KR20170027683A - 인간 유래 페리틴 모노머 단편 및 이를 이용한 융합폴리펩티드 - Google Patents

인간 유래 페리틴 모노머 단편 및 이를 이용한 융합폴리펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 유래 페리틴 모노머 단편 및 이를 이용한 융합폴리펩티드에 관한 별명으로, 보다 상세하게는 인간 유래 페리틴의 4번째 루프의 일부분 및 다섯 번째 헬릭스(helix)가 제거된 페리틴 모노머 단편 및 상기 페리틴 모노머 단편의 N-말단 또는 C-말단에 폴리펩티드 또는 단백질을 융합한 융합폴리펩티드에 관한 발명이다.
상기 융합폴리펩티드는 그 생산 효율이 매우 우수하며, 자가조립에 의해 단백질 케이지를 형성하여 내부에 유효물질의 봉입이 가능하고, 3차원적 구조 특성상 입체 가리움 효과가 적어 N-말단 또는 C-말단에 융합된 폴리펩티드 또는 단백질의 생리학적 활성이 우수하게 나타나 질병의 진단 또는 치료제 개발에 효과적이다.

Description

인간 유래 페리틴 모노머 단편 및 이를 이용한 융합폴리펩티드{Fragment of human ferritin monomer and fusion polypeptide using thereof}
본 발명은 인간 유래 페리틴 모노머 단편 및 이를 이용한 융합폴리펩티드에 관한 별명으로, 보다 상세하게는 인간 유래 페리틴의 4번째 루프의 일부분 및 다섯 번째 헬릭스(helix)가 제거된 페리틴 모노머 단편 및 상기 페리틴 모노머 단편의 N-말단 또는 C-말단에 폴리펩티드 또는 단백질을 융합한 융합폴리펩티드에 관한 발명이다.
케이지(cage) 단백질은 저분자량 단일체들의 정밀한 자가조립 성질에 의하여 단일체 분자량의 수십에서 수백 배의 거대분자를 형성할 수 있는 단백질이다. 자연계에서 바이러스 capsid 단백질, 페리틴, heat shock protein, Dps 단백질이 이에 해당되며 케이지(cage)를 구성하는 각각의 단일체들은 인접 단일체들과 매우 규칙적이고 정밀한 상호작용을 이루고 있고 케이지(cage)의 내부는 비어있는 구조이다. 상기와 같은 케이지 단백질의 용기(container)와 같은 성질에 의해 내부와 외부가 격리되는 특징을 가지고 있어, 약물 전달체로 의학분야에서 활용 빈도가 높다.
케이지 단백질 응용 물질 수송 분야는 바이러스성 수송체 (viral vector)와 비 바이러스성 수송체 (non-viral vector)에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 현재까지 바이러스성 수송체로는 아데노바이러스 (adenovirus) 등이 많이 연구되고 있고 비 바이러스성 수송체로는 페리틴, heat shock protein 등에 관하여 연구되고 있다. 그러나 기존의 바이러스성 수송체일 경우에는 바이러스 자체가 소유하는 유전자에 의한 체내 안전성 문제가 제기되어 왔다.
페리틴은 단백질은 세포내 단백질의 일종으로 철을 저장하고, 방출하는 역할을 한다. 페리틴은 일반적으로 생체 내에서 속이 빈 구형의 케이지(cage) 형태를 하고 있으며, 상기 케이지는 24개의 subunit으로 구성되며, subunit은 그 구조에 따라 heavy chain과 light chain으로 구분된다.
본 발명자들은 선행연구를 통해 인간 유래 페리틴 모노머의 N-말단에 특정 수용체를 타겟팅하는 폴리펩티드를 융합한 융합펩타이드를 제작하여, 표적 지향적 단백질 케이지를 제공한 바 있으며(한국 특허출원 10-2013-0166241호), 인간 유래 페리틴 모노머의 4번째 루프(loop) 및/또는 N-말단에 특정 수용체를 타겟팅하는 폴리펩티드를 융합한 융합펩타이드를 제작하여, 수용체에 대한 binding affinity가 월등히 향상된 표적 지향적 단백질 케이지를 제공한 바 있다(한국 특허출원 10-2014-0015142호).
그러나, 상기 페리틴 모노머의 4번째 루프에 폴리펩티드를 융합할 때에는, 인간 유래 야생형 페리틴에 존재하는 다섯 번째 헬릭스로 인한 입체적 장애가 발생하여, 융합할 수 있는 폴리펩티드의 크기에 제약이 발생한다는 한계점이 있었고, 인간 유래 페리틴의 C-말단에 분자량이 큰 폴리펩티드 또는 단백질을 융합할 경우에는 입체적인 장애로 인해 단백질 케이지가 형성되지 않거나, 융합된 폴리펩티드 또는 단백질로 인한 가리움 효과가 발생하여 목적하는 생리학적 활성을 나타내지 못하는 문제점이 나타난다는 것을 알게 되었다.
따라서, 상기한 문제점들을 해결하여 페리틴 모노머의 N-말단 뿐만 아니라 C-말단에 분자량이 큰 펩티드 또는 단백질을 융합하더라도 케이지 형성에 문제가 없고, 구조적으로 가리움 효과가 완화된 약물전달 플랫폼의 개발이 필요한 상황이다.
이에, 본 발명자들은 인간 유래 페리틴 모노머의 4번째 루프의 일부분 및 다섯 번째 헬릭스(helix)가 제거된 페리틴 모노머 단편(short ferritin, sFt)을 제작하였고, 상기 페리틴 모노머 단편은 C-말단에 분자량이 큰 폴리펩티드 또는 단백질을 융합한다 하더라도 페리틴 모노머 단편의 자가조립(self-assembly)이 가능하여 페리틴 케이지를 형성하며, 야생형의 페리틴 모노머와 비교하여 입체적인 가리움 효과가 상당히 완화되는 등 다양한 이점이 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 모노머 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 유래 페리틴 모노머 단편의 C-말단, N-말단, 또는 C-말단 및 N-말단에 폴리펩티드 또는 단백질이 융합된 융합폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 유래 페리틴 모노머 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합폴리펩티드를 포함하는 단백질 케이지를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 페리틴 모노머 단편 C-말단, N-말단, 또는 C-말단 및 N-말단에 항체 또는 세포 수용체와 결합할 수 있는 리간드 펩티드가 융합된 융합폴리펩티드를 포함하는 약물전달시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 페리틴 모노머 단편 C-말단, N-말단, 또는 C-말단 및 N-말단에 세포독성 펩티드 또는 단백질이 융합된 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 페리틴 모노머 단편 C-말단, N-말단, 또는 C-말단 및 N-말단에 형광 단백질이 융합된 융합폴리펩티드를 포함하는 생체 이미징 시스템을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 모노머 단편을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 인간 유래 페리틴 모노머 단편의 C-말단, N-말단, 또는 C-말단 및 N-말단에 폴리펩티드 또는 단백질이 융합된 융합폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 인간 유래 페리틴 모노머 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 융합폴리펩티드를 포함하는 단백질 케이지를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 페리틴 모노머 단편 C-말단, N-말단, 또는 C-말단 및 N-말단에 항체 또는 세포 수용체와 결합할 수 있는 리간드 펩티드가 융합된 융합폴리펩티드를 포함하는 약물전달시스템을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 페리틴 모노머 단편 C-말단, N-말단, 또는 C-말단 및 N-말단에 세포독성 펩티드 또는 단백질이 융합된 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 페리틴 모노머 단편 C-말단, N-말단, 또는 C-말단 및 N-말단에 형광 단백질이 융합된 융합폴리펩티드를 포함하는 생체 이미징 시스템을 제공한다.
이하에서 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 모노머 단편을 제공한다.
서열번호 2 (인간유래 페리틴 heavy chain 모노머 단편):
MTTASTSQVR QNYHQDSEAA INRQINLELY ASYVYLSMSY YFDRDDVALK NFAKYFLHQS HEEREHAEKL MKLQNQRGGR IFLQDIKKPD CDDWESGLNA MECALHLEKN VNQSLLELHK LATDKNDPHL CDFIETHYLN EQVKAIKELG DHVTNLRKMG A
또한, 본 발명자들은 상기 인간유래 페리틴 heavy chain 모노머 단편과 더불어 인간유래 페리틴 light chain 모노머 단편도 제작하였고, 야생형 페리틴 light chain 모노머 단편의 용해도를 증가시키기 위해 아미노산 서열에 돌연변이를 주었다. 용해도가 개선된 인간유래 페리틴 light chain 모노머 단편의 아미노산 서열은 다음과 같다:
MSSQIRQNYS TDVEAAVNSL VNLYLQASYT YLSLGFYFDR DDVALEGVSH FFRELAEEKR EGYERLLKMQ NQRGGRIFLQ DIKKPAEDEW GKTPDAMKAA MALEKKLNQA LLDLHALGSA RTDPHLCDFL ETHFLDEEVK LIKKMGDHLT NLHRLGG
페리틴(ferritin) 단백질은 세포내 단백질의 일종으로 철을 저장하고, 방출하는 역할을 한다. 페리틴은 일반적으로 생체 내에서 속이 빈 구형의 케이지(cage) 형태를 하고 있으며, 상기 케이지는 24개의 페리틴 모노머(monomer)로 구성되며, 상기 페리틴 모노머는 그 구조에 따라 heavy chain과 light chain으로 구분된다.
본 발명의 페리틴 모노머는 페리틴 모노머의 구조에 상관없이 모두 가능하며, 바람직하게는 페리틴 헤비 체인(heavy chain) 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 일 수 있다. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열은 인간유래 페리틴(ferritin) 단백질의 heavy chain이다.
페리틴 모노머의 구조는 5개의 알파헬릭스(alpha helix) 구조가 순차적으로 연결된 형태이며, 각각의 알파헬릭스 구조의 폴리펩티드를 연결하는 비정형 폴리펩티드 부분을 루프(loop)라고 한다.
본 발명에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 모노머 단편은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 heavy chain 모노머의 1 내지 161번째 아미노산으로 이루어진 것이며, 이는 페리틴 heavy chain 모노머의 네 번째 루프의 일부분 및 다섯 번째 헬릭스가 제거되어 짧아진 형태의 페리틴 모노머 단편(short ferritin, sFt)이라고 할 수 있다. 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열은 다음과 같다:
서열번호 1 (인간유래 페리틴 heavy chain 모노머)
MTTASTSQVR QNYHQDSEAA INRQINLELY ASYVYLSMSY YFDRDDVALK NFAKYFLHQS HEEREHAEKL MKLQNQRGGR IFLQDIKKPD CDDWESGLNA MECALHLEKN VNQSLLELHK LATDKNDPHL CDFIETHYLN EQVKAIKELG DHVTNLRKMG APESGLAEYL FDKHTLGDSD NES
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 모노머 단편은 야생형 페리틴 모노머에서 일부 폴리펩타이드가 제거되어 변형된 형태이지만, 자가조립(self-assembly)에 의해 단백질 케이지를 형성하는 페리틴 고유의 특징은 그대로 나타내면서, 입체적인 장애가 상당히 완화되어 C 말단에 융합할 수 있는 펩티드 또는 단백질의 크기에 대한 제약이 해소되었다는 점에서 중요한 의미를 갖는 약물 전달 플랫폼이 될 수 있다. 한편, 이와 같은 장점을 나타내는 페리틴 모노머 단편은 종래 기술에서는 보고된 바 없는 본원 발명 특유의 기술적 특징이라 할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 인간 유래 페리틴 모노머 단편의 C-말단, N-말단 또는 C-말단 및 N-말단에 폴리펩티드 또는 단백질이 융합된 융합폴리펩티드를 제공한다.
야생형의 페리틴 모노머의 C-말단에 분자량이 큰 폴리펩티드 또는 단백질을 융합할 경우, 페리틴의 자가조립에 영향을 주어 페리틴 케이지를 형성하지 못하는 문제가 발생할 수 있다. 뿐만 아니라, 야생형 페리틴 모노머의 C-말단 및 N-말단 모두에 폴리펩티드 또는 단백질을 융합할 경우, C-말단에 융합된 폴리펩티드 또는 단백질이 입체적으로 가리움 효과를 발휘하여 N-말단에 융합된 폴리펩티드 또는 단백질의 생리학적 활성을 저해하거나, 목적하는 체내 조직 또는 장기에서 폴리펩티드의 방출이 원활하게 이루어지지 않는 문제점이 나타날 수 있다.
그러나, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 짧은 페리틴 모노머 단편을 이용한 융합펩티드의 경우, 페리틴 모노머 단편의 C-말단에 분자량이 큰 단백질을 융합한다고 하더라도 상기한 문제점들이 상당부분 완화되거나 완전히 해결될 수 있어 야생형의 페리틴 모노머를 이용한 융합단백질이 나타내지 못하는 생리학적 이점을 나타낼 수 있다.
즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 짧은 페리틴(sFt) 모노머와 야생형의 페리틴(wFt)을 이용하여 융합폴리펩티드를 제작하고 각각의 특성을 비교하였다.
sFt 및 wFt 각각의 C-말단에 비교적 분자량이 큰 단백질인 GFP를 융합하여 sFt-GFP 및 wFt-GFP 융합 펩티드를 제작하였다. 상기 sFt-GFP 및 wFt-GFP는 모두 E. coli에서 잘 발현이 되었고, 양자 모두 cage를 잘 형성하였지만, sFt-GFP가 wFt-GFP와 비교해 세 배 정도 더 많이 발현이 되어, 그 단백질 발현이 매우 우수하다는 것을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, sFt-GFP는 wFt-GFP와 비교해 MMP-2에 의해 더 쉽게 절단이 되는 것으로 확인되었고(실시예 1 및 도 3), NTA-아가로스 비드에 의해 sFt-GFP의 N-말단에 부착된 히스티딘 tag가 wFt-GFP의 N-말단에 부착된 히스티딘 tag에 비해 훨씬 더 효율적으로 분리가 되는 것으로 되는 것을 확인할 수 있었다(실시예 1 및 도 4).
상기한 결과를 통해, wFt의 C-말단에 거대한 분자인 GFP가 결합된 융합 펩티드는 공간 구조적으로 매우 밀집되어 MMP-2에 의해 절단되는 링커 부위가 쉽게 노출이 되지 않으며, N-말단에 부착된 6개의 히스티딘 tag가 입체적으로 상당히 가리워져 있을 것으로 판단할 수 있었다. 이에 반해, 야생형 페리틴 모노머에서 네 번째 루프의 일부분 및 다섯 번째 헬릭스가 제거된 sFt의 경우, C-말단에 거대한 분자인 GFP가 결합되어 있음에도 불구하고 MMP-2에 의해 쉽게 절단이 되었으며, N-말단에 부착된 히스티딘 tag가 용이하게 분리가 되는 것이 미루어 보아, wFt에 비해 공간 구조적으로 상당히 노출이 되어 있다는 것을 알 수 있었다.
상기와 같은 sFt의 특성을 이용하면, (i) wFt에 융합된 융합폴리펩티드와 비교하여 동일한 조건 하에서 훨씬 더 높은 수율로 융합폴리펩티드를 생산할 수 있으며, (ii) 체내 목적하는 부위에서 N-말단 또는 C-말단에 융합된 폴리펩티드를 효소적으로 절단하여 용이하게 방출할 수 있어 약물 등을 효과적으로 전달할 수 있으며, (iii) N-말단 및 C-말단 모두에 폴리펩티드 또는 단백질을 융합한다고 하더라도 상호간에 가리움 효과가 낮아, 원하는 생리학적 활성을 효율적으로 나타낼 수 있는 융합폴리펩티드를 제작할 수 있다.
인간 유래 페리틴 모노머 단편의 C-말단 및/또는 N-말단에 융합할 수 있는 펩티드 또는 단백질은 특별히 제한되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 원하는 목적을 달성하기 위하여 적절하게 선택할 수 있다. 이의 비제한적인 예시로는, 조직 또는 기관에서 발현하고 있는 특정 단백질을 인식할 수 있는 항체, 체내 특정 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드 펩티드, 단백질 약물, 효소, 세포독성 폴리펩티드, 세포독성 단백질 또는 형광 단백질을 들 수 있다.
본 발명에서 페리틴 모노머 단편에 특정 병리조직에서 발현하는 항원을 인식할 수 있는 항체를 융합함으로써, 약물을 목적하는 조직 또는 장기에 효과적으로 전달할 수 있다. 상기 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, Fv-단편, Fab-단편, F(ab’)2-단편 및 scFv 단편일 수 있다. 또한, 상기 항체는 전체 항체 (whole) 형태일 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 및 scFv 등을 포함한다.
본 발명에서 상기 항체의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당업계에서 특정 병리상태를 나타내는 조직 또는 장기에서 발현하는 항원을 인식하는 것으로 알려져 있는 항체는 모두 포함이 될 수 있다.
본 발명에서 상기 리간드 펩티드는 페리틴 모노머 단편과 융합된 이후에 표적 세포의 수용체에 특이적으로 결합하여 본 발명의 융합폴리펩티드를 표적 세포에 전달할 수 있는 펩티드를 의미한다. 즉, 상기 리간드 펩티드는 병리학적 상태를 매개하는 호르몬 수용체, 사이토카인 수용체 또는 성장인자 수용체 등에 특이적으로 결합할 수 있는 어떠한 리간드라도 가능하다.
또한, 본 발명에서 상기 리간드는 표적 세포의 수용체와 결합하여 수용체-매개 엔도시토시스(receptor-mediated endocytosis)가 일어날 수 있는 것을 포함한다. 따라서, 상기 수용체는 수용체-매게 엔도시토시스가 일어날 수 있는 세포 상에 존재하는 어떠한 수용체라도 가능하며, 상기 리간드 펩티드는 상기 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 어떠한 리간드라도 가능하다.
본 발명에서 상기 단백질 약물은 알부민, 인슐린, erythropoietin, 인슐린 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 변형 성장인자 알파, 변형 성장인자 베타, 뼈형성 단백질 및 이들의 혼합물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 일반적으로 단백질 약물은 다양한 질병의 치료에 유용하게 사용되지만 생체내 반감기가 짧고 흡수율이 낮아 치료효과를 내기에 한계를 갖는다. 이렇듯이 낮은 체내흡수율로 인하여 대부분 주사투여를 하며 주사투여시에도 생체내 반감기가 2~4시간으로 짧아서 반복적인 약물투여가 필요하다. 단백질 제제 등과 같은 거대분자 약물과 관련하여서는 폴리락티드산이나 폴리글리콜산등의 생분해성 합성고분자로서 기름 속 물 에멀젼(water in oil emulsion)으로 마이크로/나노입자 등을 제조하여 사용하거나 폴리에틸렌 글리콘(polyethylene glycol)을 이용한 PEGylation, 혹은 음이온과 양이온간의 반응을 이용하여 고분자 재료간의 complex를 이용하는 방법들이 사용되었다. 하지만 폴리락티드산이나 폴리락티드-글리콜상 공중합체를 이용하여 제조된 미세입자의 경우 고분자 재료의 소수성으로 인해 단백질 약물의 변성이 유발되어지는 단점이 있으며 체내에서 폴리락티드산의 분해시 생성되는 산으로 인해 pH가 떨어지고 약물의 변성과 응집을 촉진하게 된다. 이에 단백질 약물의 생리학적 활성을 유지하면서 일정기간에 체내에서 안정적인 혈중농도를 유지할 수 있는 약물전달체가 필요하며, 본 발명의 페리틴 모노머 단편은 상기한 단백질 약물의 문제점을 해결할 수 있는 유용한 약물전달체로서 이용이 될 수 있다.
본 발명에서 상기 세포독성 폴리펩티드 또는 세포독성 단백질은 본 발명의 페리틴 모노머 단편에 융합되어 암세포의 사멸을 유도하여 항암효과를 나타내는 약물을 포함하는 개념이다.
본 발명에서 상기 세포독성 단백질(protein)로는 트라스트주맵(trastuzumab), 리투시맵(rituximab), 베바시주맵(bevacizumab), 세투시맵(cetuximab), 보테조밉(bortezomib), 엘로티닙(erlotinib), 제피티닙(gefitinib), 이매티닙 메실레이트(imatinib mesylate), 수니티닙(sunitinib), L-아스파라지나제(L-asparaginase), 트리톨레린 아세테이트(triptorelin acetate), 메제스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 플루타미드(flutamide), 비카루타마이드(bicalutamide), 고세레린(goserelin), 시토크롬 씨(cytochrome c), p53 단백질 등을 예로 들 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 세포독성 펩타이드(pro-apoptotic peptide)의 비제한적인 예시로는, KLAKLAKKLAKLAK, KGGGQVGRQLAIIGDDINR(Bak BH3 펩타이드), LQHRAEVQIARKLQCIADQFHRLHT(Bmf BH3 펩타이드) 및 YGRELRRMSDEFVDS(Bad BH3 펩타이드)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자는 본 명세서에 구체적으로 제시되지 않은 것을 비롯한 세포독성을 나타내는 펩타이드를 잘 알고 있을 것이다.
본 발명에서 상기 형광 단백질은 물리적 조건 변화, 화학적 처리에 의해 빛을 발생하는 물질을 의미한다. 상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색 형광 단백질(Yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(Red fluorescent protein, RFP)과 같은 형광 단백질(fluorescent protein)이거나, 발광 단백질(photoprotein) 또는 루시퍼라제(luciferase) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업계에서 사용되는 형광물질은 모두 포함될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 페리틴 모노머 단편의 N-말단에 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 세포사멸 유도 펩티드(pro-apoptotic peptide), C-말단에 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP)을 각각 융합한 융합폴리펩티드를 제작하여 그 생리학적 활성을 평가하였다.
구체적으로, 페리틴 모노머 단편의 N-말단에 융합된 서열번호 3의 세포사멸 유도 펩티드는 암세포의 표면에서 과발현 되어 있는 p32 수용체에 결합할 수 있는 아미노산 서열(CGKRK)를 포함하고 있으며, 상기 융합폴리펩티드를 암세포에 처리한 결과, 융합폴리펩티드가 암세포의 p32 수용체를 통해 세포내로 원활히 uptake 되어 C-말단에 융합된 녹색 형광이 세포의 세포질 내에서 관찰이 되었으며, 결과적으로 세포의 사멸을 유도하는 것을 확인하였다(실시예 5).
즉, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 짧은 페리틴 모노머 단편의 C-말단에 분자량이 큰 단백질인 GFP를 융합한다 하더라도 N-말단에 융합된 폴리펩티드의 생리학적 활성을 전혀 저해하지 않으며, N-말단 또는 C-말단에 융합된 폴리펩티드 또는 단백질 각각의 생리학적 활성이 모두 정상적으로 발현된다는 것을 알 수 있었다.
본 발명은 또한, 상기 펩티드 또는 단백질은 인간 유래 페리틴 모노머 단편의 C-말단 및/또는 N-말단에 링커를 통해 융합된 것을 특징으로 하는 융합폴리펩티드를 제공한다.
상기 링커는 폴리펩티드 또는 단백질을 페리틴 모노머 단편의 C-말단 또는 N-말단의 특정부위에 부착시키기 위한 것으로, 1개 내지 수 개의 아미노산으로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 상기 링커는 바람직하게는 단백질 절단 효소의 기질이 될 수 있는 아미노산 서열을 포함하고 있는 링커일 수 있다. 즉, 단백질 절단 효소에 의해 링커가 절단되고, 융합된 폴리펩티드 또는 단백질이 페리틴 모노머 단편으로부터 유리되어 원하는 조직 또는 장기에서 생리학적 활성을 나타낼 수 있다.
상기 링커의 종류는 특별이 제한되지 않으나, 유로키나제, 프로-유로키나제, 플라스민, 플라스미노겐, TGFβ, 스타필로키나제, 트롬빈, 인자 IXa, 인자 Xa 또는 간질 콜라게나제와 같은 메탈로프로테이나제(MMP), 젤라티나제 또는 스트로멜리신에 대한 절단 부위를 포함하는 펩티드 링커가 특히 바람직하며, 본 발명의 일실시예에서 상기 링커는 MMP-2에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 링커를 사용하여 그 활성을 평가하였다.
상기 서열번호 5의 아미노산 서열은 다음과 같다:
서열번호 5 (링커)
GSGGGSGEFGPLGLAGGGSGTS
페리틴 모노머 단편의 N-말단 또는 C-말단에 상기한 효소들에 의해 분해될 수 있는 링커를 결합한 융합폴리펩티드를 제작함으로써, 목적하는 부위에서 생리학적 활성을 나타낼 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질을 원활하게 방출하여 약물전달체로서의 역할을 수행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 페리틴 모노머 단편의 C-말단 또는 C-말단 및 N-말단에 MMP-2에 의해 절단이 될 수 있는 아미노산 서열을 갖는 링커를 결합하여 세포사멸 유도 펩티드(pro-apoptotic peptide) 또는 GFP를 융합한 융합폴리펩티드를 제작하였고(서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 융합폴리펩티드), 상기 융합폴리펩티드가 페리틴 케이지를 형성한 후, 링커들이 효소에 노출되어 절단이 될 수 있는지 여부를 평가하였다(실시예 4). 그 결과, C-말단 또는 N-말단에 결합된 각각의 링커가 MMP-2에 의해 절단되어 생성된 산물들이 농도 의존적으로 관찰되었다.
상기 서열번호 6 및 7의 아미노산 서열은 다음과 같다:
서열번호 6 (세포사멸 유도 펩티드-페리틴 모노머 단편-링커-GFP가 융합된 융합폴리펩티드)
MGGTCGKRKKLAKLAKKLAKLAKGHMTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAGSGGGSGEFGPLGLAGGGSGTSVDVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
서열번호 7 (세포사멸 유도 펩티드-링커-페리틴 모노머 단편-링커-GFP가 융합된 융합폴리펩티드)
MGGTCGKRKKLAKLAKKLAKLAKASGPLGLAGHMTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAGSGGGSGEFGPLGLAGGGSGTSVDVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
또한 본 발명의 융합폴리펩티드는 공지의 검출방법에 사용되는 표지물질등을 추가로 부착할 수 있는데, 바람직하게는 1개 내지 10개의 히스티딘(Histidine)으로 이루어진 펩타이드 단편 즉, His-태그를 사용할 수 있다.
상기에서 히스티딘 잔기는 재조합 단백질을 발현시킨 후 정제시 필요한 꼬리표(tag)로 가장 많이 이용되는 tag 중 하나로, 특이성(specificity)이 높아야 하고 원하는 단백질의 구조에 영향을 최대한 적게 주어야 한다. 바람직하게는 Histidine이 1개 내지는 10개가 연속으로 오는 peptide로 구성될 수 있는데, size가 작고 원래의 protein 구조에 영향도 별로 주지 않기 때문에 재조합 단백질을 만든 후 따로 잘라주지 않아도 된다는 편의성이 있다. tag은 vector의 종류에 따라 target protein의 N-말단, C-말단 어느 쪽에도 만들 수 있고, 단백질의 구조의 영향을 주는 것에 따라 그 방향을 결정할 수 있다.
한편, 본 발명에서 상기 페리틴 모노머 단편에 융합되는 펩티드 또는 단백질은 바람직하게는 상기 융합폴리펩티드 간 또는 상기 융합폴리펩티드와 인간 유래 페리틴 모노머 간의 결합을 방해하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 융합폴리펩티드는 상기 융합폴리펩티드 간 또는 융합폴리펩티드와 다른 페리틴 모노머 간의 결합 없이 단독으로 사용이 가능하나, 페리틴과 같이 융합폴리펩티드 간 또는 융합폴리펩티드와 다른 페리틴 모노머 간의 결합을 통하여 다이머, 트라이머를 형성하거나, 또는 수개의 모노머가 케이지 단백질을 형성하여 새로운 기능을 나타내거나, 다른 물질과의 결합 특이성을 더욱 높일 수 있으므로, 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질은 상기 융합폴리펩티드간 또는 상기 융합폴리펩티드와 인간 유래 패리틴 모노머 간의 결합을 방해하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 페리틴 모노머 단편의 N-말단에 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 세포사멸 유도 펩티드(pro-apoptotic peptide) 및 C-말단에 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 GFP 단백질을 융합한 융합폴리펩티드(KLAK-sFt-GFP)를 제작하여 케이지 단백질을 형성하는지 여부를 관찰하였다(실시예 3). 그 결과, 분자량이 큰 GFP 단백질이 C-말단에 융합되어 있음에도 불구하고, 상기 융합폴리펩티드는 케이지를 형성하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 서열번호 3 및 4의 아미노산 서열은 다음과 같다:
서열번호 3 (세포사멸 유도 펩타이드, pro-apoptotic peptide)
CGKRKKLAKLAKKLAKLAK
서열번호4 (GFP)
VDVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
본 발명의 융합폴리펩티드는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 외부 유전자를 발현할 수 있는 용도로 제작된 통상의 벡터에 발현 가능하도록 삽입하여, 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있다. 상기 벡터는 단백질을 생산하기 위한 숙주세포의 종류 및 특성에 따라 적절히 선택하거나, 신규로 제작할 수 있다. 상기 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 방법 및 형질전환체로부터 재조합 단백질을 생산하는 방법은 통상의 방법으로 용이하게 실시 할 수 있다. 상기한 벡터의 선택, 제작, 형질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시할 수 있으며, 통상의 방법에서 일부의 변형도 본원발명에 포함된다.
한편 본 발명은 본 발명의 페리틴 모노머 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 페리틴 모노머 단편의 N-말단에 세포사멸 유도 펩티드 및 C-말단에 GFP 단백질이 융합된 융합폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 페리틴 모노머 단편 또는 융합폴리펩티드를 암호화하는 것이면 어떠한 염기서열의 것도 가능하다. 바람직하게는 페리틴 모노머 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 것일 수 있으며, 상기 융합폴리펩티드를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9 또는 10의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.
상기 서열번호 8 내지 10의 폴리뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
서열번호 8 (서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간유래 페리틴 heavy chain 모노머 단편을 인코딩하는 핵산 서열)
ATGacgaccgcgtccacctcgcaggtgcgccagaactaccaccaggactcagaggccgccatcaaccgccagatcaacctggagctctacgcctcctacgtttacctgtccatgtcttactactttgaccgcgatgatgtggctttgaagaactttgccaaatactttcttcaccaatctcatgaggagagggaacatgctgagaaactgatgaagctgcagaaccaacgaggtggccgaatcttccttcaggatatcaagaaaccagactgtgatgactgggagagcgggctgaatgcaatggagtgtgcattacatttggaaaaaaatgtgaatcagtcactactggaactgcacaaactggccactgacaaaaatgacccccatttgtgtgacttcattgagacacattacctgaatgagcaggtgaaagccatcaaagaattgggtgaccacgtgaccaacttgcgcaagatgggagcg
서열번호 9 (서열번호 6의 융합폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열)
GGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
서열번호 10 (서열번호 7의 융합폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열)
GCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
한편 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 발현벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하며, 그 종류는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 발현벡터는 통상의 발현벡터일 수 있으며, 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 상기 발현벡터의 프로모터는 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible)일 수 있다. 또한 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제기원을 포함한다.
한편 본 발명은 본 발명의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 형질전환체는 본 발명의 발현벡터로 형질전환 된 것을 특징으로 한다. 상기 발현벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method)을 이용할 수 있으며, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
한편 본 발명은 본 발명의 페리틴 모노머 단편 또는 융합폴리펩티드를 포함하는 단백질 케이지를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 페리틴 모노머 단편 또는 융합폴리펩티드를 포함하는 페리틴 단백질을 제공한다.
단백질 케이지(Protein cage)는 저분자량 단일체들의 정밀한 자가조립 성질에 의하여 형성되며, 내부에 공간을 가지는 단백질로 된 케이지이다. 바이러스 capsid 단백질, 페리틴, heat shock protein, Dps 단백질이 이에 해당된다. 본 발명의 단백질 케이지는 본 발명의 페리틴 모노머 단편 또는 융합폴리펩티드를 상기 단백질 케이지를 구성하는 단일체(모노머, monomer)로 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 단백질 케이지는 본 발명의 페리틴 모노머 단편 또는 융합폴리펩티드만으로, 또는 본 발명의 페리틴 모노머 단편 또는 융합폴리펩티드 및 다른 페리틴 단백질 모노머와의 조합으로 구성될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어인 “자가조립(self-assembly)”란 어떤 분자들이 외부의 특별한 자극이나 인위적인 유도없이, 스스로 알아서 특정한 나노구조를 형성하는 성질을 의미한다.
본 발명의 페리틴 단백질은 페리틴 단백질 모노머의 결합에 의해 만들어지는 것으로 일반적으로 생체 내에서 구형의 케이지 형태를 하고 있다.
본 발명의 페리틴 단백질은 본 발명의 페리틴 모노머 단편 또는 융합폴리펩티드가 단위체로서 규칙적으로 배열된 복합 단백질일 수 있으며, 더 바람직하게는 본 발명의 페리틴 모노머 단편 또는 융합폴리펩티드 24개가 3차원적으로 규칙적으로 배열을 통해 형성된 것일 수 있다.
본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 페리틴 모노머 단편 C-말단, N-말단, 또는 C-말단 및 N-말단에 항체 또는 세포 수용체와 결합할 수 있는 리간드 펩티드가 융합된 융합폴리펩티드를 포함하는 약물전달시스템을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합폴리펩티드는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 약물전달시스템을 제공한다.
본 발명의 약물전달시스템은 본 발명의 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 약물은 예를 들어 특정 질병의 치료 또는 예방 활성이 있는 약물 또는 진단용 약물일 수 있다. 상기 특정 질병은 약물에 의한 치료 또는 예방이 가능한 어떠한 질병도 가능하다. 바람직하게는 상기 특정 질병은 암, 알레르기, 동맥경화 또는 천식 일 수 있다. 상기 약물은 화학적 합성 화합물, 단백질 치료제, 핵산 등 알려진 어떠한 종류의 물질도 가능하며, 바람직하게는 암, 알레르기, 동맥경화 또는 천식 치료용 화학적 합성 화합물, 단백질 치료제, siRNA 등의 핵산 일 수 있다.
본 발명의 융합폴리펩티드는 단백질 케이지를 형성할 수 있으며, 약물을 형성된 단백질 케이지 내부에 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 융합폴리펩티드는 단백질 케이지 형성시 활성폴리펩티드를 외부로 노출시켜 이와 결합하는 분자, 세포 또는 조직과 특이적으로 결합할 수 있으므로, 약물을 상기 분자, 세포 또는 조직에 선택적으로 전달하는 약물전달시스템으로 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 페리틴 모노머 단편의 N말단 및/또는 C말단에 약리학적 활성을 나타내는 약물이 결합할 수 있으므로, 이 경우 본 발명의 융합폴리펩티드는 약물이 페리틴 모노머 단편에 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 결합되어 전달되는 약물전달시스템으로 사용될 수 있다.
본 발명의 약물전달시스템은 본 발명의 융합폴리펩티드에 융합되는 폴리펩티드단편의 종류에 따라 다양한 세포, 조직, 질병을 표적할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 암세포의 표면에 과발현되어 있는 단백질인 p32 수용체에 결합할 수 있는 아미노산 서열(CGKRK)을 포함하는 서열번호 3의 폴리펩티드를 페리틴 모노머 단편의 N-말단에 융합한 후, 융합폴리펩티드의 세포 내 uptake 여부를 관찰하였다. FACS 분석, 형광현미경 분석 및 공초점 현미경 Z-stack 분석을 통해 확인한 결과, 본 발명의 융합폴리펩티드가 암세포 내부로 uptake 되어 있음을 확인하여 본 발명의 융합폴리펩티드가 표적 세포로 약물을 전달하기 위한 플랫폼으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다(실시예 5).
본 발명은 또한 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 페리틴 모노머 단편의 C-말단, N-말단, 또는 C-말단 및 N-말단에 세포독성 펩티드 또는 단백질이 융합된 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 융합폴리펩티드는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 융합폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서는, 페리틴 모노머 단편에 세포사멸 유도 펩티드(pro-apoptotic peptide)가 융합된 융합펩티드를 제작하여 암세포에 대한 세포독성을 평가한 결과, 본 발명의 융합폴리펩티드가 농도 의존적으로 암세포의 세포사멸을 유도하는 것으로 확인되었다(실시예 6).
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 융합폴리펩티드를 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1 mg 내지 500 mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 페리틴 모노머 단편 C-말단, N-말단, 또는 C-말단 및 N-말단에 형광 단백질이 융합된 융합폴리펩티드를 포함하는 생체 이미징 시스템을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 융합폴리펩티드는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 생체 이미징 시스템을 제공한다.
본 발명에 따른 페리틴 모노머 단편에 형광단백질이 융합된 융합폴리펩티드는 생체 이미징 시스템으로 활용될 수 있으며, 상기 시스템은 유동세포분석기(FACS) 또는 공초점현미경 등을 이용하여 세포 내 형광을 측정함으로써 생체 내 화상을 전달하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 암세포 표면에서 과발현되어 있는 단백질인 p32 수용체에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 서열번호 3의 폴리펩티드를 페리틴 모노머 N-말단에 융합하고, 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP)을 C-말단에 융합한 후, FACS, 형광현미경 및 공초점 현미경 Z-stack 분석을 시행하였다. 그 결과, 암세포 내에서 녹색 형광이 강하게 발현되는 것을 확인하여 본 발명의 융합폴리펩티드가 질병의 진단에 유용하게 사용될 수 있는 생체 이미징 시스템을 제공할 수 있다는 것을 알 수 있었다(실시예 5).
특히, 본 발명의 융합폴리펩티드는 페리틴 케이지 내부, N-말단 또는 C-말단에 질병 치료용 약물들을 자유롭게 포함할 수 있고, 동시에 N-말단 또는 C-말단에 형광 단백질을 융합함으로써 질병의 진단과 동시에 치료에도 응용할 수 있어 그 효용성이 매우 우수하다.
이상 살펴본 바와 같이, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 모노머 단편의 N-말단 및/또는 C-말단에 폴리펩티드 또는 단백질이 융합된 융합폴리펩티드는 그 생산 효율이 매우 우수하며, 자가조립에 의해 단백질 케이지를 형성하여 내부에 유효물질의 봉입이 가능하고, 3차원적 구조 특성상 입체 가리움 효과가 적어 N-말단 또는 C-말단에 융합된 폴리펩티드 또는 단백질의 생리학적 활성이 우수하게 나타난다는 점에서 질병의 진단 또는 치료제 개발에 효과적이다.
도 1은 야생형의 페리틴 모노머, V 헬릭스가 제거된 짧은 페리틴 모노머 및 각각의 페리틴 모노머로 이루어진 페리틴 cage의 모식도를 나타낸 도면이다.
도 2A는 짧은 페리틴 모노머의 C-말단에 GFP가 결합된 융합 펩티드(sFt-GFP) 및 야생형의 페리틴 모노머의 C-말단에 GFP가 결합된 융합 펩티드(wFt-GFP)의 모식도를 나타낸 도면이다.
도 2B는 sFt-GFP 및 wFt-GFP가 cage를 형성하는지 여부를 TEM 이미징으로 관찰한 결과이다.
도 3은 sFt-GFP 및 wFt-GFP를 MMP-2와 1시간 동안 37℃에서 배양한 후 링커가 절단되는 경향을 SDS-PAGE 분석을 통해 관찰한 결과이다(FT: ferritin)
도 4는 sFt-GFP 및 wFt-GFP의 정제 분획을 분자량 마커와 함께 SDS-PAGE 분석을 통해 관찰한 결과이다(uninduced:IPTG에 의한 단백질 발현유도 전 whole cell suspension. induced:단백질 발현 유도 후 whole cell suspension. sup: soluble cell lysate (supernatant). ppt:cell lysis precipitant NTA purified from sup: bound fraction to NTA agarose beads from the soluble cell lysate. NTA FT from sup: unbound fraction(flow through)to NTA agarose beads from the soluble cell lysate)
도 5는 sFt의 N-말단에 세포사멸 유도 펩티드(pro-apoptotic peptide) 및 C-말단에 MMP-2에 의해 절단이 가능한 서열을 포함하고 있는 링커에 연결된 GFP를 융합한 융합펩티드(KLAK-sFt-GFP) 단편 및 상기 단편이 형성한 cage의 모식도를 나타낸 도면이다.
도 6A는 야생형 페리틴, 짧은 페리틴, sFt-GFP 융합펩티드 및 KLAK-sFt-GFP 융합펩티드가 cage를 형성하는지 여부를 TEP 이미징으로 관찰한 결과이다.
도 6B는 짧은 페리틴, sFt-GFP 융합펩티드 및 KLAK-sFt-GFP 융합펩티드가 형성한 cage를 SEC로 분석한 결과이다.
도 7A는 sFt의 C-말단에 MMP-2에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열을 갖고 있는 링커를 통해 GFP를 결합한 융합펩티드(제I형) 및 sFt의 C-말단 및 N-말단에 MMP-2에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열을 갖고 있는 링커를 통해 GFP 및 세포사멸 유도 펩티드를 각각 결합한 융합펩티드(제II형)의 모식도를 나타낸 도면이다.
도 7B는 제I형 및 제II형 융합펩티드에 MMP-2를 처리한 후 절단된 산물을 SDS PAGE겔에 로딩하여 관찰한 결과이다.
도 8은 세포주에서 sFt-GFP 융합펩티드 및 KLAK-sFt-GFP 융합펩티드를 처리한 후 융합펩티드의 세포 내 uptake 여부를 관찰한 결과이다(A: MDA-MB-231 세포주(암표적 펩타이드 수용체 (p32) 발현 세포, 왼쪽 패널)와 HL-60 세포주(p32를 발현하지 않는 대조군 세포, 오른쪽 패널)의 FACS 분석결과, B: 형광 현미경 관찰 결과, C: 공초점 현미경 Z-stack 분석 결과).
도 9A는 KLAK-sFt-GFP 융합펩티드의 세포독성을 MTT assay를 통해 평가한 결과이다.
도 9B는 KLAK-sFt-GFP 융합펩티드의 세포독성을 FACS를 이용하여 평가한 결과이다.
도 10은 KLAK-sFt-GFP 융합펩티드의 생체 내 세포 사멸 활성을 평가한 것으로, 공초점 현미경을 이용하여 동물실험을 통해 획득한 종양의 조직학적 검사를 실시한 결과이다(Nuclear: blue, apoptotic region: red, Scale bar=40μm).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법>
1. CGKRK(KLAKLAK) 2 및 GFP 가 짧은 페리틴 모노머(short- ferritin monomer)에 융합된 융합 펩티드(KLAK-sFt-GFP)의 제작
Double Chambered Nano Cage(DCNC)를 발현하는 재조합 플라스미드를 변형된 pET28 벡터(Novagen)를 이용하여 제작하였다. 효율적인 클로닝을 위해 변형된 pET28 벡터는 NcoI/NdeI 사이에 KpnI 및 NheI, 그리고 EcoRI/Sa1I 사이에 SpeI의 추가적인 제한효소 위치를 포함하고 있다. 짧은 페리틴(short-ferritin, sFt) heavy chain(1~161 amino acid)을 인코딩 하는 유전자는 인간 페리틴 heavy chain(Sino Biological Inc.)의 cDNA를 이용한 PCR을 통해 얻었으며, 종래 보고된 방법(ACS nano 2013, 7, (9), 7462-7471. 등)에 따라 박테리아-발현을 이용하기 위해 NdeI 및 BamH1 위치에 삽입되었다.
CGKRK(KLAKLAK)2를 인코딩 하는 올리고뉴클레오티드가 합성되었고 KpnI 및 NheI 사이에 삽입되었다. seGFP(signal enhanced Green Fluorescent Protein) 유전자는 PCR을 통해 준비 되었으며 Spe1 및 XhoI 사이에 삽입되었다. 합성된 유동성 있는 링커(GSGGGSG)는 BamHI 및 EcoRI 사이에 삽입되었고, MMP-2 절단 서열(GPLGLAGGGSG)은 합성된 후 EcoRI 및 SpeI 사이에 삽입되었다. 상기 서열은 최종적으로 GFP와 페리틴 모노머 사이에 GSGGGSGEFGPLGLAGGGSGTS 의 서열을 갖는 링커를 생성하였다.
N-말단 chamber와 페리틴 모노머 사이에 MMP2 절단 부위를 삽입하기 위해, GPLGLAG 서열이 합성되었고, NheI 및 NdeI 사이에 삽입되었다.
sFt-GFP 융합 펩티드는 CGKRK(KLAKLAK)2를 삽입하는 것을 제외하고는 상기와 동일한 클로닝 방법에 따라 제작되었다.
2. 단백질 발현 및 정제
단백질은 E. coli BL21(DE3) 세포에서 과발현 되었다. 세포는 LB배지에서 37℃에서 키운 후 OD600 값이 0.5에 도달하면 IPTG 1mM을 이용하여 발현을 유도하였다. 이 후 세포를 원심분리를 통해 모은 후, 펠렛을 lysis 버퍼(20mM Tris-HCl pH 8.0, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 1% TritonX-100, 1mM PMSF, 0.5mM DTT)를 이용하여 세포를 파괴하였고, 초음파 프로세서와 함께 파쇄하였다. 세포 lysate로부터 얻어진 발현된 단백질은 NTA 아가로스 비드를 이용하여 종래 보고된 방법(J. Analytical chemistry 2011, 83, (15), 5834-5843)에 따라 정제하였다.
3. KLAK-sFt-GFP DCNC의 확인
단백질 정제 이후에, 단백질은 size exclusion chromatography(SEC, Superdex 200 10/300 GL column)을 이용하여 분석하였다. 올리고머 상태는 용출 부피와 표준 분자량과의 비교를 통해 판단하였다. 단백질 용출 프로파일은 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 관찰하였다. TEM 사진은 FEI Tecnai(the Korea Basic Science Institute, KBSI)를 사용하여 기록되었다.
4. 재조합된 MMP-2에 의한 KLAK-sFt-GFP DCND의 절단
재조합 MMP-2는 R&D systems(Minneapolis, MN, USA)에서 구매하여 사용하였고, 제조자의 지시에 따란 절단 시험에 이용하였다. MMP-2는 처음에 APMA(p-aminophenylmercuric acetate; 1mM, Sigma, Saint Louis, MO, USA)와 함께 1시간 동안, 37℃에서 배양하여 활성화를 시켰다. 활성화된 MMP-2(0, 25, 50, 100 ng)을 20 μg의 DCNC에 첨가하여 최종 부피 TCBN 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 및 0.05% Grij-35) 40 μl가 되도록 하였다. 1시간 동안 37℃에서 배양한 후, DCNC 단독 또는 MMP-2와 반응시킨 DCNC를 12% SDS-PAGE에 로딩하였다.
5. 세포 결합 및 세포 내 uptake 평가
인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231세포(ATCC, Manassas, VA)를 DMEM(high glucose)에서 배양하였다. 세포 내 흡수를 분석하기 위하여 2 × 105 의 세포를 KLAK-sFt-GFP DCNC 또는 sFt-GFP와 함께 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이 후 세포를 PBS로 세척하고, 다시 부유시킨 후, 세포 녹색 형광을 FACS Calibur cytometry(BD Biosciences, SanJose, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 현미경 분석을 위하여, MDA-MB-231 세포는 8개의 chamber culture slide에 1 × 105 세포/chamber 의 밀도로 시딩하였으며, 하룻밤 동안 부착할 수 있도록 배양하였다. 세포는 1.4 μM의 KLAK-sFt-GFP DCNC 또는 sFt-GFP와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 핵은 DAPI로 염색하였고, 슬라이드를 형광 현미경을 이용하여 분석하였다. 세포질 내 나노파티클의 분포를 관찰하기 위해, 공초점 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하였고, 세포는 lectin으로 세포막을 염색하여 z-sectional 이미징하였다.
6. KLAK-sFt-GFP DCNC 의 세포독성 평가
MDA-MB-231 세포주를 이용하여 KLAK-sFt-GFP DCNC의 세포독성을 평가하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고 24시간 동안 배양하였다. 이 후 배양 배지를 KLAK-sFt-GFP DCNC(0.5 내지 4 μM)이 포함된 새로운 DMEM 배지로 교체하였다. 대조군으로서, 4 μM sFt-GFP를 배지에 첨가하였다. 총 48시간의 배양 후에, 세포 생존률을 MTT 어세이를 통해 평가하였다.
세포사멸(apoptosis) 유발 여부는 아넥신 V-Alexa Fluor 647 (Invitrogen) 및 propidium iodide(PI)을 이용하여 FACS를 통해 평가하였다.
1 × 105 의 MDA-MB-231 세포를 0.35, 0.7 및 1.4 μM의 KLAK-sFt-GFP DCNC가 포함된 배지에서, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세포는 PBS와 binding buffer(10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2)를 이용하여 3회 세척하였다. 세척된 세포는 아넥신 V-Alexa Fluor 647 및 PI와 함께 37℃에서 20분간 배양하였고, 즉시 FACS를 통해 분석하였다. 세포사멸(apoptosis)의 대조군으로서, etoposide(50 μM, Sigma)를 세포에 처리하여 관찰하였다.
7. 마우스 모델에서 KLAK-sFt-GFP DCNC의 세포사멸 효과
모든 동물실험은 기관의 지침에 따라 수행하였고 경북대학교 동물 관리 및 사용위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 지침에 따라 승인된 동물 실험 방법에 따라 실시하였다(허가번호 KNU 2015-0017). 동물의 고통을 최소화하기 위해 노력했다. 6 내지 8 주령이고, 몸무게가 20±3g인 암컷 BALB/c 누드 마우스(그룹당 4마리, 총 16마리)의 오른쪽 어깨에 MDA-MB-231 세포(1×106)를 감염시켰다. 100mm3 종양이 관찰되었을 때, 30μmol/L인 KLAK-sFt-GFP 100μL를 하루에 한번씩 일주일에 3번 정맥주사로 투여하였다. 비교를 위해 KLAK 펩티드 단독, sFt-GFP + KLAK 펩티드 또는 식염수를 같은 양으로 사용하였다. 4번 투여한 후(9일 후), 동물들을 CO2로 안락사시켰고, 동물에서 종양 조직을 제거했고, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, PFA)로 밤새 고정시킨 뒤, 냉동 절편(cryosectioning)으로 동결시켰으며, 공초점 현미경(Zeiss, Germany)으로 면역 조직 화학적(immunohistochemical) 연구를 실시하였다. 제조사의 지침에 따라 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) 염색법으로 종양 조직에서의 세포 사멸을 평가하였다.
<실험결과(실시예)>
<실시예 1>
짧은 페리틴(short ferritin, sFt) 모노머의 제작 및 이의 특성
펩티드, 화학물질 및 단백질들로 표면이 다양하게 변형된 페리틴이 cage 구조를 형성할 수 있는지 여부가 검증되어 왔다. Cage의 표면에 리간드를 노출시키기 위해 두 가지의 위치가 빈번하게 선택되었으며, 이는 페리틴 모노머의 N-말단과 IV번 및 V번 헬릭스 사이에 존재하는 짧은 루프(loop)이다. Cage의 내부에 위치하고 있는 구부러진 헬릭스 V는 페리틴의 C-말단에 큰 단백질 단편이 결합될 경우, cage의 외부로 돌출이 된다.
본 발명자들은 이중 기능성을 나타내는 나노 프랫폼을 개발하기 위해여, 페리틴 모노머의 다섯 번째 헬릭스를 제거함으로써 짧은 페리틴(sFt) 모노머를 만들었고(도 1), 야생형의 페리틴(wFt)과 그 특성을 비교하였다.
즉, sFt과 wFt의 특성을 비교하기 위해 sFt 및 wFt 각각의 C-terminal 말단에 비교적 크기가 큰 펩티드인 GFP를 융합하여 sFt-GFP 및 wFt-GFP 융합 펩티드를 제작하였고(도 2A), 상기 두 융합 펩티드 모두 cage를 잘 형성하는 것을 TEM(transmission electro microscopy)를 통해 확인하였다(도 2B).
상기 sFt-GFP 및 wFt-GFP는 모두 E.coli에서 잘 발현이 되었고, 양자 모두 cage를 잘 형성하였지만, sFt-GFP가 wFt-GFP와 비교해 세 배 정도 더 많이 발현이 되어, 그 단백질 발현이 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다.
뿐만 아니라, sFt-GFP는 wFt-GFP와 비교해 MMP-2에 의해 더 쉽게 절단이 되는 것으로 확인되었고(도 3), NTA-아가로스 비드에 의해 sFt-GFP의 N-말단에 부착된 히스티딘 tag가 wFt-GFP의 N-말단에 부착된 히스티딘 tag에 비해 훨씬 더 효율적으로 분리가 되는 것으로 되는 것을 확인할 수 있었다(도 4).
상기한 결과를 통해, wFt의 C-말단에 거대한 분자인 GFP가 결합된 융합 펩티드는 공간 구조적으로 매우 밀집되어 MMP-2에 의해 절단되는 링커 부위가 쉽게 노출이 되지 않으며, N-말단에 부착된 6개의 히스티딘 tag가 입체적으로 상당히 가리워져 있을 것으로 판단할 수 있었다. 이에 반해, 야생형 페리틴 모노머에서 V 헬릭스가 제거된 sFt의 경우, C-말단에 거대한 분자인 GFP가 결합되어 있음에도 불구하고 MMP-2에 의해 쉽게 절단이 되었으며, N-말단에 부착된 히스티딘 tag가 용이하게 분리가 되는 것이 미루어 보아, wFt에 비해 공간 구조적으로 상당히 노출이 되어 있다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 2>
세포사멸 유도 펩티드 및 GFP가 sFt에 융합된 융합펩티드의 제작
상기한 실험 결과를 통해, sFt이 펩티드 및/또는 단백질의 이중 전달체로서 사용이 가능할 뿐만 아니라, 효소에 의한 절단이 용이하여 목적 부위에서 융합된 펩티드의 방출이 용이하다는 것을 알았고, 이에, 본 발명의 발명자들은 sFt의 N-말단에 세포사멸 유도 펩티드(pro-apoptotic peptide)인 CGKRK(KLAKLAK)2를, 그리고 sFt의 C-말단에 MMP-2에 의해 절단이 될 수 있는 서열을 포함하고 있는 링커에 연결된 GFP를 융합한 융합 펩티드(KLAK-sFt-GFP)를 제작하였다(도 5).
<실시예 3>
KLAK-sFt-GFP 융합펩티드의 cage 형성 테스트
KLAK-sFt-GFP 융합펩티드가 cage를 잘 형성하는지 여부를 판단하기 위해 size-exclusion chromatography(SEC) 및 TEM(transmission electron microscopy)를 통해 관찰하였다. 또한, cage 형성의 경향을 비교하기 위해 야생형의 페리틴(wFt), sFt 및 sFt-GFP 융합펩티드의 cage 형성도 함께 관찰하였다.
이에 대한 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6A에 나타낸 바와 같이, KLAK-sFt-GFP 융합펩티드는 wFt, sFt 및 sFt-GFP 융합펩티드와 함께 일정한 크기의 cage를 잘 형성하는 것을 확인할 수 있었다. KLAK-sFt-GFP 융합펩티드 및 sFt-GFP 융합펩티드는 wFt, sFt과 비교해 그 cage의 형태가 크다는 것도 함께 확인할 수 있었다.
도 6B에 나타낸 바와 같이, SEC 분석 결과 KLAK-sFt-GFP 융합펩티드 및 sFt-GFP 융합펩티드는 sFt과 비교해 보다 이른 시점에서 단백질의 방출이 나타났다는 점에서 cage의 크기가 sFT에 비해 더 크다는 것을 알 수 있었다.
상기한 결과를 통해, sFt의 N-말단 및 C-말단에 펩티드 또는 단백질을 융합한다고 하더라도, cage를 형성하는데 아무런 문제가 없다는 것을 확인하였다.
<실시예 4>
효소에 의한 KLAK-sFt-GFP 융합펩티드 내 링커의 절단
KLAK-sFt-GFP 융합펩티드에 융합되어 있는 펩티드를 연결하고 있는 링커들이 효소에 노출이 될 수 있는지 및 효소에 의해 절단이 될 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다. 제I형 융합펩티드는 sFt의 C-말단에 MMP-2에 의해 절단될 수 있는 서열을 갖고 있는 링커를 통해 GFP를 융합하였고, 제II형 융합펩티드는 sFT의 C-말단 및 N-말단에 상기와 동일한 링커를 연결하여 GFP 및 세포사멸 유도 펩티드를 각각 융합하였다(도 7A). 상기한 두 종류의 융합펩티드에 MMP-2를 처리하고 SDS PAGE 겔에 로딩하여 그 결과를 관찰하였다.
이에 대한 결과를 도 7B에 나타내었다.
도 7B에 나타낸 바와 같이, 제I형 및 제II형 융합펩티드에서 각각의 링커가 절단되어 생성된 산물들이 농도 의존적으로 관찰되었다. 상기한 결과를 통해, 목적하는 펩티드 또는 단백질을 링커를 이용하여 sFt의 C-말단 및/또는 N-말단에 융합할 경우, 링커가 효소에 노출되어 절단될 수 있다는 것을 알 수 있었다.
따라서, sFt의 C-말단 및/또는 N-말단에 특정 효소에 의해 분해될 수 있는 아미노산 서열을 갖고 있는 링커를 결합하여 펩티드 또는 단백질을 융합함으로써, 융합된 펩티드 또는 단백질을 방출할 수 있을 것이다.
<실시예 5>
KLAK-sFt-GFP 융합펩티드의 세포와의 결합 및 세포 내 uptake 평가
특정 암세포의 표면에 과발현되어 있는 단백질인 p32 수용체는, KLAK-sFt-GFP 융합펩티드의 N-말단에 융합된 CGKRK 펩티드를 인식하고, 이를 세포질 내로 uptake할 수 있다. 이에, KLAK-sFt-GFP 융합펩티드의 세포와의 결합 및 세포 내 uptake 여부를 관찰하였다.
우선, MDA-MB-231 세포와 p32를 발현하지 않는 HL-60세포에 KLAK-sFt-GFP 융합펩티드 또는 sFt-GFP 융합펩티드를 처리하고 37℃에서 1시간 배양한 후 FACS를 이용하여 세포 내 형광의 발현 여부를 분석하였다.
이에 대한 결과를 도 8A에 나타내었다. 도 8A에 나타낸 바와 같이, N-말단에 CGKRK 펩티드가 포함되어 있는 KLAK-sFt-GFP 융합펩티드를 처리한 세포군에서는 농도 의존적으로 세포 내에서 형광이 관찰된 반면, sFt의 C-말단에 GFP만을 융합한 sFt-GFP 펩티드를 처리한 세포군에서는 비특이적인 음세포작용(pinocytosis)에 의해 융합펩티드가 세포 내로 이송되어 매우 낮은 형광만이 관찰되는 것을 확인하였다. 또한, HL-60 세포에서는 대조군과 sFt-GFP 펩티드를 처리한 세포군과 같이, KLAK-sFt-GFP DCNC을 처리한 농도와 관계없이, 융합펩티드가 비특이적으로 세포 내로 이송되고 매우 낮은 형광만이 관찰되는 것을 확인하였다.
또한, MDA-MB-231 세포에 KLAK-sFt-GFP 융합펩티드 또는 sFt-GFP 융합펩티드를 처리하고 37℃에서 1시간 배양한 후 형광 현미경으로 융합펩티드의 세포 내 uptake 여부를 관찰하였다.
이에 대한 결과를 도 8B에 나타내었다. 도 8B에 나타낸 바와 같이, KLAK-sFt-GFP 융합펩티드를 처리한 세포군에서는 핵(파란색)과 함께 녹색 형광이 관찰되어, 세포질 내로 융합펩티드가 uptake 된 것을 확인할 수 있는 반면, sFt-GFP 융합펩티드를 처리한 세포군에서는 세포의 핵만 관찰될 뿐 세포질 내에서 녹색 형광이 거의 관찰되지 않는 것을 확인하였다.
한편, KLAK-sFt-GFP 융합펩티드를 처리한 세포를 공초점 현미경 Z-stack 분석을 통해 확인한 결과, 도 8C에 나타낸 바와 같이 빨간색으로 나타난 세포막 내부에서 녹색 형광색이 위치하는 것으로 보아, 융합펩티드가 세포 내로 uptake 되었다는 것을 다시 한번 확인할 수 있었다.
<실시예 6>
KLAK-sFt-GFP 융합펩티드의 세포독성 평가
MDA-MB-231 세포주에 KLAK-sFt-GFP 융합펩티드를 처리한 후 48시간을 배양하고 세포 생존률을 MTT 어세이로 평가하였다.
이에 대한 결과를 도 9A에 나타내었다.
도 9A에 나타낸 바와 같이, KLAK-sFt-GFP 융합펩티드를 처리에 의해 농도 의존적으로 세포의 생존률이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 다만, 48시간 동안 배양하면서 세포의 과다한 분열로 인해 생존률이 크게 억제되지 않아 다른 또 다른 실험을 추가적으로 진행하였다.
즉, KLAK-sFt-GFP 융합펩티드를 세포에 처리한 후, 세포를 아넥신 V 및 propidium iodide(PI) 염색하여 FACS를 통해 세포의 생존률을 평가하였다.
이에 대한 결과를 도 9B에 나타내었다. 세포에 KLAK-sFt-GFP 융합펩티드를 24시간 처리한 후 생존 세포는 70% 까지 감소하였다. 사멸한 세포의 대부분은 아넥신 V만이 염색되었고, 이는 세포사멸(apoptosis)가 일찍 유도 되었다는 것을 의미한다. 한편, KLAK-sFt-GFP 융합펩티드에 의해 유도된 세포사멸은, 양성 대조군으로 사용된 50 μM의 etoposide에 의해 유발된 세포사멸과 유사한 정도였다.
또한, 마우스 이종 모델을 사용하여 KLAK-sFt-GFP DCNC의 세포사멸 효과를 확인하기 위한 동물 실험을 실시하였다. 다음과 같이 4개의 그룹에 각각 식염수(saline), KLAK 펩티드(KLAK), sFt-GFP와 KLAK 펩티드 혼합(sFt-GFP+KLAK), KLAK-sFt-GFP(30 μmol/L)를 정맥 주사법으로 투여하였다.
이에 대한 결과를 도 10에 나타내었다.
다른 그룹에 비하여 KLAK-sFt-GFP를 처리한 경우는 종양 성장에 영향을 미치지 않았으나, 도 10에 나타난 바와 같이, 종양 내에서 세포 사멸(apoptosis)이 발생하는 부위가 증가하였다. 마우스 내에 KLAK-sFt-GFP DCNC를 투여한 양이 종양의 성장을 억제하기에 충분하지 않았음에도 불구하고, KLAK-sFt-GFP DCNC는 종양 내에서 세포 사멸을 촉진시키는 것을 확인할 수 있었다.
결론적으로, 세포사멸 유도 펩티드가 융합된 본 발명의 융합펩티드는 세포 내로 uptake된 이후에 세포의 사멸을 유발한다는 것을 알 수 있었다.
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 모노머 단편의 N-말단 및/또는 C-말단에 폴리펩티드 또는 단백질이 융합된 융합폴리펩티드는 그 생산 효율이 매우 우수하며, 자가조립에 의해 단백질 케이지를 형성하여 내부에 유효물질의 봉입이 가능하고, 3차원적 구조 특성상 입체 가리움 효과가 적어 N-말단 또는 C-말단에 융합된 폴리펩티드 또는 단백질의 생리학적 활성이 우수하게 나타나 질병의 진단 또는 치료제 개발에 효과적이므로 산업상 이용가능성이 매우 높다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Fragment of human ferritin monomer and fusion polypeptide using thereof <130> NP16-0079 <150> KR 10-2015-0124467 <151> 2015-09-02 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human ferritin heavy chain monomer <400> 1 Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 20 25 30 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 50 55 60 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro 115 120 125 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys 130 135 140 Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly 145 150 155 160 Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu 165 170 175 Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser 180 <210> 2 <211> 161 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human ferritin heavy chain monomer fragment <400> 2 Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 20 25 30 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 50 55 60 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro 115 120 125 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys 130 135 140 Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly 145 150 155 160 Ala <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pro-apoptotic peptide <400> 3 Cys Gly Lys Arg Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys 1 5 10 15 Leu Ala Lys <210> 4 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Green fluorescent protein <400> 4 Val Asp Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile 1 5 10 15 Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser 20 25 30 Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe 35 40 45 Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr 50 55 60 Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met 65 70 75 80 Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln 85 90 95 Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala 100 105 110 Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys 115 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Gln Asp Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg 35 40 45 Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser 50 55 60 Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr 65 70 75 80 Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg Glu His Ala Glu Lys Leu Met 85 90 95 Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys 100 105 110 Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys 115 120 125 Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln Ser Leu Leu Glu Leu His 130 135 140 Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His Leu Cys Asp Phe Ile Glu 145 150 155 160 Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp 165 170 175 His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ser 180 185 190 Gly Glu Phe Gly Pro Leu Gly Leu Ala Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser 195 200 205 Val Asp Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile 210 215 220 Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser 225 230 235 240 Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe 245 250 255 Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr 260 265 270 Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met 275 280 285 Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln 290 295 300 Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala 305 310 315 320 Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys 325 330 335 Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu 340 345 350 Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys 355 360 365 Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly 370 375 380 Gly Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp 385 390 395 400 Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala 405 410 415 Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu 420 425 430 Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 435 440 445 <210> 7 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion polypeptide(2) <400> 7 Met Gly Gly Thr Cys Gly Lys Arg Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys 1 5 10 15 Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Ser Gly Pro Leu Gly Leu Ala Gly 20 25 30 His Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln 35 40 45 Asp Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala 50 55 60 Ser Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val 65 70 75 80 Ala Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu 85 90 95 Arg Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly 100 105 110 Arg Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu 115 120 125 Ser Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val 130 135 140 Asn Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp 145 150 155 160 Pro His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val 165 170 175 Lys Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met 180 185 190 Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu Phe Gly Pro Leu Gly Leu 195 200 205 Ala Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ser Val Asp Val Ser Lys Gly Glu Glu 210 215 220 Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val 225 230 235 240 Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr 245 250 255 Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro 260 265 270 Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys 275 280 285 Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser 290 295 300 Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp 305 310 315 320 Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr 325 330 335 Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly 340 345 350 Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val 355 360 365 Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys 370 375 380 Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala Asp His Tyr 385 390 395 400 Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn 405 410 415 His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys 420 425 430 Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr 435 440 445 Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 450 455 <210> 8 <211> 483 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide incoding human ferritin heavy chain monomer <400> 8 atgacgaccg cgtccacctc gcaggtgcgc cagaactacc accaggactc agaggccgcc 60 atcaaccgcc agatcaacct ggagctctac gcctcctacg tttacctgtc catgtcttac 120 tactttgacc gcgatgatgt ggctttgaag aactttgcca aatactttct tcaccaatct 180 catgaggaga gggaacatgc tgagaaactg atgaagctgc agaaccaacg aggtggccga 240 atcttccttc aggatatcaa gaaaccagac tgtgatgact gggagagcgg gctgaatgca 300 atggagtgtg cattacattt ggaaaaaaat gtgaatcagt cactactgga actgcacaaa 360 ctggccactg acaaaaatga cccccatttg tgtgacttca ttgagacaca ttacctgaat 420 gagcaggtga aagccatcaa agaattgggt gaccacgtga ccaacttgcg caagatggga 480 gcg 483 <210> 9 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide incoding fusion polypeptide of sequence No.6 <400> 9 atgggcggta cctgcggcaa gcgcaagaag ctcgcgaagc tcgcgaagaa gctcgcgaag 60 ctcgcgaagg gccatatgac gaccgcgtcc acctcgcagg tgcgccagaa ctaccaccag 120 gactcagagg ccgccatcaa ccgccagatc aacctggagc tctacgcctc ctacgtttac 180 ctgtccatgt cttactactt tgaccgcgat gatgtggctt tgaagaactt tgccaaatac 240 tttcttcacc aatctcatga ggagagggaa catgctgaga aactgatgaa gctgcagaac 300 caacgaggtg gccgaatctt ccttcaggat atcaagaaac cagactgtga tgactgggag 360 agcgggctga atgcaatgga gtgtgcatta catttggaaa aaaatgtgaa tcagtcacta 420 ctggaactgc acaaactggc cactgacaaa aatgaccccc atttgtgtga cttcattgag 480 acacattacc tgaatgagca ggtgaaagcc atcaaagaat tgggtgacca cgtgaccaac 540 ttgcgcaaga tgggagcggg atccggtgga ggatctggtg aattcggacc gctgggacta 600 gccggaggtg gatctggtac tagtgtcgac gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg 660 gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc 720 ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc 780 ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc 840 ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa 900 ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc 960 gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc 1020 aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc 1080 tatatcaccg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggcca acttcaagat ccgccacaac 1140 atcgaggacg gcggcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac 1200 ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac 1260 cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact 1320 ctcggcatgg acgagctgta caag 1344 <210> 10 <211> 1368 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide incoding fusion polypeptide of sequence No.7 <400> 10 atgggcggta cctgcggcaa gcgcaagaag ctcgcgaagc tcgcgaagaa gctcgcgaag 60 ctcgcgaagg ctagcggacc gctgggacta gccggacata tgacgaccgc gtccacctcg 120 caggtgcgcc agaactacca ccaggactca gaggccgcca tcaaccgcca gatcaacctg 180 gagctctacg cctcctacgt ttacctgtcc atgtcttact actttgaccg cgatgatgtg 240 gctttgaaga actttgccaa atactttctt caccaatctc atgaggagag ggaacatgct 300 gagaaactga tgaagctgca gaaccaacga ggtggccgaa tcttccttca ggatatcaag 360 aaaccagact gtgatgactg ggagagcggg ctgaatgcaa tggagtgtgc attacatttg 420 gaaaaaaatg tgaatcagtc actactggaa ctgcacaaac tggccactga caaaaatgac 480 ccccatttgt gtgacttcat tgagacacat tacctgaatg agcaggtgaa agccatcaaa 540 gaattgggtg accacgtgac caacttgcgc aagatgggag cgggatccgg tggaggatct 600 ggtgaattcg gaccgctggg actagccgga ggtggatctg gtactagtgt cgacgtgagc 660 aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta 720 aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg 780 accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc 840 accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac 900 ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac 960 gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc 1020 atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag 1080 tacaactaca acagccacaa cgtctatatc accgccgaca agcagaagaa cggcatcaag 1140 gccaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcggcg tgcagctcgc cgaccactac 1200 cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc 1260 acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag 1320 ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaag 1368

Claims (20)

  1. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 유래 페리틴 모노머 단편.
  2. 제1항의 인간 유래 페리틴 모노머 단편의 C-말단, N-말단, 또는 C-말단 및 N-말단에 펩티드 또는 단백질이 융합된 융합폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 펩티드 또는 단백질은 항체, 수용체와 결합할 수 있는 리간드 펩티드, 단백질 약물, 세포독성 폴리펩티드, 세포독성 단백질 및 형광 단백질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 융합폴리펩티드.
  4. 제2항에 있어서, 상기 펩티드 또는 단백질은 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합폴리펩티드.
  5. 제2항에 있어서, 상기 펩티드 또는 단백질은 인간 유래 페리틴 모노머 단편의 C-말단 또는 N-말단에 링커를 통해 융합된 것을 특징으로 하는 융합폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 링커는 단백질 절단 효소의 기질이 될 수 있는 아미노산 서열을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 융합폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 단백질 절단 효소는 유로키나제(urokinase), 프로-유로키나제(pro-urokinase), 플라스민(plasmin), 플라스미노겐(plasminogen), TGFβ, 스타필로키나제(staphylokinase), 트롬빈(thrombin), 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 및 젤라티나제(gellatinase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 융합폴리펩티드.
  8. 제5항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합폴리펩티드.
  9. 제2항에 있어서, 상기 융합폴리펩티드는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합폴리펩티드.
  10. 제2항에 있어서, 상기 펩티드 또는 단백질은 상기 융합폴리펩티드 간 또는 상기 융합폴리펩티드와 인간 유래 페리틴 모노머 간의 결합을 방해하지 않는 것을 특징으로 하는 융합폴리펩티드.
  11. 제1항의 인간 유래 페리틴 모노머 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  13. 제12항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
  14. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합폴리펩티드를 포함하는 단백질 케이지.
  15. 제1항의 페리틴 모노머 단편 C-말단, N-말단, 또는 C-말단 및 N-말단에 항체 또는 세포 수용체와 결합할 수 있는 리간드 펩티드가 융합된 융합폴리펩티드를 포함하는 약물전달시스템.
  16. 제15항에 있어서, 상기 융합폴리펩티드는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 약물전달시스템.
  17. 제1항의 페리틴 모노머 단편 C-말단, N-말단, 또는 C-말단 및 N-말단에 세포독성 펩티드 또는 세포독성 단백질이 융합된 융합폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 융합폴리펩티드는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  19. 제1항의 페리틴 모노머 단편 C-말단, N-말단, 또는 C-말단 및 N-말단에 형광 단백질이 융합된 융합폴리펩티드를 포함하는 생체 이미징 시스템.
  20. 제19항에 있어서, 상기 융합폴리펩티드는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 생체 이미징 시스템.
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