CN110292635A - 一种基于天然硅藻外壳和藻胆蛋白的新型材料及应用 - Google Patents

一种基于天然硅藻外壳和藻胆蛋白的新型材料及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110292635A
CN110292635A CN201910738797.8A CN201910738797A CN110292635A CN 110292635 A CN110292635 A CN 110292635A CN 201910738797 A CN201910738797 A CN 201910738797A CN 110292635 A CN110292635 A CN 110292635A
Authority
CN
China
Prior art keywords
diatom
shell
phycobniliprotein
new material
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910738797.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110292635B (zh
Inventor
赵华伟
蒲洋
魏梦娇
李文军
秦松
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Beiyou Biotechnology Co.,Ltd.
Original Assignee
Ludong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ludong University filed Critical Ludong University
Priority to CN201910738797.8A priority Critical patent/CN110292635B/zh
Publication of CN110292635A publication Critical patent/CN110292635A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110292635B publication Critical patent/CN110292635B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于天然硅藻外壳和藻胆蛋白的新型材料及应用，本发明通过除去培养硅藻的外壳中所含的有机质，再利用APTES(3‑氨丙基三甲氧基硅烷)使硅壳烷基化，然后将烷基化硅壳通过BS3(磺基琥珀酰亚氨基辛二酸酯)与藻胆蛋白进行反应，形成共价连接，达到在硅藻外壳固定藻胆蛋白的目的。所采用的硅藻外壳取材方便，价格相对较低且具有极高的生物相容性、稳定性、反应惰性以及一定的光效应，从而使连接上的藻胆蛋白结构更加稳定且具有增敏效应。

Description

一种基于天然硅藻外壳和藻胆蛋白的新型材料及应用
技术领域
本发明涉及新材料技术领域，具体涉及一种基于天然硅藻外壳和藻胆蛋白的新型材料及应用。
背景技术
藻胆蛋白是存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数一些甲藻中具有共价连接的开链四吡咯结构藻胆素的捕光色素蛋白；能把捕获的光能高效的传递给光反应中心，是一类寡聚体水溶性色素蛋白，主要包括藻蓝蛋白和藻红蛋白。藻蓝蛋白是分布最普遍的藻胆蛋白，在几乎所有含藻胆蛋白的生物中都能够观察到。在自然环境中生长的大多数蓝藻物种中含量最丰富。这些蓝色或蓝紫色的藻胆蛋白能够吸收从580nm到630nm范围内的可见光，并在635nm-645nm范围密集发射出红色荧光。藻红蛋白也是是分布较广的藻胆蛋白。这些含有红色的藻红胆素的藻胆蛋白能够吸收从500nm到600nm范围内的可见光，并在535nm～615nm范围密集发射出红色荧光。
在临床上，光动力疗法作为一种新型肿瘤疗法，是借助于在病灶区富集的光敏剂，经光照后产生自由基和活性态氧，对肿瘤组织进行氧化杀伤。因此筛选高效、低毒、选择性好的光敏剂是光动力疗法的核心。从海洋蓝藻中提取的藻蓝蛋白，在国外已用于皮肤癌等肿瘤的光动态治疗，具有进一步推广应用的价值，其对癌症的光动力治疗已获得美国FDA的批准。同时在公开号为CN1091976A的中国发明专利、公开号为CN1325729A以及公开号为CN01115003的中国发明专利中公开了藻蓝蛋白和藻红蛋白可以作为治疗癌症的光敏剂。对藻蓝蛋白和藻红蛋白的研究也表明，其可以通过光动力反应过程中产生的活性氧物质来引起肿瘤细胞凋亡，同时藻蓝蛋白和藻红蛋白还具有抑制肿瘤生长的作用，能够通过多方面的共同作用从而达到治疗肿瘤的目的。但是藻蓝蛋白结构不是很稳定，光敏效应较弱，其作为光敏剂的应用极大的受到了限制。因此，新型高效的有光动力治疗前景的新型生物医学材料在肿瘤细胞特别是皮肤相关肿瘤治疗中具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种基于天然硅藻外壳和藻胆蛋白的新型材料，通过合适的制备方法将藻胆蛋白和天然硅藻外壳共价组装，硅藻外壳使连接上的藻胆蛋白结构更加稳定且具有增敏效应。
本发明的另一目的在于提供上述基于天然硅藻外壳和藻胆蛋白的新型材料的应用，主要是作为光疗治疗肿瘤用光敏剂中的应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种基于天然硅藻外壳和藻胆蛋白的新型材料，所述材料由以下制备方法制备而成：
(1)收集硅藻藻体，去除硅藻藻体的有机质获得纯净硅壳；
(2)处理硅壳使其烷基化，得到烷基化硅壳；
(3)配制藻胆蛋白溶液：将提取的藻胆蛋白溶解于pH值为6.0的PBS缓冲液(氯化钠，8g/L；氯化钾，0.2g/L；磷酸氢二钠，1.44g/L；磷酸二氢钾，0.24g/L)中，得到浓度为0.05～0.4mg/ml的藻胆蛋白溶液；
(4)将所述烷基化硅壳放入上述PBS缓冲液中，4℃条件下，用1～5mL 1.6mmol/L的磺基琥珀酰亚氨基辛二酸酯处理5～7h，上述PBS缓冲液清洗两遍，7000～15000rpm离心30～40min，弃上清，得沉淀；
(5)经过步骤(4)处理的烷基化硅壳与过量藻胆蛋白溶液混合均匀，在4℃下处理一夜；然后在4℃下，再使用PBS缓冲液清洗两遍，7000～15000rpm离心30～40min，弃上清，得到基于天然硅藻外壳和藻胆蛋白共价组装的新型材料。
所述硅藻藻体的来源可以是天然硅藻，也可以是人工培养的硅藻，当选用人工硅藻时，其培养方法为：在f/2海水培养基中添加30毫克/升硅酸钠，调节pH至7.8-8.0，接种硅藻藻种，在光照培养箱中培养，培养温度25℃，12h，600Lux连续光照，12h黑暗处理，定期通过沉淀法采收硅藻藻体。
优选地，步骤(1)所述去除硅藻藻体的有机质获得纯净硅壳的方法为：将采收的硅藻藻体于烧杯中沉降6～15h，吸走上清，加入10～110mL蒸馏水并吹打，然后静置1～8h，吸取上清，再加入100～1000mL蒸馏水，室温下静置4～9天，吸走上清，加入15～85mL双氧水，避光60～90℃水浴处理2～10h，即得。
优选地，步骤(2)所述烷基化硅壳的制备方法为：将去除有机质的纯净硅壳，用Piranha溶液在70～80℃下处理30min，用去离子水清洗两遍；80℃下，用2～5mol/L HCl溶液处理过夜，7000～15000rpm离心30min，弃上清，去离子水清洗两遍；再放入无水乙醇中用5％的3-氨丙基三甲氧基硅烷浸泡一小时，7000～15000rpm离心30min，弃上清；沉淀用无水乙醇清洗两遍，在恒温干燥箱中80～100℃处理10～30min，用无水乙醇和上述PBS缓冲液清洗两遍，即得。
优选地，在烷基化硅壳的制备过程中，所述Piranha溶液中双氧水和浓硫酸体积比为1∶4～8。
优选地，步骤(3)所述提取的藻胆蛋白纯度＞90％，比如藻蓝蛋白提取自天然蓝藻，隐藻，螺旋藻等；藻红蛋白提取自紫菜，多管藻属红藻，紫球藻属等，不受种类的限制。
本发明还公开了上述新型材料在作为光疗治瘤用光敏剂中的应用。
具体地，所述基于天然硅藻外壳和藻胆蛋白共价组装的新型材料添加到多种癌细胞培养液中，用600-630nm波段的光进行照射，测量癌细胞的存活率。结果表明该新型材料不仅稳定性好，而且作为光疗治癌用光敏剂治疗癌症效果优良。
本发明具有如下优点：
通过除去培养硅藻的外壳中所含的有机质，再利用APTES使硅壳烷基化，然后将烷基化硅壳通过BS3与藻胆蛋白的氨基进行反应，形成共价连接，达到在硅藻外壳固定藻胆蛋白的目的。本发明的硅藻外壳取材方便，价格相对较低且具有极高的生物相容性、稳定性、反应惰性以及一定的光效应，从而使连接上的藻胆蛋白结构更加稳定且具有增敏效应。
将藻胆蛋白与具有特殊的多孔纳米结构的硅藻二氧化硅外壳连接后作为光敏剂其稳定性更强。
附图说明
图1为一实施方式的光学显微镜硅藻形态图；
图2为一实施方式的去除有机质获得纯净硅壳的扫描电镜图；
图3a为一实施方式的纯化后的藻蓝蛋白的电泳图；
图3b为一实施方式的纯化后的藻蓝蛋白的全波长吸收光谱图；
图4a为一实施方式中所制备的新型光敏材料的激光共聚焦显微镜暗视野图像；
图4b为一实施方式中所制备的新型光敏材料的激光共聚焦显微镜亮视野图像；
图5为一实施方式中所制备的新型光敏材料的扫描电镜图像；
图6为一实施方式中所制备的新型光敏材料的傅里叶红外光谱图；
图7a为一实施方式的纯化后的藻红蛋白的电泳图；
图7b一实施方式的纯化后的藻红蛋白的圆二色谱和吸收光谱图；
图8为一实施方式中所制备的新型材料与癌细胞作用的激光共聚焦显微镜图像；
图9为一实施方式中所制备的新型光敏材料，不同藻蓝蛋白应用浓度下对小鼠乳腺癌细胞4T1的暗毒性和光毒性实验结果图；
图10为一实施方式中所制备的新型光敏材料，不同藻红蛋白应用浓度下对小鼠乳腺癌细胞4T1的暗毒性和光毒性实验结果图；
图11a为一实施方式中以藻胆蛋白使肿瘤细胞凋亡的荧光显微镜观察图像；
图11b为一实施方式中以藻胆蛋白所制备的新型光敏材料，使肿瘤细胞凋亡的荧光显微镜观察图像。
具体实施方式
下面将通过具体实施例来对本发明进行进一步的解释，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
如无特殊说明，本发明采用各种方法均为常规的方法，各种材料和试剂均能通过商业的途径获得。
实施例1
一种基于天然硅藻外壳和藻蓝蛋白的新型材料制备方法，包括如下步骤：
(1)配制f/2海水培养基添加30毫克/升的硅酸钠，调节pH至7.8-8.0。接种微壳藻属(Nanofrustulum)硅藻藻种，设定光照培养箱培养温度25℃，12h，600Lux连续光照，12h黑暗处理，定期通过沉淀法采收生长良好的硅藻(硅藻光学显微镜图片见图1)。
(2)将上述采收的硅藻藻体于烧杯中沉降6h，吸走上清，加入10mL蒸馏水并吹打，然后静置4h，吸取上清，再加入100mL蒸馏水，室温静置四至五天，吸走上清，加入35mL双氧水，避光90℃水浴处理4h；即获得去除有机质获得纯净的硅壳(去除有机质获得的纯净硅壳的扫描电镜图见图2)。
(3)硅藻壳用Piranha溶液(H2O2∶H2SO4＝1∶4混合)在80℃下处理30min，去离子水清洗两遍。
(4)80℃下，用5mol/L HCl溶液处理过夜，15000rpm离心30min，弃上清，去离子水清洗两遍。
(5)无水乙醇中用5％的3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)浸泡一小时，15000rpm离心30min，弃上清。
(6)沉淀用无水乙醇清洗两遍，在恒温干燥箱箱中100℃培养10分钟，用乙醇和PBS缓冲液清洗两遍。
(7)在PBS中4℃条件下，用1mL 1.6mmol/L BS3(磺基琥珀酰亚氨基辛二酸酯)处理5小时，PBS缓冲液清洗两遍，15000rpm离心30min，弃上清，得沉淀。
(8)在PBS中4℃条件下，加入1mL纯化后的来自于螺旋藻的藻蓝蛋白溶液处理过夜，单一条带的非变性蛋白电泳结果和全波长吸收光谱中藻蓝蛋白在特定波长的吸收峰表明其为高纯度藻蓝蛋白(纯化后的藻蓝蛋白电泳图见图3a及其全波长吸收光谱图见图3b)。
(9)4℃条件下，PBS缓冲液清洗两遍，15000rpm离心30min，弃上清。将样品进行激光共聚焦显微镜检测(奥林巴斯FLUO FV1000，日本)，具体检测条件为559nm波长的固态激光器用于激发荧光信号，然后获取570nm-670nm波长频带的荧光图像，40倍物镜；结果显示暗视野下新型材料表面有强烈的红色荧光(图4)。另外将干燥的样品进行扫描电镜和傅里叶红外光谱检测，使用高分辨率场发射扫描电子显微镜(日立S-4800，日本)的检测结果表明：与未连接藻胆蛋白的硅壳相对比，两者有非常显著的差异，在约0.2微米直径的多孔结构几乎被填充殆尽，硅壳表面的其它部分为蛋白质的不均匀覆盖(图5)。傅里叶红外光谱谱图中与空白样品图片对照两者有非常显著的差异(图6)，最下方的光谱图中出现了一个波数为798cm-1的代表Si-CHx键新的红外峰，同时在波数为1651cm-1处出现了一个代表与肽键相关的C＝O键的新峰。以上结果充分表明了除去有机质的纯净硅壳烷基化成功并与藻蓝蛋白完成了共价连接。
实施例2
一种基于天然硅藻外壳和藻蓝蛋白的新型材料制备方法，包括如下步骤：
(1)配制f/2海水培养基添加30毫克/升的硅酸钠，调节pH至7.8-8.0。接种硅藻藻种设定光照培养箱培养温度25℃，12h，600Lux连续光照，12h黑暗处理，定期通过沉淀法采收硅藻。
(2)将上述采收的硅藻藻体于烧杯中沉降6h，吸走上清，加入10mL蒸馏水并吹打，然后静置4h，吸取上清，再加入100mL蒸馏水，室温静置四至五天，吸走上清，加入35mL双氧水，避光90℃水浴处理4h；即获得去除有机质获得纯净的硅壳。
(3)硅藻壳用Piranha溶液(H2O2℃H2SO4＝1℃6混合)在80℃下处理30min，去离子水清洗两遍。
(4)80℃下，用5mol/L HCl溶液处理过夜，10000rpm离心30min，弃上清，去离子水清洗两遍。
(5)无水乙醇中用5％的3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)浸泡一小时，15000rpm离心30min，弃上清。
(6)沉淀用无水乙醇清洗两遍，在恒温干燥箱中100℃处理30min，用乙醇和PBS缓冲液清洗两遍。
(7)在PBS中4℃条件下，用1mL 2.6mmol/L磺基琥珀酰亚氨基辛二酸酯(BS3)处理5h，PBS缓冲液清洗两遍，15000rpm离心30min，弃上清，得沉淀。
(8)在PBS中4℃条件下，加入1mL纯化后的来自于嗜热蓝藻的藻蓝蛋白溶液处理过夜。全波长吸收光谱表明为高纯度藻蓝蛋白。
(9)4℃条件下，PBS缓冲液清洗两遍，15000rpm离心40min，弃上清。进行傅里叶红外光谱、激光共聚焦显微镜和扫描电镜相关检测，结果显示除去有机质的纯净硅壳烷基化成功并与藻蓝蛋白完成了共价连接。
实施例3
一种基于天然硅藻外壳和藻蓝蛋白的新型材料制备方法，包括如下步骤：
(1)配制f/2海水培养基添加30毫克/升的硅酸钠，调节pH至7.8-8.0。接种硅藻藻种设定光照培养箱培养温度25℃，12h，600Lux连续光照，12h黑暗处理，定期通过沉淀法采收硅藻。
(2)将上述采收的硅藻藻体于烧杯中沉降10h，吸走上清，加入100mL蒸馏水并吹打，然后静置6h，吸取上清，再加入200mL蒸馏水，室温静置四至五天，吸走上清，加入85mL双氧水，避光80℃水浴处理4h；即获得去除有机质获得纯净的硅壳。
(3)硅藻壳用Piranha溶液(H2O2∶H2SO4＝1∶8混合)在80℃下处理50min，去离子水清洗两遍。
(4)80℃下，用3mol/LHCl溶液处理过夜，10000rpm离心30min，弃上清，去离子水清洗两遍。
(5)无水乙醇中用5％的3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)浸泡一小时，10000rpm离心40min，弃上清。
(6)沉淀用无水乙醇清洗两遍，在恒温培养箱中120℃处理10min，用乙醇和PBS缓冲液清洗两遍。
(7)在PBS中4℃条件下，用5mL 1.0mmol/L磺基琥珀酰亚氨基辛二酸酯(BS3)处理7h，PBS缓冲液清洗两遍，10000rpm离心30min，弃上清，得沉淀。
(8)在PBS中4℃条件下，加入3mL纯化后的的来自于蓝隐藻的藻蓝蛋白溶液处理过夜。全波长吸收光谱表明为高纯度藻蓝蛋白。
(9)4℃条件下，PBS缓冲液清洗两遍，10000rpm离心30min，弃上清。进行傅里叶红外光谱、激光共聚焦显微镜和扫描电镜相关检测，结果显示除去有机质的纯净硅壳烷基化成功并与藻蓝蛋白完成了共价连接。
实施例4
一种基于天然硅藻外壳和藻红蛋白共价组装的新型材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制f/2海水培养基添加30毫克/升的硅酸钠，调节pH至7.8-8.0。接种硅藻藻种设定光照培养箱培养温度25℃，12h，600Lux连续光照，12h黑暗处理，定期通过沉淀法采收硅藻。
(2)将上述采收的硅藻藻体于烧杯中沉降15h，吸走上清，加入100mL蒸馏水并吹打，然后静置1h，吸取上清，再加入800mL蒸馏水，室温静置五天，吸走上清，加入68mL双氧水，避光60℃水浴处理12h；即获得去除有机质获得纯净的硅壳。
(3)硅藻壳用Piranha溶液(H2O2∶H2SO4＝1∶6混合)在60℃下处理60min，去离子水清洗两遍。
(4)80℃下，用2mol/L HCl溶液处理过夜，8000rpm离心30min，弃上清，去离子水清洗两遍。
(5)无水乙醇中用6％的3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)浸泡一小时，8000rpm离心30min，弃上清。
(6)沉淀用无水乙醇清洗两遍，在恒温干燥箱中130℃处理60min，用乙醇和PBS缓冲液清洗两遍。
(7)在PBS中4℃条件下，用1mL 0.6mmol/L磺基琥珀酰亚氨基辛二酸酯(BS3)处理5h，PBS缓冲液清洗两遍，8000rpm离心30min，弃上清，得沉淀。
(8)在PBS中4℃条件下，加入1mL纯化后的来自于红藻的藻红蛋白溶液处理过夜，单一条带的非变性蛋白电泳结果以及圆二色谱和吸收光谱中藻红蛋白在特定波长的吸收峰峰值表明其为高纯度藻红蛋白。纯化后的藻红蛋白电泳图(图7a)及圆二色谱和吸收光谱图(图7b)。
(9)4℃条件下，PBS缓冲液清洗两遍，8000rpm离心40min，弃上清。进行傅里叶红外光谱、激光共聚焦显微镜和扫描电镜相关检测，结果同样显示除去有机质的纯净硅壳烷基化成功并与藻蓝蛋白完成了共价连接。
实施例5
一种基于天然硅藻外壳和藻蓝蛋白共价组装的新型材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制f/2海水培养基添加30毫克/升的硅酸钠，调节pH至7.8-8.0。接种硅藻藻种设定光照培养箱培养温度25℃，12h，600Lux连续光照，12h黑暗处理，定期通过沉淀法采收硅藻。
(2)将上述采收的硅藻藻体于烧杯中沉降15h，吸走上清，加入110mL蒸馏水并吹打，然后静置1h，吸取上清，再加入1000mL蒸馏水，室温静置四至五天，吸走上清，加入55mL双氧水，避光60℃水浴处理10h；即获得去除有机质获得纯净的硅壳。
(3)硅藻壳用Piranha溶液(H2O2∶H2SO4＝1∶6混合)在60℃下处理50min，去离子水清洗两遍。
(4)80℃下，用2mol/L HCl溶液处理过夜，8000rpm离心30min，弃上清，去离子水清洗两遍。
(5)无水乙醇中用5％的3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)浸泡一小时，8000rpm离心30min，弃上清。
(6)沉淀用无水乙醇清洗两遍，在恒温干燥箱中140℃处理60min，用乙醇和PBS缓冲液清洗两遍。
(7)在PBS中4℃条件下，用1mL 0.6mmol/L磺基琥珀酰亚氨基辛二酸酯(BS3)处理5h，PBS缓冲液清洗两遍，8000rpm离心30min，弃上清，得沉淀。
(8)在PBS中4℃条件下，加入1mL纯化后的来自于蓝藻的藻蓝蛋白溶液处理过夜，全波长吸收光谱表明为高纯度藻蓝蛋白。
(9)4℃条件下，PBS缓冲液清洗两遍，8000rpm离心40min，弃上清。进行傅里叶红外光谱、激光共聚焦显微镜和扫描电镜相关检测，结果同样显示除去有机质的纯净硅壳烷基化成功并与藻蓝蛋白完成了共价连接。
实施例6
一种基于天然硅藻外壳和藻蓝蛋白的新型材料制备方法，包括如下步骤：
(1)配制f/2海水培养基添加30毫克/升的硅酸钠，调节pH至7.8-8.0。接种硅藻藻种设定光照培养箱培养温度25℃，12h，600Lux连续光照，12h黑暗处理，定期通过沉淀法采收硅藻。
(2)将上述采收的硅藻藻体于烧杯中沉降六小时，吸走上清，加入130mL蒸馏水并吹打，然后静置8h，吸取上清，再加入130ml蒸馏水，室温静置四至九天，吸走上清，加入15mL双氧水，避光70℃水浴处理2h；即获得去除有机质获得纯净的硅壳。
(3)硅藻壳用Piranha溶液(H2O2∶H2SO4＝1∶6混合)在70℃下处理30min，去离子水清洗两遍。
(4)70℃下，用5mol/L HCl溶液处理过夜，7000rpm离心30min，弃上清，去离子水清洗两遍。
(5)无水乙醇中用5％的3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)浸泡一小时，7000rpm离心30min，弃上清。
(6)沉淀用无水乙醇清洗两遍，在恒温干燥中60℃处理30分钟，用乙醇和PBS缓冲液清洗两遍。
(7)在PBS中4℃条件下，用1mL 2.6mmol/L磺基琥珀酰亚氨基辛二酸酯(BS3)处理5h，PBS缓冲液清洗两遍，7000rpm离心30min，弃上清，得沉淀。
(8)在PBS中4℃条件下，加入1mL纯化后的来自于隐藻的藻蓝蛋白溶液处理过夜，全波长吸收光谱表明为高纯度藻蓝蛋白。
(9)4℃条件下，PBS缓冲液清洗两遍，7000rpm离心40min，弃上清。进行傅里叶红外光谱、激光共聚焦显微镜和扫描电镜相关检测，结果同样显示除去有机质的纯净硅壳烷基化成功并与藻蓝蛋白完成了共价连接。
实施例7
基于天然硅藻外壳和藻胆蛋白的新型材料在作为光疗治瘤用光敏剂中的应用。
发明人对其进行了如下试验：
(1)癌细胞的培养
小鼠乳腺癌细胞(4T1)于37℃、5％CO2和饱和湿度下，用含10％小牛血清的RMPI-1640培养液培养。收集对数期生长的4T1细胞，无血清培养液离心洗涤三次，去除培养液中的血清。以无血清培养液稀释细胞至106个/mL，接种96孔板，每孔50μL含细胞5×104个。
(2)体外肿瘤细胞的暗毒性和光毒性实验
进行体外细胞暗毒性实验。在每孔50μL含细胞5×104个的小鼠乳腺癌细胞(4T1)的96孔板中加入一系列浓度的新样品(样品以藻胆蛋白含量计分别为0μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)，另外作为对照加入纯藻胆蛋白100μg/mL，与肿瘤细胞孵育4h，激光共聚焦显微镜观察下，发射红色荧光的新型光敏材料吸附在细胞表面显示了其与细胞有很强的相互作用(图8)。
分别进行了下述处理：
处理1：以600-610nm波段的光进行照射，辐射总能量为27J/cm2；
处理2：以550-610nm波段的光进行照射，辐射总能量为80J/cm2；
处理3：以600-630nm波段的光进行照射，辐射总能量为54J/cm2；
24小时后用MTT试剂测定不同给药浓度对细胞的杀伤程度，无光照条件下，光敏材料与溶液均对细胞无明显的毒性，细胞基本没有改变，与正常细胞形态一致，说明新型光敏材料本身具有高生物相容性；在相同光照辐射强度下，新型光敏材料对细胞的光毒性随光敏材料的浓度增加而增大，这是因为光敏剂材料的细胞摄取量较多。同样浓度的新型光敏材料和纯藻胆蛋白对照相比，细胞致死率提高了20％以上，效果非常明显。处理1条件下，不同应用浓度下新型光敏材料对小鼠乳腺癌细胞4T1的暗毒性和光毒性实验结果见图9(不同藻蓝蛋白应用浓度下对小鼠乳腺癌细胞4T1的暗毒性和光毒性实验结果图)，图10(不同藻红蛋白应用浓度下对小鼠乳腺癌细胞4T1的暗毒性和光毒性实验结果图)。PI染色的荧光显微镜图片显示细胞形态发生了较大的改变，并且发生了细胞凋亡，所制备的新型光敏材料和相同浓度的藻胆蛋白使肿瘤细胞凋亡的荧光显微镜观察图像分别见图11a(藻胆蛋白)和图11b(新型光敏材料)。同时与同浓度的纯藻胆蛋白杀伤癌细胞的荧光显微图像相比，荧光强度更高(大于25％)，分布更加密集，表明相对于游离的藻胆蛋白，新型材料共价连接的藻胆蛋白稳定性更强，相对的治疗效果也会更好。此结果进一步证实了肿瘤细胞的死亡，以及新型光敏材料良好的细胞杀伤效果，所以该新型材料可以作为光疗治瘤用光敏剂或者药物等。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种基于天然硅藻外壳和藻胆蛋白的新型材料，其特征在于，所述材料由以下制备方法制备而成：
(1)收集硅藻藻体，去除硅藻藻体的有机质获得纯净硅壳；
(2)处理硅壳使其烷基化，得烷基化硅壳；
(3)配制藻胆蛋白溶液：将提取的藻胆蛋白溶解于pH值为6.0-7.4的PBS缓冲液中，得到浓度为0.05～0.4mg/mL的藻胆蛋白溶液；所述PBS缓冲液的配方为：氯化钠，8g/L；氯化钾，0.2g/L；磷酸氢二钠，1.44g/L；磷酸二氢钾，0.24g/L；
(4)将所述烷基化硅壳放入上述PBS缓冲液中，4℃条件下，用1～5mL 1.6mmol/L的磺基琥珀酰亚氨基辛二酸酯处理5～7h，以及上述PBS缓冲液清洗两遍，7000～15000rpm离心30～40min，弃上清，得沉淀；
(5)经过步骤(4)处理的烷基化硅壳与过量藻胆蛋白溶液混合均匀，在4℃下处理一夜；然后在4℃下，再使用上述PBS缓冲液清洗两遍，7000～15000rpm离心30～40min，弃上清，得到基于天然硅藻外壳和藻胆蛋白共价组装的新型材料。
2.根据权利要求1所述的新型材料，其特征在于，步骤(1)所述硅藻藻体的培养方法：在f/2海水培养基中添加30毫克/升硅酸钠，调节pH至7.8-8.0，接种硅藻藻种，在光照培养箱中培养，培养温度25℃，12h，600Lux连续光照，12h黑暗处理，定期通过沉淀法采收硅藻藻体。
3.根据权利要求1所述的新型材料，其特征在于，步骤(1)所述去除硅藻藻体的有机质获得纯净硅壳的方法为：将采收的硅藻藻体于烧杯中沉降6～15h，吸走上清，加入10～110mL蒸馏水并吹打，然后静置1～8小时，吸取上清，再加入100～1000mL蒸馏水，室温下静置4～9天，吸走上清，加入15～85mL双氧水，避光60～90℃水浴处理2～10h，即得。
4.根据权利要求1所述的新型材料，其特征在于，步骤(2)所述烷基化硅壳的制备方法为：将去除有机质的纯净硅壳，用Piranha溶液在70～80℃下处理30min，用去离子水清洗两遍；80℃下，用2～5mol/L HCl溶液处理过夜，7000～15000rpm离心30min，弃上清，去离子水清洗两遍；再放入无水乙醇中用5％的3-氨丙基三甲氧基硅烷浸泡一小时，7000～15000rpm离心30min，弃上清；沉淀用无水乙醇清洗两遍，在恒温干燥箱中80～100℃处理10～30min，用无水乙醇和上述PBS缓冲液清洗两遍，即得。
5.根据权利要求4所述的新型材料，其特征在于，所述Piranha溶液中双氧水和浓硫酸的体积比为1∶4～8。
6.根据权利要求1所述的新型材料，其特征在于，步骤(3)所述提取的藻胆蛋白纯度＞90％。
7.权利要求1-6任一项所述的新型材料在作为光疗治瘤用光敏剂中的应用。
CN201910738797.8A 2019-08-08 2019-08-08 一种基于天然硅藻外壳和藻胆蛋白的材料及应用 Active CN110292635B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910738797.8A CN110292635B (zh) 2019-08-08 2019-08-08 一种基于天然硅藻外壳和藻胆蛋白的材料及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910738797.8A CN110292635B (zh) 2019-08-08 2019-08-08 一种基于天然硅藻外壳和藻胆蛋白的材料及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110292635A true CN110292635A (zh) 2019-10-01
CN110292635B CN110292635B (zh) 2021-07-16

Family

ID=68033010

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910738797.8A Active CN110292635B (zh) 2019-08-08 2019-08-08 一种基于天然硅藻外壳和藻胆蛋白的材料及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110292635B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111477458A (zh) * 2020-03-10 2020-07-31 鲁东大学 基于硅壳-藻红蛋白的新型材料在光阳极中的应用
CN113000341A (zh) * 2021-02-24 2021-06-22 青岛大学 活体硅藻壳掺杂铕络合物的发光薄膜及制备方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012088071A2 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 James Weifu Lee Designer calvin-cycle-channeled and hydrogenotrophic production of butanol and related higher alcohols
WO2016059622A2 (en) * 2016-02-04 2016-04-21 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Specific conjugation linkers, specific immunoconjugates thereof, methods of making and uses such conjugates thereof
CN106177949A (zh) * 2016-07-28 2016-12-07 浙江省人民医院 一种荧光‑磁性双模态纳米载体及制备方法
CN106668871A (zh) * 2017-01-17 2017-05-17 华南师范大学 一种抑制乳腺癌细胞生长的光敏型磁性纳米粒体系的制备方法及应用
CN108414740A (zh) * 2018-01-16 2018-08-17 湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司 一种荧光-磁性双功能微球及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012088071A2 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 James Weifu Lee Designer calvin-cycle-channeled and hydrogenotrophic production of butanol and related higher alcohols
WO2016059622A2 (en) * 2016-02-04 2016-04-21 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Specific conjugation linkers, specific immunoconjugates thereof, methods of making and uses such conjugates thereof
CN106177949A (zh) * 2016-07-28 2016-12-07 浙江省人民医院 一种荧光‑磁性双模态纳米载体及制备方法
CN106668871A (zh) * 2017-01-17 2017-05-17 华南师范大学 一种抑制乳腺癌细胞生长的光敏型磁性纳米粒体系的制备方法及应用
CN108414740A (zh) * 2018-01-16 2018-08-17 湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司 一种荧光-磁性双功能微球及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ILARIA REA ET AL: "Bioengineered Silicon Diatoms: Adding Photonic Features to a Nanostructured Semiconductive Material for Biomolecular Sensing", 《NANOSCALE RESEARCH LETTERS》 *
YANG PU ET AL: "A hybrid biomaterial of biosilica and C-phycocyanin for enhanced photodynamic effect towards tumor cells", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 *
李冠武 等: "藻胆蛋白与血卟啉衍生物光敏剂的光毒性比较", 《汕头大学医学院院报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111477458A (zh) * 2020-03-10 2020-07-31 鲁东大学 基于硅壳-藻红蛋白的新型材料在光阳极中的应用
CN113000341A (zh) * 2021-02-24 2021-06-22 青岛大学 活体硅藻壳掺杂铕络合物的发光薄膜及制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110292635B (zh) 2021-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mann et al. On Pigments, Growth, And Photosynthesis Of Phaeodactylum Tricornutum 1 2
Chan et al. Cell uptake, distribution and response to aluminium chloro sulphonated phthalocyanine, a potential anti-tumour photosensitizer
Mang et al. Photobleaching of porphyrins used in photodynamic therapy and implications for therapy
CN110292635A (zh) 一种基于天然硅藻外壳和藻胆蛋白的新型材料及应用
Gudkov et al. Effect of visible light on biological objects: Physiological and pathophysiological aspects
SU818494A3 (ru) Способ отбеливани текстильныхМАТЕРиАлОВ
Zheng et al. A nitroreductase-activatable near-infrared theranostic photosensitizer for photodynamic therapy under mild hypoxia
CN110028553B (zh) 一种抗菌纳米探针Au-PEG-AMP-Ce6的制备方法和应用
CN110339357B (zh) 铜离子掺杂碳点、制备及其作为光动力治疗光敏剂的应用
NO166284B (no) Fremgangsmaate for fremstilling av en stoffblanding som ereffektiv til lokalisering og/eller oedeleggelse av tumorer.
JP2000500763A (ja) 合成の金属置換されたバクテリオクロロフィル誘導体およびその使用
Davila et al. Photosensitized oxidation of biomaterials and related model compounds
CN108675280A (zh) 吩噻嗪衍生物荧光碳点及其制备方法和应用
Belik et al. Synthesis, photophysical properties, and photochemical activity of the water-soluble dyad based on fullerene С 60 and chlorin e 6 derivatives
US6147195A (en) Chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them
CN107375930A (zh) 一种基于圆偏振光光动力治疗的等离子手性金纳米棒二聚体的构建方法
Kassab et al. Photosensitization of Colpoda inflata cysts by meso-substituted cationic porphyrins
CN104650129B (zh) 一种轴向酯键连接哌啶或吗啉衍生物的硅酞菁
Hunter et al. FLUORESCENCE YIELD PROPERTIES OF A FRACTION ENRICHED IN NEWLY SYNTHESIZED BACTERIOCHLOROPHYLL U‐PROTEIN COMPLEXES FROM RHODOPSEUDOMONAS SPHAEROIDES
CN116712544A (zh) 一种具有光动力-光热协同抗菌活性的超分子纳米材料的制备方法和应用
Mueller et al. From green to red–To more dead? Autofluorescent proteins as photosensitizers
CN112402608B (zh) 5-烷氧基吲哚-3-乙烯基喹啉盐作为靶向可迁移光敏剂的应用
CN113230419A (zh) 一种基于藻蓝胆素的新型靶向纳米颗粒及其制备方法
CN108653730B (zh) 长余辉油溶胶及其制备方法、用途
CN114149362B (zh) 一种半菁类小分子化合物作为荧光探针及光动力抗菌剂的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: A material based on natural diatom shell and phycobiliprotein and its application

Effective date of registration: 20211216

Granted publication date: 20210716

Pledgee: Yantai financing guarantee Group Co.,Ltd.

Pledgor: LUDONG University

Registration number: Y2021980015152

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right

Date of cancellation: 20220317

Granted publication date: 20210716

Pledgee: Yantai financing guarantee Group Co.,Ltd.

Pledgor: LUDONG University

Registration number: Y2021980015152

PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20231005

Address after: 261200 West of Quanhetou Village, Fangcheng Street Office, Fangzi District, Weifang City, Shandong Province

Patentee after: Shandong Beiyou Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 264025 No. 186 Hongqi Middle Road, Zhifu District, Shandong, Yantai

Patentee before: LUDONG University

TR01 Transfer of patent right