CN110779884B - 一种基于dna调控金-汞合金生长的甲基汞可视化检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于DNA模板调控金‑汞合金纳米颗粒生长的甲基汞可视化检测方法,属于重金属检测技术领域。将HT9 DNA核酸模板与不同浓度甲基汞标准溶液混匀后孵育5分钟,加入硼氢化钠溶液还原制得纳米晶种,紧接着依次加入盐酸羟胺溶液和氯金酸溶液,充分混匀后,记录溶液的颜色,建立标准色卡,利用酶标仪测定溶液的吸光度,与甲基汞浓度对应,建立标准工作曲线。以海产品提取液替换甲基汞标准溶液进行操作,记录溶液的颜色,与标准色卡进行比对,检测溶液吸光值,代入标准曲线,实现海产品中有机汞的检测。本发明的方法简单、灵敏、稳定、抗干扰能力强,无需加热,30分钟完成检测,检测成本低。
Description
技术领域
本发明属于重金属检测技术领域,具体涉及一种基于DNA模板调控金-汞合金纳米颗粒生长的甲基汞可视化检测方法。
背景技术
汞污染是不容忽视的环境问题。自然界中的汞可分为无基汞和有机汞,其中有机汞包含甲基汞和乙基汞,海产品中汞的主要形态是有机汞,比如鱼肉中汞形态95%以上为甲基汞,易通过食物链富集并造成毒性伤害。并且甲基汞的毒性比无基汞高,有机汞脂溶性更强,更容易被人体胃肠道吸收,穿过血脑屏障从而作用于中枢神经系统。甲基汞中毒造成的神经系统损伤多种多样,包括产前脑损伤、认知和运动障碍甚至死亡,特别对于胎儿及儿童的影响更加值得关注。如上世纪50年代发生在日本的水俣病,正是由于食用了甲基汞污染的海产品造成的群体性中毒事件。我国对于鱼类中甲基汞的最大残留限量标准为0.5 mg/kg,食肉鱼类为1.0 mg/kg。
对于食品安全检测来说,仅检测总汞含量无法准确评估其毒性,因此需要分别检测不同形态汞的浓度。对于有机汞的测定一直以来是食品安全与环境评价的难点。传统的有机汞检测方法主要包括原子荧光光谱法以及基于小分子生色团的液相色谱法和毛细管电泳法,这些方法需要复杂的样品制备或大型仪器。近年来,为了避免繁琐的样品制备并实现现场便携式检测,有机汞残留的快速检测方法也取得了进展。比如Zhang等通过合成一种有机小分子荧光探针同时检测无基汞和甲基汞,这一方法的广泛使用受有机小分子合成和荧光检测稳定性的限制(Anal. Chem. 2014, 86, 11919−11924)。自从富含胸腺嘧啶的DNA被发现能够与汞形成T-Hg-T结构,便被大量用于无基汞离子的测定。近年来,Yang Ronghua课题组筛选并优化了甲基汞特异性核酸序列,并结合金属纳米合金法设计了甲基汞的荧光快速检测方法(Anal. Chem. 2015, 87, 2452−2458)。Fu Fengfu课题组在此基础上设计了银-汞纳米合金生长法,实现了甲基汞和乙基汞的可视化检测,然而上述可视化检测方法需要在精确控制反应时间的基础上,进一步通过95 ℃加热反应才能完成检测,在一定程度上受加热设备的限制(Anal. Chem., 2018, 90, 8, 5489-5495)。
发明内容
本发明提供了一种基于DNA调控金-汞合金生长的甲基汞可视化检测方法,一种海产品中甲基汞离子的快速检测方法,该方法在常温下即可完成甲基汞的可视化检测,无需复杂的样品制备过程和昂贵的检测仪器,操作简便、结果稳定。
为实现本发明的目的,采用如下技术方案:
一种基于DNA调控金-汞合金生长的甲基汞可视化检测方法,包括以下步骤:
(1)比对标准的建立:将10 μL 、37.5 μM HT9 DNA核酸模板序列与50 μL 不同浓度甲基汞标准溶液混匀后,室温下放置5分钟;然后分别加入5 μL 25 mM 硼氢化钠溶液,充分混匀后,室温静置20 分钟制得纳米晶种;再分别加入5 μL 浓度为200 mM 的盐酸羟胺(NH2OH · HCl)溶液和50 μL浓度为 1.0 mM氯金酸 HAuCl4 溶液,充分混匀1分钟后,记录混合溶液的颜色;与不同甲基汞浓度一一对应,建立标准色卡;同时,利用酶标仪测定溶液的吸光度,与甲基汞浓度对应,建立标准工作曲线。
(2)取50 μL 经0.22 μm 滤膜过滤的海产品提取液,替换步骤(1)中的甲基汞标准溶液,按按相同的步骤操作,观察混合溶液的颜色变化,并与步骤(1)所构建标准色卡比对,实现甲基汞的半定量检测;通过酶标仪测定混合溶液吸光度代入标准工作曲线,计算甲基汞的含量,实现对海产品提取液中甲基汞含量的检测。
上述步骤(1)所述HT9 DNA核酸模板序列为:5’-TTGTTCTTTGTTAAAAATTCTTTGTTCTT-3’;
上述步骤(1)所述甲基汞标准溶液为:甲基汞溶于pH值为 7.0 (含10 mM Tris–HCl、100 mM 氯化钠、 2 mM 氯化镁)的Tris-HCl 缓冲液中制备而成;
上述步骤(1)所述200 mM 的盐酸羟胺(NH2OH · HCl)溶液的溶剂为纯水;
上述步骤(1)所述1.0 mM 氯金酸HAuCl4 溶液的溶剂为pH 8.0 10 mM Tris-HNO3;
上述步骤(1)所述25 mM 硼氢化钠溶液的溶剂为冰水,现配现用;
上述步骤(1)所述甲基汞标准溶液浓度范围为0.05 -4.0 μM ;
上述步骤(2)所述海产品提取液的制备方法为:海产品清洗干净,打碎,均质;准确称取5.0 g均质样品,加入500 ng/g甲基汞标准溶液对匀质样品进行加标,放入100 mL聚四氟乙烯消解瓶中,加入20 mL 1mol /L 盐酸溶液,盖紧后放入微波消解器中, 微波系统功率为400w,70 ℃加热5 min进行提取, 将提取物冷却至室温后,移出上清液,再加入20 mL1mol /L 盐酸溶液以同样方式重复提取残留物1次,合并两次上清液,从中取1 mL上清液,用0.22 μm滤膜过滤后加入3 kDa 超滤管中,10000 rpm 离心5分钟以分离大分子基质,从收集管的滤液中取400 μL,用真空离心浓缩仪浓缩至干,加入50 μL反应缓冲液Tris-HCl(10 mM Tris–HCl, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, pH 7.0)充分溶解,制得海产品提取液。
本发明的原理是利用能特异性识别甲基汞的HT9 DNA序列为模板,结合甲基汞后经强还原剂硼氢化钠还原后形成不同浓度的汞纳米晶种,晶种颗粒大小约为2-5 nm(透射电镜图如图1a所示);在此基础上加入氯金酸和弱还原剂盐酸羟胺,使纳米晶种继续生长成金汞合金纳米颗粒,大小约为20-30 nm(透射电镜图如图1b所示),呈现由无色向紫红色的颜色变化。而加入其他金属离子时,在较高盐浓度情况下,无法形成稳定的纳米晶种,进一步还原后不发生颜色变化。从而实现对甲基汞的特异性、可视化检测,本方法抗复杂基质干扰能力强,可用于水产品提取液中甲基汞的快速可视化检测。
与现有技术相比,本发明的优势在于:
(1)本发明的甲基汞可视化检测方法,不依赖于大型仪器,以DNA为模板生长金-汞纳米合金进行可视化检测,通过分光光度法可检测低至0.05 μM 甲基汞,通过肉眼可识别低至0.2 μM 甲基汞。
(2)本发明的方法操作简单,无需额外的加热步骤或精确控制反应时间,检测时间短,30分钟内可完成检测,价格低廉,每个样品检测成本低于2元。
(3)本发明所构建的检测方法抗基质干扰能力强,具有较好的选择性。常见金属离子如Hg2+、Mg2+、Na+、Al3+、Ni2+、Cr2+、Ca2+、K+、Fe3+、Fe2+、Ln3+、Co2+、Cd2+、Cu2+、Pb2+等不干扰检测。与传统的基于纳米金聚沉检测方法相比,抗干扰能力更强,可用于水产品提取液中甲基汞的快速检测。
附图说明
图1: 金-汞纳米合金生长不同反应阶段的电镜表征图。a:表示硼氢化钠还原后汞纳米晶种的电镜图;b:表示加入氯金酸和盐酸羟胺进一步还原生长后金-汞纳米合金电镜图。
图2 :分光光度法检测甲基汞标准工作曲线。左侧图表示金汞纳米颗粒在550nm处的吸收值A550与甲基汞浓度的线性关系;右侧图表示不同浓度甲基汞处理后,金汞纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱。
图3:不同浓度甲基汞处理后金-汞纳米合金显色图。
图4:本发明甲基汞的可视化检测方法特异性验证。5μM甲基汞离子CH3Hg+、5μM无机汞离子Hg2+、500 μM无机汞离子Hg2+及500 μM其他金属离子(Al3+、Ni2+、Cr2+、Ca2+、K+、Fe3+、Fe2+、Ln3+、Co2+、Cd2+、Cu2+、Pb2+)处理后的颜色变化图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解,下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明,但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已,并不代表本发明所限定的权利保护范围,本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
溶液配制:
Tris-HCl 缓冲液:10 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、 2 mM MgCl2,pH值为 7.0 。
甲基汞标准溶液:将50.0 mg 氯化甲基汞标准品粉末溶于1991 µL甲醇,配制成100 mM母液,使用前,将100 mM甲基汞母液用Tris-HCl 缓冲液稀释至相应浓度。
37.5 μM HT9 DNA模板:HT9 DNA由上海生工生物公司合成,产品为冻干粉末,相对分子质量为8834.81g/mol, 使用前,每OD(33.71 μg)DNA 粉末中加入38 μL 纯水,配制成100 μM DNA 存储液,并通过Nanodrop 微量分光光度计测定280 nm处的吸光度值计算实际浓度,使用前将DNA存储液稀释成37.5 μM DNA 溶液;
25 mM 硼氢化钠溶液:称取10 mg 硼氢化钠粉末,加入10.57 mL 冰纯水溶解配制成25 mM硼氢化钠溶液 ,此溶液为现配现用;
200 mM 的盐酸羟胺溶液:称取13.9 mg盐酸羟胺粉末,加入1.0 mL纯水溶解配制成200 mM盐酸羟胺溶液;
1.0 mM氯金酸 HAuCl4 溶液:称取1.0 g三水合氯化金,加入50.7 mL纯水,配制成50 mM氯金酸 HAuCl4母液,避光存储;使用前,取200 µL50 mM HAuCl4母液加入9.8 mL pH8.0 的10 mM Tris-HNO3溶液稀释成1.0 mM氯金酸溶液;
实施例1
一种基于DNA调控金-汞合金生长的甲基汞可视化检测方法,包括以下步骤:
(1)比对标准的建立:
取 50 μL一系列不同浓度(0 μM、0.05 μM、0.1 μM、0.2μM、0.5 μM、1.0 μM、2.0 μM、3.0 μM、4.0 μM)的甲基汞标准溶液与10 μL 、37.5 μM HT9 DNA模板混匀后,室温(25℃)下放置5分钟,然后分别加入5 μL 25mM 硼氢化钠溶液,充分混匀后离心10秒,室温(25℃)静置20 分钟制得纳米晶种(图1a),再分别加入5 μL 浓度为200 mM 的盐酸羟胺溶液和50 μL浓度为 1.0 mM氯金酸 HAuCl4 溶液,充分混匀1分钟后,获得金-汞纳米合金产物(图1b)。利用智能手机或数码相机记录溶液的颜色变化(随着甲基汞浓度增大,溶液颜色由无色变为紫红色,颜色由浅色加深,图3)。与甲基汞浓度一一对应,建立标准色卡。同时,利用酶标仪测定溶液在550nm处的吸光度,与甲基汞浓度对应,建立标准工作曲线(如图2所示)。
(2)样品的测定:
小黄鱼、海带、鲍鱼样品购自福州市场,购买后储存于冰上,立即送到实验室。海带样品表面经过纯水冲洗后,用无尘纸吸走表面水分。鲍鱼样品取可食部分,小黄鱼切取食用肌肉部分,将上述三种海产品分别打碎,均质,保存于-20 ℃ 冰箱。准确称取5.0 g海带、鲍鱼肉、小黄鱼肉均质样品,加入500 ng/g甲基汞标准溶液对匀质样品进行加标,以不加标的匀质样品为空白样品;将加标样品和空白样品分别放入100 mL聚四氟乙烯消解瓶中,加入20 mL 1mol /L 盐酸溶液,盖紧后放入微波消解器中。 微波系统功率为400w,70 ℃加热5min, 将提取物冷却至室温后,移出上清液。再加入20 mL 1mol /L 盐酸溶液以同样方式重复提取残留物1次,合并两次上清液。从中取1 mL上清液,用0.22 μm滤膜过滤后加入3kDa 超滤管中,10000 rpm 离心5分钟以分离大分子基质,从收集管中的滤液中取400 μL,用真空离心浓缩仪浓缩至干,加入50 μLTris-HCl 缓冲液充分溶解,制得加标和空白的海产品提取液;以加标和空白的海产品提取液替换步骤(1)比对标准的建立方法中的甲基汞标准溶液进行操作,记录溶液颜色或直接观察颜色变化;通过酶标仪测定吸光度,与标准色卡及标准工作曲线进行比对,实现海产品提取液中甲基汞的检测,回收率计算方法为:
使用离子色谱-电感耦合等离子体质谱法(IC-ICP-MS )对同一样品进行测定,与本发明所述方法进行比对。将空白海产品提取液与等体积2.0 mM L-半胱氨酸(pH 2.0)混匀络合;加标海产品提取液用1.0 mM L-半胱氨酸 (pH 2.0) 稀释62.5倍;各取25 μL进行IC-ICP-MS 分析,IC-ICP-MS分离柱为两个串联的Zorbax SCX阳离子柱,流动相为1.0 mML-半胱氨酸(pH 2.0),流速为1mL/min。从对比结果表1看出: 样品加标回收率为90.4-96.9%,其检测结果与IC-ICP-MS检测结果一致。
表1 空白实际样品与加标实际样品检测结果(n=5)
实施例2一种基于DNA调控金-汞合金生长的甲基汞可视化检测方法特异性检测
将实施例1中, 50 μL一系列不同浓度的甲基汞标准溶液,替换成:5μM甲基汞离子CH3Hg+、5μM无机汞离子Hg2+、500 μM无机汞离子Hg2+、500 μM其他金属离子(Al3+、Ni2+、Cr2+ 、Ca2+、K+、Fe3+、Fe2+、Ln3+ 、Co2+、Cd2+ 、Cu2+、Pb2+),其余步骤同实施例1,检测本发明基于DNA调控金-汞合金生长的甲基汞可视化检测方法的特异性,结果见图4。图4结果表明:5 µM无机汞离子Hg2+ 、500 μM无机汞离子Hg2+及500 µM Al3+、Ni2+、Cr2+、Ca2+、K+、Fe3+、Fe2+、Ln3+、Co2+、Cd2+、Cu2+、Pb2+ 等其他金属离子对甲基汞的检测无干扰。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学,福建商学院
<120> 一种基于DNA调控金-汞合金生长的甲基汞可视化检测方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> HT9 DNA
<400> 1
ttgttctttg ttaaaaattc tttgttctt 29
Claims (5)
1.一种基于DNA调控金-汞合金生长的甲基汞可视化检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)比对标准的建立:将10 μL 、37.5 μM HT9 DNA核酸模板序列与50 μL 不同浓度甲基汞标准溶液混匀后,室温下放置5分钟;然后分别加入5 μL 25 mM 硼氢化钠溶液,充分混匀后,室温静置20 分钟制得纳米晶种;再分别加入5 μL 浓度为200 mM 的盐酸羟胺溶液和50 μL浓度为 1.0 mM氯金酸溶液,充分混匀1分钟后,记录混合溶液的颜色变化;与不同甲基汞浓度一一对应,建立标准色卡;同时,利用酶标仪测定溶液的吸光度,与甲基汞浓度对应,建立标准工作曲线;
(2)取50 μL 经0.22 μm 滤膜过滤的海产品提取液,替换步骤(1)中的甲基汞标准溶液,按相同的步骤操作,观察混合溶液的颜色变化,并与步骤(1)所建立的标准色卡比对,实现甲基汞的半定量检测;通过酶标仪测定混合溶液吸光度代入标准工作曲线,计算甲基汞的含量,从而实现对海产品提取液中甲基汞含量的检测;
步骤(1)所述200 mM 的盐酸羟胺溶液的溶剂为纯水;所述1.0 mM 氯金酸溶液的溶剂为pH 8.0的10 mM Tris-HNO3;所述25 mM 硼氢化钠溶液的溶剂为冰水,现配现用;
步骤(1)所述HT9 DNA核酸模板序列为:5’-TTGTTCTTTGTTAAAAATTCTTTGTTCTT-3’。
2.根据权利要求1所述一种基于DNA调控金-汞合金生长的甲基汞可视化检测方法,其特征在:步骤(1)所述甲基汞标准溶液浓度范围为0.05 -4.0 μM。
3.根据权利要求1所述一种基于DNA调控金-汞合金生长的甲基汞可视化检测方法,其特征在:步骤(1)所述甲基汞标准溶液为甲基汞溶于pH值为 7.0 的Tris-HCl 缓冲液中制备而成。
4.根据权利要求1所述一种基于DNA调控金-汞合金生长的甲基汞可视化检测方法,其特征在:步骤(2)所述海产品提取液的制备方法为:海产品清洗干净,打碎,均质;准确称取5.0 g均质样品,加入500 ng/g甲基汞标准溶液对匀质样品进行加标,然后放入聚四氟乙烯消解瓶中,加入20 mL 1mol /L 盐酸溶液,盖紧后放入微波消解器中,微波系统功率为400w,70 ℃加热5min进行提取,将提取物冷却至室温后,移出上清液,再加入20 mL 1mol /L 盐酸溶液以同样方式重复提取残留物1次,合并两次上清液,从中取1 mL上清液,用0.22μm滤膜过滤后加入3 kDa 超滤管中,10000 rpm 离心5分钟,从收集管中的滤液中取400 μL,用真空离心浓缩仪浓缩至干,加入50 μLTris-HCl缓冲液充分溶解,制得海产品提取液。
5.如权利要求1所述的一种基于DNA调控金-汞合金生长的甲基汞可视化检测方法在甲基汞检测中的应用。
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