CN110179973B - 一种光热响应的杂化纳米疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种光热响应的杂化纳米疫苗及其制备方法，所述杂化纳米疫苗包括磁性介孔硅、吲哚菁绿及金黄色葡萄球菌外膜囊泡（OMV）。本发明以细菌外膜囊泡作为疫苗及递送载体；同时激光照射可使吲哚菁绿产生热量促进溶酶体逃逸；溶酶体破裂产生的活性氧（ROS）可进一步激活蛋白酶体，以促进抗原的加工处理；最终获得协同效应以提高疫苗免疫效果。本发明属于药物制剂领域与生物医药技术领域。本发明的纳米疫苗制备过程简单、可控，经济成本低，重复性好，可对耐药性金黄色葡萄球菌感染进行有效预防，在临床上具有很高的应用价值。

Description

一种光热响应的杂化纳米疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及药物制剂领域与生物医药技术领域，具体来说涉及一种光热响应的杂化纳米疫苗及其制备方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)广泛分布于自然环境中，是临床上常见的病原菌之一。由摄入葡萄球菌肠毒素而引起的食物中毒是世界上最常见的食源性疾病之一，严重危害公共卫生安全。由于抗生素的滥用，金黄色葡萄球菌菌株出现不同程度的耐药现象，多重耐药菌株也大大增多，耐药金黄色葡萄球菌已经成为目前现有的抗生素难以抑制的病原菌之一。耐药金黄色葡萄球菌的产生给相关治疗带来了巨大挑战，因此急需一种新的抗菌策略来抑制金黄色葡萄球菌引起的感染。
外膜囊泡(Outer membrane vesicles，OMV)是由革兰氏阴性菌和某些革兰氏阳性菌产生的具有生物学活性物质的囊泡状结构，大多数为球形，大小在20-250nm之间。外膜囊泡的组成包括外膜蛋白、磷脂、DNA以及在形成过程中被外膜包裹的周质成分等。由于外膜囊泡不能复制且含有大量的细菌抗原，并能有效激活免疫系统，所以被认为是极具潜力的疫苗候选物质。
光热效应可导致溶酶体膜流动性增加及膜破裂，促进纳米粒子的溶酶体逃逸。吲哚菁绿(indocyanine green，ICG)是一种用于临床的近红外成像试剂，遇可见光会分解并产热。因此介孔硅装载吲哚菁绿后，通过激光照射可产热，以促进溶酶体逃逸，从而促进交叉递呈、提高疫苗免疫效果。
发明内容
发明目的：为了解决现有技术存在的问题，本发明所要解决的技术问题是提供了一种光热响应的杂化纳米疫苗。
本发明还要解决的技术问题是提供了光热响应的杂化纳米疫苗的制备方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种光热响应的杂化纳米疫苗，所述杂化纳米疫苗包括磁性介孔硅、吲哚菁绿及金黄色葡萄球菌外膜囊泡。
其中，所述磁性介孔硅装载吲哚菁绿形成内核，所述金黄色葡萄球菌外膜囊泡包裹于内核表面。
其中，所述金黄色葡萄球菌包括但不仅限于S.aureus BW15，其它分泌外膜囊泡的细菌均适用。
其中，所述磁性介孔硅的粒径为50～100nm左右。
本发明内容还包括所述的光热响应的杂化纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)OMV的制备：选取金黄色葡萄球菌培养至对数期，菌液离心取上清，超滤管浓缩后进行超离，沉淀即OMV；
2)ICG/MSN的制备：配置ICG溶液，加入MSN，室温避光搅拌，磁力架分离ICG/MSN；
3)OMV/ICG/MSN的制备：取步骤1)中OMV与步骤2)中ICG/MSN混合，用挤出仪来回挤出，磁力架分离包裹好的OMV/ICG/MSN。
其中，所述步骤1)的金黄色葡萄球菌包括但不仅限于S.aureus BW15，其它分泌外膜囊泡的细菌均适用。
其中，所述步骤2)中的ICG溶液与MSN的质量比为1∶100～1∶200。
其中，所述步骤3)中的OMV与ICG/MSN质量比为1.5∶1～2∶1。
其中，所述步骤3)中的挤出仪滤膜孔大小为150nm。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：由于耐药金黄色葡萄球菌的产生，传统的采用抗生素治疗金黄色葡萄球菌的方法已经无法控制其感染，且抗生素的滥用可进一步产生多重耐药菌株，严重影响公共卫生安全。本发明以细菌外膜囊泡作为疫苗及递送载体；同时激光照射可使吲哚菁绿产生热量促进溶酶体逃逸；溶酶体破裂产生的活性氧(ROS)可进一步激活蛋白酶体，以促进抗原的加工处理；最终获得协同效应以提高疫苗免疫效果。本发明制备的纳米疫苗过程简单可控，生产成本低，重复性好，适合大规模生产；载体稳定性好，安全性高。该疫苗可有效降低细菌产生耐药性的风险并可有效控制金黄色葡萄球菌引起的感染。
附图说明
图1、本发明的光热响应的杂化纳米疫苗制备原理示意图；
图2、本发明的金黄色葡萄球菌外膜囊泡(OMV15)的表征；
A：本发明的金黄色葡萄球菌外膜囊泡(OMV15)的透射电镜图；
B：本发明的金黄色葡萄球菌外膜囊泡(OMV15)的粒径大小；
C：本发明的金黄色葡萄球菌外膜囊泡(OMV15)的电位分布；
图3：本发明的光热响应的杂化纳米疫苗的表征；
A：分别为本发明的MSN、ICG/MSN、OMV15/ICG/MSN的透射电镜图；
B：分别为本发明的MSN、ICG/MSN、OMV15/ICG/MSN的粒径大小；
C：分别为本发明的MSN、ICG/MSN、OMV15/ICG/MSN的电位大小；
图4：本发明的光热响应的杂化纳米疫苗的体液免疫和细胞免疫应答；
A：于第0天、7天、14天皮下注射杂化纳米疫苗3次，并经808nm激光照射5min。于第-1、7、14、21天收集免疫小鼠的血清样品，测定血清中抗金黄色葡萄球菌的IgG滴度；
B：于第21天，取免疫小鼠脾脏，制备成单细胞悬液，与CD3及CD8抗体孵育，流式细胞术检测小鼠体内CD8+T细胞的含量；
C：制备的脾脏单细胞经CFSE标记后，进一步标记CD8+T细胞，流式细胞术检测小鼠体内CD8+T细胞增值情况；
图5：纳米疫苗预防金黄色葡萄球菌感染引起的伤口大小及菌落数；
A：小鼠免疫并经激光照射后，每只小鼠感染1×109CFU金黄色葡萄球菌S.aureusBW15，每天记录金黄色葡萄球菌感染引起的伤口大小；
B：于第7天处死小鼠并涂板检测感染部位细菌含量。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
材料与设备：
(1)磁性介孔硅(MSN)购自上海索菲生物公司，货号为：M-MSNs-50；
(2)吲哚菁绿(ICG)购自南京伟沃生物科技有限公司；
(3)金黄色葡萄球菌为实验室保存菌种S.aureus BW15；
(4)PBS采购自江苏碧云天生物技术有限公司；
(5)超滤管、滤膜购自南京伟沃生物科技有限公司；
(6)挤出仪购自默格机械(上海)有限公司；
(7)离心机购自eppendorf公司，超净台购自Thermo Fisher公司，磁力分离器购自美国Promega公司。
实施例1
(1)OMV的制备：挑取菌株为S.aureus BW15的单菌落金黄色葡萄球菌在含有250mLLB培养基的1L三角瓶中37℃分别摇菌至对数期(OD600约为1)，菌液6000g离心20min，去除沉淀，上清经0.45μm滤膜过滤后，滤液用100kDa超滤管浓缩至20～30mL，再用0.22μm的滤膜过滤，滤液经超速离心150,000g，3h，4℃，沉淀即OMV15，用PBS洗三次，150,000g，3h，4℃，去除杂蛋白；
(2)ICG/MSN的制备：配置1mg/mL的ICG母液，并稀释至12μg/mL，取1mLICG稀释液，加入20mg MSN，避光室温搅拌2h，磁力架分离IGG/MSN；
(3)OMV/ICG/MSN的制备：分别取步骤(1)中的OMV15与步骤(2)中ICG/MSN混合，质量比为1.5∶1，用挤出仪挤出7次，滤膜孔的大小为150nm，磁力架分离包裹好的OMV15/ICG/MSN。
我们取制备好的金黄色葡萄球菌外膜囊泡OMV15通过透射电镜和粒径分析仪来进行表征观察。如图2A所示，外膜囊泡为球形颗粒，大小在100nm左右；如图2B、2C所示，外膜囊泡大小95.77nm，电位为-20.9mV。
实施例2
将实施例1制备过程中的MSN、ICG/MSN、OMV15/ICG/MSN通过透射电镜和粒径分析仪进行表征观察。如图3A所示，介孔硅可有效装载ICG，并能成功被外膜囊泡包被；如图3B所示，为MSN、ICG/MSN、OMV15/ICG/MSN的粒径大小，分别为88.6nm、90.365nm及96.3nm，多分散系数PDI分别为0.20、0.27及0.22；图3C为其表面电位，MSN带正电(+26.6mV)，ICG带负电，MSN装载ICG后电位降低(+1.51mV)，而OMV15带负电(-20.9mV)，所以包裹OMV15后OMV15/ICG/MSN变为负电位(-15.9mV)。
实施例3
将实施例1中制备的杂化纳米疫苗通过皮下注射免疫小鼠，第0天、7天、14天免疫3次，剂量为0.5μg OMV蛋白，随后经808nm激光照射5min。于第-1、7、14、21天收集免疫小鼠的血清样品，测定血清中抗金黄色葡萄球菌的IgG滴度，如图4A所示，制备的OMV对小鼠具有强烈的体液免疫效果，进一步制备成杂化纳米疫苗及经激光照射后，体液免疫效果进一步增强。于第21天，取免疫小鼠脾脏，制备成单细胞悬液，收集200万细胞至1.5mL离心管中，1600rpm离心5min，去掉上清后用1mL PBS轻柔洗两次，最后100μL PBS重悬，加入CD3及CD8抗体，于4℃下避光孵育30min。随后用4％多聚甲醛固定，进行流式检测。如图4B所示，制备的杂化纳米疫苗能有效诱导体内CD8+T细胞含量上升，经激光照射之后，CD8+T细胞含量进一步升高。制备的脾脏单细胞经CFSE标记后，进一步标记CD8+T细胞，如图4C所示，经杂化纳米疫苗及激光处理后，CD8+T细胞增殖情况显著提高。因此，该光热响应的杂化纳米疫苗能有效诱导体内体液免疫及细胞免疫反应。
实施例4
小鼠免疫并经激光照射后，每只小鼠感染1×109CFu金黄色葡萄球菌S.aureusBW15，以红霉素作为和阳性对照。每天测量感染部位伤口大小，于第7天处死小鼠并涂板检测感染部位细菌含量。如图5所示，经纳米疫苗免疫及经激光照射后，小鼠最终感染伤口面积为64.17mm2，感染部位平均菌落数为48004.1，而生理盐水与红霉素组分别为701.67mm2与508.70mm2，平均菌落数为1739061.5及1036017.5，并且与抗生素联用后并无明显增强的抑菌现象产生。因此，光热响应的杂化纳米疫苗对耐药型金黄色葡萄球菌有明显的免疫预防作用。
上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种光热响应的杂化纳米疫苗，其特征在于，所述光热响应的杂化纳米疫苗包括磁性介孔硅MSN、吲哚菁绿ICG及金黄色葡萄球菌外膜囊泡OMV15，所述磁性介孔硅装载吲哚菁绿形成内核，所述金黄色葡萄球菌外膜囊泡包裹于内核表面，所述金黄色葡萄球菌包括S.aureus BW15，所述光热响应的杂化纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：
（1）OMV15的制备：挑取菌株为S.aureus BW15的单菌落金黄色葡萄球菌在含有250 mLLB培养基的1 L三角瓶中37℃分别摇菌至对数期，OD600为1，菌液6000 g离心20 min，去除沉淀，上清经0.45 μm滤膜过滤后，滤液用100 kDa超滤管浓缩至20~30mL，再用0.22 μm的滤膜过滤，滤液经超速离心150,000 g，3 h，4℃，沉淀即OMV15，用PBS洗三次，150,000 g，3 h，4℃，去除杂蛋白；
（2）ICG/MSN的制备：配置1mg/mL的 ICG母液，并稀释至12 μg/mL，取1mL ICG稀释液，加入20 mg MSN，避光室温搅拌2 h，磁力架分离IGG/MSN；
（3）OMV15/ICG/MSN的制备：分别取步骤（1）中的OMV15与步骤（2）中ICG/MSN混合，质量比为1.5:1，用挤出仪挤出7次，滤膜孔的大小为150 nm，磁力架分离包裹好的OMV15/ICG/MSN；
所述金黄色葡萄球菌外膜囊泡OMV15大小为95.77 nm，OMV15/ICG/MSN变为负电位-15.9mV。
2.一种光热响应的杂化纳米疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）OMV15的制备：挑取菌株为S.aureus BW15的单菌落金黄色葡萄球菌在含有250 mLLB培养基的1 L三角瓶中37℃分别摇菌至对数期，OD600为1，菌液6000 g离心20 min，去除沉淀，上清经0.45 μm滤膜过滤后，滤液用100 kDa超滤管浓缩至20~30mL，再用0.22 μm的滤膜过滤，滤液经超速离心150,000 g，3 h，4℃，沉淀即OMV15，用PBS洗三次，150,000 g，3 h，4℃，去除杂蛋白；
（2）ICG/MSN的制备：配置1mg/mL的 ICG母液，并稀释至12 μg/mL，取1mL ICG稀释液，加入20 mg MSN，避光室温搅拌2 h，磁力架分离IGG/MSN；
（3）OMV15/ICG/MSN的制备：分别取步骤（1）中的OMV15与步骤（2）中ICG/MSN混合，质量比为1.5:1，用挤出仪挤出7次，滤膜孔的大小为150 nm，磁力架分离包裹好的OMV15/ICG/MSN。
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