CN103273080B - 一种纳米金花及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有光热效应并能杀死癌细胞的纳米金花及其制备方法与应用。所述纳米金花是按照包括下述步骤的方法制备得到的：1)将纳米金与C18N3囊泡溶液混合，形成纳米金/C18N3囊泡复合物溶液；2)将纳米金/C18N3囊泡复合物溶液作为种子加入到HAuCl4与C18N3的混合溶液中，混合均匀后加入还原剂，使氯金酸进行还原反应，得到纳米金花。该纳米金花可吸收近红外区域的光，然后迅速将光转化成热，从而在纳米颗粒表面引起快速升温，因此可作为光热剂用于肿瘤的光热治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米金花及其制备方法与应用。
背景技术
近年来，纳米材料作为药物是目前纳米技术领域的一个很重要的应用。在这些应用中，利用纳米材料吸收近红外区域的光从而进行光热治疗癌症的研究受到了研究者们广泛的关注。光热疗法相比于传统的手术疗法具有易于操作，治疗后能够快速恢复，副作用小以及治疗周期较短等优势。
具有等离子体激元特性的纳米材料，尤其是可以将近红外区域的光转化成热量的纳米材料成为了光热剂的很好的选择。这类纳米材料可以通过调节其尺寸形貌和组成来调节它的吸收光谱，其中以金、银以及钯的纳米材料研究的较多。纳米金因其良好的生物相容性而被广泛应用于生物医疗领域，其中以金纳米棒，核壳结构两类材料进行光热治疗癌症的研究尤其受到青睐。但是金纳米棒的制备过程比较复杂，对制备条件的要求较高。而传统的核壳结构都具有一个硬模板的核，例如SiO2，PS等，这些核在生物体内的滞留和代谢不得不引起我们的思考。因此，制备过程简便，光热效应明显并且组成简单的光热剂成为了迫切的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有光热效应并能杀死癌细胞的纳米金花及其制备方法。
本发明所提供的纳米金花是按照包括下述步骤的方法制备得到的：
1)将小尺寸纳米金与C18N3(二(氨基乙基酰甲基乙基)十八胺)囊泡溶液混合，形成纳米金/C18N3囊泡复合物溶液；
2)将所述纳米金/C18N3囊泡复合物溶液作为种子加入到氯金酸(HAuCl4)与表面活性剂分子C18N3的混合溶液中，混合均匀后加入还原剂，使氯金酸进行还原反应，得到所述核壳式纳米金花。
其中，步骤1)中所述C18N3囊泡溶液的摩尔浓度为0.05～10mM，优选1～10mM，具体可为5mM；pH值为1～14，优选pH值为2～6，具体pH值为3。所述C18N3囊泡溶液中C18N3囊泡的直径可为50nm-300nm。
所述C18N3囊泡溶液是按照下述方法制备的：通过将树枝状表面活性剂分子C18N3溶于水溶液中，通过调节溶液的浓度以及pH值使得C18N3分子在水溶液中以囊泡的形式存在。
步骤1)中纳米金的粒径尺寸为3～50nm，优选10～30nm。所述纳米金与所述C18N3(二(氨基乙基酰甲基乙基)十八胺)囊泡溶液中形成C18N3囊泡所用的C18N3的摩尔比为0.01～0.1。
步骤1)中所述混合的时间可为0～24小时，但不包括0小时。
步骤2)中所述HAuCl4与C18N3的混合溶液中HAuCl4与C18N3摩尔比为0.1～10；优选摩尔比为0.5～0.67。
步骤2)中还原剂选自硼氢化钠、抗坏血酸、盐酸羟胺、水合肼、氨水和甲醛中的至少一种。
所述还原剂的摩尔浓度为0～1mol/L，但不为0；所述还原剂与氯金酸的摩尔比例为1～4，优选为1～2。
步骤2)中所述纳米金/C18N3囊泡复合物溶液作为种子，其加入量为0.05mL～0.5mL。
本发明方法制备的纳米材料的结构为表面粗糙类似花状的核壳结构，其核芯为C18N3形成的囊泡，壳层为纳米金。该纳米金花的尺寸为40nm～300nm，具体可为100～150nm。
所述纳米金花具有接受红外光照射后迅速升温的性能，红外光波长的范围为700nm-1200nm，具体可为医学上应用较多的激光器波长808纳米。
上述的纳米金花具有在常温且不接受光照条件下对HeLa细胞无害而在光照条件下可以杀死人源宫颈癌细胞(HeLa细胞)的功能。因此，可作为光热剂用于肿瘤细胞的光热治疗。
上述的纳米金花杀死HeLa细胞的功能是具有浓度依赖性的，其浓度为0mg/mL～50mg/mL，优选浓度为0.3mg/mL～50mg/mL。
本发明中所应用的表面活性剂分子C18N3(二(氨基乙基酰甲基乙基)十八胺)可参照文献(Wang，W.；Lu，W.S.；Jiang，L.Influence of pH on the Aggregation Morphology ofa Novel Surfactant with Single Hydrocarbon Chain and Multi-Amine Headgroups.J.Phys.Chem.B.2008，112，1409-1413)制备得到。
本发明提供的具有光热效应的纳米金花是以表面活性剂分子C18N3(二(氨基乙基酰甲基乙基)十八胺)形成的囊泡作为软模板，纳米金花为壳层形成的空心结构。由于本发明所制备的纳米金花可吸收近红外的光之后迅速转化成热量，在纳米颗粒表面引起快速升温，从而可以作为光热剂应用到光热杀死肿瘤细胞的实验中。本发明提供的纳米金花相比于传统的光热剂具有以下优势：反应条件温和，反应的操作过程简便，以利于节约生产成本，产物的产率较高(几乎可达100％)，单分散性好，尺寸均匀。在近红外区域的吸收峰的位置可通过调节C18N3和氯金酸的混合溶液的浓度进行调节。
附图说明
图1为本发明提供的具有光热效应的纳米金花的制备方法的流程示意图。
图2为本发明实施例1制备的纳米金花的扫描电镜照片。
图3为本发明实施例1制备的纳米金花在光照后温度随光照时间升高的曲线。
图4为本发明实施例1制备的纳米金花在不同浓度时在光照与非光照条件下对HeLa细胞活性的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所述方法如无特别说明均为常规方法。所述试剂和生物材料，如无特别说明，均能从公开商业途径而得。
下述实施例中所应用的表面活性剂两亲分子C18N3(二(氨基乙基酰甲基乙基)十八胺)是根据文献(Wang，W.；Lu，W.S.；Jiang，L.Influence of pH on the AggregationMorphology of a Novel Surfactant with Single Hydrocarbon Chain and Multi-AmineHeadgroups.J.Phys.Chem.B.2008，112，1409-1413)制备得到，方法简单，产率高。
表面活性剂分子C18N3的囊泡直径为50nm-300nm，溶液pH值为2-6，是按照以下方法制备的：将0.2g-0.6g的C18N3加入到20mL-40mL水中，置于超声水浴中超声3min-10min。然后，用0.05M-0.2M的盐酸水溶液调节C18N3水溶液的pH值至2-6。
实施例1、150nm的纳米金花的制备
(1)纳米金花种子溶液的制备
将小尺寸的纳米金(制备方法参照文献T.Liu，J.A.Tang，L.Jiang，The enhancementeffect of gold nanoparticles as a surface modifier on DNA sensor sensitivity.Biochem.Biophys.Res.Commun.313(2004)3.)(粒径约为24nm，纳米金溶液的浓度为0.25mM)与C18N3形成的囊泡溶液(浓度5mM，pH值3)按照体积比1∶5混合，室温搅拌过夜。此溶液称之为种子溶液。
(2)纳米金花生长液的制备
配制氯金酸与C18N3的混合溶液，步骤如下：配100mL C18N3水溶液，此溶液中同时含有氯金酸(HAuCl4·4H2O)，且C18N3与氯金酸的摩尔比为1.5∶1。将混合溶液置于超声水浴中室温超声直至C18N3完全分散在水中。此溶液称之为生长液。
(3)150nm纳米金花的制备
将2.5mL的种子溶液加入到100mL的生长液中，轻轻搅拌使两种溶液均匀混合，30s后向混合溶液中加入350μL、0.5mol/L的抗坏血酸(AA)水溶液(抗坏血酸与氯金酸的摩尔比为1.3)，观察溶液慢慢的由淡黄色转变成蓝色，搅拌均匀后室温静置过夜。
(4)待反应完成后，将产物放到离心机中用8000r/min的转速离心5min，将金纳米粒子沉降下来后用二次蒸馏水洗涤。如此循环3次。按照此实施例的方法制备的纳米金花的直径为150nm，产率为100％。
本实施例制备的纳米金花的扫描电镜照片如图2所示。
实施例2、100nm纳米金花的制备
(1)纳米金花种子溶液的制备
同实施例1的步骤(1)中的步骤
(2)纳米金花生长液的制备
配制氯金酸与C18N3的混合溶液，步骤如下：配100mL C18N3与氯金酸(HAuCl4·4H2O)的混合溶液，其中C18N3与氯金酸(HAuCl4·4H2O)的摩尔比为2∶1。将混合溶液置于超声水浴中室温超声直至C18N3完全分散在水中。此溶液在以下的实施例中称之为生长液。
(3)100nm纳米金花的制备
同实施例1的步骤(3)，其中纳米金花的生长液使用的是本实施例步骤(2)中的生长液，还原剂为盐酸羟胺。
(4)待反应完成后，将产物放到离心机中用8000r/min的转速离心10min，将金纳米粒子沉降下来后用二次蒸馏水洗涤。如此循环3次。按照此实施例的方法制备的纳米金花其直径为100nm，产率为100％。
实施例3、实施例1制备的纳米金花的升温实验
将实施例1制备的纳米金花分散在PBS溶液中，浓度分别为0mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、1mg/mL和2mg/mL。每个浓度的纳米金花取10μL置于含有100μLPBS溶液的96孔板中，然后用功率密度为9W cm-2，波长为808nm的激光器作为光源照射，每隔一定的时间用红外测温枪对每个测量孔的温度进行监测，并记录数据。
实施例1制备的纳米金花不同浓度时温度随时间的变化曲线如图3所示。由图3可知，实施例1制备的纳米金花经过激光照射后3分钟之内温度就能迅速升高，并且升温显著，在浓度达到2mg/mL时，10分钟之内温升可以达到70℃，具有显著的光热效应。
实施例4、实施例2制备的纳米金花的升温实验
将实施例2制备的纳米金花分散在PBS溶液中，浓度分别为0mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、1mg/mL和2mg/mL。每个浓度的纳米金花取10μL置于含有100μL PBS溶液的96孔板中，然后用功率密度为9W cm-2，波长为808nm的激光器作为光源照射，每隔一定的时间用红外测温枪对每个测量孔的温度进行监测，并记录数据。实施例2制备的纳米金花也具有良好的光热效应，10分钟之内的温升可达60℃。
实施例5、实施例1制备的纳米金花的应用
(1)HeLa细胞的培养
人类宫颈癌(HeLa)细胞培养在DMEM培养基中，DMEM培养基中包含有10％的新生牛血清NCS，100units/mL的青霉素和100units/mL的链霉素。细胞及培养介质一直置于37℃含CO25％的生物培养箱中进行细胞培养。HeLa细胞为贴壁型生长的细胞，当其覆盖培养瓶底部达到90％的时候要对细胞消化，所用的消化液为胰蛋白酶。当培养瓶中的HeLa细胞处于对数生长期时对其进行消化，然后离心配制成1mL的细胞悬液，通过血球计数器对细胞进行计数，选择96孔板，每个孔接种～10000个细胞。将接种完HeLa细胞的孔板置于37℃含CO25％的生物培养箱中，24小时细胞贴壁完全后待用。
(2)非光照条件下纳米金花的应用
将实施例1中的纳米金花分别配成0.3mg/mL、0.4mg/mL和0.6mg/mL的水溶液。分别取10μL加入到本实施例步骤(1)准备好的96孔板中，每个浓度设3个复孔。然后将孔板继续置于37℃含CO25％的生物培养箱中培养，24小时后，吸出孔板内的培养液然后用PBS缓冲溶液润洗，再加入等量的无酚红的培养基，其中含有体积分数为10％的CCK溶液。将孔板重新放在生物培养箱中，1h后取出孔板在酶标仪上进行测试。计算细胞存活率时未加入细胞只有培养液的孔作为空白孔，只含有细胞而没有加入纳米金花的孔作为对照孔。
实施例6、实施例1制备的纳米金花的应用
(1)HeLa细胞的培养
同实施例4中步骤(1)的步骤。
(2)光照条件下纳米金花的应用
将实施例1中的纳米金花分别配成0.3mg/mL、0.4mg/mL和0.6mg/mL的水溶液。分别取10μL加入到本实施例步骤(1)准备好的96孔板中，每个浓度设3个复孔。4小时后，待纳米金花与细胞相互作用后，将孔内上方的培养液去除，接着用PBS缓冲溶液润洗几次目的是除去没有与细胞相互作用仍然存在于液体中的过量的纳米金花。然后用功率为9W cm-2，波长为808nm的激光器作为光源照射每个测量孔5min。然后将孔板继续置于37℃含CO25％的生物培养箱中培养，24小时后，吸出孔板内的培养液然后用PBS缓冲溶液润洗，再加入等量的无酚红的培养基，其中含有体积分数为10％的CCK溶液。将孔板重新放在生物培养箱中，1h后取出孔板在酶标仪上进行测试。计算细胞存活率时未加入细胞只有培养液的孔作为空白孔，只含有细胞而没有加入纳米金花的孔作为对照孔。
实施例5与实施例6的细胞活性同时放在附图4中表示，其中AuHNF代表非光照的结果，而AuHNF-NIR代表光照后的结果。结果表明，纳米金花的浓度在0mg/mL～0.6mg/mL的范围内时，实施例1制备的纳米金花在非光照的条件下对细胞没有毒性，即生物相容性良好。在光照条件下，实施例1制备的纳米金花在功率为9W cm-2，波长为808nm的激光器作为光源照射5min后能十分有效的杀死HeLa细胞，尤其是当浓度大于0.4mg/mL时，可以作为一种优良的光热剂应用在光热治疗肿瘤细胞中。
Claims (5)
1.一种制备纳米金花的方法，包括下述步骤：
1)将纳米金与二(氨基乙基酰甲基乙基)十八胺囊泡溶液混合，形成纳米金/C18N3囊泡复合物溶液；
2)将所述纳米金/二(氨基乙基酰甲基乙基)十八胺囊泡复合物溶液作为种子加入到HAuCl4与二(氨基乙基酰甲基乙基)十八胺的混合溶液中，混合均匀后加入还原剂，使氯金酸进行还原反应，得到所述纳米金花；
步骤1)中所述二(氨基乙基酰甲基乙基)十八胺囊泡溶液的摩尔浓度为0.05～10mM，pH值为2～6；
所述二(氨基乙基酰甲基乙基)十八胺囊泡溶液中二(氨基乙基酰甲基乙基)十八胺囊泡的直径为50nm-300nm；
所述纳米金的粒径尺寸为3～50nm；
所述纳米金与所述二(氨基乙基酰甲基乙基)十八胺囊泡溶液中形成二(氨基乙基酰甲基乙基)十八胺囊泡所用的二(氨基乙基酰甲基乙基)十八胺的摩尔比为0.01～0.1；
所述混合的时间为0～24小时，不包括0小时；
步骤2)中所述还原剂选自硼氢化钠、抗坏血酸、盐酸羟胺、水合肼、氨水和甲醛中的至少一种；
步骤2)中所述HAuCl4与二(氨基乙基酰甲基乙基)十八胺的混合溶液中HAuCl4与二(氨基乙基酰甲基乙基)十八胺摩尔比为0.5～0.67；
所述还原剂的摩尔浓度为0～1mol/L，但不为0；所述还原剂与氯金酸的摩尔比例为1～4；
所述纳米金花的粒径为100nm～150nm。
2.权利要求1所述方法制备得到的纳米金花；所述纳米金花是表面粗糙花状的核壳结构，其核芯为二(氨基乙基酰甲基乙基)十八胺形成的囊泡，壳层为纳米金。
3.根据权利要求2所述的纳米金花，其特征在于：所述纳米金花具有接受红外光照射后迅速升温的性能；所述红外光的波长范围为700nm～1200nm。
4.权利要求2或3所述的纳米金花在制备肿瘤光热治疗的光热剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为癌，所述癌为宫颈癌。
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Granted publication date: 20150812 Termination date: 20200530 |