CN104587488A - 一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，本发明属于生物医用材料领域。本发明是要解决现有方法制备的载体不能特异性的识别靶细胞，药物分子大部分分布于正常组织并被正常细胞摄取，而病变组织中的药物分布较少，造成药物递送能力较低，增加了药物在体内的毒副作用的技术问题。方法：一、模板剂的准备；二、介孔羟基磷灰石纳米粒子的制备；三、介孔羟基磷灰石的氨基化；四、介孔磷灰石的硼酸化；五、乳糖酸功能化牛血清白蛋白的制备；六、具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备。本发明得到的产物能靶向识别肝癌细胞，减少了正常组织对药物的摄取，降低了药物在体内的毒副作用。
Description
技术领域：
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法。
背景技术：
随着恶性肿瘤发病率的逐年上升，智能响应型药物输送体系越来越得到人们的关注。智能响应性体系是到达目标患处后，药物载体通过对周围环境的变化或外界刺激产生智能响应，达到可控释放药物的目的。目前为止，一系列响应性释放药物载体都已经被构建，像温度响应、光响应、超声波响应，这类体系在体内循环中能够稳定的存在，再刺激下通过载体解离、键断裂、降解等方式释放药物，但这些响应性释放药物都来自于外界附加刺激，而并非体内生理环境的自身变化，这在一定程度上限制了其应用。由于人体内正常组织和病变状态之间存在着显著的pH梯度，如人体的肿瘤胞外环境(pH 5.5-6.5)比正常血液或组织(pH 7.4)偏酸性，而且细胞内涵体和溶酶体的pH更低(pH 4.5-5.5)，因此pH响应性药物释放体系是一类极具应用前景的智能药物传递系统。设计一种pH响应的药物释放载体充分利用体内环境的变化，方便、安全、智能的在肿瘤组织或肿瘤细胞内选择释放药物，达到高效治疗的目的。
目前为止，大多数pH响应性药物输送体系都是通过引入pH响应型官能团达到响应性释放药物的目的，主要是有几种方法：一种是在嵌段共聚物中引入氨基或羧酸根等官能团，利用酸碱度变化的质子化作用来改变体系的形态，达到pH相应的能力；另一种发展pH响应药物载体的方法是利用对酸敏感的官能团如亚胺、腙等作为连接药物分子和载体的纽带形成药物缀合物，通过该“纽带”酸性降解来释放药物。这些方法制备的载体不能特异性的识别靶细胞，药物分子大部分分布于正常组织并被正常细胞摄取，而病变组织中的药物分布较少，造成药物递送能力较低，增加了药物在体内的毒副作用。因此，设计一种细胞靶向和pH型智能响应的药物载体，使药物在正常组织“零释放”和在弱酸性病变组织中大量释放仍然是一个大的挑战。
发明内容：
本发明是要解决现有方法制备的载体不能特异性的识别靶细胞，药物分子大部分分布于正常组织并被正常细胞摄取，而病变组织中的药物分布较少，造成药物递送能力较低，增加了药物在体内的毒副作用的技术问题，从而提供了一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法。
本发明的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法是按以下步骤进行的：
一、模板剂的准备：将模板剂F127和泛酸钙单水合物溶解在去离子水中，在搅拌速度为250r/min～400r/min下搅拌至得到清晰乳状液，得到F127-泛酸钙混合液，即得到模板剂；
步骤一中所述的模板剂F127与泛酸钙单水合物的质量比为1∶(2.5～8)；步骤一中所述的F127与去离子水的质量比为1∶(15～67)；
二、介孔羟基磷灰石纳米粒子的制备：将K2HPO4·3H2O溶解在去离子水中，得到K2HPO4溶液，然后用NH3·H2O调解K2HPO4溶液的pH值至pH值为10～14，再将pH值为10～14的K2HPO4溶液以滴加速度为1.0g/min～3.0g/min滴加到步骤一得到的F127-泛酸钙混合液中，搅拌均匀后采用水浴回流的方式进行加热，控制水浴加热温度为60～100℃，回流时间为24h～48h，完成水浴回流反应，将水浴回流反应后的溶液过滤，收集白色沉淀物，将白色沉淀物在温度为80℃～150℃的真空条件下干燥12h～24h，得到干燥后的白色沉淀物，然后将干燥后的白色沉淀物在温度为200℃～300℃下预烧2h～6h，再在马弗炉中煅烧，控制煅烧温度为500℃～600℃，煅烧时间为8h～10h，得到介孔羟基磷灰石纳米粒子；
步骤二中所述的K2HPO4·3H2O的质量与去离子水的体积比为1g∶(10～25)mL；步骤二中所述的pH值为10～14的K2HPO4溶液中的K2HPO4·3H2O质量与步骤一得到的F127-泛酸钙混合液中F127的质量比为1∶(0.5～1.5)；
三、介孔羟基磷灰石的氨基化：将步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子均匀分散在甲苯溶液中，在搅拌速度为300r/min～600r/min下搅拌10min～30min后，加入3-氨丙基三甲氧基硅烷，然后置于温度为60℃～80℃的水浴锅中回流24h～48h，离心冷冻干燥后得到氨基化的介孔磷灰石；
步骤三中所述的步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与甲苯溶液的体积的比为1g∶(40～100)mL；步骤三中所述的步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与3-氨丙基三甲氧基硅烷的体积比为1g∶(2.4～67)mL；
四、介孔磷灰石的硼酸化∶将步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石均匀分散在二甲基亚砜溶液中，然后在室温下以搅拌速度为400r/min～600r/min搅拌2h～4h，得到氨基化的介孔磷灰石分散液，再将4-羧基苯硼酸、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺加入氨基化的介孔磷灰石分散液中，然后在室温下以搅拌速度为300r/min～500r/min搅拌36h～72h，然后依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤并离心10～20次，再真空干燥，得到硼酸化的介孔磷灰石；
步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石的质量与二甲基亚砜溶液的体积的比为1g∶(33～100)mL；步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与4-羧基苯硼酸的质量比为(2～7.5)∶1；步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物的质量比为(2～7.5)∶1；步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(1.2～3)∶1；
五、乳糖酸功能化牛血清白蛋白的制备∶将乳糖酸、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在pH值为5.0的PBS缓冲溶液中，然后在室温下以搅拌速度为300r/min～600r/min搅拌2h～4h，得到混合溶液A，再将牛血清白蛋白加入混合溶液A中，在室温下以搅拌速度为200r/min～500r/min搅拌36h～72h，再冷冻干燥，得到乳糖酸功能化牛血清白蛋白；
步骤五中所述的乳糖酸与1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物的质量比为(1.6～15)∶1；步骤五中所述的乳糖酸与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(1.6～15)∶1；步骤五中所述的乳糖酸的质量与PBS缓冲溶液的体积比为1g∶(33～200)mL；所述的PBS缓冲溶液的摩尔浓度为0.005mol/L～0.02mol/L；步骤五中所述的乳糖酸与牛血清白蛋白的质量比为(0.25～1.5)∶1；
六、具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备∶将盐酸阿霉素或异氰酸荧光素和步骤四得到的硼酸化的介孔磷灰石溶解于去离子水中，在室温下以搅拌速度为200r/min～500r/min搅拌48h～60h，得到混合溶液B，然后将步骤五得到的乳糖酸功能化的牛血清白蛋白、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺加入混合溶液B中，然后在搅拌速度为300r/min～500r/min的条件下搅拌24h～48h，然后用pH值为7.4的PBS缓冲液离心洗涤10～20次，再冷冻干燥，得到介孔磷灰石纳米药物载体；
步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与步骤四得到的硼酸化的介孔磷灰石的质量比为1∶(12.5～50)；步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素的质量与去离子水的体积比为1mg∶(10～30)mL；步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与步骤五得到的乳糖酸功能化的牛血清白蛋白的质量比为1∶(25～125)；步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物的质量比为1∶(12.5～75)；步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1∶(12.5～50)；步骤六所述的PBS缓冲溶液的摩尔浓度为0.005mol/L～0.02mol/L。
本发明包括以下有益效果：
1、本发明制备的基于环酯键连接的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石药物载体，制备工艺简单，同时具又pH响应性和细胞靶向，在药物投递领域具有广阔的应用前景。
2、本发明的对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体与肝癌细胞表面的配体发生特异型反应，能靶向识别肝癌细胞，减少了正常组织对药物的摄取，降低了药物在体内的毒副作用。
3、本发明的对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体通过环酯键连接，对pH具有良好的响应性，在pH刺激下实现定时、定量的释放药物分子，有效地提高了药物的利用率。
4、本发明具有良好的对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体具有良好的生物相容性和生物降解性，细胞毒性较小，降解产物能被人体完全吸收。
5、本发明方法操作简单，成本低廉，实用性强。
附图说明
图1为验证试验(一)中介孔磷灰石纳米颗粒的TEM照片；
图2为验证试验(一)中试验一得到的负载异氰酸荧光素的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石的TEM照片；
图3为验证试验(二)中在不同pH值的PBS缓冲溶液刺激下试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石的释放曲线图；其中，a为在pH值为7.4的PBS缓冲溶液刺激下试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石的释放曲线图；b为在pH值为6.8的PBS缓冲溶液刺激下试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石的释放曲线图；c为在pH值为5.0的PBS缓冲溶液刺激下试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石的释放曲线图；
图4为验证试验(三)中在pH值的PBS缓冲溶液刺激下试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石的“爆发式”释放曲线图；
图5为验证试验(四)中肝癌细胞吞噬试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石在共培养4h后的共聚焦扫描电镜图，其中的灰白色荧光点是药物被细胞吞噬后在胞内的分布情况；
图6为验证试验(四)中肝癌细胞吞噬试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石在共培养12h后的共聚焦扫描电镜图，其中的灰白色荧光点是药物被细胞吞噬后在胞内的分布情况；
图7为验证试验(四)中肝癌细胞吞噬试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石在共培养24h后的共聚焦扫描电镜图，其中的灰白色荧光点是药物被细胞吞噬后在胞内的分布情况；
图8为验证试验(五)①中试验一得到的负载异氰酸荧光素的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石和负载FITC的介孔磷灰石对肝癌细胞靶向性的量化分析柱形图；其中a代表负载FITC的介孔磷灰石，b代表试验一得到的负载异氰酸荧光素(FITC)的乳糖酸-胶原/介孔磷灰石；
图9为验证试验(五)②中试验一得到的负载异氰酸荧光素的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石对肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞靶向性的量化分析柱形图；其中a代表人脐静脉内皮细胞，b代表肝癌细胞。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法是按以下步骤进行的：
一、模板剂的准备：将模板剂F127和泛酸钙单水合物溶解在去离子水中，在搅拌速度为250r/min～400r/min下搅拌至得到清晰乳状液，得到F127-泛酸钙混合液，即得到模板剂；
步骤一中所述的模板剂F127与泛酸钙单水合物的质量比为1∶(2.5～8)；步骤一中所述的F127与去离子水的质量比为1∶(15～67)；
二、介孔羟基磷灰石纳米粒子的制备：将K2HPO4·3H2O溶解在去离子水中，得到K2HPO4溶液，然后用NH3·H2O调解K2HPO4溶液的pH值至pH值为10～14，再将pH值为10～14的K2HPO4溶液以滴加速度为1.0g/min～3.0g/min滴加到步骤一得到的F127-泛酸钙混合液中，搅拌均匀后采用水浴回流的方式进行加热，控制水浴加热温度为60～100℃，回流时间为24h～48h，完成水浴回流反应，将水浴回流反应后的溶液过滤，收集白色沉淀物，将白色沉淀物在温度为80℃～150℃的真空条件下干燥12h～24h，得到干燥后的白色沉淀物，然后将干燥后的白色沉淀物在温度为200℃～300℃下预烧2h～6h，再在马弗炉中煅烧，控制煅烧温度为500℃～600℃，煅烧时间为8h～10h，得到介孔羟基磷灰石纳米粒子；
步骤二中所述的K2HPO4·3H2O的质量与去离子水的体积比为1g∶(10～25)mL；步骤二中所述的pH值为10～14的K2HPO4溶液中的K2HPO4·3H2O质量与步骤一得到的F127-泛酸钙混合液中F127的质量比为1∶(0.5～1.5)；
三、介孔羟基磷灰石的氨基化：将步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子均匀分散在甲苯溶液中，在搅拌速度为300r/min～600r/min下搅拌10min～30min后，加入3-氨丙基三甲氧基硅烷，然后置于温度为60℃～80℃的水浴锅中回流24h～48h，离心冷冻干燥后得到氨基化的介孔磷灰石；
步骤三中所述的步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与甲苯溶液的体积的比为1g∶(40～100)mL；步骤三中所述的步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与3-氨丙基三甲氧基硅烷的体积比为1g∶(2.4～67)mL；
四、介孔磷灰石的硼酸化∶将步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石均匀分散在二甲基亚砜溶液中，然后在室温下以搅拌速度为400r/min～600r/min搅拌2h～4h，得到氨基化的介孔磷灰石分散液，再将4-羧基苯硼酸、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺加入氨基化的介孔磷灰石分散液中，然后在室温下以搅拌速度为300r/min～500r/min搅拌36h～72h，然后依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤并离心10～20次，再真空干燥，得到硼酸化的介孔磷灰石；
步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石的质量与二甲基亚砜溶液的体积的比为1g∶(33～100)mL；步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与4-羧基苯硼酸的质量比为(2～7.5)∶1；步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物的质量比为(2～7.5)∶1；步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(1.2～3)∶1；
五、乳糖酸功能化牛血清白蛋白的制备∶将乳糖酸、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在pH值为5.0的PBS缓冲溶液中，然后在室温下以搅拌速度为300r/min～600r/min搅拌2h～4h，得到混合溶液A，再将牛血清白蛋白加入混合溶液A中，在室温下以搅拌速度为200r/min～500r/min搅拌36h～72h，再冷冻干燥，得到乳糖酸功能化牛血清白蛋白；
步骤五中所述的乳糖酸与1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物的质量比为(1.6～15)∶1；步骤五中所述的乳糖酸与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(1.6～15)∶1；步骤五中所述的乳糖酸的质量与PBS缓冲溶液的体积比为1g∶(33～200)mL；所述的PBS缓冲溶液的摩尔浓度为0.005mol/L～0.02mol/L；步骤五中所述的乳糖酸与牛血清白蛋白的质量比为(0.25～1.5)∶1；
六、具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备∶将盐酸阿霉素或异氰酸荧光素和步骤四得到的硼酸化的介孔磷灰石溶解于去离子水中，在室温下以搅拌速度为200r/min～500r/min搅拌48h～60h，得到混合溶液B，然后将步骤五得到的乳糖酸功能化的牛血清白蛋白、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺加入混合溶液B中，然后在搅拌速度为300r/min～500r/min的条件下搅拌24h～48h，然后用pH值为7.4的PBS缓冲液离心洗涤10～20次，再冷冻干燥，得到介孔磷灰石纳米药物载体；
步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与步骤四得到的硼酸化的介孔磷灰石的质量比为1∶(12.5～50)；步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素的质量与去离子水的体积比为1mg∶(10～30)mL；步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与步骤五得到的乳糖酸功能化的牛血清白蛋白的质量比为1∶(25～125)；步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物的质量比为1∶(12.5～75)；步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1∶(12.5～50)；步骤六所述的PBS缓冲溶液的摩尔浓度为0.005mol/L～0.02mol/L。
本实施方式中所述的模板剂F127为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物；
本实施方式中所述的PBS缓冲液为磷酸缓冲盐溶液。
本实施方式包括以下有益效果：
本实施方式包括以下有益效果：
1、本实施方式制备的基于环酯键连接的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石药物载体，制备工艺简单，同时具又pH响应性和细胞靶向，在药物投递领域具有广阔的应用前景。
2、本实施方式的对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体与肝癌细胞表面的配体发生特异型反应，能靶向识别肝癌细胞，减少了正常组织对药物的摄取，降低了药物在体内的毒副作用。
3、本实施方式的对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体通过环酯键连接，对pH具有良好的响应性，在pH刺激下实现定时、定量的释放药物分子，有效地提高了药物的利用率。
4、本实施方式具有良好的对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体具有良好的生物相容性和生物降解性，细胞毒性较小，降解产物能被人体完全吸收。
5、本实施方式方法操作简单，成本低廉，实用性强。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的模板剂F127与泛酸钙单水合物的质量比为2.0∶10.12。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中所述的模板剂F127的质量与去离子水的体积比为2.0g∶80mL。其他步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中在搅拌速度为350r/min下搅拌至得到清晰乳状液。其他步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二中所述的K2HPO4·3H2O的质量与去离子水的体积比为2.8g∶40mL。其他步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二中所述的pH值为11的K2HPO4溶液中的K2HPO4·3H2O质量与步骤一得到的F127-泛酸钙混合液中F127的质量比为2.8∶2.0。其他步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤二中将K2HPO4·3H2O溶解在去离子水中，得到K2HPO4溶液，然后用NH3·H2O调解K2HPO4溶液的pH值至pH值为11。其他步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤二中再将pH值为11的K2HPO4溶液以滴加速度为2.0g/min滴加到F127-泛酸钙混合液中。其他步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤二中搅拌均匀后采用水浴回流的方式进行加热，控制水浴加热温度为100℃，回流时间为24h，完成水浴回流反应。其他步骤及参数与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤二中将白色沉淀物在温度为100℃的真空条件下干燥48h，得到干燥后的白色沉淀物。其他步骤及参数与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是：步骤二中将干燥后的白色沉淀物在温度为250℃下预烧4h。其他步骤及参数与具体实施方式一至十之一相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至十一之一不同的是：步骤二中再在马弗炉中煅烧，控制煅烧温度为600℃，煅烧时间为10h，得到介孔羟基磷灰石纳米粒子。其他步骤及参数与具体实施方式一至十一之一相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是：步骤三中所述的步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与甲苯溶液的体积的比为2.1g∶120mL。其他步骤及参数与具体实施方式一至十二之一相同。
具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式一至十三之一不同的是：步骤三中所述的步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与3-氨丙基三甲氧基硅烷的体积比为2.1g∶8.5mL。其他步骤及参数与具体实施方式一至十三之一相同。
具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式一至十四之一不同的是：步骤三中将步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子均匀分散在甲苯溶液中，在搅拌速度为500r/min下搅拌20min后，加入3-氨丙基三甲氧基硅烷。其他步骤及参数与具体实施方式一至十四之一相同。
具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式一至十五之一不同的是：步骤三中然后置于温度为60℃的水浴锅中回流36h。其他步骤及参数与具体实施方式一至十五之一相同。
具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式一至十六之一不同的是：步骤三中所述的离心冷冻干燥参数为：离心速度为10000r/min，温度为-50℃，干燥时间为48h。其他步骤及参数与具体实施方式一至十六之一相同。
具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式一至十七之一不同的是：步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石的质量与二甲基亚砜溶液的体积的比为1.25g∶80mL。其他步骤及参数与具体实施方式一至十七之一相同。
具体实施方式十九：本实施方式与具体实施方式一至十八之一不同的是：步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与4-羧基苯硼酸的质量比为1.25∶0.4。其他步骤及参数与具体实施方式一至十八之一相同。
具体实施方式二十：本实施方式与具体实施方式一至十九之一不同的是：步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物的质量比为1.25∶0.2。其他步骤及参数与具体实施方式一至十九之一相同。
具体实施方式二十一：本实施方式与具体实施方式一至二十之一不同的是：步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1.25∶0.5。其他步骤及参数与具体实施方式一至二十之一相同。
具体实施方式二十二：本实施方式与具体实施方式一至二十一之一不同的是：步骤四中将步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石均匀分散在二甲基亚砜溶液中，然后在室温下以搅拌速度为500r/min搅拌3h。其他步骤及参数与具体实施方式一至二十一之一相同。
具体实施方式二十三：本实施方式与具体实施方式一至二十二之一不同的是：步骤四中再将4-羧基苯硼酸、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺加入氨基化的介孔磷灰石分散液中，然后在室温下以搅拌速度为400r/min搅拌48h。其他步骤及参数与具体实施方式一至二十二之一相同。
具体实施方式二十四：本实施方式与具体实施方式一至二十三之一不同的是：步骤五中所述的乳糖酸与1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物的质量比为1.0∶0.25。其他步骤及参数与具体实施方式一至二十三之一相同。
具体实施方式二十五：本实施方式与具体实施方式一至二十四之一不同的是：步骤五中所述的乳糖酸与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1.0∶0.15。其他步骤及参数与具体实施方式一至二十四之一相同。
具体实施方式二十六：本实施方式与具体实施方式一至二十五之一不同的是：步骤五中所述的乳糖酸的质量与PBS缓冲溶液的体积比为1.0g∶80mL。其他步骤及参数与具体实施方式一至二十五之一相同。
具体实施方式二十七：本实施方式与具体实施方式一至二十六之一不同的是：步骤五中所述的PBS缓冲溶液的摩尔浓度为0.01mol/L。其他步骤及参数与具体实施方式一至二十六之一相同。
具体实施方式二十八：本实施方式与具体实施方式一至二十七之一不同的是：步骤五中所述的乳糖酸与牛血清白蛋白的质量比为1.0∶1.2。其他步骤及参数与具体实施方式一至二十七之一相同。
具体实施方式二十九：本实施方式与具体实施方式一至二十七之一不同的是：步骤五中在搅拌速度为500r/min条件下搅拌2h，得到混合溶液A。其他步骤及参数与具体实施方式一至二十七之一相同。
具体实施方式三十：本实施方式与具体实施方式一至二十九之一不同的是：步骤五中再将牛血清白蛋白加入混合溶液A中，在室温下以搅拌速度为400r/min搅拌48h。其他步骤及参数与具体实施方式一至二十九之一相同。
具体实施方式三十一：本实施方式与具体实施方式一至三十之一不同的是：步骤五中所述的冷冻干燥参数为：温度为-50℃，干燥时间为36h。其他步骤及参数与具体实施方式一至三十之一相同。
具体实施方式三十二：本实施方式与具体实施方式一至三十一之一不同的是：步骤六所述的异氰酸荧光素与步骤四得到的硼酸化的介孔磷灰石的质量比为0.006∶0.15。其他步骤及参数与具体实施方式一至三十一之一相同。
具体实施方式三十三：本实施方式与具体实施方式一至三十二之一不同的是：步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素的质量与去离子水的体积比为6.0mg∶100mL。其他步骤及参数与具体实施方式一至三十二之一相同。
具体实施方式三十四：本实施方式与具体实施方式一至三十三之一不同的是：步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与步骤五得到的乳糖酸功能化的牛血清白蛋白的质量比为0.006∶0.3。其他步骤及参数与具体实施方式一至三十三之一相同。
具体实施方式三十五：本实施方式与具体实施方式一至三十四之一不同的是：步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物的质量比为0.006∶0.25。其他步骤及参数与具体实施方式一至三十四之一相同。
具体实施方式三十六：本实施方式与具体实施方式一至三十五之一不同的是：步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为0.006∶0.15。其他步骤及参数与具体实施方式一至三十五之一相同。
具体实施方式三十七：本实施方式与具体实施方式一至三十六之一不同的是：步骤六所述的PBS缓冲溶液的摩尔浓度为0.01mol/L。其他步骤及参数与具体实施方式一至三十六之一相同。
具体实施方式三十八：本实施方式与具体实施方式一至三十七之一不同的是：步骤六中在室温下以搅拌速度为300r/min搅拌48h，得到混合溶液B。其他步骤及参数与具体实施方式一至三十七之一相同。
具体实施方式三十九：本实施方式与具体实施方式一至三十八之一不同的是：步骤六中然后在搅拌速度为400r/min的条件下搅拌36h，然后用pH值为7.4的PBS缓冲液离心洗涤15次。其他步骤及参数与具体实施方式一至二十七三十八之一相同。
具体实施方式四十：本实施方式与具体实施方式一至三十九之一不同的是：步骤六中所述的冷冻干燥参数为：温度为-55℃，干燥时间为48h。其他步骤及参数与具体实施方式一至三十九之一相同。
通过以下试验验证本发明的有益效果：
试验一：本试验的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法是按以下步骤实现：
一、模板剂的准备：将2.0g的F127和10.12g的泛酸钙单水合物溶解在80mL的去离子水中，在搅拌速度为350r/min的条件下搅拌3h至得到清晰乳状液，得到F127-泛酸钙混合液，即得到模板剂；
二、介孔羟基磷灰石纳米粒子的制备：将2.8g的K2HPO4·3H2O溶解在40mL的去离子水中，得到K2HPO4溶液，然后用NH3·H2O调解K2HPO4溶液的pH值为11，再将配制的K2HPO4溶液以2.0g/min的滴加速度滴加到步骤一得到的F127-泛酸钙混合液中，搅拌均匀后采用水浴回流的方式进行加热，控制水浴加热温度为100℃，回流时间为24h，完成水浴回流反应，将水浴回流反应后的溶液过滤，收集白色沉淀物，将白色沉淀物在温度为100℃的真空条件下干燥48h，得到干燥后的白色沉淀物，然后将干燥后的白色沉淀物在温度为250℃下预烧4h，再在马弗炉中煅烧，控制煅烧温度为600℃，煅烧时间为10h，得到介孔羟基磷灰石纳米粒子；
三、介孔羟基磷灰石的氨基化：将2.1g的步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子均匀分散在120mL的甲苯溶液中，在搅拌速度为500r/min的条件下搅拌20min后，加入8.5mL的3-氨丙基三甲氧基硅烷，然后置于温度为60℃的水浴锅中回流36h，离心冷冻干燥后得到氨基化的介孔磷灰石；
步骤三中所述的离心冷冻干燥参数为：离心速度为10000r/min，温度为-50℃，干燥时间为48h。
四、介孔磷灰石的硼酸化：将1.25g的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石均匀分散在80mL的二甲基亚砜溶液中，然后在室温下以搅拌速度为500r/min搅拌3h，得到氨基化的介孔磷灰石分散液，再将0.4g的4-羧基苯硼酸、0.2g的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和0.5g的N-羟基琥珀酰亚胺加入氨基化的介孔磷灰石分散液中，然后在室温下以搅拌速度为400r/min搅拌48h，然后依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤并离心12次，再真空干燥，得到硼酸化的介孔磷灰石；
五、乳糖酸功能化牛血清白蛋白的制备：将1.0g的乳糖酸、0.25g的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和0.15g的N-羟基琥珀酰亚胺溶解在80mL的pH值为5.0的PBS缓冲溶液中，然后在室温下以搅拌速度为500r/min搅拌2h，得到混合溶液A，再将1.2g的牛血清白蛋白加入混合溶液A中，在室温下以搅拌速度为400r/min搅拌48h，再冷冻干燥，得到乳糖酸功能化牛血清白蛋白；
步骤五中所述的冷冻干燥参数为：温度为-50℃，干燥时间为36h；
步骤五中所述的PBS缓冲溶液的摩尔浓度为0.01mol/mL；
六、具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备：将6.0mg的异氰酸荧光素和0.15g的步骤四得到的硼酸化的介孔磷灰石溶解于100mL的去离子水中，在室温下以搅拌速度为300r/min搅拌48h，得到混合溶液B，然后将0.3g的步骤五得到的乳糖酸功能化的牛血清白蛋白、0.25g的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和0.15g的N-羟基琥珀酰亚胺加入混合溶液B，然后在搅拌速度为400r/min的条件下搅拌36h，然后用pH值为7.4的PBS缓冲液离心洗涤15次，再冷冻干燥，得到乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石；
步骤六中所述的冷冻干燥参数为：温度为-55℃，干燥时间为48h；
步骤六中所述的PBS缓冲溶液的摩尔浓度为0.01mol/mL。
(一)采用型号为Philips EM20的透射电镜对介孔磷灰石纳米颗粒和试验一得到的pH响应性细胞靶向乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石进行扫描，得到如图1所示的介孔磷灰石纳米颗粒的TEM照片，如图2所示的试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石的TEM照片。
(二)研究试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石在不同pH值的PBS缓冲溶液刺激下的释放行为，具体过程如下：
将3.3mg试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石分别溶于10mL的pH值为7.4、6.5和5.0的PBS缓冲溶液中，将缓冲溶液分别转入到透析袋中(截留分子量8000)，并置于100mL的相应pH值的PBS缓冲溶液中，37℃下孵育24h，在固定的间隔时间点，各自取出1mL，用紫外分光光度计测定溶液在480nm处的吸光度，进一步计算释放药物的质量。
结果，在不同pH值的PBS缓冲溶液刺激下试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石的释放曲线图如图3所示；其中，a为在pH值为7.4的PBS缓冲溶液刺激下试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石的释放曲线图；b为在pH值为6.8的PBS缓冲溶液刺激下试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石的释放曲线图；c为在pH值为5.0的PBS缓冲溶液刺激下试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石的释放曲线图；从图3可以看出，在pH为7.4的PBS缓冲溶液中，智能体系在5h后大约有8.0％的药物被释放出来，证明该体系对药物有很好的包封效果。而在pH6.5和5.0的PBS缓冲溶液中，在5h后有多达34％和53％的药物被释放出来。这是由于随着pH值的降低，连接在介孔磷灰石和牛血清白蛋白之间的环酯键断裂，介孔孔道被打开，导致药物释放出来。实验结果证明了乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石药物体系具有pH响应性。
(三)研究试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石在pH值的PBS缓冲溶液刺激下“爆发式”释放特性，具体过程如下：
将3.3mg试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石溶于10mL的pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，而后，将该溶液全部转移到透析袋中(分子量为8000)，并置于含有100mL的pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，37℃下孵育5h，之后调解上述溶液的pH为5.0，继续孵育24h。在固定的间隔时间点，取出1ml，用紫外分光光度计测定溶液在480nm处的吸光度，进一步计算释放药物的质量。
结果，在pH值的PBS缓冲溶液刺激下试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石的“爆发式”释放曲线图如图4所示；从图4可以看出，乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石智能响应体系在前5h，有大约8％的药物被释放；而在pH被调解为5.0后，在接下来的5h，药物的累积释放量达到了55％。这个现象说明乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石智能响应性体系在生理条件下，能有效的封装药物，但在酸性条件下，具有快速响应性，能“爆发式”释放药物。
(四)研究试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石在该肝癌细胞内的分布情况，具体过程为：
将试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石与肝癌细胞共培养，在不同的时间点利用激光共聚焦扫描显微镜检测乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石在细胞内的分布情况。
得到如图5、图6和图7所示的肝癌细胞吞噬试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石在不同时间的共聚焦扫描电镜图，其中图5为共培养6h后的共聚焦扫描电镜图，图6为共培养12h后的共聚焦扫描电镜图，图7为共培养24h后的共聚焦扫描电镜图，图5、图6和图7中的灰白色荧光点是药物被细胞吞噬后在胞内的分布情况。
从图5、图6和图7可以看出，当试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石与肝癌细胞共培养6h后，细胞胞浆内出现了少量的荧光粒子，说明异氰酸荧光素已经被释放出来。当培养12和24h后，细胞胞浆内的荧光粒子明显增多，说明模型药物异氰酸荧光素释放的越多。该结果表明，随着时间的增加，乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石纳米粒子能与肝癌细胞能持续的发生作用，不断的被细胞吞噬，并在细胞内响应性的释放药物。
(五)研究试验一得到的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石对肝癌细胞靶向性，具体过程为：
①将试验一得到的负载异氰酸荧光素的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石和负载异氰酸荧光素的介孔磷灰石与肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞共培养，利用流式细胞仪检测细胞内吞纳米颗粒的效率。
图8为试验一得到的负载异氰酸荧光素的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石和负载异氰酸荧光素的介孔磷灰石对肝癌细胞靶向性的量化分析柱形图；其中a代表负载FITC的介孔磷灰石，b代表试验一得到的负载异氰酸荧光素(FITC)的乳糖酸-胶原/介孔磷灰石；从图8可以看出，当负载异氰酸荧光素的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石和负载异氰酸荧光素的介孔磷灰石与肝癌细胞分别培养6h、12h和24h后，内吞乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石颗粒的肝癌细胞的数量分别是介孔磷灰石的2.3、2.1和23倍，说明相比于介孔磷灰石，乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石颗粒更容易被肝癌细胞吞噬，证明了肝癌细胞对乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石智能响应体系有靶向性。
②将试验一得到的负载异氰酸荧光素的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石与肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞共培养，利用流式细胞仪检测细胞内吞纳米颗粒的效率。
图9为试验一得到的负载异氰酸荧光素的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石对肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞靶向性的量化分析柱形图；其中a代表人脐静脉内皮细胞，b代表肝癌细胞。从图9可以看出，当分别培养6h、12h和24h后，内吞乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石颗粒的肝癌细胞的数量分别是人脐静脉内皮细胞的2.1、2.0和2.2倍，说明肝癌细胞比人脐静脉内皮细胞更容易吞噬乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石纳米颗粒。
①和②说明试验一得到的负载异氰酸荧光素(FITC)的乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石对肝癌细胞有明显的靶向性。这是因为肝癌细胞细胞膜上有大量的蛋白受体(ASGP-R)，而乳糖酸是ASGP-R的一种配体，能与ASGP-R发生特异性识别作用，因此，该乳糖酸-牛血清白蛋白/介孔磷灰石智能响应体系对肝癌细胞有靶向性。
Claims (10)
1.一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法是按以下步骤进行的：
一、模板剂的准备：将模板剂F127和泛酸钙单水合物溶解在去离子水中，在搅拌速度为250r/min～400r/min下搅拌至得到清晰乳状液，得到F127-泛酸钙混合液，即得到模板剂；
步骤一中所述的模板剂F127与泛酸钙单水合物的质量比为1∶(2.5～8)；步骤一中所述的F127与去离子水的质量比为1∶(15～67)；
二、介孔羟基磷灰石纳米粒子的制备：将K2HPO4·3H2O溶解在去离子水中，得到K2HPO4溶液，然后用NH3·H2O调解K2HPO4溶液的pH值至pH值为10～14，再将pH值为10～14的K2HPO4溶液以滴加速度为1.0g/min～3.0g/min滴加到步骤一得到的F127-泛酸钙混合液中，搅拌均匀后采用水浴回流的方式进行加热，控制水浴加热温度为60～100℃，回流时间为24h～48h，完成水浴回流反应，将水浴回流反应后的溶液过滤，收集白色沉淀物，将白色沉淀物在温度为80℃～150℃的真空条件下干燥12h～24h，得到干燥后的白色沉淀物，然后将干燥后的白色沉淀物在温度为200℃～300℃下预烧2h～6h，再在马弗炉中煅烧，控制煅烧温度为500℃～600℃，煅烧时间为8h～10h，得到介孔羟基磷灰石纳米粒子；
步骤二中所述的K2HPO4·3H2O的质量与去离子水的体积比为1g∶(10～25)mL；步骤二中所述的pH值为10～14的K2HPO4溶液中的K2HPO4·3H2O质量与步骤一得到的F127-泛酸钙混合液中F127的质量比为1∶(0.5～1.5)；
三、介孔羟基磷灰石的氨基化：将步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子均匀分散在甲苯溶液中，在搅拌速度为300r/min～600r/min下搅拌10min～30min后，加入3-氨丙基三甲氧基硅烷，然后置于温度为60℃～80℃的水浴锅中回流24h～48h，离心冷冻干燥后得到氨基化的介孔磷灰石；
步骤三中所述的步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与甲苯溶液的体积的比为1g∶(40～100)mL；步骤三中所述的步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与3-氨丙基三甲氧基硅烷的体积比为1g∶(2.4～67)mL；
四、介孔磷灰石的硼酸化∶将步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石均匀分散在二甲基亚砜溶液中，然后在室温下以搅拌速度为400r/min～600r/min搅拌2h～4h，得到氨基化的介孔磷灰石分散液，再将4-羧基苯硼酸、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺加入氨基化的介孔磷灰石分散液中，然后在室温下以搅拌速度为300r/min～500r/min搅拌36h～72h，然后依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤并离心10～20次，再真空干燥，得到硼酸化的介孔磷灰石；
步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石的质量与二甲基亚砜溶液的体积的比为1g∶(33～100)mL；步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与4-羧基苯硼酸的质量比为(2～7.5)∶1；步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物的质量比为(2～7.5)∶1；步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(1.2～3)∶1；
五、乳糖酸功能化牛血清白蛋白的制备∶将乳糖酸、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在pH值为5.0的PBS缓冲溶液中，然后在室温下以搅拌速度为300r/min～600r/min搅拌2h～4h，得到混合溶液A，再将牛血清白蛋白加入混合溶液A中，在室温下以搅拌速度为200r/min～500r/min搅拌36h～72h，再冷冻干燥，得到乳糖酸功能化牛血清白蛋白；
步骤五中所述的乳糖酸与1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物的质量比为(1.6～15)∶1；步骤五中所述的乳糖酸与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(1.6～15)∶1；步骤五中所述的乳糖酸的质量与PBS缓冲溶液的体积比为1g∶(33～200)mL；所述的PBS缓冲溶液的摩尔浓度为0.005mol/L～0.02mol/L；步骤五中所述的乳糖酸与牛血清白蛋白的质量比为(0.25～1.5)∶1；
六、具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备∶将盐酸阿霉素或异氰酸荧光素和步骤四得到的硼酸化的介孔磷灰石溶解于去离子水中，在室温下以搅拌速度为200r/min～500r/min搅拌48h～60h，得到混合溶液B，然后将步骤五得到的乳糖酸功能化的牛血清白蛋白、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺加入混合溶液B中，然后在搅拌速度为300r/min～500r/min的条件下搅拌24h～48h，然后用pH值为7.4的PBS缓冲液离心洗涤10～20次，再冷冻干燥，得到介孔磷灰石纳米药物载体；
步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与步骤四得到的硼酸化的介孔磷灰石的质量比为1∶(12.5～50)；步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素的质量与去离子水的体积比为1mg∶(10～30)mL；步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与步骤五得到的乳糖酸功能化的牛血清白蛋白的质量比为1∶(25～125)；步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物的质量比为1∶(12.5～75)；步骤六所述的盐酸阿霉素或异氰酸荧光素与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1∶(12.5～50)；步骤六所述的PBS缓冲溶液的摩尔浓度为0.005mol/L～0.02mol/L。
2.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤一中在搅拌速度为350r/min下搅拌至得到清晰乳状液。
3.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤二中再将pH值为11的K2HPO4溶液以滴加速度为2.0g/min滴加到F127-泛酸钙混合液中。
4.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤二中搅拌均匀后采用水浴回流的方式进行加热，控制水浴加热温度为100℃，回流时间为24h，完成水浴回流反应。
5.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤二中将干燥后的白色沉淀物在温度为250℃下预烧4h。
6.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤二中再在马弗炉中煅烧，控制煅烧温度为600℃，煅烧时间为10h，得到介孔羟基磷灰石纳米粒子。
7.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤三中将步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子均匀分散在甲苯溶液中，在搅拌速度为500r/min下搅拌20min后，加入3-氨丙基三甲氧基硅烷。
8.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤三中所述的离心冷冻干燥参数为：离心速度为10000r/min，温度为-50℃，干燥时间为48h。
9.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤五中所述的冷冻干燥参数为：温度为-50℃，干燥时间为36h。
10.根据权利要求1所述的一种对肝癌细胞具有pH响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤六中所述的冷冻干燥参数为：温度为-55℃，干燥时间为48h。
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