CN110522926A - 一种可视化纳米免疫制剂及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术和医药技术领域，提供一种可视化纳米免疫制剂及其制备方法、应用。所述纳米免疫制剂为CANPs‑ICG‑anti‑PD‑L1纳米颗粒，以海藻酸钙纳米颗粒为载体，ICG为成像剂，anti‑PD‑L1为免疫检查点封锁剂，所述纳米免疫制剂形貌均一，分散性好，可对肿瘤进行高效的可视化免疫治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和医药技术领域，尤其是一种可视化纳米免疫制剂及其制备方法、应用。
背景技术
近年来，随着纳米医学技术的发展，纳米技术用于恶性肿瘤的治疗日渐成为人们研究的热点。随着多种肿瘤治疗方法的不断发展，人们发现单一的肿瘤治疗方法效果有限，所以以纳米材料为平台的联合治疗策略成为目前的研究热点之一。最近有研究表明，基于纳米材料的免疫疗法可以产生一系列的免疫反应，从而达到免疫治疗的效果。在众多的纳米材料中，天然高分子材料海藻酸钠具有可生物降解性、良好的生物相容性、良好的凝胶性和成膜性等,以海藻酸钠为原料制备的海藻酸钙基生物医用材料在医药和生物技术领域有着广阔的应用前景。吲哚菁绿(ICG)是一种有效的近红外染料，也是为数不多的被美国FDA批准应用临床的染料。注射入体内后，借助近红外(NIR)光可进行可视化显示。由于近红外光具有较强的穿透能力，在808纳米激光的照射下，甚至能显示组织层下10mm处的吲哚菁绿分布。且近年来，随着纳米技术的不断发展，通过纳米颗粒装载吲哚菁绿已取得一系列重要研究进展，是一项成熟的体内成像的方法。肿瘤微环境诱导肿瘤细胞高表达PD-L1，PD-L1通过与PD-1结合，负性调节T细胞功能，同时抑制细胞因子产生，从而促进肿瘤的免疫逃逸。通过阻断PD-1/PD-L1的结合，可恢复免疫细胞对肿瘤的有效免疫应答。anti-PD-L1免疫检查点封锁剂通过负性调节免疫信号通路，降低肿瘤微环境的免疫抑制，重新激活T细胞活性，将肿瘤细胞识别为“非自身”抗原，并将其与“自身”抗原区分开来，达到利用人体自身免疫系统杀伤肿瘤的目的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种一种可视化纳米免疫制剂及其制备方法与应用。
本发明为解决背景技术中提出的技术问题，采用的技术方案是：一种可视化纳米免疫制剂，为CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒，以海藻酸钙纳米颗粒为载体，吲哚菁绿(ICG)为近红外(NIR)光热治疗剂，anti-PD-L1为免疫检查点封锁剂。
优选的，上述纳米免疫制剂，粒径为70-160nm。
优选的，上述纳米免疫制剂，其中，ICG的载药率为75-85％，PD-L1连接率8％-12％。
本发明的第二个技术方案是上述可视化纳米免疫制剂的制备方法，具体方法步骤如下：
(1)制备海藻酸钙水凝胶纳米颗粒CANPs：配制18-36mM CaCl2水溶液和0.03-0.06％(m/v)海藻酸钠水溶液，取27-29mL海藻酸钠水溶液，快速搅拌，同时逐滴加入1-3mLCaCl2水溶液，快速搅拌一小时，10000转每分钟离心收集沉淀。
(2)制备CANPs-ICG纳米颗粒：取3-5mg吲哚菁绿，溶于5ml 10-20mg/ml的CANPs水溶液中，室温搅拌8-12小时，10000转每分钟离心收集沉淀，水洗2-3次。
(3)制备CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒：活化上述CANPs-ICG纳米颗粒表面的羧基，将50-100微克anti-PD-L1加入到上述CANPs-ICG纳米颗粒溶液中，室温搅拌8-12小时，10000转每分钟离心收集沉淀，水洗2-3次。
本发明的第三个技术方案是纳米免疫制剂在制备肿瘤抑制药物方面的应用。
上述纳米免疫制剂制备的肿瘤抑制药物用于对原位肿瘤的成像和免疫治疗，有效抑制肿瘤。
上述纳米免疫制剂制备的肿瘤抑制药物通过808纳米激光连续照射进行成像，从而达到可视化清除肿瘤细胞的效果。
本发明结构有如下有益效果：
上述纳米免疫制剂，为CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒，形貌均一，分散性好，可进行高效的免疫治疗，从而有效抑制肿瘤生长。
附图说明
图1：制备的CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒的透射电镜图。
图2：制备的CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒的粒径分布。
图3：制备的CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒与对照组分别对B16F10细胞进行处理后的死活细胞染色图。
具体实施方式
为进一步说明本发明，现通过具体实施实例对本发明进行详细阐述。
下述实施例中：
(1)制备海藻酸钙水凝胶纳米颗粒CANPs：配制18-36mM CaCl2水溶液和0.03-0.06％(m/v)海藻酸钠水溶液，取27-29mL海藻酸钠水溶液，快速搅拌，同时逐滴加入1-3mLCaCl2水溶液，快速搅拌一小时，10000转每分钟离心收集沉淀。
(2)制备CANPs-ICG纳米颗粒：取3-5mg吲哚菁绿，溶于5ml 10-20mg/ml的CANPs水溶液中，室温搅拌8-12小时，10000转每分钟离心收集沉淀，水洗2-3次。
(3)制备CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒：活化上述CANPs-ICG纳米颗粒表面的羧基，将50-100微克anti-PD-L1加入到上述CANPs-ICG纳米颗粒溶液中，室温搅拌8-12小时，10000转每分钟离心收集沉淀，水洗2-3次。冷冻干燥得到CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒，重悬于去离子水中保存，粒径为70-160纳米(如图1,图2所示)。
评估本发明制备的纳米材料的成像性能实验技术如下：
将B16F10细胞培养于含有10％的胎牛血清的DMEM中，并放置于恒温37℃,含有5％CO2培养箱中培养。在加入CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒前，细胞(1×105cells/cm2)在6孔的培养板中放置24小时。然后细胞被PBS溶液冲洗3次并放入含有1.5×10-9mol/L CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒的溶液中进行孵育。在不同时间点进行成像，对其进行荧光光谱及显微测量。实验结果显示B16F10细胞与CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒孵育后显示出明显的红色，这一结果说明CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒可以显著的被B16F10细胞摄取并且成像性能良好。
评估本发明制备的纳米免疫抑制剂的体外肿瘤细胞杀伤性能实验技术如下：
将B16F10细胞(5000个/孔)在96孔板中培养24小时，吸出培养液，加入含有0.1-0.2毫克每毫升CANPs-ICG-anti-PD-L1(吲哚菁绿：0.01-0.02毫摩尔每毫升，anti-PD-L1：100-200纳摩尔每升)的培养基，继续孵育6-8小时。随后向每孔中加入200微升的磷酸盐缓冲液，将对照组、单一成像组和经过成像及化疗的B16F10细胞用Hoechast/PI混合荧光染料进行死活细胞染色10分钟。在倒置荧光显微镜下通过观察蓝色荧光(活细胞)和红色荧光(死细胞)的比例来判断肿瘤细胞杀伤效果。结果显示肿瘤细胞死亡率可达到75％-80％(如图3所示)。
评估本发明制备的纳米免疫抑制剂的体内肿瘤细胞杀伤性能实验技术如下：
(1)黑色素肿瘤模型的建立：将B16F10细胞复苏并稳定传代3-4次。取处于对数生长期的细胞，用胰酶消化后制成单细胞悬液(密度为1×106每毫升)。取8周龄左右的C57/B6小鼠30只，用1毫升注射器吸取100-200微升的B16F10细胞悬液，注射入小鼠腹腔右上侧的皮下位置，注入的细胞数量约为2×106。注射完毕后将小鼠置于动物房中饲养。
(2)小鼠分组及不同治疗方式：当B16F10荷瘤小鼠的肿瘤直径达到约4-6毫米的时候，开始进行分组治疗。一共分为3组，每组3只老鼠。具体治疗方案如下：
组一：局部注射磷酸盐缓冲液
组二：局部注射CANPs-ICG纳米粒子
组三：局部注射CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米粒子
治疗结束后每天测量小鼠的的体重及肿瘤大小，6-7天后收集淋巴结，用胰酶消化成单个细胞，并用CD80/CD86荧光抗体标记，上流式细胞仪对DCs的含量进行分析。结果显示，组三诱导了高水平的DC成熟(80-90％)，肿瘤生长明显低于其他两组，有效抑制肿瘤。
实施例1
(1)制备海藻酸钙水凝胶纳米颗粒CANPs：配制18mM CaCl2水溶液和0.03％(m/v)海藻酸钠水溶液，取27mL海藻酸钠水溶液，快速搅拌，同时逐滴加入1mL CaCl2水溶液，快速搅拌一小时，10000转每分钟离心收集沉淀。
(2)制备CANPs-ICG纳米颗粒：取3mg吲哚菁绿，溶于5ml 10mg/ml的CANPs水溶液中，室温搅拌8小时，10000转每分钟离心收集沉淀，水洗2-3次。
(3)制备CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒：活化上述CANPs-ICG纳米颗粒表面的羧基，将50微克anti-PD-L1加入到上述CANPs-ICG纳米颗粒溶液中，室温搅拌8小时，10000转每分钟离心收集沉淀，水洗2次。得到CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒，重悬于去离子水中保存。
实施例2
(1)制备海藻酸钙水凝胶纳米颗粒CANPs：配制24mM CaCl2水溶液和0.04％(m/v)海藻酸钠水溶液，取28mL海藻酸钠水溶液，快速搅拌，同时逐滴加入2mL CaCl2水溶液，快速搅拌一小时，10000转每分钟离心收集沉淀。
(2)制备CANPs-ICG纳米颗粒：取4mg吲哚菁绿，溶于5ml 15mg/ml的CANPs水溶液中，室温搅拌10小时，10000转每分钟离心收集沉淀，水洗2次。
(3)制备CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒：活化上述CANPs-ICG纳米颗粒表面的羧基，将100微克anti-PD-L1加入到上述CANPs-ICG纳米颗粒溶液中，室温搅拌10小时，10000转每分钟离心收集沉淀，水洗2次。冷冻干燥得到CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒，重悬于去离子水中保存。
实施例3
(1)制备海藻酸钙水凝胶纳米颗粒CANPs：配制36mM CaCl2水溶液和0.06％(m/v)海藻酸钠水溶液，取29mL海藻酸钠水溶液，快速搅拌，同时逐滴加入3mL CaCl2水溶液，快速搅拌一小时，10000转每分钟离心收集沉淀。
(2)制备CANPs-ICG纳米颗粒：取5mg吲哚菁绿，溶于5ml 20mg/ml的CANPs水溶液中，室温搅拌12小时，10000转每分钟离心收集沉淀，水洗3次。
(3)制备CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒：活化上述CANPs-ICG纳米颗粒表面的羧基，将100微克anti-PD-L1加入到上述CANPs-ICG纳米颗粒溶液中，室温搅拌12小时，10000转每分钟离心收集沉淀，水洗3次。冷冻干燥得到CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒，重悬于去离子水中保存。
实施例4
CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米粒子的光热性能测试：将B16F10细胞培养于含有10％的胎牛血清的DMEM中，并放置于恒温37℃,含有5％CO2培养箱中培养。在加入不同样品前，细胞(1×105cells/cm2)在6孔的培养板中放置24小时。然后细胞被PBS溶液冲洗3次并放入含有不用样品(水，ICG，CANPs，CANPs-ICG，CANPs-ICG-anti-PD-L1)的水溶液(1毫升)中进行孵育。在不同时间点对不同的样品进行成像，并对其进行荧光光谱及显微测量。实验结果与对照组相比(水，ICG，CANPs，CANPs-ICG)显示B16F10细胞与CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒孵育后显示出更明显的红色，说明ICG被CANPs-ICG-anti-PD-L1包载之后成像性能有一定的提高，更加有利于治疗的进行。
实施例5
检验CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米粒子的体外抗肿瘤疗效。将B16F10细胞(5000个/孔)在96孔板中培养24小时，吸出培养液，加入含有0.2毫克每毫升CANPs-ICG-anti-PD-L1(吲哚菁绿：0.02毫摩尔每毫升，anti-PD-L1：200纳摩尔每升)的培养基，继续孵育6-8小时。随后向每孔中加入200微升的磷酸盐缓冲液，将对照组、单一成像组和经过成像及化疗的B16F10细胞用Hoechast/PI混合荧光染料进行死活细胞染色10分钟。在倒置荧光显微镜下通过观察蓝色荧光(活细胞)和红色荧光(死细胞)的比例来判断肿瘤细胞杀伤效果。结果显示肿瘤细胞死亡率可达到77.8％。
实施例6
检验CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米粒子的体内抗肿瘤疗效。
(1)黑色素肿瘤模型的建立：将B16F10细胞复苏并稳定传代3次。取处于对数生长期的细胞，用胰酶消化后制成单细胞悬液(密度为1×106每毫升)。取8周龄左右的C57/B6小鼠30只，用1毫升注射器吸取100微升的B16F10细胞悬液，注射入小鼠右腿上侧的皮下位置，注入的细胞数量约为2×106。注射完毕后将小鼠置于动物房中饲养。
(2)小鼠分组及不同治疗方式：当B16F10荷瘤小鼠的肿瘤直径达到约5毫米的时候，开始进行分组治疗。一共分为3组，每组3只老鼠。具体治疗方案如下：
组一：局部注射磷酸盐缓冲液
组二：局部注射CANPs-ICG纳米粒子
组三：局部注射CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米粒子
治疗结束后每天测量小鼠的的体重及肿瘤大小，6天后收集淋巴结，用胰酶消化成单个细胞，并用CD80/CD86荧光抗体标记，上流式细胞仪对DCs的含量进行分析。结果显示，组三诱导了高水平的DC成熟(86％)，肿瘤生长明显低于其他两组，有效抑制肿瘤。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种可视化纳米免疫制剂，其特征在于：为CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒，以海藻酸钙纳米颗粒为载体，ICG为成像剂，anti-PD-L1为免疫检查点封锁剂。
2.根据权利要求1所述的纳米免疫制剂，其特征在于：粒径为70-160nm。
3.根据权利要求1所述的纳米免疫制剂，其特征在于：所述ICG载药率为75％-85％，PD-L1连接率为8％-12％。
4.权利要求1所述的可视化纳米免疫制剂的制备方法，其特征在于：具体方法步骤如下：
1)制备海藻酸钙水凝胶纳米颗粒CANPs：配制18-36mM CaCl2水溶液和0.03-0.06％(m/v)海藻酸钠水溶液，取27-29mL海藻酸钠水溶液，快速搅拌，同时逐滴加入1-3mL CaCl2水溶液，快速搅拌，离心收集沉淀；
2)制备CANPs-ICG纳米颗粒：取3-5mg吲哚菁绿，溶于5ml10-20mg/ml的CANPs水溶液中，室温搅拌8-12小时，离心收集沉淀，水洗2-3次；
3)制备CANPs-ICG-anti-PD-L1纳米颗粒：活化上述CANPs-ICG纳米颗粒表面的羧基，将50-100微克anti-PD-L1加入到上述CANPs-ICG纳米颗粒溶液中，室温搅拌8-12小时，10000转每分钟离心收集沉淀，水洗2-3次。
5.根据权利要求1所述的可视化纳米免疫制剂在制备肿瘤抑制药物方面的应用。
6.根据权利要求5所述的可视化纳米免疫制剂在制备肿瘤抑制药物方面的应用，纳米免疫制剂制备的肿瘤抑制药物用于对原位肿瘤的成像和免疫治疗。
7.根据权利要求5所述的可视化纳米免疫制剂在制备肿瘤抑制药物方面的应用，纳米免疫制剂制备的肿瘤抑制药物通过808纳米激光连续照射进行成像。
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| CN201910723330.6A CN110522926A (zh) | 2019-08-06 | 2019-08-06 | 一种可视化纳米免疫制剂及其制备方法、应用 |
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| CN111743855A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-10-09 | 天津大学 | 一种类风湿性关节炎治疗凝胶制剂的合成方法 |
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| CN101549158A (zh) * | 2009-05-08 | 2009-10-07 | 南开大学 | 一种海藻酸钠肝靶向纳米给药系统及其制备方法 |
| US20180185395A1 (en) * | 2015-06-16 | 2018-07-05 | Prism Pharma Co., Ltd. | Anticancer agent |
| CN109620816A (zh) * | 2018-11-16 | 2019-04-16 | 天津大学 | 一种纳米免疫制剂及其制备方法与应用 |
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Patent Citations (3)
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