CN117255690A - 用于预防或治疗肺癌的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及：融合有能够与免疫检查点分子结合的分子的蛋白质；及其用途。本发明的蛋白质具有融合至其外表面的能够与免疫检查点分子结合的分子，由此可用作免疫检查点抑制剂。

Description

用于预防或治疗肺癌的药物组合物

技术领域

本发明涉及用于预防或治疗肺癌的药物组合物。

背景技术

在现代时代，随着医疗技术的进步，不能治愈的疾病几乎消失。然而，与其它疾病不同，癌症需要非常困难且复杂的治疗。目前用于癌症治疗的方法主要包括手术、放射疗法和化学疗法。如果癌症在局部发展并且没有转移至其它部位，可以通过手术去除癌症来治疗。然而，由于在超过70％的癌症患者中发生癌症转移，需要联合辅助治疗方案。

作为辅助治疗方法之一，使用高能辐射执行杀死癌细胞的放射疗法。在放射疗法中，当用辐射照射癌细胞时，癌细胞的增殖受到抑制，使得不会产生新的癌细胞并且癌细胞不会进一步分裂。然而，该方法存在涉及副作用的问题，因为辐射不仅影响癌细胞，还影响正常细胞。

化学疗法是手术后使用药物杀死癌细胞的辅助治疗，其目的在于杀死看不见的癌细胞。然而，化学疗法存在涉及例如呕吐、腹泻和脱发等副作用的问题。

为了使这些副作用最小化，最近出现了免疫治疗方法。免疫疗法是一种使用患者的免疫应答来治疗癌症的方法，甚至可以预防癌症。癌症免疫治疗，类似于疫苗的原理，是一种通过施用导致肿瘤形成的抗原来激活癌症-特异性免疫细胞、然后使激活的免疫细胞特异性地攻击体内的癌症的治疗方法。此外，即使患者不患有癌症，通过向体内施用癌症特异性抗原，失活的免疫细胞被激活为癌症-特异性记忆免疫细胞，以便在发生癌症时特异性地攻击癌细胞。

对于癌症免疫疗法，将癌症-特异性抗原(肿瘤相关抗原(TAA)；和肿瘤特异性抗原(TSA))递送至免疫细胞集中的淋巴结是非常重要的。在肿瘤-特异性抗原中，存在于例如肺癌和肾癌等各种肿瘤类型中、但主要存在于肺癌和黑色素瘤中的新抗原是由于癌症患者中的潜在基因活性或DNA突变而新产生的抗原。因此，该抗原在基于患者的个体遗传信息的“定制化癌症疫苗”的生产中非常重要。

然而，仅将癌症-特异性抗原本身递送至淋巴结的常规尝试并不是非常有效。这是因为肿瘤抗原本身的长度较短，用于放大和激活肿瘤抗原-特异性免疫细胞的肿瘤抗原呈递效果明显较低，因此肿瘤抗原特异性免疫诱导效率也显著较低(非专利文献1)。聚合物被广泛用作体内癌症-特异性抗原的载体，在将癌症抗原固定在用于在体内递送癌症特异性抗原的聚合物的表面时，应当通过化学结合使癌症特异性抗原暴露于颗粒表面。然而，在将癌症-特异性抗原以高密度均匀暴露于颗粒表面方面仍然存在局限性。

与常规抗癌治疗方法相比，癌症免疫疗法由于使用患者的免疫系统，副作用小，并且通过形成免疫记忆，治疗效果可以持续很长时间。此外，由于肿瘤抗原-特异性识别原理，其对一般细胞的影响小，具有几乎无副作用的优点。此外，由于最近在具有复发性或抗癌药物抗性的癌症患者中的临床成功案例，癌症免疫疗法受到了爆炸性的关注，甚至被《科学》杂志评选为2013年度突破。

此外，在中和作为免疫检查点因子的PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)/PD-L1(PD1配体)的抗体治疗的情况中，在黑色素瘤和肺癌中获得了临床结果，反应率(response rate)为20-30％或更高，因此，在未来几年内，癌症免疫疗法很可能作为用于癌症的标准治疗应用于临床环境。然而，免疫检查点因子如PD1/PD-L1或CTLA4特异性免疫活性抑制阻断抗体不能从根本上增强免疫细胞自身的活性，并且由于抗体和抗体的Fc结构域部分在体内长时间停留而导致例如自身免疫性疾病等副作用的发生。此外，由于高消耗导致的高抗体治疗成本以及由于在动物细胞系统中生产和纯化抗体而导致的高生产成本，这反而导致经济上的劣势。

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供用于预防或治疗肺癌的药物组合物，其包含能够与免疫检查点分子结合的蛋白质。

本发明的另一目的在于提供使用上述组合物治疗肺癌的方法。

用于解决问题的方案

为了实现上述目的，本发明提供用于预防或治疗肺癌的药物组合物，其包含铁蛋白，其中能够与免疫检查点分子结合的分子融合至所述蛋白的外表面。

所述蛋白可以是由融合有能够与免疫检查点分子结合的分子的24个铁蛋白单体的自组装而形成的球状蛋白质。

所述能够与免疫检查点分子结合的分子可融合在铁蛋白单体的α-螺旋中的至少一个的内部，或融合至铁蛋白单体的相邻α-螺旋之间的至少一处。

所述能够与免疫检查点分子结合的分子可融合至铁蛋白单体的N-末端或C-末端。

所述能够与免疫检查点分子结合的分子可融合在铁蛋白单体的A螺旋、B螺旋、C螺旋、D螺旋或E螺旋的内部。

所述能够与免疫检查点分子结合的分子可融合至铁蛋白单体的A-B环、B-C环、C-D环或D-E环。

所述能够与免疫检查点分子结合的分子可融合在铁蛋白单体的N-末端和A螺旋之间或E螺旋和C-末端之间。

所述蛋白可经突变而使得减少对人转铁蛋白受体的结合力。

构成所述蛋白的铁蛋白单体中的至少一个的特征在于SEQ ID NO:1的序列中的氨基酸No.15、16、23、82、84、117、120或124被丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或亮氨酸取代。

所述铁蛋白对转铁蛋白受体的结合力(K)可满足以下等式1：

[等式1]

K≥10nM

(等式1中，K为[P][T]/[PT]，其中[P]表示铁蛋白和转铁蛋白受体之间的结合反应的平衡状态中的铁蛋白的浓度，[T]表示平衡状态中的转铁蛋白受体的浓度，和[PT]表示平衡状态中的铁蛋白和转铁蛋白受体的复合物的浓度)。

所述转铁蛋白受体可以是人转铁蛋白受体。

所述免疫检查点分子可以是选自由以下组成的组中的任一种：Her-2/neu、VISTA、4-1BBL、半乳糖凝集素-9(Galectin-9)、腺苷A2a受体、CD80、CD86、ICOS、ICOSL、BTLA、OX-40L、CD155、BCL2、MYC、PP2A、BRD1、BRD2、BRD3、BRD4、BRDT、CBP、E2F1、MDM2、MDMX、PPP2CA、PPM1D、STAT3、IDH1、PD1、CTLA4、PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM3、TIGIT、BTLA、SLAMF7、4-1BB、OX-40、ICOS、GITR、ICAM-1、BAFFR、HVEM、LFA-1、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、LAIR1、2B4、CD2、CD3、CD16、CD20、CD27、CD28、CD40L、CD48、CD52、EGFR家族、AXL、CSF1R、DDR1、DDR2、EPH受体家族、FGFR家族、VEGFR家族、IGF1R、LTK、PDGFR家族、RET、KIT、KRAS、NTRK1和NTRK2。

所述能够与免疫检查点分子结合的分子可以是对免疫检查点分子具有结合力的配体或其片段、受体或其片段、抗体或其包括抗原结合区(CDR)的片段。

所述铁蛋白可以是人铁蛋白重链。

本发明的铁蛋白以40％以上的水溶性级分存在于大肠杆菌(E.coli)生产系统中。

发明的效果

本发明的蛋白质对免疫检查点分子具有优异的结合力。

本发明的蛋白质通过防止免疫检查点分子使T细胞失活而使T细胞杀伤癌细胞。

本发明的蛋白质可融合与各种免疫检查点分子结合的分子。

本发明的蛋白质能够与各种免疫检查点分子结合。

本发明的用于预防或治疗癌症的药物组合物具有优异的抗癌功效。

附图说明

图1是用于制备野生型(native)人铁蛋白重链(huHF)和突变型人铁蛋白重链蛋白质的基础载体的示意图。

图2是用于生产huHF_Mutant1-dual的载体的示意图，和证实了铁蛋白的生产的图。

图3是用于生产huHF_Mutant1-h_smPD1的载体的示意图，和证实了铁蛋白的生产的图。

图4示出了铁蛋白针对小鼠肺癌细胞系LLC1的靶向能力的评价结果。

图5示出了铁蛋白针对人肺癌细胞系A549的靶向能力的评价结果。

图6示出了铁蛋白针对小鼠肺癌细胞系LLC1的靶向能力的评价结果。

图7示出了铁蛋白针对人肺癌细胞系A549的靶向能力的评价结果。

图8和9分别示出了huHF_native-h_smPD1和huHF_Mutant1-h_smPD1对人转铁蛋白受体的结合力的评价结果。

图10示出了huHF_Mutant1-dual对人转铁蛋白受体的结合力的评价结果。

图11示出了huHF_Mutant1-dual和huHF_Mutant2-dual对人转铁蛋白受体的结合力的评价结果。

图12示出了根据huHF_mutant1-dual处理，NK细胞和癌细胞之间的结合能力的评价结果。

图13和14示出了根据huHF_mutant1-dual处理，NK细胞和癌细胞之间的结合能力的评价结果。

图15示出了根据huHF_mutant1-dual处理，NK细胞的癌细胞杀伤能力的评价结果。

图16是显示LLC1肺癌的动物模型的制备和肿瘤抑制实验的示意图。

图17和18示出了根据huHF_mutant1-dual处理，肿瘤生长抑制的评价结果。

图19至21示出了huHF_mutant1-dual对肺癌细胞系A549的亲合力的评价结果。

图22示出了在使用huHF_mutant1-dual或与抗癌剂组合使用huHF_mutant1-dual时，LLC1肺癌的动物模型中的肿瘤生长抑制的评价结果。

图23和24分别是用于生产其中外源肽融合至螺旋的铁蛋白的载体的示意图，并示出了蛋白质生产结果。

具体实施方式

本发明涉及用于预防或治疗肺癌的药物组合物，其包含铁蛋白，其中能够与免疫检查点分子结合的分子融合至所述蛋白的外表面。

所述铁蛋白可以是源自人、动物和微生物的铁蛋白。

人铁蛋白由重链(21kDa)和轻链(19kDa)构成，表现出通过构成铁蛋白的单体的自组装能力形成球状纳米颗粒的特征。所述铁蛋白可以通过聚集24个单体而形成具有球状三维结构的自组装体。

对于人铁蛋白，外直径为约12nm，内直径为约8nm。铁蛋白单体的结构是其中五个α-螺旋结构即A螺旋、B螺旋、C螺旋、D螺旋和E螺旋顺序连接的形式，并且可包括称为环的连接具有各α-螺旋结构的多肽的非经典多肽部分。

所述环是即使在将肽或小蛋白质抗原插入至铁蛋白时结构上也不断裂的区域。本文中，使用克隆融合肽，使得可以制备肽-铁蛋白融合蛋白单体，其中例如表位等肽位于铁蛋白单体中。连接A螺旋和B螺旋的环称为A-B环，连接B螺旋和C螺旋的环称为B-C环，连接C螺旋和D螺旋的环称为C-D环，连接D螺旋和E螺旋的环称为D-E环。

关于铁蛋白的信息可从NCBI(GenBank登记号No.NM_000146或NM_002032等)获知。

所述铁蛋白可以是铁蛋白重链，具体地，人铁蛋白重链。人铁蛋白重链可以是由源自人的SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的蛋白质，并且在本说明书中，所述铁蛋白可以与“人铁蛋白重链”或“huHF”可交换地使用。

所述铁蛋白可以是铁蛋白单体。因此，其可以是铁蛋白重链单体或人铁蛋白重链单体。

铁蛋白通过其几个单体的自组装而形成有组织的结构或模式。本发明的铁蛋白是纳米级颗粒。例如，融合有能够与免疫检查点分子结合的分子的24个铁蛋白单体可以自组装以形成铁蛋白。

铁蛋白可以具有球状形状。在球状形状的情况中，例如，粒径可为8至50nm。更具体地，其可为8至50nm、8至45nm、8至40nm、8至35nm、8至30nm、8至25nm、8至20nm、或8至15nm。

所述铁蛋白是由在其外表面上融合能够与免疫检查点分子结合的分子而产生的。只要所述能够与免疫检查点分子结合的分子融合至铁蛋白的外表面，所述能够与免疫检查点分子结合的分子不需要融合至构成铁蛋白的所有铁蛋白单体。

例如，当融合有能够与免疫检查点分子结合的分子的24个铁蛋白单体自组装以形成铁蛋白时，能够与免疫检查点分子结合的分子融合至24个铁蛋白单体中的至少一个铁蛋白单体是足够的。为了增加铁蛋白的外表面上能够与免疫检查点分子结合的分子的密度，所有24个铁蛋白单体可以融合至能够与免疫检查点分子结合的分子。

一个或两个以上的能够与免疫检查点分子结合的分子可以融合至构成铁蛋白的每个铁蛋白单体。构成铁蛋白的每个铁蛋白单体可以融合有能够与不同的免疫检查点分子结合的分子。构成铁蛋白的每个铁蛋白单体可以融合有能够与相同免疫检查点分子结合的不同分子。

免疫检查点分子可以结合至T细胞并使其失活。这样的免疫检查点分子可以包括例如Her-2/neu、VISTA、4-1BBL、半乳糖凝集素-9、腺苷A2a受体、CD80、CD86、ICOS、ICOSL、BTLA、OX-40L、CD155、BCL2、MYC、PP2A、BRD1、BRD2、BRD3、BRD4、BRDT、CBP、E2F1、MDM2、MDMX、PPP2CA、PPM1D、STAT3、IDH1、PD1、CTLA4、PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM3、TIGIT、BTLA、SLAMF7、4-1BB、OX-40、ICOS、GITR、ICAM-1、BAFFR、HVEM、LFA-1、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、LAIR1、2B4、CD2、CD3、CD16、CD20、CD27、CD28、CD40L、CD48、CD52、EGFR家族、AXL、CSF1R、DDR1、DDR2、EPH受体家族、FGFR家族、VEGFR家族、IGF1R、LTK、PDGFR家族、RET、KIT、KRAS、NTRK1和NTRK2等。

所述能够与免疫检查点分子结合的分子可以是对免疫检查点分子具有结合力的配体或其片段、受体或其片段、抗体或其包含抗原结合位点(CDR)的片段。

能够与免疫检查点分子结合的分子可以融合至铁蛋白单体的任何部分，只要它们可以暴露于铁蛋白的外表面即可。所述能够与免疫检查点分子结合的分子融合在不干扰铁蛋白单体的自组装的位置。

所述能够与免疫检查点分子结合的分子可以融合在铁蛋白单体的内部以改变铁蛋白的结构。在铁蛋白单体的各组分中，内部凹陷的部分可以通过其与能够与免疫检查点分子结合的分子的融合而突出至外部。另一方面，在铁蛋白单体的各组分中，突出至外部的部分可以通过其与能够与免疫检查点分子结合的分子的融合而内部凹陷。

所述能够与免疫检查点分子结合的分子优选融合至铁蛋白减少对人转铁蛋白受体的结合力或干扰与人转铁蛋白受体的结合的位置。

能够与免疫检查点分子结合的分子在其结构、分子量和氨基酸长度方面不限于特定范围。

所述能够与免疫检查点分子结合的分子可以是例如其氨基酸长度为25aa以下的配体、抗体、或片段。更具体地，氨基酸长度可为25aa以下、24aa以下、23aa以下、22aa以下、21aa以下、20aa以下、19aa以下、18aa以下、17aa以下、16aa以下、15aa以下、14aa以下、13aa以下、12aa以下、11aa以下、10aa以下、9aa以下、8aa以下、7aa以下、6aa以下、5aa以下。此外，例如，氨基酸长度可为3aa以上、4aa以上、5aa以上、6aa以上、7aa以上、8aa以上、9aa以上、10aa以上。

能够与免疫检查点分子结合的分子的融合位点不限于特定位置，例如，融合可以在铁蛋白单体的α-螺旋(A螺旋、B螺旋、C螺旋、D螺旋或E螺旋)的内部、相邻α-螺旋之间、N-末端、C-末端、A-B环、B-C环、C-D环、D-E环、N-末端和A螺旋之间、E螺旋和C-末端之间、螺旋的内部等进行。

此外，本发明的蛋白质可进一步包括外源肽，所述外源肽融合在铁蛋白单体的α-螺旋(A螺旋、B螺旋、C螺旋、D螺旋或E螺旋)的内部、相邻α-螺旋之间、N-末端、C-末端、A-B环、B-C环、C-D环、D-E环、N-末端和A螺旋之间、E螺旋和C-末端之间、螺旋的内部等。所述外源肽可以是药理学活性肽。

由于铁蛋白设计成与免疫检查点分子结合，优选其不与转铁蛋白受体良好结合。例如，铁蛋白对于转铁蛋白受体满足以下等式1：

[等式1]

K≥10nM

(等式1中，K为[P][T]/[PT]，其中[P]表示铁蛋白和转铁蛋白受体之间的结合反应的平衡状态中的铁蛋白的浓度，[T]表示平衡状态中的转铁蛋白受体的浓度，和[PT]表示平衡状态中的铁蛋白和转铁蛋白受体的复合物的浓度)。

所述结合力可以是例如对人转铁蛋白受体的结合力。

等式1的K值为10nM以上、20nM以上、30nM以上、40nM以上、50nM以上、60nM以上、70nM以上、80nM以上、90nM以上、100nM以上、110nM以上、120nM以上、125nM以上、超过125nM、150nM以上、200nM以上、210nM以上、220nM以上、230nM以上、240nM以上、250nM以上、260nM以上、270nM以上、280nM以上、290nM以上、300nM以上、350nM以上、400nM以上、450nM以上、500nM以上、550nM以上、600nM以上、700nM以上、800nM以上、900nM以上、或1000nM以上。等式1中的K的值越大，对转铁蛋白受体的结合力越低。上限可为例如100,000nM、90,000nM、80,000nM、70,000nM、60,000nM、50,000nM、10,000nM、9,000nM、8,000nM、7,000nM、6,000nM或5,000nM等，但不限于此。

对转铁蛋白受体的结合力(K)是在本发明的铁蛋白(A)和转铁蛋白受体之间的结合反应的平衡状态中测定的。平衡状态中的铁蛋白的浓度([P])、转铁蛋白受体的浓度([T])、和本发明的蛋白质与转铁蛋白受体的复合物的浓度([PT])可通过各种已知方法测定。

铁蛋白可使能够与免疫检查点分子结合的分子融合至参与与转铁蛋白受体的结合的位点以减少对转铁蛋白受体的结合力。例如，该蛋白质可使能够与免疫检查点分子结合的分子融合至位于本发明的铁蛋白的B-C环和A螺旋部分。

铁蛋白可以经突变而使得减少对人转铁蛋白受体的结合。例如，SEQ ID NO:1的序列中的氨基酸No.15、16、23、82、84、117、120或124可被丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或亮氨酸取代。

所述铁蛋白可以在表达编码相应蛋白质的序列的微生物中生产。

可以使用本领域已知的微生物而没有对其的限制。例如，其可为大肠杆菌，具体地，BL21(DE3)，但不限于此。

在通过微生物系统生产蛋白质的情况下，仅在所得蛋白质以溶解状态存在于细胞质中时，容易进行分离/纯化。在许多情况中，所制备的蛋白质以聚集状态作为内涵体(inclusion body)等存在。本发明的铁蛋白在微生物生产系统中在细胞质中具有高裂解率。因此，容易进行分离/纯化并使用。

铁蛋白可以例如在用于生产铁蛋白的大肠杆菌系统中以总蛋白质的水溶性级分比率为40％以上的状态来制备。具体地，级分比率可为40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上。其上限可为例如100％、99％、98％、97％、或96％等。

本发明的药物组合物可以包括药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不抑制所施用的组分的生物活性和性质且不显著刺激生物体的载体或稀释剂。本发明中的药学上可接受的载体可以是盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇中的一种组分、或一种以上的组分的混合物。此外，根据需要，可以添加其它常规添加剂如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂以配制适用于注入组织或器官的注射剂。此外，它可被配制成等渗无菌溶液，或者在某些情况下，可被配制成可以通过添加无菌水或生理盐水而成可注射溶液的干燥制剂(尤其是冻干制剂)。此外，靶器官-特异性抗体或其它配体可以与载体组合使用，以便特异性地作用于靶器官。

此外，本发明的组合物还可以包括填料、赋形剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂。此外，可以使用本领域已知的方法配制本发明的组合物，以在施用至哺乳动物后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。

在一个实施方案中，药物组合物可以是注射制剂，并且可以是静脉施用的，但不限于此。

如本文所用，术语“有效量”是指延迟要治疗的特定疾病的发作或发展、或者完全促进其所必需的量。

在本发明中，组合物可以以药学有效量施用。对于本领域技术人员显而易见的是，药物组合物的合适的总日量可以由主治医师在合理的医学判断的范围内确定。

为了本发明的目的，取决于包括以下在内的各种因素，优选不同地施用用于特定患者的特定药学有效量：要实现的应答的类型和程度；是否根据需要使用其它药剂；特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食；施用时间；施用途径；组合物的分泌速率；治疗期；与特定组合物一起或同时使用的药物、以及药物领域公知的类似因素。

在本发明中，根据需要，药物组合物可附有由负责药物制造、使用和销售的政府机构指示的格式的与包装相关的说明书。该说明书表明任何私人利益组织对组合物的形式或对人或动物施用的批准，并且可以是例如美国食品和药物管理局(US Food and DrugAdministration)批准的用于药物处方的标签。

本发明的药物组合物还可以包括抗癌剂，或可以与抗癌剂共施用。

作为抗癌剂，可以使用具有抗癌活性的任何物质而没有对其的限制，并且也可以使用已知的抗癌剂。

例如，抗癌剂可以是抗癌化学治疗剂、靶向抗癌剂、或抗癌免疫治疗剂。

抗癌化学治疗剂可以是烷基化剂、微管抑制剂、抗代谢药、或拓补异构酶抑制剂，但不限于此。

烷基化剂可以是盐酸氮芥(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、塞替派(thiotepa)、六甲蜜胺(altretamine)、甲基苄肼(procarbazine)、白消安(busulfan)、链脲菌素(streptozocin)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(iomustine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)或奥沙利铂(oxaliplatin)等，但不限于此。微管抑制剂可以是多西他赛(docetaxel)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(oncovin)或长春瑞宾(vinorelbine)等，但不限于此。抗代谢药可以是氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、氟达拉滨(fludarabine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)或巯基嘌呤(mercaptopurine)等，但不限于此。拓补异构酶抑制剂可以是拓普替康(hycamtin)、伊立替康(camptosar)、依托泊苷(vepesid)、紫杉醇(taxol)、博莱霉素(bleomycin)、阿霉素(adriamycin)或柔红霉素(cerubidine)等，但不限于此。

靶向抗癌剂可以是曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、帕尼单抗(panitumumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、阿柏西普(aflibercept)、利妥昔单抗(rituximab)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、达妥木单抗(daratumumab)、迪诺苏单抗(denosumab)、依鲁替尼(ibrutinib)、达沙替尼(dasatinib)、尼罗替尼(nilotinib)、伊马替尼(imatinib)、伯舒替尼(bosutinib)、奥希替尼(osimertinib)、埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、尼达尼布(nintedanib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、卡博替尼(cabozantinib)、乐伐替尼(lenvatinib)、瑞格非尼(regorafenib)、阿西替尼(axitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、卡博替尼(cabozantinib)、曲美替尼(trametinib)、达拉非尼(dabrafenib)、阿贝西利(abemaciclib)、哌柏西利(palbociclib)、来那度胺(lenalidomide)、鲁索替尼(ruxolitinib)、艾乐替尼(alectinib)、克唑替尼(crizotinib)、奥拉帕尼(olaparib)或维奈托克(venetoclax)等，但不限于此。

免疫-癌症剂可以是免疫检查点抑制剂、免疫细胞治疗剂(CAR-T)、抗体药物缀合物(ADC)、双抗体(dual antibody)、抗癌病毒或抗癌疫苗，但不限于此。

检查点抑制剂可以是PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、TIM3抗体或LAG3抗体。PD-1抗体可以是派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)或西米普利单抗(cemiplimab)，PD-L1抗体可以是阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)或德瓦鲁单抗(durvalumab)，但不限于此。此外，CTLA-4抗体可以是伊匹单抗(ipilimumab)或曲美木单抗(tremelimumab)，TIM3抗体可以是MBG452，LAG3抗体可以是BMS-986016或LAG525，但不限于此。此外，免疫细胞治疗剂可以是司利弗明(tisagenlecleucel)或阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel)，但不限于此。ADC可以是吉妥珠单抗-奥唑米星(gemtuzumab-ozogamicin)、维布妥昔单抗(brentuximab vedotin)、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(trastuzumab emtansine)、奥加伊妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)或甲磺酸艾日布林(eribulin mesylate)，但不限于此。双抗体可以是博纳吐单抗(blinatumomab)，抗癌病毒可以是拉他莫基(talimogene laherparepvec)，抗癌疫苗可以是西普鲁塞-T(sipuleucel-T)，但不限于此。

抗癌剂可以是用于肺癌的抗癌剂。

本发明的药物组合物可以作为单一治疗剂施用或者与其它治疗剂组合施用，并且可以与常规抗癌剂同时、分别或顺序施用。此外，可以以单个或多个剂量施用。考虑到所有上述因素，以可以以最小量实现最大效果而无副作用的量来施用药物组合物是重要的，所述量可以由本领域技术人员容易地确定。

除非另外特别指出，否则术语“同时”是指同时地发生或进行，并且除非另外特别指出，否则术语“分别”是指保持彼此分别。此外，除非另外特别指出，否则术语“顺序”是指表征为规则顺序或次序，并且顺序剂量方案可以包括在施用包括提取物的另一组合物之前、与之同时、或之后施用包括抗癌剂的组合物，两种组合物将以规则顺序或次序施用。顺序使用是指在时间上分开施用本文所述的组合物。

本发明提供使用上述铁蛋白治疗肺癌的方法。所有上述关于铁蛋白的描述均直接适用于作为本申请的癌症治疗方法中的活性成分的铁蛋白。

本发明的治疗方法可以包括向患有肺癌的受试者施用本发明的铁蛋白。

患有肺癌的个体可以是患有肺癌的动物，具体地，患有肺癌的哺乳动物，更具体地，患有肺癌的人。

所述蛋白可以以治疗有效量施用。

在本发明中，术语“施用”是指通过任何合适的方法将本发明的组合物引入至患者，并且本发明的组合物的施用途径可以包括通过口服或肠胃外的各种途径施用，只要其能够到达靶组织即可。其可以包括腹膜内施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、皮内施用、口服施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用或直肠施用等，但不限于此。

本发明的方法可以进一步包括将抗癌剂施用至受试者。

作为抗癌剂，可以使用具有抗癌活性的任何物质而没有对其的限制，例如，可以使用上述例示的抗癌剂。

所述抗癌剂可以与所述铁蛋白同时、分别或顺序施用。

在下文中，将参照以下实施例更详细地描述本发明。

实施例

1.用于蛋白质生产的表达载体的构建

huHF是由24个单体构成的球状蛋白质纳米颗粒(12nm)，其中每个单体由总共5个α-螺旋构成。本发明人通过基因克隆在huHF单体的与转铁蛋白受体结合的氨基酸序列中诱导突变，使得获得了如下表1中所示的huHF_Mutant1(Q15A、D16A、R23A、F82A、Q84A)、huHF_Mutant2(Q15A、D16A、R23A、F82A、Q84A、E117A、K120A、D124A)。通过基因克隆将抗体CDR3肽和结构域插入至huHF_Mutant1和2的α-螺旋之间的环(基于PDB 3AJO序列，huHF 5T至176G中的BC环；92D/93W)和C-末端中选定的位置，以确保递送系统。

使用下表2中的序列，并根据图1至3的载体示意图和表3进行PCR，从而制备huHF_Mutant1_1_dual(BC环，C-末端)、huHF_Mutant2-dual(BC环，C-末端)和huHF_Mutant1-h_smPD1(C-末端)。将所有构建的质粒表达载体在琼脂糖凝胶上纯化，然后通过完整DNA测序确认序列。

[表1]

名称	SEQ ID NO.
		huHF_Native	1
huHF-Mutant1	2
		huHF-Mutant2	3

[表2]

名称	SEQ ID NO.
		huHF-αPD-L1	4
huHFαTIGIT	5
		huHF-h_smPD1	6
接头1	7
		接头2	8
接头3	9

[表3]

2.蛋白质生物合成

分别用上述制备的表达载体转化大肠杆菌菌株BL21[(fhuA2[lon]ompT gal[dcm]ΔhsdS)]，并选择卡那霉素抗性转化株。将转化的大肠杆菌在含有50mL的Luria-Bertani(LB)培养基(含100mg L^-1卡那霉素)的烧瓶(250mL锥形烧瓶，37℃，150rpm)中培养。当培养基浊度(O.D 600)达到约0.5～0.7时，注射异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)(1.0mM)以诱导重组基因的表达。

在20℃培养16至18小时后，将所培养的大肠杆菌以4,500rpm离心10分钟来回收细胞沉淀物，然后将沉淀物悬浮于5ml的破碎溶液(10mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5，10mMEDTA)，然后使用超声波破碎仪(Branson Ultrasonics Corp.,Danbury,CT,USA)将其破碎。破碎后，以13,000rpm进行离心10分钟来分离上清液与不溶性聚集体。将所分离的上清液用于后续实验。

3.蛋白质的纯化

通过三步法纯化上述实施例2中获得的上清液。首先，1)进行使用与重组蛋白融合的组氨酸和镍的结合的Ni²⁺-NTA亲和色谱法，2)浓缩重组蛋白并通过缓冲液交换附着荧光材料，和3)最后，为了仅分离荧光材料附着的自组装的蛋白质纳米颗粒，进行蔗糖梯度超速离心法。各个步骤的具体说明如下。

1)Ni²⁺-NTA亲和色谱法

为了纯化重组蛋白，回收以与如上所述相同的方法培养的大肠杆菌，将其细胞沉淀物重悬于5mL裂解缓冲液(pH 8.0,50mM磷酸钠,300mM NaCl,20mM咪唑)，使用超声波破碎仪破碎细胞。将裂解的细胞溶液以13,000rpm离心10分钟以仅分离上清液，然后使用Ni²⁺-NTA柱(Qiagen,Hilden,Germany)分离各个重组蛋白(洗涤缓冲液：pH 8.0，50mM磷酸钠，300mM NaCl，80mM咪唑/洗脱缓冲液：pH 8.0，50mM磷酸钠，300mM NaCl，200mM咪唑)。

2)浓缩、缓冲液交换、和荧光材料附着过程

对于FACS，对huHF_Native、huHF_Mutant1-h_smPD1和huHF_Mutant1-dual颗粒进行Ni²⁺-NTA亲和力色谱法，将3ml的洗脱的重组蛋白置于超离心过滤器(Amicon Ultra100K,Millipore,Billerica,MA)中，以5,000g进行离心直至柱上剩余1ml的溶液。其后，为了附着荧光材料FITC(荧光素异硫氰酸酯)，用碳酸氢钠(0.1M,pH 8.5)缓冲液对蛋白质颗粒进行缓冲液交换，然后在室温下附着荧光材料12小时。

3)蔗糖梯度超高速离心

向PBS(2.7mM KCl，137mM NaCl，2mM KH₂PO₄，10mM Na₂HPO₄，pH7.4)缓冲液添加各浓度的蔗糖，从而制备各自为含有40％、35％、30％、25％和20％蔗糖的溶液，从最高浓度开始按顺序地将2ml的浓度为(40-20％)的各蔗糖溶液置于超速离心管中(ultraclear13.2ml管，Beckman)。然后，在填充1ml的存在于所制备的自组装的缓冲液中的重组蛋白溶液后，在35,000rpm和4℃下进行超高速离心16小时(Ultracentrifuge L-90k，Beckman)。离心后，如上述第2)项中所述，使用移液管和超速离心过滤器、用PBS缓冲液小心地替换上层(20～25％蔗糖溶液部分)。

4.蛋白质的水溶性级分的鉴定

用基于pCM(Tac启动子)的各种表达载体转化BL21感受态细胞。将单个菌落接种至补充有100mg/L的卡那霉素的LB液体培养基(50mL)中，并在振荡培养箱中、在37℃和130rpm下培养。当600nm处的浊度/光密度达到0.5时，通过施用1mM IPTG诱导靶蛋白的表达。在20℃培养12至16小时后，通过离心(13,000rpm，10分钟)将培养基中的细胞旋转下来，收集细胞沉淀物并重悬于10mM Tris-Hcl(pH 7.4)缓冲液中。使用Branson超声波破碎仪(BransonUltrasonics Corp.,Danbury,CT)破碎重悬的细胞。超声波处理后，通过离心(13,000rpm，10分钟)分离含有可溶性蛋白质的上清液和含有不溶性蛋白质的聚集体。通过SDS-PAGE分析，鉴定分离的可溶性和不溶性蛋白质级分(图2和3)。

5.蛋白质组装的验证

对于实施例3中制备的每种蛋白质的纯化重组蛋白纳米颗粒的结构分析，通过透射电子显微镜(TEM)对重组蛋白进行拍照。首先，将未染色的且纯化的蛋白质样品置于碳包覆的铜电子显微镜载网(grid)上，然后自然干燥。为了获得蛋白质的染色图像，将包含自然干燥的样品的电子显微镜载网与2％(w/v)乙酸铀(uranyl acetate)水溶液在室温下孵育10分钟，并用蒸馏水洗涤3至4次。作为使用Philips Technai 120kV电子显微镜观察蛋白质图像的结果，证实了每个颗粒形成球状纳米颗粒(图2，图3)。

6.所制备的蛋白质的肺癌细胞靶向能力的验证

对已附着荧光材料的实施例3中制备的huHF_Native、huHF_Mutant1-h_smPD1、和huHF_Mutant1-dual蛋白质进行肺癌细胞靶向效率的比较。

为了比较实施例3中制备的huHF_Native、huHF_Mutant1-h_smPD1、和huHF_Mutant1-dual蛋白质针对LLC1小鼠肺癌和A549人肺癌的靶向效率，使LLC1小鼠肺癌和A549人肺癌细胞与浓度为荧光强度1400的蛋白质反应2小时，然后比较荧光信号，由此确定肺癌细胞靶向效率(图4和5)。作为结果，证实了与抗体相比，表现显著更高的靶向效率。

为了比较实施例3中制备的huHF_Native、huHF_Mutant1-h_smPD1、和huHF_Mutant1-dual蛋白质针对LLC1小鼠肺癌和A549人肺癌的靶向效率，使LLC1小鼠肺癌和A549人肺癌细胞与预定浓度部分的蛋白质反应2小时，然后，和与蛋白质的His标签结合的荧光蛋白反应1小时，然后比较荧光信号，由此确定靶向效率(图5和6)。50％细胞分数的浓度被认为是Kd，证实了与抗体相比，蛋白质表现50倍以上的靶向能力(表4)。

[表4]

7.蛋白质与转铁蛋白受体的结合的测量

将上述实施例中制备的天然形式的蛋白质和突变体对人转铁蛋白受体的结合力相比较。

首先，通过在4℃过夜而使100μl的2μg/ml的人转铁蛋白受体-Fc标签标准品附着至高结合96孔板。

然后，将其用200μl的PBST(PBS+Tween0.05％)洗涤3次。在室温下用100μl的SuperBlcok^TM(PBS)封闭缓冲液(thermo cat#37515)进行封闭工序1小时。

然后，将其用200μl的PBST(PBS+Tween0.05％)洗涤3次。将上述实施例中制备的蛋白质在4℃过夜处理，每个浓度部分100μl。

然后，将其用200μl的PBST(PBS+Tween0.05％)洗涤3次。将与六-His标签特异性结合的抗体(小鼠抗His标签抗体，Hisprobe)在PBST中1/1000稀释，并在室温下用100μl稀释液进行处理1小时。

随后，将其用200μl的PBST(PBS+Tween0.05％)洗涤3次。将与小鼠抗体特异性结合的抗体(山羊抗小鼠IgG抗体-HRP)在PBST中1/1000稀释，并在室温下用100μl稀释液进行处理1小时。

然后，将其用200μl的PBST(PBS+Tween0.05％)洗涤3次。在室温下用100μl的与HRP反应而显色的TMB溶液进行处理15分钟。在用50μl的1MH₂SO₄溶液进行处理后，用TECAN在450nm的波长处测定光密度。使用Langmuir等式进行计算(表5，图8至10)。

[表5]

图11示出了huHF_mutant1-dual和huHF_mutant2-dual对hTfR的结合力的评价/比较结果。参照该附图，在huHF_mutant2-dual的情况中，即使在将蛋白质的浓度增加至10000nM时，不饱和，从而表明对hTfR的结合力进一步降低。在选择预期的饱和点并计算结合力Kd值时，其变为约4400nM。

8.根据huHF_mutant1-dual处理，NK细胞和癌细胞之间的结合能力的评价

用CFSE作为荧光材料标记人肺癌细胞系A549。使10⁶个细胞与5μM的浓度的CFSE在培养箱中、在37℃反应20分钟，用PBS洗涤，通过将10⁵个细胞在2ml细胞板上、在2ml培养基中稀释来培养1天。

然后，使10⁵个NK细胞与用CFSE染色的A549细胞系反应。

此时，将10μl的PBS用作对照，添加10μl的用Cy5.5荧光染料标记的3μMhuHF_mutant1-dual(dICB，双重免疫检查点阻断剂)作为实验组。

在培养箱中培养10分钟后，使用NK 1.1抗体-PE抗体标记NK细胞。

用4％甲醛固定样品，并通过荧光显微镜确认荧光图像。

与对照组(PBS)相比，在实验组(huHF_mutant1-dual)的荧光图像中确认有更多的NK细胞附着至A549细胞(图12和13)。

9.根据huHF_mutant1-dual处理，NK细胞和癌细胞之间的结合能力以及NK细胞的癌细胞杀伤能力的评价

用CFSE作为荧光材料标记人肺癌细胞系A549。使10⁶个细胞与5μM的浓度的CFSE在培养箱中、在37℃反应20分钟，用PBS洗涤，通过将10⁴个细胞在96孔板上、在200μl培养基中稀释来培养1天。

其后，取决于条件，使10⁴至10⁵个DAPI标记的NK细胞与用CFSE染色的A549细胞系反应。

此时，添加10μl的PBS、10μl的3μM Abs(Tecentriq+mAb-mTIGIT(Bio XCell,#BE0274)共施用组)(各3μM，总共6μM)、和10μl的3μMhuHF mutant1-dual。

对于结合测量，使反应液在培养箱中反应30分钟，然后使用FACS设备分析同时显示CFSE荧光和DAPI荧光的细胞的比例(图14)。参照此，可以确认在huHF_mutant1-dual处理期间，NK细胞对A549细胞的结合能力增加。

荧光显微镜用于确认荧光图像(图14)。用NK 1.1抗体-PE抗体标记NK细胞。

对于毒性测量，使反应液在培养箱中反应48小时，然后使用FACS设备验证每个样品的毒性能力。用7-AAD分析细胞死亡的程度。

通过分析同时显示CFSE荧光和7-AAD荧光的细胞的比例，分析根据样品的NK细胞与癌细胞的比以及NK细胞的毒性能力(图15)。参照此，可以确认在huHF_mutant1-dual处理期间，NK细胞的A549细胞杀伤能力增加。

10.癌细胞生长抑制能力的评价

对于以下各个样本组(PBS、Tecentriq、Tecentriq+mAb-mTIGIT和huHF_mutant-dual)，通过每组5只小鼠验证了针对小鼠肺癌细胞系LLC1的抑制正常癌细胞的功效。Tecentriq是一种与PD-1或PD-L1结合的单克隆抗体，用于治疗肺癌等，而mAb-mTIGIT是一种与鼠TIGIT结合的单克隆抗体。

通过将LLC1以每只5x 10⁵皮下植入C57BL/6来形成肿瘤模型。

7天后，测量每个个体的肿瘤大小并进行分类，并调整为每组相同大小。

从第7天开始，每3天通过尾静脉静脉内注射样品，并测量每个个体的肿瘤大小以比较肿瘤生长抑制功效(图16)。

图17示出了每个实验组中每天的肿瘤大小，具体地，图17示出了每个实验组中第22天的肿瘤大小。参照这些附图，在huHF_mutant-dual的情况下，可以确认效果优异，因为即使用较小的剂量进行治疗，肿瘤大小也最小。

11.细胞亲合力评价

分析huHF_mutant-dual和mut-huHF针对人肺癌细胞系A549的亲合力。

首先，培养靶细胞(免疫细胞，癌细胞)并分配。

(1x 10⁵个/10μl，1FACS柱(5ml聚苯乙烯圆底管，Falcon(352052)))。

然后，用100μl/FACS柱处理样品(药物，抗体(抗小鼠PD-L1抗体(BE0101)、抗小鼠TIGIT抗体(BE0274)、抗人PD-L1(BE0285)))，用100μl的FACS缓冲液(PBS中0.1％ BSA+0.01％叠氮化钠)处理对照组(3小时，室温)。

在将1ml的每个FACS缓冲液置于FACS柱后，以1,700rpm进行离心5分钟，然后重复去除上清液的过程3次。

其后，荧光抗体(抗his标签抗体-PE(SC-8036PE)、抗-IgG抗体-PE(PE山羊F(ab’)2抗大鼠(IgG)二抗(ab7010)、PE F(ab’)2-山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗(12-4010-82)))用于进行处理(2小时，室温)。

在将1ml的每个FACS缓冲液置于FACS柱后，以1,700rpm进行离心5分钟，然后重复去除上清液的过程3次。

然后，在将100μl的FACS缓冲液置于各样品FACS柱后，将其用2μl的7-AAD(BDPharmigen(559925))处理5分钟。

借助于BD Biosciences和FACS设备、使用每个FAC柱中的活细胞中显示PE荧光的靶细胞的比例进行分析(图19至21)。

由此，验证了huHF_mutant-dual具有较大的每个细胞结合的样品数量和更大的结合细胞数。

12.肿瘤生长抑制能力的评价

对以下各个样品组(PBS、Ab-1、huHF_mutant-dual和huHF_mutant-dual+Vac)，通过每组5只小鼠验证了针对小鼠肺癌细胞系LLC1的抑制正常癌细胞的功效。本文使用的Ab-1是小鼠抗PD-L1抗体(Bio X Cell,#BE0101)，LLC-1新抗原疫苗(SEQ ID NO:10)用作疫苗(Vac)。

通过将LLC1以5x 10⁵皮下植入C57BL/6来形成肿瘤模型。

从第7天开始，每3天通过尾静脉静脉内注射样品(在G2组的情况中，每6天进行注射)，并测量每个个体的肿瘤大小以比较肿瘤生长抑制功效(图22)。

以30nmol/kg的浓度注射Ab-1，huHF_mutant-dual为30nmol/kg，Vac为10nmol/kg。

参照该结果，可以确认huHF_mutant-dual处理组具有优异的肿瘤生长抑制能力，并且在与疫苗组合使用时表现出更优异的效果。

13.铁蛋白在螺旋内部融合有外源肽

除了使用图23和24中的载体示意图以外，以与实施例1中相同的方式构建用于蛋白质生产的表达载体。然后，通过实施例2和3中所述的方法来生物合成和纯化蛋白质。

参照该结果，可以看出即使在将外源肽插入(融合)在huHF的D螺旋的中部和在E螺旋的中部、以及在A-E螺旋之间的环，仍顺利形成huHF结构。

这被认为是由于螺旋、特别是D螺旋和E螺旋的中部在维持铁蛋白的功能/结构方法相对不太重要，并且所融合的肽的大小不大。

14.蛋白质的水溶性级分的比的确定

用各种基于pT7-7的表达载体转化BL21(DE3)感受态细胞。将单个菌落接种在添加有100mg/L的氨苄青霉素的LB液体培养基(50mL)中，并在振荡培养箱中、在37℃和130rpm的条件下培养。当600nm处的浊度/光密度达到0.5时，通过施用1mM IPTG诱导靶蛋白的表达。在20℃培养12至16小时后，通过离心(13,000rpm，10分钟)将培养基中的细胞旋转下来，收集细胞沉淀物并重悬于10mM Tris-Hcl(pH 7.4)缓冲液中。使用Branson超声波破碎仪(Branson Ultrasonics Corp.,Danbury,CT)破碎重悬的细胞。超声波处理后，通过离心(13,000rpm，10分钟)分离含有可溶性蛋白质的上清液和含有不溶性蛋白质的聚集体。通过SDS-PAGE对分离的可溶性和不溶性蛋白质级分分析溶解度。即，用密度计(Duoscan T1200,Bio-Rad,Hercules,CA)扫描由Coomassie染色的靶蛋白质条带，然后定量可溶性级分的比。具体地，使用扫描的SDS-PAGE凝胶图像，在用‘Quantity One’程序‘Volume Rect.Tool’设定条带厚度和背景值后，使用‘Volume Analysis Report’将可溶性和不溶性蛋白质级分的总和设定为100％，然后定量溶解度。

其结果示于下表6。参照该表，可以看到即使在将外源肽融合在D螺旋的内部或E螺旋的内部时，水溶解度比也高。

[表6]

蛋白质NP	溶解度(％)
		intD-gp100-huHF	48.21
intE-gp100-huHF	73.00

<110> 塞尔美迪有限公司(CELLEMEDY CO., LTD)

<120> 用于预防或治疗肺癌的药物组合物

<130> 22P03023

<150> KR 10-2021-0057060

<151> 2021-05-03

<150> KR 10-2022-0054781

<151> 2022-05-03

<160> 10

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 183

<212> PRT

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 1

Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp

1 5 10 15

Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala

35 40 45

Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg

50 55 60

Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg

65 70 75 80

Ile Phe Leu Gln Asp Ile Gln Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser

85 90 95

Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn

100 105 110

Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro

115 120 125

His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys

130 135 140

Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly

145 150 155 160

Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu

165 170 175

Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser

180

<210> 2

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人铁蛋白重链突变体

<400> 2

Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Ala Ala

1 5 10 15

Ser Glu Ala Ala Ile Asn Ala Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala

35 40 45

Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg

50 55 60

Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg

65 70 75 80

Ile Ala Leu Ala Asp Ile Gln Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser

85 90 95

Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn

100 105 110

Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro

115 120 125

His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys

130 135 140

Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly

145 150 155 160

Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu

165 170 175

Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser

180

<210> 3

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人铁蛋白重链突变体

<400> 3

Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Ala Ala

1 5 10 15

Ser Glu Ala Ala Ile Asn Ala Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala

35 40 45

Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg

50 55 60

Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg

65 70 75 80

Ile Ala Leu Ala Asp Ile Gln Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser

85 90 95

Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn

100 105 110

Gln Ser Leu Leu Ala Leu His Ala Leu Ala Thr Ala Lys Asn Asp Pro

115 120 125

His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys

130 135 140

Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly

145 150 155 160

Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu

165 170 175

Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser

180

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Gly Gly Ser Tyr Gly Ser Leu Tyr Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Met Pro Ser Phe Ile Thr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Trp Glu Gly Tyr

1 5 10 15

Phe Asp Phe

<210> 6

<211> 52

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu

1 5 10 15

Ala Ala Phe Pro Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly

20 25 30

Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln

35 40 45

Ile Lys Glu Ser

50

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 7

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr

1 5

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 8

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr

1 5 10

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 9

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 10

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LLC-1新抗原疫苗

<400> 10

Glu Leu Glu Leu Ala Leu Ser Pro Ile His Tyr Ser Ser Ala Ile Pro

1 5 10 15

Ala Ala Gly Ser Asn Gln Val Thr

20

Claims (16)

1.一种用于预防或治疗肺癌的药物组合物，其包含铁蛋白，其中能够与免疫检查点分子结合的分子融合至所述蛋白的外表面。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述蛋白是由融合有能够与免疫检查点分子结合的分子的24个铁蛋白单体的自组装而形成的球状蛋白质。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述能够与免疫检查点分子结合的分子融合至铁蛋白单体的相邻α-螺旋之间的至少一处。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述能够与免疫检查点分子结合的分子融合至铁蛋白单体的N-末端或C-末端。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述能够与免疫检查点分子结合的分子融合至铁蛋白单体的A-B环、B-C环、C-D环或D-E环。

6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述能够与免疫检查点分子结合的分子融合在铁蛋白单体的N-末端和A螺旋之间或E螺旋和C-末端之间。

7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述能够与免疫检查点分子结合的分子融合在铁蛋白单体的α-螺旋的内部。

8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述能够与免疫检查点分子结合的分子融合在铁蛋白单体的A螺旋、B螺旋、C螺旋、D螺旋或E螺旋的内部。

9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述蛋白经突变而使得减少对人转铁蛋白受体的结合力。

10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中构成所述蛋白的铁蛋白单体中的至少一个的特征可在于SEQ ID NO:1的序列中的氨基酸No.15、16、23、82、84、117、120或124被丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或亮氨酸取代。

11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中对转铁蛋白受体的结合力(K)满足以下等式1：

[等式1]

K≥10nM

(等式1中，K为[P][T]/[PT]，其中[P]表示铁蛋白和转铁蛋白受体之间的结合反应的平衡状态中的铁蛋白的浓度，[T]表示平衡状态中的转铁蛋白受体的浓度，和[PT]表示平衡状态中的铁蛋白和转铁蛋白受体的复合物的浓度)。

12.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述转铁蛋白受体是人转铁蛋白受体。

13.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述免疫检查点分子是选自由以下组成的组中的任一种：Her-2/neu、VISTA、4-1BBL、半乳糖凝集素-9、腺苷A2a受体、CD80、CD86、ICOS、ICOSL、BTLA、OX-40L、CD155、BCL2、MYC、PP2A、BRD1、BRD2、BRD3、BRD4、BRDT、CBP、E2F1、MDM2、MDMX、PPP2CA、PPM1D、STAT3、IDH1、PD1、CTLA4、PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM3、TIGIT、BTLA、SLAMF7、4-1BB、OX-40、ICOS、GITR、ICAM-1、BAFFR、HVEM、LFA-1、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、LAIR1、2B4、CD2、CD3、CD16、CD20、CD27、CD28、CD40L、CD48、CD52、EGFR家族、AXL、CSF1R、DDR1、DDR2、EPH受体家族、FGFR家族、VEGFR家族、IGF1R、LTK、PDGFR家族、RET、KIT、KRAS、NTRK1和NTRK2。

14.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述能够与免疫检查点分子结合的分子是对所述免疫检查点分子具有结合力的配体或其片段、受体或其片段、抗体或其包括抗原结合区(CDR)的片段。

15.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述铁蛋白是人铁蛋白重链。

16.根据权利要求1所述的药物组合物，其还包含抗癌剂或其中所述组合物与所述抗癌剂共施用。