하여 발색반응을 나타내는 TMB solution을 100㎕씩 15분 상온에서 처리해주었다. 1M H2SO4 용액을 50㎕씩 처리해준 뒤, TECAN으로 450nm 파장으로 optical density를 측정해주었다. 이를 Langmuir equation을 이용하여 계산하였다. (표 5, 도 8 내지 도 10)
구분 결합력
huHF-h_smPD1 Native 46.8
Mutant 94.2
huHF-mutant1-dual 181.9
도 11은 huHF_mutant1-dual과 huHF_mutant2-dual의 hTfR에 대한 결합력을 평가/비교한 것으로서, 이를 참고하면 huHF_mutant2-dual의 경우 농도를 10000nM까지 증가시킨 경우에도 포화되지 않아, hTfR에 대한 결합력이 더욱 감소한 것을 확인할 수 있다. 예상 포화지점을 선정하여 그 결합력 Kd 값을 계산한다면 약 4400nM이 된다.
8. huHF_mutant1-dual 처리에 따른 NK 세포와 암 세포 간의 결합능 평가
형광물질인 CFSE로 인간 폐암 세포주인 A549를 표지하였다. 106개의 세포에 CFSE를 5μM 농도로 20분간 37℃인큐베이터에서 반응시키고, 이를 PBS로 워싱하여 105 세포를 2ml cell plate 에 2 ml culture media에 희석해서 하루 배양하였다.
이후 105개의 NK 세포를 CFSE로 염색된 A549 세포주와 반응시켰다.
이때, 대조군으로 PBS 10 μl를 사용하고, 실험군으로 Cy5.5 형광염료가 표지된 huHF_mutant1-dual(dICB, dual immune checkpoint blocker)을 3 μM 10 μl를 넣었다.
인큐베이터에서 10분간 반응시킨 뒤, NK 1.1 antibody-PE 항체를 이용하여 NK 세포를 표지하였다.
4% formaldehyde로 샘플을 고정하고, fluorescence microscopy로 형광 이미지를 확인하였다.
대조군(PBS)에 비해 실험군(huHF_mutant1-dual)의 형광 이미지에서 NK 세포가 A549 세포에 더 많이 부착되어 있는 것을 확인하였다(도 12, 13).
9. huHF_mutant1-dual 처리에 따른 NK 세포와 암 세포 간의 결합능력 및 NK 세포의 암세포 사멸능 평가
형광물질인 CFSE로 인간 폐암 세포주인 A549를 표지하였다. 106개의 세포에 CFSE를 5μM 농도로 20분간 37℃ 인큐베이터에서 반응시키고, 이를 PBS로 워싱하여 104 세포를 96 well plate 에 200 μl culture media에 희석해서 하루 배양하였다.
이후 DAPI로 표지된 104~105개의 NK 세포를 조건에 따라 CFSE로 염색된 A549 세포주와 반응시켰다.
이때, PBS 10 μl, Abs(Tecentriq+mAb-mTIGIT (Bio X Cell, #BE0274) 병용투여군) 3 μM 10 μl (각각 3 μM , 총 6 μM), 및 huHF_mutant1-dual 3 μM 10 μl를 넣었다.
결합 측정은 상기 반응액을 인큐베이터에서 30분간 반응시킨 뒤 FACS 장비로 CFSE fluorescence와 DAPI fluorescence를 동시에 나타내는 세포 비율을 분석하였다 (도 14). 이를 참고하면 huHF_mutant1-dual 처리시에 NK cell의 A549 cell에 대한 결합능이 증가함을 확인할 수 있다.
Fluorescence microscopy로 이에 대한 형광 이미지를 확인하였다(도 14). NK 1.1 antibody-PE 항체로 NK 세포를 표지하였다.
독성 측정은 상기 반응액을 인큐베이터에서 48시간 반응시킨 뒤 FACS 장비로 샘플에 따른 독성 능력을 검증하였다. 7-AAD로 세포가 사멸되는 정도를 분석하였다.
CFSE fluorescence와 7-AAD fluorescence를 동시에 나타내는 세포 비율을 분석하여 NK 세포와 암 세포 비율 및 샘플에 따른 NK 세포의 독성 능력을 분석하였다(도 15). 이를 참고하면 huHF_mutant1-dual 처리시에 NK cell의 A549 cell의 사멸능이 증가함을 확인할 수 있다.
10. 암 세포 성장 억제능 평가
다음과 같은 샘플군 (PBS, Tecentriq, Tecentriq+mAb-mTIGIT, huHF_mutant-dual)에 대하여 각 5마리씩 마우스 폐암 세포주인 LLC1에 대하여 암 세포 정상 억제 효능을 검증하였다. Tecentriq은 폐암 등의 치료에 사용되는 PD-1 또는 PD-L1에 결합하는 단일클론항체이고, mAb-mTIGIT은 murine TIGIT에 결합하는 단일클론항체이다.
LLC1을 5*105 개씩 C57BL/6에 피하에 이식하여 종양모델을 형성하였다.
7일 후, 개체마다 종양 크기를 측정 및 분류하여 각 군마다 동일한 크기로 조절하였다.
7일부터 샘플을 3일 마다 미정맥을 통해 정맥주사하며, 각 개체마다 종양 크기를 측정하여 종양 성장 억제 효능을 비교하였다(도 16).
도 17에 각 실험군에서의 날짜별 종양 크기를 나타내었고, 도 17에 각 실험군에서의 22일차의 종양 크기를 나타내었다. 이를 참고하면, huHF_mutant-dual 의 경우 보다 적은 용량으로 처리함에도 불구하고 종양 크기가 가장 작아 그 효과가 우수함을 확인할 수 있다.
11. Cell avidity 평가
huHF_mutant-dual 및 mut-huHF의 인간 폐암 세포주 A549에 대한 avidity를 분석하였다.
먼저, Target cell (immune cell, cancer cell)을 배양하고 분주하였다
(1*105 개/10㎕, 1 FACS column (5ml polystyrene round-bottom tube, Falcon(352052))).
이후, 샘플(drug, antibody(anti-mouse PD-L1 antibody(BE0101), anti-mouse TIGIT antibody(BE0274), anti-human PD-L1(BE0285)))을 100㎕/FACS column 처리하고, control 군에는 FACS buffer (0.1%BSA + 0.01% sodium azide in PBS) 100㎕를 처리하였다(3hr, room temperature).
FACS buffer를 각 1ml 씩 상기 FACS column에 넣어준 뒤, 1700rpm으로 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하는 공정을 3회 반복 수행하였다.
이후 Fluorescence antibody (anti his tag antibody-PE(SC-8036PE), anti-IgG antibody-PE(PE goat F(ab')2 anti-rat (IgG) secondary antibody(ab7010), PE F(ab')2-goat anti-mouse IgG(H+L) secondary antibody(12-4010-82)))를 처리하였다(2hr, room temperature).
FACS buffer를 각 1ml 씩 상기 FACS column에 넣어준 뒤, 1700rpm으로 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하는 공정을 3회 반복 수행하였다.
이후 각 sample FACS column에 FACS buffer 100ul 넣어준 뒤, 7-AAD(BD Pharmigen (559925)) 2㎕를 5분간 처리하였다.
BD Biosciences, FACS 장비를 각 FACS columns 에서의 live cell 중 PE 형광을 나타내는 target cell의 비율을 이용하여 분석을 수행하였다(도 19-21).
이를 통해, huHF_mutant-dual이 세포 당 결합하는 샘플 수가 더 많고 결합한 세포 수도 더 뛰어남을 검증하였다.
12. 종양 성장 억제능 평가
다음과 같은 샘플군 (PBS, Ab-1, huHF_mutant-dual, huHF_mutant-dual+ Vac)에 대하여 각 5마리씩 마우스 폐암 세포주인 LLC1에 대하여 암 세포 정상 억제 효능을 검증하였다. Ab-1은 mouse마우스 항 PD-L1 항체를 사용하였고(Bio X Cell, #BE0101), 백신(Vac)으로는 LLC-1 neo-antigen vaccine(서열번호 10)을 사용하였다.
LLC1을 5*105 개씩 C57BL/6에 피하에 이식하여 종양모델을 형성하였다.
7일부터 샘플을 3일 마다 미정맥을 통해 정맥주사하며(G2 군의 경우 6일마다 주사), 각 개체마다 종양 크기를 측정하여 종양 성장 억제 효능을 비교하였다(도 22).
Ab-1은 30 nmol/kg, huHF_mutant-dual은 30 nmol/kg, Vac은 10 nmol/kg의 농도로 주사하였다.
이를 참고하면, huHF_mutant-dual 처리군의 종양 성장 억제능이 우수하고, 백신과 병용시에 보다 우수한 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
13. 헬릭스 내부에 외래 펩타이드를 융합한 페리틴 단백질
도 23 및 24의 벡터 모식도를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 단백질 제조용 발현 벡터를 구성하고, 실시예 2 및 3에 기재된 방법으로 단백질을 생합성하고 정제하였다.
이를 참조하면, huHF의 A-E 헬릭스 사이의 루프 뿐 아니라 D 헬릭스의 중간, E 헬릭스의 중간에 외래 펩타이드를 삽입(융합)해도 huHF 구조가 원활하게 형성됨을 확인할 수 있다.
이는 헬릭스의 중간, 특히 D 헬릭스 및 E 헬릭스가 페리틴의 기능/구조 유지 측면에서의 중요도가 상대적으로 낮고, 융합된 펩타이드의 크기가 크지 않음에 의한 것으로 판단된다.
14. 단백질의 수용성 분획의 비율 측정
pT7-7 기반 각종 발현 벡터를 BL21 (DE3) competent cell을 형질전환 (transformation)시켰다. 단일 콜로니를 앰피실린 100 mg/L이 첨가된 LB 액체배지(50 mL)에 접종하여 진탕 배양기 (shaking incubator)에서 37℃ 130 rpm의 조건에서 배양하였다. 탁도(turbidity/optical density at 600 nm)가 0.5에 도달하면, IPTG 1 mM 투여를 통해 타겟 단백질의 발현을 유도하였다. 이후 20℃에서 12~16 시간 배양 후, 배양액 속의 세포들은 원심분리(13000 rpm, 10 분)을 통하여 spun-down되고, 세포 펠릿을 수거하여 10 mM Tris-Hcl (pH 7.4) 버퍼에 재부유시켰다. 재부유된 세포들은 Branson Sonifier (Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT)를 이용하여 파열되었다. 음파처리 후, 용해성 단백질을 포함한 상층액과 불용성 단백질을 포함한 응집체들은 원심분리(13000 rpm, 10 분)로 분리되었다. 분리된 용해성, 불용성 단백질 분획의 SDS-PAGE 분석을 통해 용해도를 분석하였다. 즉, Coomassie로 염색된 타겟 단백질 밴드들은 densitometer (Duoscan T1200, Bio-Rad, Hercules, CA)로 스캔 후 수용성 분획의 비율을 정량화하였다. 구체적으로, 스캔한 SDS-PAGE 겔 이미지를 이용하여 'Quantity One' program 'Volume Rect. Tool'로 밴드 굵기와 백그라운드 값을 설정한 후, 'Volume Analysis Report'를 이용하여 용해성, 불용성 단백질 분획의 합을 100 %로 설정하고 용해도를 정량화하였다.
결과는 표 6에 나타내었다. 이를 참조하면, 외래 펩타이드가 D 헬릭스 내부 또는 E 헬릭스 내부에 융합된 경우에도 수용성 비율이 높은 것을 확인할 수 있다.
Protein NP Solubility (%)
intD-gp100-huHF 48.21
intE-gp100-huHF 73.00

Claims (16)

  1. 외부 표면에 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합된 페리틴 단백질을 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질은 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자가 융합된 페리틴 단량체 24개가 자기 조립되어 이루어진 구형 단백질인 약학 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체의 인접한 α-헬릭스들 사이 중 적어도 하나에 융합되는 약학 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체의 N-말단 또는 C-말단에 융합되는 약학 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체의 A-B루프, B-C루프, C-D루프 또는 D-E루프에 융합된 약학 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체의 N-말단과 A 헬릭스 사이 또는 E 헬릭스와 C-말단 사이에 융합된 약학 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체의 α-헬릭스 내부에 융합된 약학 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 페리틴 단량체의 A 헬릭스, B 헬릭스, C 헬릭스, D 헬릭스 또는 E 헬릭스 내부에 융합된 약학 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질은 인간 트랜스페린 수용체에 대한 결합력이 떨어지도록 돌연 변이된 것인 약학 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질을 구성하는 페리틴 단량체 중 적어도 하나가 서열번호 1의 서열에서 15번, 16번, 23번, 82번, 84번, 117번, 120번, 또는 124번 아미노산이 알라닌, 글라이신, 발린 또는 류신으로 치환된 것인 약학 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서, 트랜스페린 수용체에 대한 결합력(K)이 다음 수학식 1을 만족하는 약학 조성물:
    [수학식 1]
    K ≥ 10 nM
    (식 중, K [P][T]/[PT]이고, 여기서 [P]는 상기 단백질과 상기 트랜스페린 수용체와의 결합 반응의 평형 상태에서의 상기 단백질의 농도를 나타내고, [T]는 상기 평형 상태에서의 상기 트랜스페린 수용체의 농도를 나타내며, [PT]는 상기 평형 상태에서의 상기 단백질과 상기 트랜스페린 수용체의 복합체의 농도를 나타냄).
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 트랜스페린 수용체는 인간 트랜스페린 수용체인 약학 조성물.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 면역 관문 분자는 Her-2/neu, VISTA, 4-1BBL, Galectin-9, Adenosine A2a receptor, CD80, CD86, ICOS, ICOSL, BTLA, OX-40L, CD155, BCL2, MYC, PP2A, BRD1, BRD2, BRD3, BRD4, BRDT, CBP, E2F1, MDM2, MDMX, PPP2CA, PPM1D, STAT3, IDH1, PD1, CTLA4, PD-L1, PD-L2, LAG3, TIM3, TIGIT, BTLA, SLAMF7, 4-1BB, OX-40, ICOS, GITR, ICAM-1, BAFFR, HVEM, LFA-1, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, LAIR1, 2B4, CD2, CD3, CD16, CD20, CD27, CD28, CD40L, CD48, CD52, EGFR family, AXL, CSF1R, DDR1, DDR2, EPH receptor family, FGFR family, VEGFR family, IGF1R, LTK, PDGFR family, RET, KIT, KRAS, NTRK1 및 NTRK2으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 약학 조성물.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 면역 관문 분자와 결합 가능한 분자는 상기 면역 관문 분자에 대해 결합력이 있는 리간드 또는 리간드의 단편, 수용체 또는 수용체의 단편, 항체 또는 항원 결합부위(CDR)를 포함하는 항체의 단편인 약학 조성물.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 페리틴은 인간 페리틴 중쇄인 약학 조성물.
  16. 청구항 1에 있어서, 항암제를 더 포함하거나, 항암제와 병용투여되는 약학 조성물.
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