JP2020536508A - トランスアミナーゼ突然変異体及びその使用 - Google Patents

トランスアミナーゼ突然変異体及びその使用 Download PDF

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Abstract

トランスアミナーゼ突然変異体及びその使用を開示する。該トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列が突然変異したアミノ酸配列であり、突然変異したアミノ酸部位は、Ｆ８９、Ｋ１９３、Ｐ２４３、Ｖ２３４、Ｉ２６２、Ｑ２８０、Ｖ３７９、Ｒ４１６、Ａ４１７及びＣ４１８の中から選択される１つ又は複数である。上記の突然変異部位の少なくとも1つを有するトランスアミナーゼ突然変異体は、酵素活性及び／又は安定性が向上した。【選択図】なし

Description

本発明は、酵素工学分野に関し、具体的には、トランスアミナーゼ突然変異体及びその使用に関する。
酵素は、生物学的触媒として、生体内でその高い効率及び高い特異性の特徴を十分に発揮できる。しかしながら、工業用途では、一般的には、工業的生産条件に適応できないこと、及び非天然基質に対する触媒能力が低いなどの問題が存在する。部位特異的突然変異と飽和突然変異技術は酵素分子を改造する有効手段である。
部位特異的突然変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ又はｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）とは、標的ＤＮＡ断片の特定部位に特定の塩基対を取り入れる方法を指す。遺伝子の特定の部位のヌクレオチド配列を変えることによって、コードされたアミノ酸配列を変えることは、一般的に、ある1つ（いくつかの）アミノ酸残基によるタンパク質の構造及び機能に与える影響の研究に用いられる。酵素理論的設計には、部位特異的突然変異方法を用いると、触媒活性、基質特異性及び／又は安定性が向上した突然変異酵素がスクリーニングできる。
飽和突然変異とは、目的タンパク質をコードする遺伝子を改造し、短時間内で標的部位のアミノ酸がそれぞれ他の１９種のアミノ酸に置換された突然変異体を得る方法である。この方法は、タンパク質を指向改造するために強力なツールだけではなく、タンパク質の構造−機能関係を研究するための重要な手段である。飽和突然変異は、単一部位突然変異より理想的な進化体を得る場合が多い。部位特異的突然変異方法で解決できないこれらの問題は、ちょうど飽和突然変異方法が堪能で、飽和突然変異方法に特有の利点である。
ω−トランスアミナーゼ（ω−ＴＡ）は、トランスフェラーゼ類に属し、その他のトランスアミナーゼ類と同様に、１つのアミノ基とケトン基の交換過程を触媒するものである。ω−トランスアミナーゼは、ケトン系化合物を原料として、立体特異的なアミノ基転移作用により、キラルアミンを効率よく生産することができ、多くの研究者の注目や重視を集めている。
３−アミノピロリジン誘導体及びその光学異性体は、キラルアミン化合物であり、大量のキラル医薬品又は農業化学品を合成する重要な中間体である。（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピロリジンは光学活性を有する重要な３−アミノピロリジン誘導体である。Ｊ．Ｍ．Ｃ１９９２，３５，１７６４に報告された様に、（Ｒ）−１−ベンジル−３−ピロリジノールを出発原料として、５階段反応で（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピロリジンを製造し、そのｅｅ値は、９６％であり、合成経路は、以下の通りである。
該合成経路は、出発原料の価格が高く、且つ合成プロセスに有害な試薬であるアジド化ナトリウムが使用されるため、操作装置及び、作業員の安全、廃液・廃ガス・固形廃棄物処理などに対する要求が高く、環境の汚染が深刻である。しかし、今まで報告されたバイオ酵素によりキラル（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピロリジンを不斉合成する方法が非常に少ない。
現在、トランスアミナーゼを生物学的触媒としてケトン基質をワンステップで還元して、高い光学純度の（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピロリジンが製造できる報告がある。従来の化学方法に比べて、生物学的変換法は、反応条件が温和で、強酸化剤、強還元剤及び危険な試薬の使用を回避可能で、条件が温和であり、環境汚染が低い。
しかしながら、工業生産における該生物学的変換法の適用には、さらに解決する必要があるいくつかの問題が存在し、該方法では、酵素の触媒活性が十分に効率的ではなく、その反応系の総体積が４０−６０ｍｌ／ｇ基質であり、反応系の体積が大きく、生産バッチと生産コストの増加を招いてしまうとともに、後処理過程において有機溶剤の使用量が大きくなり、反応後処理の難度が高くなり、環境に大きな負荷をもたらしてしまう。また、従来技術では、Ｄ−アラニン又はＬ−アラニン又はそれらの塩をアミノドナーとする場合が多く、反応系にさらにグルコースとＧＤＨ、及び/又は蟻酸アンモニウムとＦＤＨなどのカップリングコエンザイム系を加える必要がある。
従って、トランスアミナーゼの触媒特性を向上させ、反応系の総体積を減少させ、生産コストを削減させ、環境汚染を低減させるために、従来の生物学的変換法を改良する必要がある。
本発明は、触媒活性を向上させるために、トランスアミナーゼ突然変異体及びその使用を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本願の第１態様によれば、トランスアミナーゼ突然変異体を提供し、トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に示される配列が突然変異したアミノ酸配列であり、突然変異したアミノ酸部位は、Ｆ８９、Ｋ１９３、Ｐ２４３、Ｖ２３４、Ｉ２６２、Ｑ２８０、Ｖ３７９、Ｒ４１６、Ａ４１７及びＣ４１８の中から選択される１つ又は複数である。
さらに、突然変異したアミノ酸部位に発生した突然変異は、Ｐ２４３Ｅ、Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｋ１９３Ｅ、Ｖ２３４Ｉ、Ｉ２６２Ｖ、Ｑ２８０Ｋ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ、Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ、Ａ４１７Ｓ及びＣ４１８Ａ／Ｑ／Ｓのうちのいずれか１種又は複数種を含み、ここでは、「／」は「又は」を示す。
さらに、突然変異は、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ａ４１７Ｓ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｐ２４３Ｅ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｋ１９３Ｅ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｖ２３４Ｉ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｉ２６２Ｖ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｑ２８０Ｋ、Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ａ４１７Ｓ、Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ、Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ａ４１７Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ａ４１７Ｓ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｋ１９３Ｅ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｖ２３４Ｉ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｐ２４３Ｅ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ２６２Ｖ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ａ４１７Ｓ＋Ｑ２８０Ｋ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｑ２８０Ｋ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ＋Ｑ２８０Ｋ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ＋Ｑ２８０Ｋ＋Ｉ２６２Ｖ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ＋Ｑ２８０Ｋ＋Ａ４１７Ｓ及びＶ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ＋Ｑ２８０Ｋ＋Ｉ２６２Ｖ＋Ｖ２３４Ｉという組み合わせのうちのいずれか１つを含む。
上記目的を達成するために、本願の第２態様によれば、上記いずれか１種のトランスアミナーゼ突然変異体をコードするＤＮＡ分子を提供する。
本願の第３態様によれば、上記ＤＮＡ分子が接続されている組換えプラスミドを提供する。
さらに、組換えプラスミドは、ｐＥＴ−２１ｂ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−３ａ（＋）、ｐＥＴ−３ｄ（＋）、ｐＥＴ−１１ａ（＋）、ｐＥＴ−１２ａ（＋）、ｐＥＴ−１４ｂ（＋）、ｐＥＴ−１５ｂ（＋）、ｐＥＴ−１６ｂ（＋）、ｐＥＴ−１７ｂ（＋）、ｐＥＴ−１９ｂ（＋）、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａ（＋）、ｐＥＴ−２３ａ（＋）、ｐＥＴ−２３ｂ（＋）、ｐＥＴ−２４ａ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａ（＋）、ｐＥＴ−２９ａ（＋）、ｐＥＴ−３０ａ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａ（＋）、ｐＥＴ−３５ｂ（＋）、ｐＥＴ−３８ｂ（＋）、ｐＥＴ−３９ｂ（＋）、ｐＥＴ−４０ｂ（＋）、ｐＥＴ−４１ａ（＋）、ｐＥＴ−４１ｂ（＋）、ｐＥＴ−４２ａ（＋）、ｐＥＴ−４３ａ（＋）、ｐＥＴ−４３ｂ（＋）、ｐＥＴ−４４ａ（＋）、ｐＥＴ−４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ−Ａ、ｐＲＳＥＴ−Ｂ、ｐＲＳＥＴ−Ｃ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−６ｐ−１、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２−１８、ｐＵＣ−１８又はｐＵＣ−１９である。
本願の第４態様によれば、上記いずれか１種の組換えプラスミドを含有する宿主細胞を提供する。
さらに、宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり、好ましくは、真核細胞は、酵母細胞であり、好ましくは、宿主細胞は、形質転換受容性細胞であり、さらに好ましくは、形質転換受容性細胞は、大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌Ｗ３１１０である。
本願の第４態様によれば、上記いずれか１種のトランスアミナーゼ突然変異体であるトランスアミナーゼでケトン系化合物及びアミノドナーに対してアミノ基転移反応を触媒するステップを含むキラルアミンの生産方法を提供する。
さらに、ケトン系化合物は、
であり、ここでは、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立してＣ１〜Ｃ８アルキル基、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基であり、又はＲ１とＲ２とは、カルボニル基上の炭素と共にＣ５〜Ｃ１０複素環式基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環式基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基を形成し、Ｃ５〜Ｃ１０複素環式基及びＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基のヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄の中から選択される少なくとも１種であり、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基のうちのアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基のうちのヘテロアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環式基のうちの炭素環式基又はＣ５〜Ｃ１０複素環式基のうちの複素環式基は、それぞれ独立して置換されていないか又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つの基によって置換されており、好ましくは、ケトン系化合物は、
であり、アミノ基転移反応生成物は、
であり、好ましくは、アミノドナーは、イソプロピルアミン又はイソプロピルアミンの塩である。
本発明の技術案を用いると、部位特異的突然変異及び／又は飽和突然変異の方法でω−トランスアミナーゼを改良し、高い触媒効率及び／又は高い安定性のω−トランスアミナーゼ突然変異体を取得する。本願で得られた一部のω−トランスアミナーゼ突然変異体は、（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノ複素環式化合物（特に（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピロリジン及び（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノアミノピペリジン）の合成には、酵素の使用量が０．３ｗｔ〜０．５ｗｔに低下し、反応体積が１０Ｖ−２０Ｖに低下し、このため、酵素の利用率及び反応ケトルの利用率を大幅に向上させ、酵素液の生産バッチ及び材料の使用量を減少させ、後処理における有機溶剤の使用量を効果的に減少させ、後処理の難度及び廃液・廃ガス・固形廃棄物の排出量を低減させ、人件費を削減させる。また、得られた高い光学純度の（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピロリジンと（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピペリジンによって、該化合物の工業的生産コストを大幅に削減させ、工業生産における該酵素の応用価値を高める。
なお、衝突しない限り、本願の実施例及び実施例の特徴は、相互に組み合わせることができる。以下、実施例を参照しながら、本発明を詳細に説明する。
名称の解釈
触媒活性：単位時間あたり単位容量（又は質量）の触媒が原料反応物を転化する量である。本発明においては、トランスアミナーゼの触媒活性の大きさは、本発明の前記反応原料の転化率と正相関を示す。
進化：突然変異又は組換えなどの手段で分子の多様性を構築し、次にこの多様性をスクリーニングし、新しい機能を有する遺伝子又はＤＮＡを取得する。本発明においては、突然変異又は組換えなどの手段で野生型トランスアミナーゼを改造して、性能が向上したトランスアミナーゼを取得する。
野生型：自然から取得され、人為的に突然変異誘発又は改造されていないものである。本発明においては、野生型ω−トランスアミナーゼは、Ｇｅｎｅｂａｎｋからスクリーニングした、人為的に改造されていない天然遺伝子配列でコードされるトランスアミナーゼである。
固定化酵素：一定の空間内でその触媒作用を発揮し、且つ繰り返し連続的に使用可能な酵素である。一般的には、酵素触媒反応がすべて水溶液で行われるが、固定化酵素は、水溶性酵素を物理的又は化学的方法で処理して、水に不溶性であるが、酵素活性を有する状態にされたものである。酵素の固定化後、一般的に安定性が向上し、反応系から分離されやすくなり、制御しやすくなり、複数回使用でき、輸送・貯蔵も容易であり、自動化生産に有利であるが、活性は低減し、使用範囲は縮小する。
固定化細胞：固定化酵素に基づいて発展してきた、細胞の酵素と代謝生成物を取得するための方法である。固定化細胞は、不溶性担体に固定され、一定の空間内で生命活動を行う細胞である。固定化細胞が正常に成長、繁殖及び代謝できるため、固定化生細胞又は固定化増殖細胞とも呼ばれる。
本発明に係る１ｗｔとは、いずれも主原料１ｇの転化にトランスアミナーゼ突然変異体の組換え湿細胞１ｇを必要とすることを意味する。
本発明に係る１Ｖは、反応系の体積／基質の質量に等しい。
部位特異的突然変異及び／又は飽和突然変異の方法でトランスアミナーゼを改造することで、その触媒活性、基質特異性及び／又は安定性を向上させると、酵素液の使用量が大きく、反応系が大きく、生産コストが高いなどの従来技術の問題の解決に寄与する。本発明の主な目的は、酵素分子改造方法でω−トランスアミナーゼを改良して、高い触媒効率及び／又は高い安定性のω−トランスアミナーゼ突然変異体を取得し、それによって、従来技術の不備を解決し、工業生産における応用価値を高めることである。
本発明は、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）に由来の野生型ω−トランスアミナーゼ遺伝子を出発遺伝子とする。該野生型遺伝子によってコードされるトランスアミナーゼ（配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する）そのものの活性が高いため、３ｗｔ野生型トランスアミナーゼ菌泥を用いると、反応の転化がほとんど完了できる。しかし、該触媒活性が高い野生型のトランスアミナーゼに対して酵素分子進化改造を行い、触媒活性がさらに向上したトランスアミナーゼを取得することは、困難である。従って、本発明は、下記の触媒活性及び／又は安定性が向上したω−トランスアミナーゼ突然変異体を取得するには、３６個の部位の部位特異的突然変異を行い、飽和突然変異によって１５００個の突然変異菌株をスクリーニングしている。
ω−トランスアミナーゼ突然変異体触媒の活性及び／又は安定性を向上させる突然変異したアミノ酸部位は、Ｆ８９、Ｋ１９３、Ｐ２４３、Ｖ２３４、Ｉ２６２、Ｑ２８０、Ｖ３７９、Ｒ４１６、Ａ４１７及びＣ４１８の中から選択される１つ又は複数である。ここでは、触媒活性を向上させる部位は、Ｆ８９、Ｋ１９３、Ｐ２４３、Ｖ２３４、Ｉ２６２、Ｑ２８０、Ｖ３７９、Ｒ４１６、Ａ４１７及びＣ４１８から選択され、これらの部位は、酵素触媒の中心の近傍に位置し、基質の導入又は結合に繋がる可能性がある。
上記トランスアミナーゼに対して、配列番号１を基礎配列として、遺伝子工学手段で改造して得た単一又は複数のアミノ酸残基が変化した突然変異体は、触媒活性及び／又は安定性が顕著に向上している。
上記部位が突然変異した上に、発明者は、これらの部位を異なるアミノ酸に突然変異してそのトランスアミナーゼ活性の変化を検出したところ、これらのアミノ酸部位の突然変異が以下のいずれか１種又は数種の組み合わせである場合、トランスアミナーゼの活性及び／又は安定性がさらに向上することを見出した。突然変異は、Ｐ２４３Ｅ、Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｋ１９３Ｅ、Ｖ２３４Ｉ、Ｉ２６２Ｖ、Ｑ２８０Ｋ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ、Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ、Ａ４１７Ｓ及びＣ４１８Ａ／Ｑ／Ｓのうちの任意の１つ又は複数を含み、ここでは、「／」は「又は」を示す。
本発明者は、触媒活性及び／又は安定性に対して有益な作用を有するこれらの上記部位に対して多部位の組合せ突然変異を行い、指向スクリーニングの方法によって触媒特性がさらに向上したω−トランスアミナーゼ突然変異体を取得し、該突然変異体は、野生型ω−トランスアミナーゼに比べて触媒活性及び／又は安定性が顕著に向上している。
より好適な実施例では、上記突然変異は、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ａ４１７Ｓ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｐ２４３Ｅ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｋ１９３Ｅ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｖ２３４Ｉ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｉ２６２Ｖ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｑ２８０Ｋ、Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ａ４１７Ｓ、Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ、Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ａ４１７Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ａ４１７Ｓ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｋ１９３Ｅ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｖ２３４Ｉ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｐ２４３Ｅ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ２６２Ｖ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ａ４１７Ｓ＋Ｑ２８０Ｋ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｑ２８０Ｋ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ＋Ｑ２８０Ｋ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ＋Ｑ２８０Ｋ＋Ｉ２６２Ｖ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ＋Ｑ２８０Ｋ＋Ａ４１７Ｓ及びＶ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ＋Ｑ２８０Ｋ＋Ｉ２６２Ｖ＋Ｖ２３４Ｉという組み合わせのうちのいずれか１つを含むが、これらに限られない。
上記突然変異体及びその組み合わせのスクリーニング過程は、具体的には、以下の通りである。
３６対の部位特異的突然変異プライマーを用いて３６個の部位に対して部位特異的突然変異を行う（Ｆ２２Ｖ、Ｆ２２Ａ、Ｆ２２Ｌ、Ｌ５９Ｖ、Ｌ５９Ａ、Ｗ６０Ｆ、Ｃ６１Ｓ、Ｃ６１Ａ、Ｆ８８Ｖ、Ｆ８９Ｗ、Ｆ８９Ｙ、Ｙ１５３Ｆ、Ｙ１５３Ｍ、Ｙ１５３Ｖ、Ａ２３１Ｇ、Ｒ４１６Ｋ、Ｒ４１６Ｃ、Ｒ４１６Ａ、Ａ４１７Ｈ、Ｃ４１８Ｑ、Ｆ３２０Ｖ、Ｐ９４Ｅ、Ｓ１０１Ｋ、Ｐ２４３Ｅ、Ｑ２８０Ｋ、Ｑ３４６Ｓ、Ｐ３５４Ａ、Ｆ３９７Ａ、Ｗ６０Ｌ、Ｔ８７Ａ、Ｖ２３４Ｍ、Ｖ２３４Ｉ、Ｉ２６２Ｖ、Ｔ３２１Ａ、Ｖ３７９Ｌ、Ｖ３７９Ｍ）。また、９つの飽和突然変異プライマーを用いて９つの部位に対して飽和突然変異を行う（Ｗ６０、Ｔ３２１、Ｖ３７９、Ｆ８９、Ｙ１５３、Ａ２３１、Ｙ３２２、Ｒ４１６、Ａ４１７、Ｃ４１８）。ここでは、部位特異的突然変異プライマーは、Ｑｕｉｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎウェブページで設計されたプライマー配列を本実験に用い、飽和突然変異プライマー配列は以下の表１に示された。全プラスミドＰＣＲによって完全な線形フラグメントを取得し、上記ＰＣＲ産物をＤｐｎＩで消化して出発遺伝子の母本のテンプレートを除去した後に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転化し、形質転化したものを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢシャーレにコーティングし、３７℃で一晩培養する。部位特異的突然変異には、遺伝子配列決定を使用して突然変異部位を特定し、飽和突然変異には、ハイスループットスクリーニングした後に、遺伝子配列決定を行って突然変異部位を特定する。
（一）下記方法によってハイスループットスクリーニングを行う。
１、９６ウェルプレート誘導発現：モノクローナルを選択して１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃でＯＤ６００＝０．６になるまで振とう培養し、最終濃度が０．２ｍＭになるまでＩＰＴＧを加え、２５℃で一晩誘導発現する。
２、酵素液の調製方法：９６ウェルプレートを遠心して上清培地を除去し、各ウェルに２００μｌの酵素分解溶液（リゾチーム２ｍｇ／ｍＬ、ポリミキシン１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ＝７．０）を加え、３７℃で２ｈ保温しながら破砕する。酵素分解後の細胞破砕液を４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心し、粗酵素液として上清を得る。
３、表２に示される体系に従って、マイクロプレートリーダーで活性の一次スクリーニングを行う。
以上の表２に示される体系の酵素液以外の他の成分を９６浅いウェルプレートに均一に混合し、４３０ｎｍでバックグラウンド検出を行い、次に、各ウェルに９６μＬの製造済みの突然変異体酵素液をそれぞれ加えた直後に、混合系を４０℃、２００ｒｐｍのシェーカーに置いて反応させ、３０〜４０ｍｉｎ後に、マイクロプレートリーダーでＯＤ４３０の吸光値変化を検出する。
酵素活性の計算式：酵素活性（ｕ／ｍＬ）＝（ΔＡ×６０×Ｖ１）／（６．２２×ｔ×Ｖ２）
ΔＡ：反応プロセス中の吸光光度値の変化量、
Ｖ１：反応系の総体積、
６．２２：消光係数、
ｔ：ΔＡの検出時間、
Ｖ２：加える酵素液の体積。
野生型トランスアミナーゼの酵素活性と比較することで、活性が高い突然変異株をスクリーニングし、二次スクリーニング及び遺伝子配列決定を行う。
（二）トランスアミナーゼ突然変異体の２次スクリーニング
上記の一次スクリーニングによる酵素の活性が野生型トランスアミナーゼより高い突然変異体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５００ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃でＯＤ６００＝０．６になるまで振とう培養し、最終濃度が０．２ｍＭになるまでＩＰＴＧを加え、２５℃で誘導発現を行う。１６ｈ誘導した後に、６０００ｇを１０ｍｉｎ遠心して菌体を収集する。菌体に対して超音波破砕機（ＪＹ９２−２Ｄ、寧波新芝生物科技株式会社製）で細胞を破砕し、４℃で、１００００ｇを２０ｍｉｎ遠心して上清液を取得して、活性検出に用いる。
（１）Ｎ−Ｃｂｚ−３−ピロリドンを基質としてトランスアミナーゼ突然変異体の反応活性をテストする。以下の体系を用いる。
Ｎ−Ｃｂｚ−３−ピロリドン基質０．２ｇをＤＭＳＯ ０．５ｍｌに溶解して均一に混合し、４．３Ｍのイソプロピルアミンの塩酸塩１．２５ｍｌ、０．０１ｇ／ｍｌのＰＬＰ ０．２ｍｌ、組換え粗酵素０．３〜３ｗｔを加え、ｐＨ７．０の１００ｍＭのリン酸塩緩衝液を用いて反応系を２０〜３０Ｖに補完し、ｐＨを７．０に調整し、３０℃の恒温でシェーカーに２００ｒｐｍで反応させる。３ｈ、１６ｈに２００μＬの体系を取り、４００μＬのメタノールを加えて均一に混合し、１２０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清液２００μＬにメタノール８００μＬを加えて均一に混合し、ＨＰＬＣにより転化率を検出する。触媒活性が向上した突然変異体を決定する。
一部の検出結果は表３に示される。
表３からわかるように、トランスアミナーゼは、反応速度が速く、３ｈと一晩１６ｈとの転化効果がほぼ同じ、転化率の差が１０％以下であり、しかし、サンプリング操作の便利のため、その後、実験には、一晩反応を用いる。本発明の一部のω−トランスアミナーゼ突然変異体は、（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノ複素環式化合物（特に（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピロリジン）の合成には、酵素の使用量がさらに０．３−０．５ｗｔに低下し、反応体積が２０Ｖであり、得られた（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピロリジンのｅｅ値が９９％より大きく、これにより、酵素の利用率を大幅に向上させ、該化合物の工業生産コストを大幅に削減させる。
また、（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピペリジンの合成反応条件及び一部の反応結果は表４に示される。
表４からわかるように、本発明の一部のω−トランスアミナーゼ突然変異体は、（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピペリジン合成には、酵素の使用量が０．５ｗｔに低下し、反応体積が１０Ｖに低下し、転化率が８％〜３０％向上し、ｅｅ値＞９８％である。これにより、酵素と反応釜の利用率を大幅に向上させ、酵素液の生産バッチ及び材料の使用量を効果的に減少させ、生産コストを削減させる。
（２）Ｎ−Ｃｂｚ−３−ピロリドンを基質としてトランスアミナーゼ突然変異体の耐性をテストする。以下の体系を用いる。
Ｎ−Ｃｂｚ−３−ピロリドン基質０．２ｇをＤＭＳＯ０．５ｍｌに溶解して均一に混合し、４．３Ｍのイソプロピルアミンの塩酸塩１．２５ｍｌ、０．０１ｇ／ｍｌのＰＬＰ ０．２ｍｌ、３０℃で、ｐＨ９．５の５０％のＤＭＳＯで１ｈ処理した組換え粗酵素０．５〜２ｗｔを加え、１００ｍＭのＮａＨＣＯ３を用いて反応系を２０〜３０Ｖに補完し、ｐＨを７．０に調整し、３０℃の恒温でシェーカーにおいて２００ｒｐｍで一晩反応させる。１６ｈ後に、体系２００μＬを取り、メタノール４００μＬを加えて均一に混合し、１２０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清液２００μＬにメタノール８００μＬを加えて均一に混合し、ＨＰＬＣにより転化率を検出する。安定性が向上した突然変異体を決定する。一部の結果は表５に示される。
酵素は、高温、強酸、強アルカリ、有機溶剤などの極端条件に長時間晒されると、活性を失ってしまい、残留酵素活性は、高温、強酸、強アルカリ又は有機溶剤などの環境下で活性を維持する酵素の総活性である。相対残留活性は、高温、アルカリ性、有機溶剤などの極端条件で適切に処理された酵素液を測定した酵素活性と、極端環境で処理されていない酵素液の最適条件での酵素活性との百分率である。同一の処理条件において、相対残留活性が高ければ高いほど、この条件での該酵素の安定性が高い。
表５からわかるように、同じ極端条件において、突然変異体の相対残留活性は、野生型トランスアミナーゼより２倍〜３倍高い。従って、本発明で得られたω−トランスアミナーゼ突然変異体の安定性が大幅に向上し、それにより、後続の固定化及び連続流反応のために良好な条件を提供する。
以上からわかるように、本発明で指向スクリーニングの方法により取得されたω−トランスアミナーゼ突然変異体は、触媒活性及び／又は安定性が大幅に向上し、それにより、アミノ基転移反応、特に安いイソプロピルアミンをアミノドナーとして、（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピペリジンと（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピロリジンを触媒合成する反応に用いると、酵素使用量を低減させ、反応系を減少させる。
本発明の第２典型的な実施形態では、上記いずれか１種のω−トランスアミナーゼ突然変異体をコードするＤＮＡ分子を提供する。コードされる上記トランスアミナーゼ突然変異体は、触媒活性及び／又は安定性が顕著に向上するという利点を有する。
本発明の第３典型的な実施形態では、上記ＤＮＡ分子が接続されている組換えプラスミドを提供する。
上記組換えプラスミドとして、上記のトランスアミナーゼ突然変異体を発現できるＤＮＡ分子の任意の組換えプラスミドは、本発明に適用できる。本発明の好適な実施例では、組換えプラスミドは、ｐＥＴ−２１ｂ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−３ａ（＋）、ｐＥＴ−３ｄ（＋）、ｐＥＴ−１１ａ（＋）、ｐＥＴ−１２ａ（＋）、ｐＥＴ−１４ｂ（＋）、ｐＥＴ−１５ｂ（＋）、ｐＥＴ−１６ｂ（＋）、ｐＥＴ−１７ｂ（＋）、ｐＥＴ−１９ｂ（＋）、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａ（＋）、ｐＥＴ−２３ａ（＋）、ｐＥＴ−２３ｂ（＋）、ｐＥＴ−２４ａ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａ（＋）、ｐＥＴ−２９ａ（＋）、ｐＥＴ−３０ａ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａ（＋）、ｐＥＴ−３５ｂ（＋）、ｐＥＴ−３８ｂ（＋）、ｐＥＴ−３９ｂ（＋）、ｐＥＴ−４０ｂ（＋）、ｐＥＴ−４１ａ（＋）、ｐＥＴ−４１ｂ（＋）、ｐＥＴ−４２ａ（＋）、ｐＥＴ−４３ａ（＋）、ｐＥＴ−４３ｂ（＋）、ｐＥＴ−４４ａ（＋）、ｐＥＴ−４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ−Ａ、ｐＲＳＥＴ−Ｂ、ｐＲＳＥＴ−Ｃ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−６ｐ−１、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２−１８、ｐＵＣ−１８又はｐＵＣ−１９の中から選択される１つである。
本発明の第４典型的な実施形態では、上記いずれか１種の組換えプラスミドを含有する宿主細胞を提供する。具体的な宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり、好ましくは、真核細胞は、酵母細胞である。より好ましくは、上記宿主細胞は、形質転換受容性細胞であり、さらに好ましくは、形質転換受容性細胞は、大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌Ｗ３１１０である。
本発明の第５典型的な実施形態では、上記いずれか１種のトランスアミナーゼ突然変異体であるトランスアミナーゼを用いてケトン系化合物及びアミノドナーに対してアミノ基転移反応を触媒するステップを含むキラルアミンの生産方法を提供する。
ケトン系化合物は、
であり、ここでは、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立してＣ１〜Ｃ８アルキル基、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基であり、又はＲ１とＲ２とはカルボニル基上の炭素と共にＣ５〜Ｃ１０複素環式基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環式基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基を形成し、Ｃ５〜Ｃ１０複素環式基及びＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基のヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄の中から選択される少なくとも１種であり、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基のうちのアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基のうちのヘテロアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環式基のうちの炭素環式基又はＣ５〜Ｃ１０複素環式基のうちの複素環式基は、それぞれ独立して置換されていないか又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つの基によって置換されており、好ましくは、ケトン系化合物は、
であり、アミノ基転移反応生成物は、
であり、好ましくは、アミノドナーは、イソプロピルアミン又はイソプロピルアミンの塩である。
触媒活性及び／又は安定性が顕著に向上したこれらのトランスアミナーゼ突然変異体を用いると、（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノ複素環式化合物の合成中の酵素の使用量と反応体積を大幅に低減させ、生産バッチと生成コストを大幅に減少させ、工業生産における該酵素の応用価値を高める。本発明は、安いアミノドナー（例えばイソプロピルアミン及びその塩酸塩）を用いて反応させ、反応中にカプリングコエンザイム系を必要とせず、このため、反応材料の種類が少なく、操作がシンプルである。
本発明の上記トランスアミナーゼ突然変異作を触媒として（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピロリジン又は（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピペリジンなどの（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノ複素環式化合物を製造するプロセスでは、酵素の触媒活性及び／又は安定性が顕著に向上するため、酵素の使用量が顕著に低減し、反応体積が１０−２０ｍｌ／ｇの基質に減少し、従来技術の反応体積より遥かに小さい。以上により、上記反応の温度、時間及びｐＨ値は、従来の反応条件下で合理的に調整して最適化して得ることができる。本願の好適な反応条件を用いると、反応効率が高い。
以下、下記非制限的実施例によって本発明をさらに説明し、当業者にとっては、本発明の精神から逸脱することなく、本発明に対して多くの修正が可能であることが周知であり、このような修正も本発明の範囲に属する。
下記実験方法は、特に断らない限り、いずれも従来の方法であり、用いられた実験材は、特に断らない限り、いずれも商業会社から容易に入手できる。
実施例１
Ｑｕｉｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎウェブページで設計された３６対の部位特異的突然変異プライマー及び表１に示される９つの飽和突然変異プライマーを用い、全プラスミドＰＣＲによって完全な線形フラグメントを取得し、上記のＰＣＲ産物をＤｐｎＩで消化して出発遺伝子の母本のテンプレートを除去した後に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転化し、形質転化したものを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢシャーレにコーティングし、３７℃で一晩培養した。飽和突然変異をハイスループットスクリーニングした。具体的には、上記突然変異体に対して以下の方法によりハイスループットスクリーニングを行った。
（１）９６ウェルプレート誘導発現：モノクローナルを選択して１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃でＯＤ６００＝０．６になるまで振とう培養し、最終濃度が０．２ｍＭになるまでＩＰＴＧを加え、２５℃で一晩誘導発現した。
（２）酵素液の調製方法：９６ウェルプレートを遠心して上清培地を除去し、各ウェルに２００μｌの酵素分解溶液（リゾチーム２ｍｇ／ｍＬ、ポリミキシン１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０）を加え、３７℃で２ｈ保温しながら破砕した。酵素分解後の細胞破砕液を４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心して、粗酵素液として上清を得た。
実施例２：Ｎ−Ｃｂｚ−３−ピロリドン基質に対するトランスアミナーゼ突然変異体の活性のテスト
酵素活性が野生型トランスアミナーゼより高い上記突然変異体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５００ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃でＯＤ６００＝０．６になるまで振とう培養し、最終濃度が０．２ｍＭになるまでＩＰＴＧを加え、２５℃で誘導発現を行った。１６ｈ誘導した後に、６０００ｇのものを１０ｍｉｎ遠心して菌体を収集した。菌体に対して超音波破砕機（ＪＹ９２−２Ｄ、寧波新芝生物科技株式会社製）で細胞を破砕し、４℃で、１００００ｇを２０ｍｉｎ遠心して上清液を取得して、活性検出に用いた。
Ｎ−Ｃｂｚ−３−ピロリドン基質０．２ｇをＤＭＳＯ ０．５ｍｌに溶解して均一に混合し、４．３Ｍのイソプロピルアミンの塩酸塩１．２５ｍｌ、０．０１ｇ／ｍｌのＰＬＰ ０．２ｍｌ、組換え粗酵素０．３〜２ｗｔを加え、ｐＨ７．０の１００ｍＭのリン酸塩緩衝液で反応系を２０〜３０Ｖに補完し、ｐＨを７．０に調整し、３０℃の恒温でシェーカーにおいて２００ｒｐｍで一晩反応させた。１６ｈ後に、体系２００μＬを取り、メタノール４００μＬを加えて均一に混合し、１２０００ｒｐｍで３分間遠心して、ＨＰＬＣにより上清液について転化率を検出した。触媒活性が向上した突然変異体を決定した。
触媒活性が向上した突然変異体結果は表６に示される。
「１」は、３ｗｔのケトレダクターゼの粗酵素で、反応系が３０Ｖである場合に、１６ｈの転化率は＞９３％であることを示し、「＋」は、１ｗｔのケトレダクターゼの粗酵素で、反応系が３０Ｖである場合に、１６ｈの転化率は９３％より大きいことを示し、「＋＋」は、１ｗｔのケトレダクターゼの粗酵素で、反応系が２０Ｖである場合に、１６ｈの転化率は＞９３％であることを示し、「＋＋＋」は、０．５ｗｔのケトレダクターゼの粗酵素で、反応系が２０Ｖである場合に、１６ｈの転化率は＞９３％であることを示し、「＋＋＋＋」は、０．３ｗｔ〜０．５ｗｔのケトレダクターゼの粗酵素で、反応系が２０Ｖである場合に、１６ｈの転化率は、９４％−１００％であることを示す。
実施例３：
番号１〜２１、３３〜４３及び５４の突然変異体で誘導発現した３３個のトランスアミナーゼを（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピペリジンの合成反応のスクリーニングに用い、Ｎ−ＢＯＣ−ピペリジノン基質０．２ｇをＤＭＳＯ ０．３ｍｌに溶解して均一に混合し、４．３Ｍのイソプロピルアミンの塩酸塩６９８ｕｌ、ＰＬＰ ２ｍｇ、組換え粗酵素０．５〜３ｗｔを加え、ｐＨ７．０の１００ｍＭのリン酸塩緩衝液を用いて反応系を１０〜１６Ｖに補完し、ｐＨを７．０に調整し、３０℃で、２００ｒｐｍで一晩反応させる様な反応系を用いた。反応をスクリーニングした結果活性が高い菌種の反応結果は、表７に示される。表７を除いた２１個のトランスアミナーゼ突然変異体の触媒活性は、野生型トランスアミナーゼの活性に比べて増加していなかった。
実施例４：Ｎ−Ｃｂｚ−３−ピペリジノンを基質としたトランスアミナーゼ突然変異体の耐性のテスト
０．５ｗｔのトランスアミナーゼの粗酵素を３０℃、ｐＨ９．５で、５０％のＤＭＳＯで１ｈ処理した後、以下の反応に用いた。Ｎ−Ｃｂｚ−３−ピペリジノン基質０．２ｇをＤＭＳＯ ０．３ｍｌに溶解して均一に混合し、４．３Ｍのイソプロピルアミンの塩酸塩６９８ｕｌ、０．０１ｇ／ｍｌのＰＬＰ ０．２ｍｌを加え、１００ｍＭのＮａＨＣＯ３で反応系を１１Ｖに補完し、ｐＨを９．５に調整し、３０℃の恒温でシェーカーにおいて２００ｒｐｍで一晩反応させた。１６ｈ後に、体系２００μＬを取り、メタノール４００μＬを加えて均一に混合し、１２０００ｒｐｍで３分間遠心して、ＨＰＬＣにより上清液について転化率を検出した。具体的な結果は表８に示される。
表８からわかるように、同じ処理条件において、一部のトランスアミナーゼ突然変異体は、野生型トランスアミナーゼに比べて安定性が高くなった。
実施例５：
４つの０．５ｗｔのトランスアミナーゼの粗酵素を３０℃、ｐＨ９．５で、５０％〜６０％のＤＭＳＯで１ｈ処理した後、以下の反応に用いた。Ｎ−Ｃｂｚ−３−ピペリジノン基質０．２ｇをＤＭＳＯ ０．３ｍｌに溶解して均一に混合し、４．３Ｍのイソプロピルアミンの塩酸塩６９８ｕｌ、０．０１ｇ／ｍｌのＰＬＰ ０．２ｍｌを加え、１００ｍＭのＮａＨＣＯ３で反応系を２ｍｌに補完し、ｐＨを９．５に調整し、３０℃の恒温でシェーカーにおいて２００ｒｐｍで一晩反応させた。１６ｈ後に、体系２００μＬを取り、メタノール４００μＬを加えて均一に混合し、１２０００ｒｐｍで３分間遠心して、ＨＰＬＣにより上清液について転化率を検出し、結果は表９に示される。
実施例６：（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピロリジンの合成製造におけるトランスアミナーゼ突然変異体の応用
その反応方程式は、以下の通りである。
反応系は、以下の通りであった。Ｎ−Ｃｂｚ−３−ピロリドン基質１ｇをＤＭＳＯ ２．５ｍｌに溶解して均一に混合し、４．３Ｍのイソプロピルアミンの塩酸塩６．２５ｍｌ、０．０１ｇ／ｍｌのＰＬＰ（リン酸ピリドキサール）１ｍｌ、Ｖ３７９Ｔ＋Ｒ４１６Ａ＋Ｃ４１８Ａ＋Ｆ８９Ｙ組換え粗酵素０．３〜０．５ｗｔを加え、ｐＨ７．０の１００ｍＭのリン酸塩緩衝液を用いて反応系を２０Ｖに補完し、ｐＨを７．０に調整し、３０℃の恒温でシェーカーにおいて２００ｒｐｍで反応させた。ＨＰＬＣにより検出したところ、１６ｈ後の転化率は、９６．３８％であり、反応終了後に、体系のアルカリ性を調整し、メチルｔｅｒｔ-ブチルエーテルを加えて３回抽出し、抽出した有機相を合併後に、硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、乾固するまで回転蒸発し、収率は、８０〜８６％であり、ｅｅ値は＞９９％であった。
実施例７：（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピペリジンの製造合成におけるトランスアミナーゼ突然変異体の応用
その反応方程式は、以下の通りであった。
反応系は、以下の通りであった。Ｎ−ＢＯＣ−ピペリジノン基質２ｇをＤＭＳＯ ３ｍｌに溶解して均一に混合し、４．３Ｍのイソプロピルアミンの塩酸塩６．９８ｍｌ、ＰＬＰ（リン酸ピリドキサール）２０ｍｇ、Ｖ３７９Ｔ＋Ｒ４１６Ａ＋Ｃ４１８Ｓ＋Ｆ８９Ｙ組換え粗酵素０．５ｗｔを加え、ｐＨ７．０の１００ｍＭのリン酸塩緩衝液を用いて反応系を１０Ｖに補完し、ｐＨを７．０に調整し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩反応させた。ＨＰＬＣにより検出したところ、１６ｈ後の転化率は、９８．３％であり、反応終了後に、体系のアルカリ性を調整し、メチルｔｅｒｔ-ブチルエーテルを加えて３回抽出し、抽出した有機相を合併した後に、硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、乾固するまで回転蒸発させ、収率は＞９０％、ｅｅ値は９９％であった。
以上の説明からわかるように、本発明の上記実施例は、以下の技術的効果を実現する。
本願で得られた一部のω−トランスアミナーゼ突然変異体は、（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノ複素環式化合物（特に（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピロリジン及び（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノアミノピペリジン）の合成には、酵素の使用量が０．３ｗｔ〜０．５ｗｔに低下し、反応体積が１０Ｖ−２０Ｖに低下し、酵素の利用率と反応ケトルの利用率を大幅に向上させ、酵素液の生産バッチ及び材料の使用量を減少させ、後処理中の有機溶剤の使用量を効果的に減少させ、後処理の難度と廃液・廃ガス・固形廃棄物の排出量を低減させ、人件費を削減させる。また、得られた高い光学純度の（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピロリジンと（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピペリジンによって、該化合物の工業生産コストを大幅に削減させ、工業生産における該酵素の応用価値を高める。
以上は、本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明を限定するためのものではなく、当業者にとっては、本発明は様々な変更や変化が可能である。本発明の精神と原則から逸脱することなく行われた任意の修正、等価置換、改良などは、いずれも本発明の保護範囲に含まれる。
本発明の技術案を用いると、部位特異的突然変異及び／又は飽和突然変異の方法でω−トランスアミナーゼを改良し、高い触媒効率及び／又は高い安定性のω−トランスアミナーゼ突然変異体を取得する。本願で得られた一部のω−トランスアミナーゼ突然変異体は、（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノ複素環式化合物（特に（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピロリジン及び（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピペリジン）の合成には、酵素の使用量が０．３ｗｔ〜０．５ｗｔに低下し、反応体積が１０Ｖ−２０Ｖに低下し、このため、酵素の利用率及び反応ケトルの利用率を大幅に向上させ、酵素液の生産バッチ及び材料の使用量を減少させ、後処理における有機溶剤の使用量を効果的に減少させ、後処理の難度及び廃液・廃ガス・固形廃棄物の排出量を低減させ、人件費を削減させる。また、得られた高い光学純度の（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピロリジンと（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピペリジンによって、該化合物の工業的生産コストを大幅に削減させ、工業生産における該酵素の応用価値を高める。
本願で得られた一部のω−トランスアミナーゼ突然変異体は、（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノ複素環式化合物（特に（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピロリジン及び（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピペリジン）の合成には、酵素の使用量が０．３ｗｔ〜０．５ｗｔに低下し、反応体積が１０Ｖ−２０Ｖに低下し、酵素の利用率と反応ケトルの利用率を大幅に向上させ、酵素液の生産バッチ及び材料の使用量を減少させ、後処理中の有機溶剤の使用量を効果的に減少させ、後処理の難度と廃液・廃ガス・固形廃棄物の排出量を低減させ、人件費を削減させる。また、得られた高い光学純度の（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピロリジンと（Ｓ）−１−ベンジルオキシカルボニル−３−アミノピペリジンによって、該化合物の工業生産コストを大幅に削減させ、工業生産における該酵素の応用価値を高める。

Claims (10)

  1. トランスアミナーゼ突然変異体であって、
    アミノ酸配列は、配列番号１に示される配列が突然変異したアミノ酸配列であり、前記突然変異したアミノ酸部位は、Ｆ８９、Ｋ１９３、Ｐ２４３、Ｖ２３４、Ｉ２６２、Ｑ２８０、Ｖ３７９、Ｒ４１６、Ａ４１７及びＣ４１８からなる群から選択される１つ又は複数である、
    ことを特徴とするトランスアミナーゼ突然変異体。
  2. 前記突然変異したアミノ酸部位における突然変異は、Ｐ２４３Ｅ、Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｋ１９３Ｅ、Ｖ２３４Ｉ、Ｉ２６２Ｖ、Ｑ２８０Ｋ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ、Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ、Ａ４１７Ｓ及びＣ４１８Ａ／Ｑ／Ｓのうちのいずれか１種又は複数種を含み、ここでは、「／」は「又は」を示す、
    ことを特徴とする請求項１に記載のトランスアミナーゼ突然変異体。
  3. 前記突然変異は、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ａ４１７Ｓ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｐ２４３Ｅ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｋ１９３Ｅ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｖ２３４Ｉ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｉ２６２Ｖ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｑ２８０Ｋ、Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ａ４１７Ｓ、Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ、Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ａ４１７Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ａ４１７Ｓ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｋ１９３Ｅ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｖ２３４Ｉ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｐ２４３Ｅ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｉ２６２Ｖ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ａ４１７Ｓ＋Ｑ２８０Ｋ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｑ２８０Ｋ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ＋Ｑ２８０Ｋ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ＋Ｑ２８０Ｋ＋Ｉ２６２Ｖ、Ｖ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ＋Ｑ２８０Ｋ＋Ａ４１７Ｓ及びＶ３７９Ｌ／Ｍ／Ｔ＋Ｒ４１６Ａ／Ｃ／Ｈ／Ｑ／Ｔ／Ｓ＋Ｃ４１８Ａ／Ｑ／Ｓ＋Ｆ８９Ｙ／Ｗ＋Ｑ２８０Ｋ＋Ｉ２６２Ｖ＋Ｖ２３４Ｉの組み合わせのうちのいずれか1つを含む、
    ことを特徴とする請求項１又は２に記載のトランスアミナーゼ突然変異体。
  4. ＤＮＡ分子であって、
    請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスアミナーゼ突然変異体をコードする、
    ことを特徴とするＤＮＡ分子。
  5. 組換えプラスミドであって、
    請求項４に記載のＤＮＡ分子が接続されている、
    ことを特徴とする組換えプラスミド。
  6. 前記組換えプラスミドは、ｐＥＴ−２１ｂ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−３ａ（＋）、ｐＥＴ−３ｄ（＋）、ｐＥＴ−１１ａ（＋）、ｐＥＴ−１２ａ（＋）、ｐＥＴ−１４ｂ（＋）、ｐＥＴ−１５ｂ（＋）、ｐＥＴ−１６ｂ（＋）、ｐＥＴ−１７ｂ（＋）、ｐＥＴ−１９ｂ（＋）、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａ（＋）、ｐＥＴ−２３ａ（＋）、ｐＥＴ−２３ｂ（＋）、ｐＥＴ−２４ａ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａ（＋）、ｐＥＴ−２９ａ（＋）、ｐＥＴ−３０ａ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａ（＋）、ｐＥＴ−３５ｂ（＋）、ｐＥＴ−３８ｂ（＋）、ｐＥＴ−３９ｂ（＋）、ｐＥＴ−４０ｂ（＋）、ｐＥＴ−４１ａ（＋）、ｐＥＴ−４１ｂ（＋）、ｐＥＴ−４２ａ（＋）、ｐＥＴ−４３ａ（＋）、ｐＥＴ−４３ｂ（＋）、ｐＥＴ−４４ａ（＋）、ｐＥＴ−４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ−Ａ、ｐＲＳＥＴ−Ｂ、ｐＲＳＥＴ−Ｃ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−６ｐ−１、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２−１８、ｐＵＣ−１８又はｐＵＣ−１９である、
    ことを特徴とする請求項５に記載の組換えプラスミド。
  7. 前記宿主細胞であって、
    請求項５又は６に記載の組換えプラスミドを含有する、
    ことを特徴とする宿主細胞。
  8. 前記宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり、
    好ましくは、前記真核細胞は、酵母細胞であり、
    好ましくは、前記宿主細胞は、形質転換受容性細胞であり、さらに好ましくは、前記形質転換受容性細胞は、大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌Ｗ３１１０である、
    ことを特徴とする請求項７に記載の宿主細胞。
  9. トランスアミナーゼを用いてケトン系化合物及びアミノドナーのアミノ基転移反応を触媒するステップを含むキラルアミンの生産方法であって、
    前記トランスアミナーゼは、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスアミナーゼ突然変異体である、
    ことを特徴とするキラルアミンの生産方法。
  10. 前記ケトン系化合物は、
    であり、ここでは、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立してＣ１〜Ｃ８アルキル基、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基であり、又はＲ１とＲ２とは、カルボニル基上の炭素と共にＣ５〜Ｃ１０複素環式基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環式基又はＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基を形成し、前記Ｃ５〜Ｃ１０複素環式基及びＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基のヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄の中から選択される少なくとも１種であり、前記Ｃ６〜Ｃ１０アリール基のうちのアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール基のうちのヘテロアリール基、Ｃ５〜Ｃ１０炭素環式基のうちの炭素環式基又はＣ５〜Ｃ１０複素環式基のうちの複素環式基は、それぞれ独立して置換されていないか又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つの基によって置換されており、好ましくは、前記ケトン系化合物は、
    であり、アミノ基転移反応生成物は、
    であり、好ましくは、アミノドナーは、イソプロピルアミン又はイソプロピルアミンの塩である、
    ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
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