CN107916259A - 一种青霉素酰化酶固定化载体及其制备方法 - Google Patents

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李轲
张霞云
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Abstract

本发明公开了一种青霉素酰化酶固定化载体及其制备方法，属于材料科学与工程领域，包括各个反应物质量比为TiO2：戊二醛：乙醇＝10：13:177。固定化PGA活力范围为11000‑14000U/g、对应游离酶负载量范围13000‑15000U/g、酶活回收率范围为80‑90％，重复使用12次后，其酶活保留率为60％。

Description

一种青霉素酰化酶固定化载体及其制备方法
技术领域
本发明属于材料科学与工程领域，涉及一种青霉素酰化酶固定化载体及其制备方法。
背景技术
固定化酶(Immobilized enzyme)是20世纪60年代发展起来的一种新技术。所谓固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。酶法生产6-氨基青霉素烷酸(6-Aminopenicillanic acid,6-APA)工艺的核心问题是高效固定化青霉素酰化酶(Penicillin G acylase,PGA)的制备技术，而载体材料的设计与制备是PGA固定化技术的关键所在。
因此，本专利结合各方面因素，制备出一种成本低廉，物理化学稳定性好及有机溶剂耐受性强的的酶固定化载体。
发明内容
本发明的目的在于合成一种酶的载体，通过对工艺条件的优化制备出酶活回收率高的固定化酶。
载体通过表面修饰，使其表面能够以化学键合的方式，通过共价键合固定化酶。提高固定化酶的分散性和稳定性。
一种青霉素酰化酶固定化载体，其特征在于，通过戊二醛对载体表面进行修饰，使戊二醛的醛基与TiO2表面的羟基通过缩醛反应结合在一起，而另一端的醛基则作为靶点，用于与PGA分子聚集体外表面的氨基通过希曼反应固定化PGA；该专利方法所制得的固定化PGA活力范围为11000-14000U/g、对应游离酶负载量范围13000-15000U/g、酶活回收率的范围为80-90％，重复使用12次后，其酶活保留率为60％。
一种本发明青霉素酰化酶固定化载体的制备方法，包括以下步骤：
)将TiO2在120℃活化24小时。
2)取体积比为1:10的戊二醛无水乙醇溶液，按固液比1:16的比例加入活化TiO2，恒温水浴机械搅拌24小时。产物冲洗至加入比例量的盐酸羟胺(残液：2％的HO-NH2.HCl＝5:1)，于50℃反应20分钟后，在238nm处的吸光度小于0.003，然后将产物过滤，置于室温下晾干即得到酶固定化载体。
2)固定化PGA
称取上述合成的载体，加入到反应器中，再加入60倍载体质量的1％(原酶溶液按体积比稀释至1％)的游离PGA酶液，密封，在25℃条件下避光震荡24小时；分离游离酶残液，固定化PGA用磷酸盐缓冲液冲洗，直到洗涤液中加入青霉素G，并用PDAB显色3min后，测的溶液的吸光度小于0.003为止；放入35℃真空烘箱干燥至恒重，得固定化PGA。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明合成了一种价格低廉，物理化学稳定性好、有机溶剂耐受性强和较便于分离回收的酶固定化载体。使得固定化酶热稳定性，pH稳定性，回收率以及重复使用性较游离酶都有较大的提高。
附图说明
图1是固定化PGA的流程图；
图2是载体制备的反应式；
图3是固定化PGA反应式。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1.改性TiO2的检测
反应结束后，将改性TiO2体系中的离心上清液用蒸馏水稀释910倍，取一定量的稀释液加0.2倍稀释液体积的浓度为2％的盐酸羟胺溶液，于50℃下反应20分钟后加入比色皿，以蒸馏水做参比，在波长238nm处测吸光度。并以加入到反应体系中的原始戊二醛作对照液，在不加TiO2的情况下，将原始戊二醛在相同条件下处理，以消除因戊二醛的自然氧化二产生的误差。戊二醛接枝率G按以下公式(1)计算：
其中C0为对照实验所得的戊二醛的浓度，C1为残液中戊二醛的浓度，V为反应体系的体积，m为二氧化钛质量。
2.青霉素酰化酶的固定化及酶活力、酶负载量、酶活回收率的测定
固定化称取上述合成的载体，加入到反应器中，再加入60倍载体质量的1％(原酶溶液按体积比稀释至1％)的游离PGA酶液，密封，在25℃条件下避光震荡24小时；分离游离酶残夜，固定化PGA用磷酸盐缓冲液冲洗，直到洗涤液中加入青霉素G，并用PDAB显色3min后，测的溶液的吸光度小于0.003为止；放入35℃真空烘箱干燥至恒重，得固定化PGA。
酶负载量将一定量1％(原酶溶液按体积比稀释至1％)的游离PGA酶液与8倍量的5％(wt％)的青霉素G钾反应5分钟，将反应液稀释20倍。取一定量稀释液，加入7倍稀释液体积的PDAB液显色3分钟后，通过PDAB显色法测定6-APA的含量根据式(2)，可求出av0。取一定量固定化酶残液与8倍量的5％(wt％)的青霉素G钾反应5分钟，将反应液稀释20倍。取一定量稀释液，加入7倍稀释液体积的PDAB液显色3分钟后，通过PDAB显色法测定6-APA的含量根据式(2)，可求出av。再依据式(3)计算酶负载量。
酶活力、酶活回收率的测定将固定化PGA与20倍量的5％(wt％)的青霉素G钾反应5分钟，将反应液稀释20倍。取一定量稀释液，加入7倍稀释液体积的PDAB液显色3分钟后，通过PDAB显色法测定6-APA的含量，依式(2)、(4)计算酶活力、酶活回收率。
式中，ag代表固定化PGA酶活力(U/g)，C代表6-APA浓度(mM)，V代表6-APA体积(mL)，m代表PGA质量(g)，t代表固定化PGA与底物反应时间，Ac代表酶负载量，av0代表原液酶活力(U/g)，av代表固定化残液酶活力(U/g)，Ar代表酶活回收率；V1代表用于固定化PGA的酶液体积。
实施例1
以反应温度为45℃,活化温度120℃,pH＝6,戊二醛：乙醇＝1：10，时间24小时条件下制备的载体固定化PGA，固定化酶活力为13260U/g、对应游离酶负载量为14956U/g、酶活回收率为88％。
实施例2
以反应温度为45℃,活化温度100℃,pH＝6,戊二醛：乙醇＝1：10，时间24小时条件下制备的载体固定化PGA，固定化酶活力为12722U/g、对应游离酶负载量为14876U/g、酶活回收率为85％。
实施例3
以反应温度为45℃,活化温度140℃,pH＝6,戊二醛：乙醇＝1：10，时间24小时条件下制备的载体固定化PGA，固定化酶活力为11129U/g、对应游离酶负载量为13903U/g、酶活回收率为80％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种青霉素酰化酶固定化载体，其特征在于，载体通过戊二醛对其表面进行修饰，戊二醛通过醛基与TiO2表面的羟基结合在一起，以另一端的醛基为靶点固定PGA；固定化PGA活力范围为11000-14000U/g、对应游离酶负载量范围13000-15000U/g、酶活回收率范围80-90％、重复使用12次后，其酶活保留率为60％。
2.根据权利要求1所述的青霉素酰化酶固定化载体，其特征在于，各个反应物质量比为TiO2：戊二醛：乙醇＝10：13:177；固定化青霉素酰化酶对应游离酶负载量为14956U、游离酶活力16939U/g、酶活回收率88％。
3.一种权利要求1所述青霉素酰化酶固定化载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、改性TiO2载体的制备；
1)将TiO2在120℃活化24小时；
2)固定化载体的合成：以各个反应物质量比为TiO2：戊二醛：乙醇＝10：13:177；称取戊二醛与无水乙醇的混合液，加入活化的TiO2，恒温水浴机械搅拌24h；产物冲洗干净，常温干燥至恒重，即得到酶固定化载体；
步骤2、固定化PGA
向上述合成的载体中，加入20倍载体质量的1％的游离PGA溶液，密封，超声分散均匀后，在25℃条件下避光震荡24小时；分离游离酶残液，固定化PGA用磷酸盐缓冲液冲洗，直到洗涤液中加入青霉素G，并用PDAB显色3min后，测的溶液的吸光度小于0.003为止；放入35℃真空烘箱干燥至恒重，得固定化PGA。
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