CN106668871A - 一种抑制乳腺癌细胞生长的光敏型磁性纳米粒体系的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制乳腺癌细胞生长的光敏型磁性纳米粒体系的制备方法及其应用。首先对油酸包裹的磁性纳米粒子Fe₃O₄‑OA进行氨基化处理，活化光敏剂上的羧基，然后通过氨基与羧基的缩合反应将光敏剂接枝到Fe₃O₄‑OA表面，得到所述光敏型磁性纳米粒体系。在光照条件下具有光动力治疗乳腺癌的效果，实现了磁场的乳腺癌靶向与叶酸细胞靶向相结合，能够高效靶向抑制乳腺癌细胞生长，并且具有较好缓释性、稳定性、分散性以及均一性的特点，以及毒副作用低的优势。该体系是一种结合磁靶向和纳米技术的新的给药途径，对于药物的充分利用，达到高效低毒害的治疗效果十分有意义，具有和好的应用前景。

Description

一种抑制乳腺癌细胞生长的光敏型磁性纳米粒体系的制备方 法及应用

技术领域

本发明属于生物医药材料技术领域。更具体地，涉及一种抑制乳腺癌细胞生长的光敏型磁性纳米粒体系的制备方法及应用。

背景技术

乳腺癌是全球范围内女性最常见的恶性肿瘤之一，近几年逐渐跃居女性恶性肿瘤的首位。据有关统计，我国许多大城市的乳腺癌发病率年平均增长速度远高于世界平均增长速度。同时，我国乳腺癌的死亡率也呈缓慢的上升趋势，而且乳腺癌的发病年龄出现了年轻化的倾向，其发病的中位年龄是48岁，比西方国家提早了10年，对女性的身心健康构成了严重威胁。

目前，乳腺癌的治疗主要是以手术为主，配合术后放化疗、内分泌治疗及靶向治疗等的综合疗法，虽然治疗方法已经比较完善，但仍达不到彻底根治的目的，而且放、化疗的不良反应及药物的耐药性也给患者带来沉重的生理与心理负担，减轻病人的痛苦，提高患者的生活质量是我们急需要解决的问题。随着分子生物学技术的发展和对发病机制从细胞、分子水平的进一步认识，乳腺癌治疗进入了一个全新分子靶向治疗时代。与全身、广泛性的化疗、放疗相比，靶向治疗具有高效、选择性地杀伤乳腺癌细胞，能减少对正常组织损伤，不良反应小等优点。

纳米生物技术作为纳米技术与生物技术相结合的产物，在疾病的诊断及治疗方面具有十分广阔的应用前景，应用纳米材料作为药物载体早已成为纳米医学研究领域的前沿方向。国内外更是开展了很多用靶向纳米药物抑制各类癌细胞生长的研究。近年来由于乳腺癌发病率的持续高升，针对乳腺癌靶向治疗的研究方兴未艾，出现了抗体介导的靶向、微载体介导的靶向、乳腺癌干细胞靶向等研究领域，为乳腺癌的治疗研究奠定了理论基础。近几十年研究发现，纳米技术联合药物对退行性疾病，如肿瘤、糖尿病和心血管疾病等的预防以及治疗有着不容忽视的作用。以磁性纳米粒作为抗肿瘤药物载体，具有传统化疗法不可比拟的效果。化疗药物对肿瘤细胞和正常细胞无选择性，都有毒害作用。传统给药方法，药物经血液流经全身，因为化疗效果对用药剂量有依赖关系，要加强疗效就要加大剂量，这将使血药浓度加大，而导致全身毒性。应用载药磁性纳米粒，在靶区加磁场，可将药物集中于靶区，在血药浓度很低的情况下，也可以达到高的靶区药物浓度，从而达到既最大程度地杀伤肿瘤细胞又不伤害健康组织的目的。但是制备可重复利用、结构均一、载药量和释药率可控的纳米粒子仍然是一个技术上的挑战。

另外，光动力学治疗(Photodynamic therapy, PDT)是一种新兴的治疗癌症的方法，对肿瘤细胞具有相对选择性和组织特异性；副作用小；与手术、放疗和化疗等疗法相辅相成；可重复用药，无药物耐受性等优点。光敏剂能够吸收特定波长的光的能量并传递给周围的氧分子，产生化学性质很活泼的单线态氧，破坏细胞和细胞器的结构与功能，从而杀伤癌细胞，达到治疗肿瘤的目的。临床上，PDT已经应用于肺癌、皮肤癌、食管癌、膀胱癌、头颈部癌等多种癌症的治疗，并取得了较好的治疗效果。

由于光敏剂可以被病变靶组织选择性的吸收，所以PDT具有相对特异性地杀伤肿瘤细胞、对健康组织损害小等优点。但PDT是一种局部疗法，治疗效果受光波穿透深度和光敏剂种类的影响。临床上常采用PDT与其它肿瘤治疗方法联合作用，以提高PDT疗效。光敏剂是决定PDT效应的关键因素之一。由于光敏剂在各组织中的半衰期不同，健康组织和肿瘤组织对其清除的速率是不同的，健康组织对光敏剂的清除速率高于肿瘤组织，经过一定时间后，当健康组织中的大部分敏剂已被清空时，肿瘤细胞中光敏剂的浓度并没有多大的减少，可造成肿瘤组织中光敏剂的浓度大大高于其周围正常组织，即恶性细胞对特定光敏剂显示出很大的亲和力，此时引入光照能使肿瘤细胞选择性死亡，而对周围的正常组织影响较小或没有影响，这一特性使得PDT成为一种新的非常有发展前景的肿瘤治疗方法。其中，研究较多的是PDT联合化疗对肿瘤的抑制作用。但天然光敏剂与人工光敏剂的联合作用，却鲜见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有治疗乳腺癌药物的缺陷和不足，提供一种光敏型磁性纳米递药体系的制备技术，氨基化修饰油酸包裹的四氧化三铁磁性纳米粒，并在纳米粒子表面共价接枝光敏剂，合成磁性纳米粒子复合物，在光照条件下具有光动力治疗乳腺癌的效果，能够高效靶向抑制乳腺癌细胞生长，并且具有较好的靶向性、缓释性、稳定性、分散性以及均一性的特点，以及毒副作用低的优势。该体系是一种结合磁靶向和纳米技术的新的给药途径，对于药物的充分利用，达到高效低毒害的治疗效果十分有意义。

本发明的目的是提供一种抑制癌细胞生长的光敏型磁性纳米粒体系。

本发明另一目的是提供所述光敏型磁性纳米粒体系的制备方法。

本发明的再一目的是提供所述光敏型磁性纳米粒体系的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种抑制乳腺癌细胞生长的光敏型磁性纳米粒体系的制备方法，首先对油酸包裹的磁性纳米粒子Fe₃O₄-OA进行氨基化处理，具体是通过取代反应，将油酸包裹的磁性纳米粒子Fe₃O₄-OA上的羟基进行氨基取代，活化光敏剂上的羧基，然后通过氨基与羧基的缩合反应将光敏剂接枝到Fe₃O₄-OA表面，得到所述光敏型磁性纳米粒体系。

优选地，所述光敏剂为血卟啉单甲醚（HMME）和/或藻蓝蛋白（PC）。即合成得到的具有光敏性的磁性纳米复合物为Fe₃O₄-OA-NH-HMME、Fe₃O₄-OA-NH-PC或Fe₃O₄-OA-NH-HMME/PC。

具体优选地，上述抑制乳腺癌细胞生长的光敏型磁性纳米粒体系的制备方法，包括如下步骤：

S1.通过共沉淀法反应合成油酸包裹的磁性纳米粒子Fe₃O₄-OA；

S2.在酸性条件下，通过取代反应，用氨基化的硅烷偶联剂上的氨基取代油酸包裹的磁性纳米粒子Fe₃O₄-OA上的羟基（将硅烷偶联剂上的氨基修饰到油酸包裹的磁性纳米粒子Fe₃O₄-OA的表面），使Fe₃O₄-OA氨基化，得到Fe₃O₄-OA-NH₂；

S3.用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和水溶性碳化二亚胺（EDC）活化光敏剂上的羧基（活化后的羧基具有很强的反应活性）；

S4.通过光敏剂上活化的羧基与Fe₃O₄-OA-NH₂上氨基间的缩合反应，将光敏剂接枝到Fe₃O₄-OA-NH₂的表面，合成得到具有光敏性的磁性纳米复合物。

其中，优选的，步骤S2所述硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷。

优选地，步骤S2的具体方法为：取油酸包裹的磁性纳米粒子Fe₃O₄-OA加入分散剂中，超声分散处理20～40min（优选30min）；调节反应体系pH至6以下；随后加入过量的硅烷偶联剂，常温下剧烈搅拌反应6～8h（优选7h）；随后用去离子水清洗数次，放入45℃烘箱中过夜。

优选的，所述分散剂为体积比4：1的乙醇和高纯水的混合液。

优选地，步骤S3的具体方法为：取光敏剂加入激活剂溶液中活化20～40min（优选30min）；所述激活剂为质量比2～3：1的N-乙酰琥珀酰亚胺（NHS）和水溶性碳化二亚胺（EDC）的混合液，pH为4.5～5.5。

更优选地，所述激活剂为质量比5：2的N-乙酰琥珀酰亚胺（NHS）和水溶性碳化二亚胺（EDC）的混合液，pH为5。

优选地，步骤S4的具体方法为：取步骤S2制备的Fe₃O₄-OA-NH₂加入步骤S3的混合液中，常温下偶联反应10～15h（优选12h）；反应产物用乙醇和去离子水洗涤多次，放入烘箱中烘干。

优选地，步骤S1合成油酸包裹的磁性纳米粒子Fe₃O₄-OA的具体方法如下：

S11.取FeSO₄·7H₂O和FeCl₃·6H₂O，加入超纯水，置于油浴中，充入氮气进行保护，50～70℃搅拌20～40min（优选60℃搅拌30min），得铁盐溶液；

S12.取NaOH加入超纯水中，50～70℃（优选60℃）充分搅拌溶解，加入上述铁盐溶液中；待混合溶液反应8～15min（优选10min）后，升温至60～80℃（优选70℃），加入HCl溶液，调节pH至2～4（优选pH为3）；

S13.向步骤S12反应后溶液中加入油酸，搅拌2～4h（优选3h）后，在磁铁辅助下分别用无水乙醇和丙酮进行清洗，最后去离子水洗涤后干燥35～45h（优选40h）。

另外，根据上述方法制备得到的抑制乳腺癌细胞生长的光敏型磁性纳米粒体系，以及其在制备抗癌药物方面的应用，都应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述抗癌药物为抗乳腺癌药物。

本发明经过大量的研究探索，成功合成了磁性纳米粒复合物Fe₃O₄-OA-NH-HMME、Fe₃O₄-OA-NH-PC与Fe₃O₄-OA-NH-HMME/PC，并具有高效靶向抑制乳腺癌细胞生长的效果。血卟啉单甲醚（HMME）作为新型第二代光敏剂于401、500、533、569、613 nm处具有特征吸收峰，它可迅速从组织中清除，对正常组织的毒副作用很低，急性和长期毒性均低于第一代光敏剂血卟啉衍生物（HPD）具有成分单一明确、组成稳定、给药后避光期短等明显优点，在基础实验及临床疾病治疗中显示出在体内代谢快、皮肤光敏感时间短、单线态氧产量高、吸收波长较长等明显优势，是一种在癌症临床方面非常有应用前景的光敏剂。而藻蓝蛋白（PC）藻蓝蛋白是从螺旋藻中分离出的一种深蓝色粉末，其功用为吸收光(橙黄色)能和传递光能，具有抗癌、促进血细胞再生、养护卵巢、促使人体内合成弹力蛋白、清除人体内多余自由基等功效，对过敏也有一定抑制效果，是一种天然光敏剂，光敏杀伤肿瘤细胞作用强，适用于肿瘤光动力治疗。

本发明通过利用超顺磁性的纳米磁性粒子通过氨基化修饰后，共价接枝抗癌光敏剂血卟啉单甲醚（HMME)和藻蓝蛋白（PC）构成纳米靶向递药系统，通过局部静脉注射给药方式作用到癌变部位，两种光敏剂随载体进入细胞后，经激光照射释放单态氧与自由基诱导乳腺癌细胞死亡，从而高效抑制癌细胞生长。实验证明本发明所述递药系统具有毒副作用低，并且结合了天然光敏剂与人工合成光敏剂协同抑制的目的，是一种新型的多重靶向给药系统。

本发明成功的合成了接枝不同比例的藻蓝蛋白与血卟啉单甲醚的纳米粒子，并且具有很好的效果。将天然光敏剂与人工合成的光敏剂接枝到纳米材料表面，应用纳米技术来更好的发挥光敏剂的效果，减少毒副作用。但藻蓝蛋白与血卟啉单甲醚的作用机制尚不明确。我们初步检测了活性氧与钙离子的释放，发现单独接枝HMME的粒子，随着作用时间的延长，活性氧的浓度显著提高，接枝PC与PC/HMME的粒子，活性氧没有显著性的变化。

具体实验方面，本发明通过傅里叶红外光谱（FTIR）、紫外吸收检测、热重分析、X射线光电子能谱分析（XPS）、拉曼光谱（Raman）等手段表明，成功构建了乳腺癌纳米靶向递药系统，是一种光敏型磁性纳米递药体系，具有很好的磁性应能力与光敏特性。对于该纳米粒子的生物学效应，我们将磁性纳米粒子复合物应用于乳腺癌细胞研究，通过CCK-8检测、DAPI检测、细胞迁移检测、活性氧与Ca²⁺检测，流式细胞术等细胞实验验证显示，该纳米粒子复合物具有很好的抑制乳腺癌细胞生长的效果，对乳腺癌细胞具有显著的杀伤作用。

本发明具有以下有益效果：

本发明优化了磁性Fe₃O₄纳米粒子合成方案，并吸附光敏剂HMME与PC，实现了磁场的乳腺癌靶向与叶酸细胞靶向相结合，成功构建光敏型磁性纳米递药体系，并具有较好的稳定性、分散性以及均一性的特点，实现了载药磁性纳米药物与激光的有机结合，构成了一种新型的抑制乳腺癌细胞生长的治疗系统。

本发明的光敏型磁性纳米粒子激光处理后对乳腺癌细胞生长抑制率最高，有明显的抑制乳腺癌细胞生长的效果，并协同化疗与光动力治疗，为天然光敏剂与人工光敏剂的协同作用提供了理论基础，也为乳腺癌的精准化个体化综合治疗和靶向药物治疗临床治疗提供了新的思路。

本发明中将光敏剂利用磁性纳米粒子载体携带直接靶向作用于乳腺癌细胞，不仅能高效抑制乳腺癌细胞的生长，而且大大降低了常规光敏剂药物使用剂量，以及过高剂量的光敏剂对正常组织的损害。

附图说明

图1为本发明光敏型磁性纳米粒子（Fe₃O₄-OA-NH-HMME、Fe₃O₄-OA-NH-PC、Fe₃O₄-OA-NH-HMME/PC）的合成示意图。

图2为本发明光敏型磁性纳米粒子的粒径检测结果。

图3为本发明光敏型磁性纳米粒子的傅里叶红外光谱检测结果。

图4为本发明光敏型磁性纳米粒子的紫外吸收检测结果。

图5为本发明光敏型磁性纳米粒子的接枝率测试结果。

图6为激光条件下不同纳米粒子作用于乳腺癌细胞MCF-7形态观察；A为PC在不同激光条件下对细胞存活率影响；B为HMME在不同激光条件下对细胞存活率影响；C为激光条件下不同比例PC与HMME对细胞存活率影响；D为激光照射下纳米粒子对细胞存活率的影响。

图7为不同纳米粒子作用于乳腺癌细胞MCF-7的DAPI/PI双染结果。

图8为不同纳米粒子作用于乳腺癌细胞MCF-7的细胞迁移结果。

图9为激光条件下纳米粒子作用于乳腺癌细胞MCF-7后的活性氧（ROS）检测结果。

图10为激光条件下纳米粒子作用于乳腺癌细胞MCF-7后的钙离子（Ca²⁺）检测结果。

图11为激光条件下纳米粒子作用于乳腺癌细胞MCF-7后的吖啶橙染色结果。

图12为激光条件下纳米粒子作用于乳腺癌细胞MCF-7后的流式细胞仪检测细胞凋亡结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

以下实施例所用到的主要材料、试剂与仪器如下：

（1）细胞株：人乳腺癌细胞(MCF-7细胞系)由中国科学院深圳先进技术研究院提供，经本实验室传代培养。

（2）主要试剂：血卟啉单甲醚（HMME），购自上海笛柏化学有限公司；氨丙基乙氧基硅烷，购自成都艾科达化学试剂有限公司。

（3）仪器：Sigma32184高速冷冻离心机，Thermo CO₂培养箱，江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器，HV-85 高压灭菌器，无菌操作台，广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅等。

实施例1 纳米粒子的合成与表征

1、纳米粒子的合成示意图如附图1所示，具体方法如下：

（1）油酸包裹的磁性纳米粒子（Fe₃O₄-OA）的合成

取FeSO₄·7H₂O和FeCl₃·6H₂O，加入超纯水，置于油浴锅中，充入氮气进行保护，60℃搅拌30 min；取NaOH加入超纯水中，60 ℃充分搅拌溶解，加入如上铁盐溶液中；待混合溶液反应10 min后，升温至70 ℃，加入HCl溶液，调节pH至3；向反应后溶液中加入油酸，搅拌3 h后，在磁铁辅助下分别用无水乙醇和丙酮进行清洗，最后去离子水洗涤后干燥40 h。

（2）磁性纳米粒子上氨基的修饰（Fe₃O₄-OA-NH₂）

取100 mL乙醇和25 mL高纯水进行混合，配制成分散剂；取20 mg油酸包裹的磁性纳米粒子Fe₃O₄-OA加入分散剂中，超声分散处理30 min；调节反应体系pH至6以下；随后加入过量的硅烷偶联剂（3-氨丙基三乙氧基硅烷），在常温下剧烈搅拌反应7 h；随后用去离子水清洗四次，45℃放入烘箱中过夜。

（3）光敏剂（HMME/PC）上羧基的活化

取N-乙酰琥珀酰亚胺（NHS）50mg和水溶性碳化二亚胺（EDC）20mg进行混合，混合液作为激活剂；调节混合液的pH至5左右；取反应所需的光敏剂6mg（一种光敏剂则取6mg，两种光敏剂则每种取3mg）加入激活剂溶液中活化30min。本实施例所用光敏剂为血卟啉单甲醚（HMME）和藻蓝蛋白（PC）。

（4）光敏剂/磁性纳米粒子复合物（Fe₃O₄-OA-NH-HMME、Fe₃O₄-OA-NH-PC与Fe₃O₄-OA-NH-HMME/PC）的制备

取步骤（2）制备的Fe₃O₄-OA-NH₂ 6mg加入步骤（3）的混合液中常温下偶联反应12h；用乙醇和去离子水将反应后产物洗涤多次，放入烘箱中烘干。

2、纳米粒子的表征

（1）粒径检测

取偶联反应所得的光敏剂与磁性纳米粒子的复合物（Fe₃O₄-OA-NH-HMME、Fe₃O₄-OA-NH-PC与Fe₃O₄-OA-NH-HMME/PC），溶于去离子水中，超声20 min，离心除去大颗粒物质；吸取上清液100μL加入样品池中，打开相应测量软件进行测量。

如图2所示，偶联得到的Fe₃O₄-OA-NH₂的平均粒径在80 nm左右，表明样品合成的偶联产物大小还是比较合适与均一的。而Fe₃O₄-OA-NH-HMME的粒子粒径在200-300nm左右，Fe₃O₄-OA-NH-HMME-PC粒径更大一些，说明接枝上光敏剂之后，磁性纳米粒的粒径明显有变大的趋势，符合我们的预期。

（2）红外光谱检测

将取偶联反应所得的光敏剂与磁性纳米粒子的复合物进行干燥处理，然后放入研钵中，加入一定量的KBr，研磨均匀使混合物研磨到粒度小于2 μm，以免散射光影响，之后放入干燥机中进行干燥处理，在油压机上用10 MPa左右的压力将混合物压成透明薄片，上机测定。

红外光谱法是一种根据分子内部原子间的相对振动和分子转动等信息来确定物质分子结构和鉴别化合物的分析方法。图3是傅里叶红外变换仪检测结果，HMME、PC都有特定的基团峰，Fe₃O₄-OA-NH-HMME连接之后有明显的碳氮键生成，Fe₃O₄-OA-NH-PC连接之后也有明显的碳氮键生成，表明合成成功；Fe₃O₄-OA-NH-HMME/PC可以观察出有光敏剂连接上，但具体的种类仍需进一步表征确定。

（3）紫外可见光谱检测

通过紫外可见分光光度计，在190-900 nm的波长范围内对样品进行扫描，可以获得样品在这个波长范围内的最大吸收波长。用油酸包裹的磁性纳米粒为样品1，上述合成的偶联反应所得的光敏剂与磁性纳米粒子的复合物为样品2，然后以分散剂水为参比液，分别取适量的样品于比色皿中，在190-900 nm的范围内进行光谱扫描检测。

紫外吸收是利用物质的分子或离子对紫外和可见光的吸收所产生的紫外可见光谱及吸收程度可以对物质的组成、含量和结构进行分析、测定、推断。不同官能团，吸收的波长不一样。如图4所示，HMME的吸收波长在390 nm左右，PC的吸收波长在620 nm左右，从图中我们可以比较明了的看到接枝光敏剂后，磁性纳米粒就会在相应接枝的波长处出现光敏剂的紫外吸收峰，由此可以表明后两种光敏剂均已接枝成功。

（4）接枝率检测

PC与HMME接枝于纳米粒子上之后，总质量发生变化，剩余（未固定的）PC与HMME质量将小于固定前PC与HMME总质量。同时，分散于酒精后的密度、分光光度也将发生变化。故可采用分光光度法进行定量检测，PC与HMME在628 nm与396 nm处出现了最大紫外吸收峰，故可用该波长进行后续实验测定。通过对标准品PC与HMME进行紫外分光光度法进行标准曲线绘制后，进行对接枝一定量的PC与HMME样品的质量变化进行检测并进行计算（m₁，m₂)。接枝率=(m₁-m₂)/m₁*100%计算，得出结果。

通过配制不同浓度的血卟啉单甲醚与藻蓝蛋白标准品的溶液，通过紫外可分光光度计进行对其吸光度的检测，并根据吸光度与相应的藻蓝蛋白与血卟啉单甲醚浓度进行绘制标准曲线。通过对样品进行吸光度测定，并根据上述结果进行计算可知血卟啉单甲醚原溶液浓度1mg/ml，紫外接枝后剩余浓度为5.84μg/ml，藻蓝蛋白原溶液浓度1mg/ml，紫外接枝后剩余浓度为554μg/ml。由图5所示，氨基化修饰后的磁性纳米粒通过共价接枝光敏剂，经检测光敏剂血卟啉单甲醚的接枝率达到98.83%，藻蓝蛋白的接枝率达到44.6%，具有较好的接枝效果。

实施例2 纳米粒子体外抑制乳腺癌应用研究

1、形态学观察

从培养箱中取出培养好的细胞，胰酶消化2min，加4ml培养液吹打细胞。取3ml细胞悬液加到离心管中，加11mL培养液，吹打细胞，使细胞悬浮均匀。用移液枪吸取100μL细胞悬液加到24孔板中，使细胞贴壁培养6h。在黑暗条件下取出合成的纳米材料，用磁铁吸附，使纳米材料沉淀到试管底部。吸出上清液，用PBS洗纳米材料，用磁铁吸附，使纳米材料沉淀到试管底部。吸出上清，加PBS混匀纳米材料。取出培养好的细胞，吸去细胞废液，加PBS洗两遍，加入新鲜培养基。加纳米材料避光孵育4h，照激光（100mW,10min）。在培养箱中培养0 h,6 h,12 h,24 h,拍细胞形态照片。

2、CCK-8检测细胞毒性

为了客观地评价纳米粒子对于MCF-7细胞的影响，我们在24h，分别用不同浓度PC、HMME的作用于MCF-7细胞。通过CCK-8实验分析细胞在不同时间及浓度下细胞的存活率。

从培养箱中取出培养好的细胞，胰酶消化2 min，加4 mL培养液吹打细胞。取2 mL细胞悬液加到离心管中，加3 mL培养液，吹打细胞，使细胞悬浮均匀。用移液枪吸取100 μL细胞悬液加到96孔板中，使细胞贴壁培养6 h。取出培养好的细胞，吸去细胞废液，加PBS洗两遍，加入新鲜培养基。加纳米材料避光孵育4 h，照激光（100 mW,10 min）提前4 h, 加入CCK-8 10 μL，孵育4 h后450 nm测OD值。使用SPSS数据处理软件处理数据，PS做图。

结果如附图6所示，在激光波长633.0nm与628.5nm的激发下，随着PC浓度的加大，MCF-7细胞的存活率没有显著变化，而HMME处理后，细胞存活率显著降低，波长633.0nm激发下，粒子的作用效果更好。另一方面，我们探索了不同比例的PC/HMME处理后，细胞存活率的变化，发现在6/4时，效果最好。将PC与HMME分别接枝到磁性粒子Fe₃O₄-OA-NH₂表面，使用400mg/ml的粒子浓度作用于MCF-7细胞，可以看到随着时间的延长，粒子对细胞的杀伤效果明显提升。其中，接枝HMME的粒子，杀伤效果最好，共接枝HMME和PC的粒子，也有很好的杀伤效果。

3、DAPI/PI双染

从培养箱中取出培养好的细胞，胰酶消化2 min，加4 mL培养液吹打细胞。取3 mL细胞悬液加到离心管中，加11 mLl培养液，吹打细胞，使细胞悬浮均匀。用移液枪吸取100 μL细胞悬液加到24孔板中，使细胞贴壁培养6 h。取出培养好的细胞，吸去细胞废液，加PBS洗两遍，加入新鲜培养基。加纳米材料避光孵育4h，照激光（100 mW，10 min）。在培养箱中培养24h,吸取废液，PBS洗两遍。加配置好的DAPI染色液染色10 min，吸取废液，PBS洗两遍。加PI染色液染色10 min，使用荧光显微镜拍照，PS处理图片。

DAPI是一种可以透过细胞膜，与DNA特异性结合的蓝色荧光染料。它可以穿过正常的细胞质膜，进入细胞核中，从而将细胞核然为蓝色。PI 是一种只能通过受损伤的细胞膜，与DNA结合的红色荧光染料。

如图7所示， Fe₃O₄-OA-NH-PC处理24h的细胞核有少量的核凝集，相同浓度的Fe₃O₄-OA-NH-HMME处理的细胞有明显的核凝集，Fe₃O₄-OA-NH- HMME/PC处理的细胞也发生了核凝集现象，表明细胞发生了凋亡。另外，PI染色后，将整个细胞染成了红色， 表明粒子处理后对细胞膜造成了损伤。因此，粒子处理后细胞的死亡机制，除了凋亡，具体是什么还不清楚，需要后续的实验来进一步探索。但是明确的是，本发明的纳米粒子处理细胞后，能够引起细胞发生核凝集、凋亡现象，而且能够对细胞膜造成损伤。

4、细胞迁移

细胞划痕法是间接测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型。如图8上图所示，细胞培养到12h、24h、48h，取出细胞培养板，可以观察周围到与对照组相比，处理的细胞迁移到至中央划痕区的明显减少。初步表明Fe₃O₄-OA-NH-PC、Fe₃O₄-OA-NH-HMME、Fe₃O₄-OA-NH-HMME/PC可以抑制MCF-7细胞的迁移与增殖。图8下图表明在短时间内，粒子对细胞迁移的效果更明显一些，随着作用时间的延长，粒子仍对细胞迁移有很好的抑制作用，可以初步表明，我们的粒子合成是成功的。

5、活性氧检测试剂盒检测ROS释放

从培养箱中取出培养好的细胞，胰酶消化2 min，加4 mL培养液吹打细胞。取2 mL细胞悬液加到离心管中，加3 mL培养液，吹打细胞，使细胞悬浮均匀。移液枪吸取100 μL细胞悬液加到96孔板中，使细胞贴壁培养6 h。取出培养好的细胞，吸去细胞废液，加PBS洗两遍，加入新鲜培养基。加纳米材料避光孵育4 h，照激光（100 mW，10 min）。提前45 min，加入DCFH-DA 0.1 μL，孵育45 min后, PBS洗涤细胞2次。使用488 nm激发波长，525 nm发射波长测OD值。使用SPSS数据处理软件处理数据，PS做图。

ROS在肿瘤细胞中普遍高于正常细胞，肿瘤细胞内抗氧化酶活性更高。进一步增加ROS更容易引起肿瘤细胞的死亡。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

如图9所示，在相同浓度的粒子作用条件下，随着作用时间的延长，可以看到粒子Fe₃O₄-OA-NH-HMME处理组的活性氧浓度发生显著性的上升，而其他处理组也有一定程度的上升，初步显示粒子是通过激发活性氧来杀伤细胞。

6、Fluo-3 AM检测Ca⁺

从培养箱中取出培养好的细胞，胰酶消化2 min，加4mL培养液吹打细胞。取2 mL细胞悬液加到离心管中，加3 mL培养液，吹打细胞，使细胞悬浮均匀。用移液枪吸取100μL细胞悬液加到96孔板中，使细胞贴壁培养6 h。取出培养好的细胞，吸去细胞废液，加PBS洗两遍，加入新鲜培养基。加纳米材料避光孵育4 h，照激光（100 mW，10 min）。吸取废液，使用PBS冲洗细胞两次。提前45 min, 加入0.1 μL 的Fluo-3 AM荧光染料，孵育45 min后, PBS洗涤细胞2次，加入无血清培养基。使用488 nm激发波长，525 nm发射波长测OD值。使用SPSS数据处理软件处理数据，PS做图。

钙离子在细胞的生理活动中起着重要的作用，游离钙离子浓度的变化与细胞的功能、信号的传递及损伤和凋亡都有着密切的联系。钙离子是单个细胞生存和死亡的信号，并调控它的种种功能。同时，胞内钙离子浓度的变化也是细胞凋亡的研究手段之一。Fluo-3AM是一种可以穿透细胞膜，检测细胞内Ca²⁺浓度变化的荧光染料。在细胞凋亡的后期，钙离子通道打开，细胞内钙离子浓度升高，通过不同的方式精细调控凋亡的进程。

结果如图10所示，在相同浓度的粒子作用条件下，随着作用时间的延长，可以看到粒子Fe₃O₄-OA-NH-PC处理组的Ca²⁺浓度有一定量的上升，而其他处理组呈下降趋势，造成这种现象的原因还不清楚，需要我们后续的实验进探索。

7、吖啶橙染色

从培养箱中取出培养好的细胞，胰酶消化2 min，加4 mL培养液吹打细胞。取2ml细胞悬液加到离心管中，加8ml培养液吹打细胞，使细胞悬浮均匀。用移液枪吸取1mL细胞悬液加到24孔板中，使细胞贴壁培养6 h。取出培养好的细胞，吸去细胞废液，加PBS洗两遍，加入新鲜培养基。加纳米材料避光孵育4 h，照激光（100 mW，10 min）。吸取废液，使用PBS冲洗细胞两次。加入吖啶橙染液孵育40 s，快速吸出废液，加入PBS洗两遍，在荧光显微镜下拍照。使用Photoshop处理数据。

吖啶橙是具有细胞膜通透性，能透过完整的细胞膜进入核内，与核内核酸结合。它与细胞中DNA和RNA结合存在差别，可以发出不同颜色的荧光。细胞凋亡时主要的特征变化是细胞核，而细胞核的主要成分是DNA，核仁中含有RNA，通过DNA、RNA的不同荧光可观察凋亡细胞的核的变化。正常细胞核因含DNA显示黄绿色荧光，细胞质均匀，与核仁都显示橘红色荧光，细胞体积较大且铺展。凋亡细胞体积明显缩小，核呈黄绿色，断裂为多个碎块状，核仁无，碎裂的核由膜包裹着凸起于细胞表面呈黄绿色。

结果如图11所示，粒子作用24h后，对照组与Fe₃O₄-OA-NH-PC处理组的细胞核因含显示黄绿色荧光，细胞质均匀与核仁都显示橘红色荧光，细胞体积较大且铺展。Fe₃O₄-OA-NH-HMME与Fe₃O₄-OA-NH-HMME/PC处理组的细胞核呈黄绿色，表明细胞发生了凋亡。粒子处理48h后，Fe₃O₄-OA-NH-PC、Fe₃O₄-OA-NH-HMME与Fe₃O₄-OA-NH-HMME/PC处理的细胞都呈黄绿色，断裂为多个碎块状，无核仁，细胞都发生了凋亡。

8、流式细胞仪检测细胞凋亡

细胞在培养瓶中培养至80%后，以3×10⁴/孔的密度接种在6孔板中，在细胞培养箱中培养24 h，纳米材料处理细胞，离心管离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次，加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20 ℃长期固定。离心收集细胞，以1 mL的PBS洗细胞一次，加入500 μL PBS混合液（含50 ug/mL溴化乙锭（PI），100 μg/mL RNase A，0.2% Triton X-100）4 ℃避光孵育15 min，随后加入Annexin V荧光染料染色15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡。

Annexin V是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，Annexin V与鉴定细胞死活的核酸染料PI合并使用，来区分凋亡细胞与死亡细胞。

结果如图12，与对照组相比，经激光照射后，细胞发生了一部分的死亡和部分的细胞凋亡。粒子处理Fe₃O₄-OA-NH-PC处理后，对细胞有微量的修复作用，Fe₃O₄-OA-NH-HMME处理后，细胞发生了较多的细胞凋亡与死亡，效果较好。而粒子Fe₃O₄-OA-NH-HMME/PC处理的细胞，发生了大量的死亡，效果最好，表明本发明的纳米粒子合成是成功的，只是其具体发挥作用的机理，还需要后续的实验进一步的探究。

Claims (10)

1.一种抑制乳腺癌细胞生长的光敏型磁性纳米粒体系的制备方法，其特征在于，首先对油酸包裹的磁性纳米粒子Fe₃O₄-OA进行氨基化处理，活化光敏剂上的羧基，然后通过氨基与羧基的缩合反应将光敏剂接枝到Fe₃O₄-OA表面，得到所述光敏型磁性纳米粒体系。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述光敏剂为血卟啉单甲醚和/或藻蓝蛋白。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.通过共沉淀法反应合成油酸包裹的磁性纳米粒子Fe₃O₄-OA；

S2.在酸性条件下，通过取代反应，用氨基化的硅烷偶联剂上的氨基取代油酸包裹的磁性纳米粒子Fe₃O₄-OA上的羟基，得到Fe₃O₄-OA-NH₂；

S3.用N-羟基琥珀酰亚胺和水溶性碳化二亚胺活化光敏剂上的羧基；

S4.通过光敏剂上活化的羧基与Fe₃O₄-OA-NH₂上氨基间的缩合反应，将光敏剂接枝到Fe₃O₄-OA-NH₂的表面，合成得到具有光敏性的磁性纳米复合物。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2的具体方法为：取油酸包裹的磁性纳米粒子Fe₃O₄-OA加入分散剂中，超声分散处理20～40min；调节反应体系pH至6以下；随后加入过量的硅烷偶联剂，常温下剧烈搅拌反应6～8h；随后用去离子水清洗数次，放入45℃烘箱中过夜。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3的具体方法为：取光敏剂加入激活剂溶液中活化20～40min；所述激活剂为质量比2～3：1的N-乙酰琥珀酰亚胺和水溶性碳化二亚胺的混合液，pH为4.5～5.5。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4的具体方法为：取步骤S2制备的Fe₃O₄-OA-NH₂加入步骤S3的混合液中，常温下偶联反应10～15h；反应产物用乙醇和去离子水洗涤多次，烘干。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1合成油酸包裹的磁性纳米粒子Fe₃O₄-OA的具体方法如下：

S11.取FeSO₄·7H₂O和FeCl₃·6H₂O，加入超纯水，置于油浴中，充入氮气进行保护，50～70℃搅拌20～40min，得铁盐溶液；

S12.取NaOH加入超纯水中，50～70℃充分搅拌溶解，加入上述铁盐溶液中；待混合溶液反应8～15min后，升温至60～80℃，加入HCl溶液，调节pH至2～4；

S13.向步骤S12反应后溶液中加入油酸，搅拌2～4h后，在磁铁辅助下分别用无水乙醇和丙酮进行清洗，最后去离子水洗涤后干燥35～45h。

9.根据权利要求1～8任一所述方法制备得到的抑制乳腺癌细胞生长的光敏型磁性纳米粒体系。

10.权利要求9所述光敏型磁性纳米粒体系在制备抗癌药物方面的应用。