CN110772485A - 牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒及其制备方法和应用，以牛血清白蛋白(BSA)作为生物模板，仿生羟基磷灰石(HA)的湿法合成，反应条件在温度90℃、溶液pH＝10‑11，反应体系中牛血清白蛋白与羟基磷灰石的质量比为3:7时，能够得到颗粒形态和大小均一的牛血清白蛋白/羟基磷灰石(BSA/HA)复合纳米颗粒，形状为球形、直径约为10‑20nm。与现有技术相比，本发明BSA/HA复合纳米颗粒对正常细胞的体外毒性较低，具有较好的生物相容性。将BSA/HA复合纳米颗粒作为药物载体可装载抗生素(环丙沙星)和抗肿瘤化疗药物(紫杉醇)，载药量可控制在10wt.％‑40wt.％，纳米载药体系能够分别具有明显的抑菌效果和抗肿瘤效果，在生物医药领域具有潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药纳米材料领域，尤其是涉及一种牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)纳米材料是一种很有应用前景的生物材料，具有无毒、无刺激、无免疫原性、不致过敏、不致突变、不致溶血和不破坏生物组织的特性。纳米羟基磷灰石材料有较大的比表面积和高表面活性，能粘附蛋白质，其内部孔道结构能包载药物，是作为药物载体的理想材料。然而这种载体只是通过吸附或机械混合的方式载药，释放时总是在初始阶段造成大量的突释，随后的释放速度很慢甚至没有，不能满足长效局部给药的目的。
牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的是一种水溶性的蛋白质，来源广泛，其分子量为67000，等电点为4.7，在血液中的功能为参与维持渗透压以及物质运输等，在制药领域可作为药物载体，提高疏水药物的水溶性，具有药物缓释作用，降低药物的毒副作用。以牛血清白蛋白作为标准蛋白质模型药物的蛋白质药物载药系统研究主要集中在纳米粒、纳米囊、纳米微球、微囊、多泡脂质体、脂质体；药用辅料主要是：PLA、PLAG、PLG607、三甲基壳聚糖、壳聚糖、聚乳酸-聚羟基乙酸、聚3-羟基丁酸酯、磷脂和海藻酸钠、PVP、PLLA等；制备方法多用复乳-溶剂挥发法、原位包合法、乳化交联法、吸附法等。这些载药系统或药用辅料、制备方法存在以下问题：(1)药物包封率及载药量低；(2)使用材料毒副作用较大，制备过程中有机溶媒残余量大，毒性大；(3)制造工艺复杂、条件要求高、工艺操作时间长；(4)制备过程易破坏药物；(5)具有突释效应；(6)生物相容性不理想，产率低、不易灭菌、稳定性和重复性差，难大规模生产；(7)原料价格昂贵，生产成本高。
生物模板法是指通过利用生物组织成分和大分子为模板，通过物理空间效应、化学自组装和其他方法参与反应，可控制形成的纳米材料的结构与尺寸。生物模板主要通过少量有机大分子来操纵无机小分子成核、生长以及形成纳米结构材料来合成目标纳米材料。生物模板法合成的材料从纳米尺度到宏观尺度是高度有序的，并且可以构成具有复杂形态的高级结构。
但是现有药物载体存在形状不可控、毒性较高、生物相容性较差，载药量较低等缺点。本发明是针对现有药物载体存在的缺陷，提供一种形状可靠、毒性低、生物相容性好、载药量高的具有载药功能的牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒及其制备方法和应用。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种形状可控、毒性低、生物相容性好、载药量高的具有载药功能的牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒，其特征在于，该纳米载药颗粒包括质量比为2～4:7的牛血清白蛋白和羟基磷灰石。
所述的纳米载药颗粒的形状为球形、直径约为10-20nm。
上述牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，该方法以牛血清白蛋白作为生物模板，仿生羟基磷灰石的湿法合成，反应条件在温度85～95℃、溶液pH＝10-11，反应时间为20～30h。
所述的方法具体步骤如下：
(1)配制60～70mM的Ca(NO3)2·4H2O水溶液，称量牛血清白蛋白；
(2)将Ca(NO3)2·4H2O水溶液和牛血清白蛋白在反应器中进行混合，体系中牛血清白蛋白与羟基磷灰石的质量比为2～4:7；
(3)体系反应温度为85～95℃，加入浓度为15～25mM(NH4)2HPO4溶液与步骤(2)所得前体混合反应，用浓氨水调节反应溶液的pH＝10-11，整个反应保持20～30h；
(4)结束反应后将得到的产物陈化12h以上，用超纯水清洗产物，除去未参与反应的牛血清白蛋白，将得到的产物离心分离、冷冻干燥后得到牛血清白蛋白/羟基磷灰石纳米颗粒。
步骤(4)离心分离步骤重复3次。
上述牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒的应用，其特征在于，在纳米颗粒形成的过程中可同时加入药物，反应结束后得到的载药BSA/HA复合纳米颗粒，载药颗粒直径为40-100nm。结束反应后将得到的产物陈化12h以上，用超纯水清洗产物，除去未参与反应的BSA、药物，将得到的产物洗涤、离心分离纯化、冷冻干燥后得到载药BSA/HA复合纳米颗粒。
进一步地，载入的药物包括环丙沙星或紫杉醇。
进一步地，载入药物为环丙沙星时，选用大肠杆菌ATCC 25933评价载环丙沙星BSA/HA复合纳米载药颗粒的抗菌性能。
本发明中的载环丙沙星BSA/HA复合纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)配制60～70mM的Ca(NO3)2·4H2O水溶液，称量牛血清白蛋白；
(2)将Ca(NO3)2·4H2O水溶液和牛血清白蛋白在反应器中进行混合，体系中牛血清白蛋白与羟基磷灰石的质量比为2～4:7；
(3)体系反应温度为85～95℃，加入浓度为15～25mM(NH4)2HPO4溶液与步骤(2)所得前体混合反应，用浓氨水调节反应溶液的pH＝10-11，整个反应保持20～30h；
(4)结束反应后将得到的产物陈化12h以上，用超纯水清洗产物，除去未参与反应的牛血清白蛋白，将得到的产物离心分离、冷冻干燥后得到牛血清白蛋白/羟基磷灰石纳米颗粒；
(5)将冷冻干燥后得到BSA/HA复合纳米颗粒，均匀分散在超纯水中，滴入环丙沙星溶液(5mg/mL)，将混合溶液置于37℃下，在500rpm下进行搅拌，反应12h；
(6)将混合溶液，离心分离上清液以及下层的固体颗粒，将收集到的颗粒用超纯水清洗冻干后，可得到载环丙沙星BSA/HA复合纳米载药颗粒。
步骤(4)中的离心分离步骤重复3次，步骤(6)中的清洗步骤重复3次。
进一步地，载入药物为紫杉醇时，选用骨肉瘤细胞143B评价载紫杉醇BSA/HA复合纳米载药颗粒的抗肿瘤性能。
本发明中的载紫杉醇BSA/HA复合纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)配制60～70mM的Ca(NO3)2·4H2O水溶液，10mg/mL PTX乙醇溶液，称量牛血清白蛋白；
(2)将Ca(NO3)2·4H2O水溶液、PTX乙醇溶液和牛血清白蛋白在反应器中进行混合，体系中牛血清白蛋白与羟基磷灰石的质量比为2～4:7；
(3)体系反应温度为85～95℃，加入浓度为15～25mM(NH4)2HPO4溶液与步骤(2)所得前体混合反应，用浓氨水调节反应溶液的pH＝10-11，整个反应保持20～30h；
(4)结束反应后将得到的产物陈化12h以上，用超纯水清洗产物，除去未参与反应的牛血清白蛋白、紫杉醇，将得到的产物离心分离、冷冻干燥后得到载紫杉醇牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米颗粒。
步骤(4)中的离心分离步骤重复3次。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明通过BSA作为生物模板，模仿HA的湿法合成方法，将HA、BSA和药物三者有效地结合，简单高效的合成出具有载药功能的羟基磷灰石纳米颗粒的非常有应用前景。
(2)本发明BSA/HA复合纳米颗粒对正常细胞的体外毒性较低，具有较好的生物相容性。
(3)本发明将BSA/HA复合纳米颗粒作为药物载体可装载抗生素(环丙沙星)和抗肿瘤化疗药物(紫杉醇)，载药量可控制在10wt.％-40wt.％，纳米载药体系能够分别具有明显的抑菌效果和抗肿瘤效果，在生物医药领域具有潜在的应用前景。
附图说明
图1为BSA/HA复合纳米颗粒的透射电镜图；
图2为BSA/HA复合纳米颗粒的紫外可见光谱图，对照组为BSA与HA；
图3为BSA/HA复合纳米颗粒的红外光谱图，对照组为BSA与HA；
图4为BSA/HA复合纳米颗粒的XRD衍射图谱，对照组为HA；
图5为制得的BSA/HA复合纳米颗粒以不同浓度梯度与L929细胞共同培养24h，48h，72h后相对细胞活性的数据图；
图6为载环丙沙星BSA/HA复合纳米载药颗粒以及BSA/HA复合纳米颗粒对大肠杆菌(ATCC 25933)在24h内抑菌效果的测定；
图7为载紫杉醇BSA/HA复合纳米颗粒对人骨肉瘤143B细胞的体外毒性评价；
图8为本发明原理图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
一、原材料
四水合硝酸钙、磷酸氢二铵、乙醇、浓氨水、二甲亚砜均购于国药集团化学试剂有限公司；牛血清白蛋白和噻唑蓝(MTT)购于Sigma-Aldrich；细胞培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、磷酸盐缓冲液(PBS,6.7mM，pH＝7.2-7.4)购于Life Technologies；小鼠成纤维细胞(L929)与人骨肉瘤细胞(143B)购于中科院上海细胞所；大肠杆菌ATCC 25933购于美国ATCC中心；实验用水为超纯水(ρ>18MΩ，美国Milli-Q纯水机)。
二、主要测试设备
透射电子显微镜，Tecnai G2 spirit Biotwin型，美国FEI公司；X射线衍射仪，：3kW/D8 ADVANCE Da Vinci型，德国Bruker公司；紫外可见分光光度计，Evolution 300型，美国Thermo Scientific公司；傅里叶变换红外光谱仪，Nicolet 6700型，美国ThermoFisher公司；酶标仪，Elx800型，美国Bio Tek公司。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
牛血清白蛋白/羟基磷灰石纳米颗粒的制备：
a.配制66.8mM的Ca(NO3)2·4H2O水溶液，称量28.7mg牛血清白蛋白；
b.将10mL Ca(NO3)2·4H2O水溶液和牛血清白蛋白在圆底烧瓶中进行混合，体系中体系中BSA与HA的质量比为3:7；
c.体系反应温度为90℃，加20mL浓度为20mM(NH4)2HPO4溶液与前体混合反应。用浓氨水调节反应溶液的pH＝10-11，整个反应保持24h；
d.结束反应后将得到的产物陈化12h以上，用超纯水清洗产物，除去未参与反应的BSA等物质，将得到的产物洗涤、离心分离重复3次进行纯化，冷冻干燥后得到BSA/HA复合纳米颗粒。
1.形貌观察
将均匀分散后的样品/乙醇溶液滴1-2滴于铜网上，待溶剂完全挥发之后可进行透射电镜测试；
2.紫外可见光光谱
将样品分散在相应溶剂中，参比为空白溶剂，测量样品的紫外吸收曲线；
3.傅里叶变温红外光谱
使用溴化钾(KBr)压片制样，测定4000-400cm-1范围内样品的红外吸收光谱；
4.X射线衍射
检测条件：铜靶
电流：20mA，电压：40kV，扫描速率：0.02°2θ/s，扫描范围：2θ＝5-80°；对产物的晶体结构和物相结构进行分析并判断晶体类型和结构。
5.MTT体外细胞毒性评价
a.将L929细胞以每孔1.0×104个细胞/200μL DMEM培养基接种于96孔板中，在37℃、5％CO2培养箱中培养24h；
b.细胞完全贴壁后吸出培养基，重新加入200μL DMEM培养基；
c.将制备BSA/HA复合纳米颗粒通过紫外灯照射提前进行灭菌处理，用磷酸盐缓冲液对材料进行分散及稀释，从而可以得到一系列不同浓度的改性材料的PBS混合溶液，将样品溶液以每孔50μL的量小心加入96孔板中。实验设置6个平行样，最终得到的96孔板中样品的实际浓度分别为0.3、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40和80μg/mL；
d.将每个浓度设置6个重复孔，每孔50μL的量加入孔板中，使样品的最终浓度分别为2、10、20、50、100和200μg/mL；
e.在培养箱中继续培养48h后，吸出每个孔板中的培养液，用PBS清洗2次，在每个孔中分别加入200μL DMEM培养基与20μL浓度为5mg/mL MTT后继续培养3-4小时；
f.吸出DMEM及MTT溶液，每孔加入200μL DMSO，震荡10min后使用酶标仪在490nm波长下的吸光度值(A)。并使用下面公式计算细胞存活率。
实施例2
载环丙沙星BSA/HA复合纳米载药颗粒的制备：
a.配制66.8mM的Ca(NO3)2·4H2O水溶液，称量28.7mg牛血清白蛋白；
b.将10mL Ca(NO3)2·4H2O水溶液和BSA在圆底烧瓶中进行混合，体系中体系中牛血清白蛋白与羟基磷灰石的质量比为3:7；
c.体系反应温度为90℃，加20mL浓度为20mM(NH4)2HPO4溶液与前体混合反应。用浓氨水调节反应溶液的pH＝10-11，整个反应保持24h；
d.结束反应后将得到的产物陈化12h以上，用超纯水清洗产物，除去未参与反应的BSA等物质，将得到的产物离心分离重复3次、冷冻干燥后得到BSA/HA复合纳米颗粒。
e.将50mg冷冻干燥后得到BSA/HA复合纳米颗粒，均匀分散在10mL超纯水中，滴入10mL环丙沙星溶液(5mg/mL)，将混合溶液置于37℃下，在500rpm下进行搅拌，反应12h；
f.将混合溶液，离心分离上清液以及下层的固体颗粒，将收集到的颗粒用超纯水清洗3次冻干后，可得到载环丙沙星BSA/HA纳米载药颗粒。
选用常见的大肠杆菌ATCC 25933进行载环丙沙星BSA/HA复合纳米载药颗粒抗菌性能评价。实验具体步骤如下：
a.样品的准备：选择制备含10wt.％环丙沙星的BSA/HA复合纳米颗粒进行抑菌实验。通过压片机将冻干后得到的粉末状BSA/HA-10wt.％CIP及BSA/HA样品制成直径为13mm，厚度约为2mm的圆片后待用；
b.培养基的准备：将LB培养基粉25g加入二次水溶解，用玻璃棒搅拌均匀，用NaOH(1mol/L)控制pH＝7.4左右，将培养基定容稀释至1L后，分装于锥形瓶中，每瓶约为150mL，向锥形瓶中加入约2％的琼脂(约2.5g)。将培养基经过高压蒸汽灭菌15min，置于锥形瓶中保存待用；
c.平板的制备：将培养基置于微波炉中，中火加热3min，使琼脂融化，室温冷却至不烫手后，可用于制备平板。超净台提前进行紫外光照射灭菌后，将10-15mL培养基倒入培养皿内，使培养基的厚度约为4mm。待培养基稍干后，将制得的载环丙沙星BSA/HA复合纳米载药颗粒及BSA/HA复合纳米颗粒粉体制成的圆片置于培养皿中心位置，紫外灭菌10min后，培养皿凝固后即可涂板；
d.大肠杆菌的接种：用移液枪吸取灭菌PBS 100μL于拼板上，吸取大肠杆菌液10μL小心与平板上的PBS混合，使用灭菌后的涂抹棒涂抹大肠杆菌将其均匀涂布平板。将涂完大肠杆菌的平板倒置放入37℃的恒温培养箱中，防止产生水汽，培养24h；
e.抑菌环测量：材料圆环周围无菌落生长的区域的大小使用游标卡尺惊醒测量，所得数值即抑菌环直径，每组实验重复3次。
实施例3
载紫杉醇BSA/HA复合纳米载药颗粒的制备方法：
a.配制66.8mM的Ca(NO3)2·4H2O水溶液，10mg/mL PTX乙醇溶液，以及称量28.7mgBSA；
b.将10mL Ca(NO3)2·4H2O水溶液、10mL PTX溶液以及牛血清白蛋白在圆底烧瓶中进行混合，体系中体系中牛血清白蛋白与羟基磷灰石的质量比为3:7；
c.体系反应温度为90℃，加20mL浓度为20mM(NH4)2HPO4溶液与前体混合反应。用浓氨水调节反应溶液的pH＝10-11，整个反应保持24h；
d.结束反应后将得到的产物陈化12h以上，用超纯水清洗产物，除去未参与反应的BSA、紫杉醇等物质，将得到的产物离心分离重复3次，冷冻干燥后得到载紫杉醇BSA/HA复合纳米载药颗粒。
载紫杉醇BSA/HA复合纳米载药颗粒的体外细胞毒性评价
a.将143B细胞以每孔1.0×104个细胞/200μL DMEM培养基接种于96孔板中，在37℃、5％CO2培养箱中培养24h；
b.细胞完全贴壁后吸出培养基，重新加入200μL DMEM；
c.将制备的载紫杉醇BSA/HA复合纳米载药颗粒通过紫外灯照射提前进行灭菌处理，用磷酸盐缓冲液对材料进行分散及稀释，从而可以得到一系列不同浓度的改性材料的PBS混合溶液，将样品溶液以每孔50μL的量小心加入96孔板中。实验设置6个平行样，最终得到的96孔板中样品的实际浓度分别为是0.36、0.725、0.15、0.31、0.625，1.25、2.5、5和10μg/mL；
d.将每个浓度设置6个重复孔，每孔50μL的量加入孔板中，使样品的最终浓度分别为2、10、20、50、100和200μg/mL；
e.在培养箱中继续培养48h后，吸出每个孔板中的培养液，用PBS清洗2次，在每个孔中分别加入200μL DMEM培养基与20μL 5mg/mL MTT后继续培养3-4小时；
f.吸出DMEM及MTT溶液，每孔加入200μL DMSO，震荡10min后使用酶标仪在490nm波长下的吸光度值(A)。并使用下面公式计算细胞存活率。
三、实验结果说明
由图1可知，所得到的BSA/HA复合纳米颗粒具有形状和尺寸较为均一的颗粒，粒径约为10-20nm。
由图2可知，在BSA/HA复合纳米颗粒的紫外可见吸收曲线上，可以明显观察到曲线与HA的峰型发生了变化，其紫外可见吸收曲线与BSA的更接近，由此可初步证明通过此方法制得的BSA/HA复合纳米颗粒上存在BSA分子，反映BSA确实参与纳米颗粒的形成过程。将所得到的BSA/HA复合纳米颗粒中所含有的官能团利用红外光谱进行检测。
如图3所示，BSA/HA复合纳米颗粒的红外吸收曲线上在1600cm-1左右的吸收峰和在2800-3600cm-1的宽峰是产物中羟基的O-H键的振动吸收峰。1400cm-1处的小峰为羰基C＝O的吸收峰。1200cm-1后的峰为磷酸根离子(PO4 3-)中P-O伸缩振动和弯曲振动造成的。综上所述，BSA/HA复合纳米颗粒的红外表征结果与纯HA基本类似，但在其红外吸收谱图中可观察到存在BSA的吸收峰，说明BSA/HA复合纳米颗粒上确实存在BSA。
BSA/HA复合纳米颗粒的晶相结构使用X射线衍射方法对其进行检测，结果得到衍射峰与纯HA的衍射峰相类似，结果如图4所示，但BSA/HA复合纳米颗粒的混乱度较高，推测是由于BSA/HA复合纳米颗粒的分散性较为不好，在X射线衍射实验中存在团聚现象，使得X射线衍射曲线混乱度较高。
通过MTT比色法对，BSA/HA复合纳米颗粒的体外毒性进行评估。结果如图5所示，随着加入的BSA/HA复合纳米颗粒的浓度的增加和孵育时间的增长，纳米颗粒对L929细胞的体外毒性有所增加，在低浓度条件下，BSA/HA复合纳米颗粒与细胞共孵育24和48h可以观察到，细胞增殖较多，但当孵育时间延长到72h时，细胞的相对活性较24和48h相比有降低，分析认为由于BSA/HA复合纳米颗粒的体外毒性较低，导致细胞增殖速率过快，在96孔板中生长72h后细胞增殖地太过密集，范围会导致细胞过于密集而凋亡。最终细胞相对活性都保持在90％以上，表明所制得的BSA/HA复合纳米颗粒对于L929细胞系的体外细胞毒性较低，生物相容性较好。
抗菌实验结果如图6所示，在与大肠杆菌(ATCC 25933)共培养24h后，BSA/HA复合纳米颗粒(图6a)未能观察到抑菌环的产生，培养皿内的细菌生长均匀，证明单纯的BSA/HA复合纳米颗粒的并无抑菌能力。而对于负载了10wt.％环丙沙星的BSA/HA复合纳米载药颗粒(图6b)，可明显观察到抑菌环的产生，对抑菌环的直径进行测量，可得到此时所产生的抑菌环直径为17.24±0.52mm，证明载环丙沙星BSA/HA复合纳米载药颗粒能够对大肠杆菌(ATCC 25933)有明显的抑菌作用。
图7所示，对于人成骨肉瘤细胞系(143B)，BSA/HA复合纳米颗粒、紫杉醇原药和HA-BSA-PTX纳米颗粒对细胞都有生长抑制作用，载紫杉醇BSA/HA复合纳米载药颗粒对肿瘤细胞的毒性最大，且存在浓度依赖性。实验结果表明载紫杉醇BSA/HA复合纳米载药颗粒对于人成骨肉瘤细胞系有一定的生长抑制作用。
四、结论
通过BSA作为生物模板，模仿HA的湿法合成方法，可以在90℃，pH＝10-11，体系中牛血清白蛋白与羟基磷灰石的质量比为3:7时，可得到颗粒形状和大小均一的BSA/HA复合纳米颗粒，直径约为10-20nm。BSA/HA复合纳米颗粒对正常细胞的体外毒性较低，具有较好的生物相容性。将BSA/HA复合纳米颗粒作为药物载体形成抗生素(环丙沙星)和抗肿瘤化疗药物(紫杉醇)纳米载药体系，复合载药体系能够分别具有明显的抑菌效果和抗肿瘤效果，在生物医药领域具有潜在的应用前景。
实施例5
一种牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒，通过以下方法制备：
(1)配制60mM的Ca(NO3)2·4H2O水溶液，称量牛血清白蛋白；
(2)将Ca(NO3)2·4H2O水溶液和牛血清白蛋白在反应器中进行混合，体系中牛血清白蛋白与羟基磷灰石的质量比为2:7；
(3)体系反应温度为85℃，加入浓度为15mM(NH4)2HPO4溶液与步骤(2)所得前体混合反应，用浓氨水调节反应溶液的pH＝10，整个反应保持20h；
(4)结束反应后将得到的产物陈化12h以上，用超纯水清洗产物，除去未参与反应的牛血清白蛋白，将得到的产物离心分离、重复3次，冷冻干燥后得到牛血清白蛋白/羟基磷灰石纳米颗粒，所得纳米载药颗粒的形状为球形、直径约为10-20nm。
实施例6
一种牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒，通过以下方法制备：
(1)配制70mM的Ca(NO3)2·4H2O水溶液，称量牛血清白蛋白；
(2)将Ca(NO3)2·4H2O水溶液和牛血清白蛋白在反应器中进行混合，体系中牛血清白蛋白与羟基磷灰石的质量比为4:7；
(3)体系反应温度为95℃，加入浓度为25mM(NH4)2HPO4溶液与步骤(2)所得前体混合反应，用浓氨水调节反应溶液的pH＝11，整个反应保持30h；
(4)结束反应后将得到的产物陈化12h以上，用超纯水清洗产物，除去未参与反应的牛血清白蛋白，将得到的产物离心分离、重复3次，冷冻干燥后得到牛血清白蛋白/羟基磷灰石纳米颗粒，所得纳米载药颗粒的形状为球形、直径约为10-20nm。
Claims (10)
1.一种牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒，其特征在于，该纳米载药颗粒包括质量比为2～4:7的牛血清白蛋白和羟基磷灰石。
2.根据权利要求1所述的一种牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒，其特征在于，所述的纳米载药颗粒的形状为球形、直径约为10-20nm。
3.一种如权利要求1所述的牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，该方法以牛血清白蛋白作为生物模板，仿生羟基磷灰石的湿法合成，反应条件在温度85～95℃、溶液pH＝10-11，反应时间为20～30h。
4.根据权利要求3所述的一种牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，所述的方法具体步骤如下：
(1)配制60～70mM的Ca(NO3)2·4H2O水溶液，称量牛血清白蛋白；
(2)将Ca(NO3)2·4H2O水溶液和牛血清白蛋白在反应器中进行混合，体系中牛血清白蛋白与羟基磷灰石的质量比为2～4:7；
(3)体系反应温度为85～95℃，加入浓度为15～25mM(NH4)2HPO4溶液与步骤(2)所得前体混合反应，用浓氨水调节反应溶液的pH＝10-11，整个反应保持20～30h；
(4)结束反应后将得到的产物陈化12h以上，用超纯水清洗产物，除去未参与反应的牛血清白蛋白，将得到的产物离心分离、冷冻干燥后得到牛血清白蛋白/羟基磷灰石纳米颗粒。
5.根据权利要求3所述的一种牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(4)离心分离步骤重复3次。
6.一种如权利要求1所述的牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒的应用，其特征在于，在纳米颗粒形成的过程中可同时加入药物，反应结束后得到的载药BSA/HA复合纳米颗粒，载药颗粒直径为40-100nm。
7.根据权利要求6所述的牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒的应用，其特征在于，载入的药物包括环丙沙星或紫杉醇。
8.根据权利要求7所述的牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒的应用，其特征在于，载入药物为环丙沙星时，选用大肠杆菌ATCC 25933评价载环丙沙星BSA/HA复合纳米载药颗粒的抗菌性能。
9.根据权利要求7所述的牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒的应用，其特征在于，载入药物为紫杉醇时，选用骨肉瘤细胞143B评价载紫杉醇BSA/HA复合纳米载药颗粒的抗肿瘤性能。
10.根据权利要求6所述的牛血清白蛋白/羟基磷灰石复合纳米载药颗粒的应用，其特征在于，结束反应后将得到的产物陈化12h以上，用超纯水清洗产物，除去未参与反应的BSA、药物，将得到的产物洗涤、离心分离纯化、冷冻干燥后得到载药BSA/HA复合纳米颗粒。
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