CN104548108A - 一种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法。本发明属于生物医用材料领域，具体涉及种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法。本发明是为了解决现有方法存在着药物负载量小，载体水溶性差的问题。方法：、制备F127-泛酸钙混合液；二、制备介孔羟基磷灰石纳米粒子；三、介孔羟基磷灰石的氨基化；四、制备聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子；五、制备pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体。本发明制备的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体具有快速的pH响应性，而且药物负载量大，在生物体内毒副作用小，可用于癌症的临床治疗，具有重要的应用前景。

Description

一种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法。

背景技术

癌症是当今医学界所面临的重大难题之一，化学疗法是癌症治疗中不可或缺的重要手段。但传统的化学疗法存在毒副作用大、药物生物利用率低、缺乏特异性识别等缺点，限制了其在癌症治疗中的应用与发展。智能响应药物控释系统的出现和发展有望解决化学疗法中存在的问题。利用纳米材料作为抗肿瘤药物的载体，构建新型的智能响应体系，可实现药物的缓释并稳定血液浓度，从而降低其对病人的毒副作用，提高肿瘤的治疗效果。目前，发展的新型智能控释体系，不仅能特异性的识别靶位组织，还能定时、定量的将药物导入病变部位，提高药物的利用率，在临床治疗中具有潜在的应用前景。

目前，一系列刺激响应性释放药物体系都已被开发，他们通过靶向部位的特殊环境“激活”，将药物释放到靶向部位的一类新型药物系统。在众多环境响应性药物控释系统中，pH响应药物控释体系尤其受到了关注。这是因为人体正常血液和组织的pH值接近7.4，而肿瘤组织周围的环境略呈酸性，pH为5.5-6.5，而且细胞内涵体和溶酶体的pH更低为pH4.5-5.5，因此，利用人体内部自身存在的这种环境差异设计pH响应智能体系，实现对药物释放的控制，是一种简单可行的方法。近年来pH响应性释放体系得到了广泛的应用，大多数pH响应性药物输送体系都是通过引入pH响应型官能团达到响应性释放药物的目的，主要是通过在载体中氨基或羧酸根等官能团，利用酸碱度变化的质子化作用来改变体系的形态，达到pH相应的能力；或者是利用对酸敏感的官能团如亚胺、腙等作为连接药物分子和载体的纽带形成药物缀合物，通过该“纽带”酸性降解来释放药物。这些方法存在着药物负载量小，载体水溶性差的缺点，因此限制了pH响应体系大的应用。

发明内容

本发明是为了解决现有方法存在着药物负载量小，载体水溶性差的问题，而提供了一种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法。

一种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法具体是按以下步骤进行的：

一、F127-泛酸钙混合液的制备：将F127和泛酸钙单水合物溶解在去离子水中，在搅拌速度为250r/min～400r/min下搅拌至得到清晰乳状液，得到F127-泛酸钙混合液；

步骤一中所述的F127与泛酸钙单水合物的质量比为1:(5～10)；步骤一中所述的F127的质量与去离子水的体积比为1g:(20～80)mL；

二、介孔羟基磷灰石纳米粒子的制备：将K₂HPO₄·3H₂O溶解在去离子水中，得到K₂HPO₄溶液，然后用NH₃·H₂O调解K₂HPO₄溶液的pH值为10～14，再将pH值为10～14的K₂HPO₄溶液以滴加速度为1.0g/min～3.0g/min滴加到F127-泛酸钙混合液中，搅拌均匀后采用水浴回流的方式进行加热，控制水浴加热温度为80℃～100℃，回流时间为24h～48h，完成水浴回流反应，将水浴回流反应后的溶液过滤，收集白色沉淀物，将白色沉淀物在温度为80℃～150℃的真空条件下干燥12h～48h，得到干燥后的白色沉淀物，然后将干燥后的白色沉淀物在温度为200℃～300℃下预烧2h～6h，再在马弗炉中煅烧，控制煅烧温度为500℃～600℃，煅烧时间为6h～10h，得到介孔羟基磷灰石纳米粒子；

步骤二中所述的K₂HPO₄·3H₂O的质量与去离子水的体积比为1g:(6～15)mL；步骤二中所述的pH值为10～14的K₂HPO₄溶液中的K₂HPO₄·3H₂O的质量与F127-泛酸钙混合液中F127的质量比为(2～5):1；

三、介孔羟基磷灰石的氨基化：将步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子均匀分散在甲苯溶液中，在搅拌速度为300r/min～600r/min下搅拌10min～30min后，加入3-氨丙基三甲氧基硅烷，然后置于温度为60℃～80℃的水浴锅中回流24h～48h，离心冷冻干燥后得到氨基化的介孔磷灰石；

步骤三中所述的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与甲苯溶液的体积的比为1g:(50～100)mL；步骤三中所述的3-氨丙基三甲氧基硅烷与甲苯溶液的体积比为1:(25～80)；

四、聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子的制备：将步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石均匀分散在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，然后在室温下以搅拌速度为400r/min～600r/min搅拌2h～3h，得到氨基化的介孔磷灰石分散液，再将聚丙烯酸逐滴加入到氨基化的介孔磷灰石分散液中，然后在温度为120～160℃的条件下继续以搅拌速度为300r/min～500r/min搅拌4h～8h，离心干燥得到聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子；

步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石的质量与N,N-二甲基甲酰胺溶液的体积比为1g:(85～160)mL；步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与聚丙烯酸的质量比为1:(1～3)；

五、pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备：将步骤四得到的聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子和盐酸阿霉素共同溶解在PBS缓冲溶液中，在室温下以搅拌速度为400r/min～600r/min搅拌48h～72h，然后采用PBS缓冲液离心洗涤10～20次，冷冻干燥得到pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体；

步骤五中所述的步骤四得到的聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子与盐酸阿霉素的质量比为1:(0.5～3)；步骤五中所述的步骤四得到的聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子的质量与PBS缓冲溶液的体积比为1g:(4～15)mL。

本发明的有益效果：

本发明制备的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体，制备工艺简单，不仅具有pH响应性，而且药物负载量大和水溶性好，在药物投递领域具有广阔的应用前景。本发明的优点是：

1、本发明制备的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体通过静电作用将药物负载到载体上，药物负载量大，避免了多次重复给药，降低了载体在体内的毒副作用。

2、本发明制备的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体对pH具有良好的响应性，在pH刺激下实现定时、定量的释放药物分子，有效地提高了药物的利用率。

3、本发明制备的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体具有良好的水溶性和生物降解性，细胞毒性较小，降解产物能被人体完全吸收。

4、本发明操作简单，成本低廉，实用性强。

附图说明

图1为试验一中步骤一得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子的透射电镜图片；

图2为试验一得到的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的透射电镜图片；

图3为在不同pH刺激下试验一得到的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的pH响应性释放特性图；其中1为pH5.0，2为pH6.5，3为pH7.4；

图4为在pH刺激下试验一得到的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的“爆发式”释放行为特性图；其中a为pH调节为5.0时；

图5为试验一得到的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体对肝癌细胞靶向性的量化分析柱形图；其中a为没有载体的对照组，b为聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子，c为载有药物盐酸阿霉素的聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子；

图6为试验一得到的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体对人脐静脉内皮细胞靶向性的量化分析柱形图；其中a为没有载体的对照组，b为聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子，c为载有药物盐酸阿霉素的聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子；

图7为试验一得到的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体与肝癌细胞共培养6h后的共聚焦扫描电镜图；

图8为试验一得到的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体与肝癌细胞共培养12h后的共聚焦扫描电镜图；

图9为试验一得到的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体与肝癌细胞共培养24h后的共聚焦扫描电镜图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法具体是按以下步骤进行的：

一、F127-泛酸钙混合液的制备：将F127和泛酸钙单水合物溶解在去离子水中，在搅拌速度为250r/min～400r/min下搅拌至得到清晰乳状液，得到F127-泛酸钙混合液；

步骤一中所述的F127与泛酸钙单水合物的质量比为1:(5～10)；步骤一中所述的F127的质量与去离子水的体积比为1g:(20～80)mL；

二、介孔羟基磷灰石纳米粒子的制备：将K₂HPO₄·3H₂O溶解在去离子水中，得到K₂HPO₄溶液，然后用NH₃·H₂O调解K₂HPO₄溶液的pH值为10～14，再将pH值为10～14的K₂HPO₄溶液以滴加速度为1.0g/min～3.0g/min滴加到F127-泛酸钙混合液中，搅拌均匀后采用水浴回流的方式进行加热，控制水浴加热温度为80℃～100℃，回流时间为24h～48h，完成水浴回流反应，将水浴回流反应后的溶液过滤，收集白色沉淀物，将白色沉淀物在温度为80℃～150℃的真空条件下干燥12h～48h，得到干燥后的白色沉淀物，然后将干燥后的白色沉淀物在温度为200℃～300℃下预烧2h～6h，再在马弗炉中煅烧，控制煅烧温度为500℃～600℃，煅烧时间为6h～10h，得到介孔羟基磷灰石纳米粒子；

步骤二中所述的K₂HPO₄·3H₂O的质量与去离子水的体积比为1g:(6～15)mL；步骤二中所述的pH值为10～14的K₂HPO₄溶液中的K₂HPO₄·3H₂O的质量与F127-泛酸钙混合液中F127的质量比为(2～5):1；

三、介孔羟基磷灰石的氨基化：将步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子均匀分散在甲苯溶液中，在搅拌速度为300r/min～600r/min下搅拌10min～30min后，加入3-氨丙基三甲氧基硅烷，然后置于温度为60℃～80℃的水浴锅中回流24h～48h，离心冷冻干燥后得到氨基化的介孔磷灰石；

步骤三中所述的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与甲苯溶液的体积的比为1g:(50～100)mL；步骤三中所述的3-氨丙基三甲氧基硅烷与甲苯溶液的体积比为1:(25～80)；

四、聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子的制备：将步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石均匀分散在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，然后在室温下以搅拌速度为400r/min～600r/min搅拌2h～3h，得到氨基化的介孔磷灰石分散液，再将聚丙烯酸逐滴加入到氨基化的介孔磷灰石分散液中，然后在温度为120～160℃的条件下继续以搅拌速度为300r/min～500r/min搅拌4h～8h，离心干燥得到聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子；

步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石的质量与N,N-二甲基甲酰胺溶液的体积比为1g:(85～160)mL；步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与聚丙烯酸的质量比为1:(1～3)；

五、pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备：将步骤四得到的聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子和盐酸阿霉素共同溶解在PBS缓冲溶液中，在室温下以搅拌速度为400r/min～600r/min搅拌48h～72h，然后采用PBS缓冲液离心洗涤10～20次，冷冻干燥得到pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体；

步骤五中所述的步骤四得到的聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子与盐酸阿霉素的质量比为1:(0.5～3)；步骤五中所述的步骤四得到的聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子的质量与PBS缓冲溶液的体积比为1g:(4～15)mL。

本实施方式中步骤四中所述聚丙烯酸的分子量为3000。

本实施方式中所述PBS缓冲溶液的中文名称为磷酸缓冲盐溶液，其pH为5～7.4。

本实施方式步骤五中所述采用PBS缓冲液离心洗涤10～20次的目的是除去没有装载的药物。

本实施方式方式中F127的中文名称为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的F127与泛酸钙单水合物的质量比为2.26:18.43。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中所述的F127的质量与去离子水的体积比为2.26g:100mL。其他步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中在搅拌速度为350r/min下搅拌至得到清晰乳状液。其他步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二中所述的K₂HPO₄·3H₂O的质量与去离子水的体积比为5.16g:50mL。其他步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二中所述的pH值为10～14的K₂HPO₄溶液中的K₂HPO₄·3H₂O的质量与F127-泛酸钙混合液中F127的质量比为5.16:2.26。其他步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤二中将K₂HPO₄·3H₂O溶解在去离子水中，得到K₂HPO₄溶液，然后用NH₃·H₂O调解K₂HPO₄溶液的pH值为12。其他步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤二中再将pH值为10～14的K₂HPO₄溶液以滴加速度为2.0g/min滴加到F127-泛酸钙混合液中。其他步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤二中搅拌均匀后采用水浴回流的方式进行加热，控制水浴加热温度为90℃，回流时间为36h，完成水浴回流反应。其他步骤及参数与具体实施方式一至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤二中将白色沉淀物在温度为100℃的真空条件下干燥12h～48h，得到干燥后的白色沉淀物。其他步骤及参数与具体实施方式一至九之一相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是：步骤二中将干燥后的白色沉淀物在温度为250℃下预烧3h。其他步骤及参数与具体实施方式一至十之一相同。

具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至十一之一不同的是：步骤二中再在马弗炉中煅烧，控制煅烧温度为600℃，煅烧时间为8h，得到介孔羟基磷灰石纳米粒子。其他步骤及参数与具体实施方式一至十一之一相同。

具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是：步骤三中所述的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与甲苯溶液的体积的比为1.46g:100mL。其他步骤及参数与具体实施方式一至十二之一相同。

具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式一至十三之一不同的是：步骤三中所述的3-氨丙基三甲氧基硅烷与甲苯溶液的体积比为2.5:100。其他步骤及参数与具体实施方式一至十三之一相同。

具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式一至十四之一不同的是：步骤三中将步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子均匀分散在甲苯溶液中，在搅拌速度为500r/min下搅拌20min后，加入3-氨丙基三甲氧基硅烷。其他步骤及参数与具体实施方式一至十四之一相同。

具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式一至十五之一不同的是：步骤三中然后置于温度为60℃的水浴锅中回流36h。其他步骤及参数与具体实施方式一至十五之一相同。

具体实施方式十七本实施方式与具体实施方式一至十六之一不同的是：步骤三中所述的离心冷冻干燥参数为：离心速度为10000r/min，温度为-50℃，干燥时间为48h。其他步骤及参数与具体实施方式一至十六之一相同。

具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式一至十七之一不同的是：步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石的质量与N,N-二甲基甲酰胺溶液的体积比为1.1g:150mL。其他步骤及参数与具体实施方式一至十七之一相同。

具体实施方式十九：本实施方式与具体实施方式一至十八之一不同的是：步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与聚丙烯酸的质量比为1.1:1.8。其他步骤及参数与具体实施方式一至十八之一相同。

具体实施方式二十：本实施方式与具体实施方式一至十九之一不同的是：步骤四中在室温下以搅拌速度为500r/min搅拌2h，得到氨基化的介孔磷灰石分散液。其他步骤及参数与具体实施方式一至十九之一相同。

具体实施方式二十一：本实施方式与具体实施方式一至二十之一不同的是：步骤四中再将聚丙烯酸逐滴加入到氨基化的介孔磷灰石分散液中，然后在温度为140℃的条件下继续以搅拌速度为400r/min搅拌8h。其他步骤及参数与具体实施方式一至二十之一相同。

具体实施方式二十二：本实施方式与具体实施方式一至二十一之一不同的是：步骤五中所述的步骤四得到的聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子与盐酸阿霉素的质量比为2:3。其他步骤及参数与具体实施方式一至二十一之一相同。

具体实施方式二十三：本实施方式与具体实施方式一至二十二之一不同的是：步骤五中所述的步骤四得到的聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子的质量与PBS缓冲溶液的体积比为2g:13mL。其他步骤及参数与具体实施方式一至二十二之一相同。

具体实施方式二十四：本实施方式与具体实施方式一至二十三之一不同的是：步骤五中在室温下以搅拌速度为500r/min搅拌48h。其他步骤及参数与具体实施方式一至二十三之一相同。

通过以下试验验证本发明的有益效果

试验一：本试验的一种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法具体是按以下步骤进行的：

一、F127-泛酸钙混合液的制备：将2.26g F127和18.43g泛酸钙单水合物溶解在100mL去离子水中，在搅拌速度为300r/min下搅拌至得到清晰乳状液，得到F127-泛酸钙混合液；

二、介孔羟基磷灰石纳米粒子的制备：将5.16g K₂HPO₄·3H₂O溶解在50mL去离子水中，得到K₂HPO₄溶液，然后用NH₃·H₂O调解K₂HPO₄溶液的pH值为12，再将pH值为12的K₂HPO₄溶液以滴加速度为2.0g/min滴加到F127-泛酸钙混合液中，搅拌均匀后采用水浴回流的方式进行加热，控制水浴加热温度为80℃，回流时间为36h，完成水浴回流反应，将水浴回流反应后的溶液过滤，收集白色沉淀物，将白色沉淀物在温度为100℃的真空条件下干燥48h，得到干燥后的白色沉淀物，然后将干燥后的白色沉淀物在温度为250℃下预烧3h，再在马弗炉中煅烧，控制煅烧温度为600℃，煅烧时间为6h，得到介孔羟基磷灰石纳米粒子；

三、介孔羟基磷灰石的氨基化：将1.46g步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子均匀分散在100mL甲苯溶液中，在搅拌速度为500r/min下搅拌20min后，加入2.5mL 3-氨丙基三甲氧基硅烷，然后置于温度为80℃的水浴锅中回流36h，离心冷冻干燥后得到氨基化的介孔磷灰石；

四、聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子的制备：将1.1g步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石均匀分散在150mLN,N-二甲基甲酰胺溶液中，然后在室温下以搅拌速度为500r/min搅拌2h，得到氨基化的介孔磷灰石分散液，再将1.8g聚丙烯酸逐滴加入到氨基化的介孔磷灰石分散液中，然后在温度为140℃的条件下继续以搅拌速度为400r/min搅拌8h，离心干燥得到聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子；

五、pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备：将20mg步骤四得到的聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子和30mg盐酸阿霉素共同溶解在130mL PBS缓冲溶液中，在室温下以搅拌速度为500r/min搅拌48h，然后采用PBS缓冲液离心洗涤15次，冷冻干燥得到pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体。

本试验中步骤四中所述聚丙烯酸的分子量为3000。

本试验中所述PBS缓冲溶液的pH为7.4。

图1为试验一中步骤一得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子的透射电镜图片；图2为试验一得到的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的透射电镜图片；从图1中透射电镜图片能够清楚地看到制备的介孔羟基磷灰石纳米粒子的介孔孔道结构，从图2中透射电镜图片中介孔孔道呈现模糊的界限，证明聚丙烯酸分子已经接枝到了介孔磷灰石表面。

试验二：将三份3.0mg试验一得到的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体分别溶于10mL pH为7.4、10mL pH为6.5和10mL pH为5.0的PBS缓冲溶液中，将缓冲溶液分别转入到透析袋中(截留分子量8000)，并置于含有100mL的相应pH值的PBS缓冲溶液的培养皿内，在37℃下孵育24h。每隔1h各自取出1mL，用紫外分光光度计测定溶液在480nm处的吸光度，进一步计算释放药物的质量。

如图3所示，装载了盐酸阿霉素的聚丙烯酸-介孔磷灰石智能响应性体系在不同pH的缓冲溶液中，释放动力学是类似的。在正常的生理条件pH为7.4的缓冲溶液中，智能体系在24h后仅仅有大约有10.0％的药物被释放出来，证明该体系对药物有很好的包封效果。而在pH6.5和5.0的缓冲溶液中，在24h后有多达52％和73％的药物被释放出来。这是由于随着pH值的降低，连接在聚丙烯酸和抗癌药物盐酸阿霉素之间的静电力被破坏，导致药物释放出来。实验结果证明了本发明制备的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体具有pH响应性。

试验三：将3.0mg试验一得到的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体溶于10mL pH为7.4的PBS缓冲溶液中，而后，将该溶液全部转移到透析袋中(分子量为8000)，并置于含有100mL pH为7.4的PBS缓冲溶液的培养皿中，在37℃下孵育5h，之后调解上述溶液的pH为5.0，继续孵育24h。每隔1h取出1mL，用紫外分光光度计测定溶液在480nm处的吸光度，进一步计算释放药物的质量。

如图4所示，聚丙烯酸-介孔磷灰石智能响应体系在前5h，有大约8％的药物被释放；而在pH被调解为5.0后，在接下来的5h，药物的累积释放量达到了50％。这个现象说明聚丙烯酸-介孔磷灰石智能响应性体系在生理条件下，能有效的封装药物，但在酸性条件下，具有快速响应性，能“爆发式”释放药物。

试验四：将试验一得到的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体与肝癌细胞(HepG2)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养，利用MTT法测定细胞的活性。

苯试验通过研究装载有抗癌药物盐酸阿霉素的聚丙烯酸-介孔磷灰石智能响应性体系的细胞毒性，如图5和图6所示，当装载不同浓度的抗癌药物盐酸阿霉素的聚丙烯酸-介孔磷灰石智能响应性体系与肝癌细胞(HepG2)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养后，随着抗癌药物盐酸阿霉素浓度的增加，与装载有抗癌药物盐酸阿霉素的聚丙烯酸-介孔磷灰石共培养的肝癌细胞细胞活性逐渐降低，大部分细胞被杀死，因为在肝癌细胞内pH较低，聚丙烯酸-介孔磷灰石智能响应性体系在pH刺激下释放抗癌药物，导致细胞活性降低。而在正常的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，由于pH接近中性，聚丙烯酸-介孔磷灰石释放的抗癌药物较少，因此细胞活性较高。该结果表明，聚丙烯酸-介孔磷灰石智能体系对pH具有很好的相应性。

试验五：将试验一得到的pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体与肝癌细胞共培养，激光共聚焦扫描显微镜观察不同时间点细胞形态。

本试验通过研究装载有抗癌药物盐酸阿霉素的聚丙烯酸-介孔磷灰石智能响应性体系在共聚焦扫描电镜下的细胞形态，如图7、图8和图9所示，当装载有抗癌药物盐酸阿霉素的聚丙烯酸-介孔磷灰石智能响应性体系与肝癌细胞分别培养6h、12h和24h后，随着培养时间的增加，肝癌细胞出现不断细胞核内线粒体收缩，细胞核破裂，最终导致细胞死亡，这是因为肝癌细胞细胞内pH呈酸性，聚丙烯酸-介孔磷灰石智能响应性体系在pH刺激下释放抗癌药物，并杀死了癌细胞。这个结果证明了聚丙烯酸-介孔磷灰石是一种性能优异的pH响应性药物载体，能应用于癌症的临床治疗。

Claims (10)

1.一种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法具体是按以下步骤进行的：

一、F127-泛酸钙混合液的制备：将F127和泛酸钙单水合物溶解在去离子水中，在搅拌速度为250r/min～400r/min下搅拌至得到清晰乳状液，得到F127-泛酸钙混合液；

步骤一中所述的F127与泛酸钙单水合物的质量比为1:(5～10)；步骤一中所述的F127的质量与去离子水的体积比为1g:(20～80)mL；

二、介孔羟基磷灰石纳米粒子的制备：将K₂HPO₄·3H₂O溶解在去离子水中，得到K₂HPO₄溶液，然后用NH₃·H₂O调解K₂HPO₄溶液的pH值为10～14，再将pH值为10～14的K₂HPO₄溶液以滴加速度为1.0g/min～3.0g/min滴加到F127-泛酸钙混合液中，搅拌均匀后采用水浴回流的方式进行加热，控制水浴加热温度为80℃～100℃，回流时间为24h～48h，完成水浴回流反应，将水浴回流反应后的溶液过滤，收集白色沉淀物，将白色沉淀物在温度为80℃～150℃的真空条件下干燥12h～48h，得到干燥后的白色沉淀物，然后将干燥后的白色沉淀物在温度为200℃～300℃下预烧2h～6h，再在马弗炉中煅烧，控制煅烧温度为500℃～600℃，煅烧时间为6h～10h，得到介孔羟基磷灰石纳米粒子；

步骤二中所述的K₂HPO₄·3H₂O的质量与去离子水的体积比为1g:(6～15)mL；步骤二中所述的pH值为10～14的K₂HPO₄溶液中的K₂HPO₄·3H₂O的质量与F127-泛酸钙混合液中F127的质量比为(2～5):1；

三、介孔羟基磷灰石的氨基化：将步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子均匀分散在甲苯溶液中，在搅拌速度为300r/min～600r/min下搅拌10min～30min后，加入3-氨丙基三甲氧基硅烷，然后置于温度为60℃～80℃的水浴锅中回流24h～48h，离心冷冻干燥后得到氨基化的介孔磷灰石；

步骤三中所述的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与甲苯溶液的体积的比为1g:(50～100)mL；步骤三中所述的3-氨丙基三甲氧基硅烷与甲苯溶液的体积比为1:(25～80)；

四、聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子的制备：将步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石均匀分散在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，然后在室温下以搅拌速度为400r/min～600r/min搅拌2h～3h，得到氨基化的介孔磷灰石分散液，再将聚丙烯酸逐滴加入到氨基化的介孔磷灰石分散液中，然后在温度为120～160℃的条件下继续以搅拌速度为300r/min～500r/min搅拌4h～8h，离心干燥得到聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子；

步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石的质量与N,N-二甲基甲酰胺溶液的体积比为1g:(85～160)mL；步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与聚丙烯酸的质量比为1:(1～3)；

五、pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备：将步骤四得到的聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子和盐酸阿霉素共同溶解在PBS缓冲溶液中，在室温下以搅拌速度为400r/min～600r/min搅拌48h～72h，然后采用PBS缓冲液离心洗涤10～20次，冷冻干燥得到pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体；

步骤五中所述的步骤四得到的聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子与盐酸阿霉素的质量比为1:(0.5～3)；步骤五中所述的步骤四得到的聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子的质量与PBS缓冲溶液的体积比为1g:(4～15)mL。

2.根据权利要求1所述的一种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤一中所述的F127的质量与去离子水的体积比为2.26g:100mL。

3.根据权利要求1所述的一种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤二中所述的K₂HPO₄·3H₂O的质量与去离子水的体积比为5.16g:50mL。

4.根据权利要求1所述的一种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤二中将干燥后的白色沉淀物在温度为250℃下预烧3h。

5.根据权利要求1所述的一种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤三中所述的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与甲苯溶液的体积的比为1.46g:100mL。

6.根据权利要求1所述的一种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤三中所述的3-氨丙基三甲氧基硅烷与甲苯溶液的体积比为2.5:100。

7.根据权利要求1所述的一种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石的质量与N,N-二甲基甲酰胺溶液的体积比为1.1g:150mL。

8.根据权利要求1所述的一种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤四中所述的步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石与聚丙烯酸的质量比为1.1:1.8。

9.根据权利要求1所述的一种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤四中再将聚丙烯酸逐滴加入到氨基化的介孔磷灰石分散液中，然后在温度为140℃的条件下继续以搅拌速度为400r/min搅拌8h。

10.根据权利要求1所述的一种pH响应性核壳结构的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤五中所述的步骤四得到的聚丙烯酸-介孔磷灰石纳米粒子的质量与PBS缓冲溶液的体积比为2g:13mL。3 -->