CN106119237A - 一种重组磷脂酶c的改性方法 - Google Patents

一种重组磷脂酶c的改性方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组磷脂酶C的改性方法，包括以下步骤：步骤一、修饰剂SS‑mPEG的制备：向烧瓶中加入2g mPEG，再加入4mL N，N‑二甲基甲酰胺，充分溶解；随后加入0.12g丁二酸酐，密封混匀，于100℃边搅拌边加热3h；待反应物冷却后于层析柜中逐滴加入10mL乙醚，将所得沉淀过滤干燥；干燥后的沉淀用二氯甲烷复溶，再用乙醚沉淀；所得沉淀产物真空干燥，在干燥器中保存备用；步骤二、修饰酶的制备：将SS‑mPEG和磷脂酶C按0～30的摩尔比例溶解于体积为10mL，pH为7.2，浓度为25mM的Tris‑HCl缓冲液中，在室温下震荡反应一定时间，用透析袋4℃透析过夜，所得的修饰酶液冷冻干燥后备用。本发明制得的修饰酶的热稳定性、pH稳定性及催化效率相比原酶均得到明显提高。

Description

一种重组磷脂酶C的改性方法
技术领域
本发明涉及生物酶的技术领域，尤其涉及一种重组磷脂酶C的改性方法。
背景技术
磷脂酶C(Phospholipase C，PLC,EC3.1.4.3)是一种专一水解甘油磷脂C3键的水解酶，其水解产物为磷酸单脂和二酰甘油，普遍存在于原核及真核生物中。PLC在抗血小板新药研究、高血压等病理研究以及食品工业添加剂、尤其是植物油脱胶等方面具有广阔的应用前景。目前，从长远角度来看，PLC应用于油脂酶法脱胶最具工业应用前景。用磷脂酶C进行脱胶有很多优点：无副产品，安全性高，脱胶过程中少量的水足以发挥水解作用，避免了水解作用产生大量废水污染环境的问题，提高了脱胶油得率。目前国内尚无商业化的PLC，工业化使用的PLC主要是Novoeymes公司进口酶。
产磷脂酶C的微生物种类较多，易于大规模生产，因此源自微生物的磷脂酶C已成为工业用酶的最主要来源。微生物天然磷脂酶C产量低，纯化步骤繁琐，且细菌性来源的磷脂酶C大多是毒力因子，在生产应用中存在安全隐患。重组磷脂酶C由遗传背景清楚的大肠杆菌表达，在工业应用中不存在安全问题。利用大肠杆菌大量发酵可提高磷脂酶C的产量，为满足工业生产奠定良好基础。但目前微生物PLC异源表达存在表达量低、可溶性差及稳定性不好等问题。
大分子侧链修饰蛋白(或酶)可使其性能发生改变，且可使其稳定性增强。聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)是一种呈线性或支化链状结构的中性无毒、水溶性较高的大分子亲水聚合物，具有良好的生物相容性且无毒副作用，因此被FAD批准可作为体内注射药用聚合物。PEG修饰广泛应用于药物修饰领域，这些修饰后的药物通常半衰期延长、免疫原性降低、溶解度增强、毒副作用减小。
迄今为止对磷脂酶C的改性研究尚未见报道。本研究利用大肠杆菌SUMO融合表达系统显著提高了重组磷脂酶C的溶解性，在此基础上采用聚乙二醇对该重组磷脂酶C进行修饰，以期提高该酶的酶活及其热稳定性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组磷脂酶C的改性方法，采用聚乙二醇对该重组磷脂酶C进行修饰，以提高该酶的酶活及其热稳定性。
为了达到上述目的，本发明解决的技术方案为：
一种重组磷脂酶C的改性方法，包括以下步骤：
步骤一、修饰剂SS-mPEG的制备：
向烧瓶中加入2g分子量为5000的单甲氧基聚乙二醇mPEG，再加入4mL N，N-二甲基甲酰胺，充分溶解；随后加入0.12g丁二酸酐，密封混匀，于100℃边搅拌边加热3h；待反应物冷却后于层析柜中逐滴加入10mL乙醚，将所得沉淀过滤干燥；干燥后的沉淀用二氯甲烷复溶，再用乙醚沉淀，重复四次；所得沉淀产物真空干燥，在干燥器中保存备用；将上述终产物溶于4mL N，N-二甲基甲酰胺，加入0.46g N-羟基琥珀酰亚胺和0.825g二环己基碳二亚胺，30℃溶解过夜，将反应产物置于层析柜冷却至0℃，逐滴加入40mL乙醚，将所得沉淀过滤干燥；干燥后的沉淀用二氯甲烷复溶，再用乙醚沉淀，重复四次；终沉淀产物即为活化的聚乙二醇(mPEG的N-羟基琥珀酰亚胺衍生物，SS-mPEG)，将其干燥，备用；
步骤二、修饰酶的制备：
将SS-mPEG和磷脂酶C按0～30的摩尔比例溶解于体积为10mL，pH为7.2，浓度为25mM的Tris-HCl缓冲液中，在室温下震荡反应一定时间，用透析袋4℃透析过夜，所得的修饰酶液冷冻干燥后备用。
作为实施例的优选方式，所述SS-mPEG与所述磷脂酶C的摩尔比分别设置为0、10、20和30。
本发明采用化学修饰剂SS-mPEG(琥珀酰亚胺酸酯)对大肠杆菌重组磷脂酶C进行了化学修饰。修饰酶的热稳定性、pH稳定性及催化效率相比原酶均得到明显提高。
附图说明
图1不同摩尔比条件下修饰酶的修饰率及相对活性的关系；
图2不同摩尔比条件下修饰酶SDS-PAGE分析；其中，M：蛋白marker；1：未修饰PLC；2：摩尔比10；3：摩尔比20；4：摩尔比30；
图3不同修饰率SS-mPEG-PLC的最适温度；
图4不同修饰率SS-mPEG-PLC的热稳定性；
图5不同修饰率SS-mPEG-PLC的最适pH；
图6不同修饰率对于SS-mPEG-PLC pH稳定性的影响；
图7 PLC和SS-mPEG-PLC的贮藏稳定性；
图8修饰前后分子量质谱测定；
图9修饰前后磷脂酶C的圆二色谱图。
具体实施方式
为使本领域的技术人员能进一步了解本发明，下面列举本发明的具体实施例，并配合说明书附图，详细说明本发明的技术方案。需强调的：实施例并非本发明技术方案所有可能实施方式的穷举，故不用于限制本发明的保护范围。
1.实验所用试剂
重组磷脂酶C为本实验室自制，单甲氧基聚乙二醇(mPEG)，N-羟基琥珀酰亚胺均购于Sigma公司；丁二酸酐，N，N-二甲基甲酰胺，二环己基碳二亚胺，三硝基苯磺酸(TNBS)购自Aladdin试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
2.主要溶液的配制
(1)4％碳酸氢钠：称取4g碳酸氢钠溶于蒸馏水中，搅拌混匀，调pH至8.5，定容至100mL，室温保存待用。
(2)0.1％TNBS：量取1mL 5％TNBS用稀释至50mL，4℃保存备用。
3.实验方法
(1)修饰剂SS-mPEG的制备
向烧瓶中加入2g分子量为5000的mPEG，再加入4mL N，N-二甲基甲酰胺，充分溶解。随后加入0.12g丁二酸酐，密封混匀，于100℃边搅拌边加热3h。待反应物冷却后于层析柜中逐滴加入10mL乙醚，将所得沉淀过滤干燥。干燥后的沉淀用二氯甲烷复溶，再用乙醚沉淀，重复四次。所得沉淀产物真空干燥，在干燥器中保存备用。将上述终产物溶于4mL N，N-二甲基甲酰胺，加入0.46g N-羟基琥珀酰亚胺和0.825g二环己基碳二亚胺，30℃溶解过夜，将反应产物置于层析柜冷却至0℃，逐滴加入40mL乙醚，将所得沉淀过滤干燥。干燥后的沉淀用二氯甲烷复溶，再用乙醚沉淀，重复四次。终沉淀产物即为活化的聚乙二醇(mPEG的N-羟基琥珀酰亚胺衍生物，SS-mPEG)，将其干燥，备用。
(2)修饰酶的制备
将磷脂酶C和SS-mPEG按比例溶解于10mL Tris-HCl缓冲液(25mM，pH7.2)，在室温下震荡反应一定时间，用透析袋4℃透析过夜，所得的修饰酶液冷冻干燥后备用。
(3)不同摩尔比对磷脂酶C修饰的影响
将SS-mPEG与PLC的摩尔比分别设置为0、10、20和30，溶解于10mL Tris-HCl缓冲液(25mM，pH 7.2)中，在室温(25℃)下震荡(20rpm)2h，测定磷脂酶活力和修饰率。
(4)磷脂酶C活力测定
p-NPPC法定量测酶活：磷脂酶C可以水解卵磷脂的结构类似物p-NPPC，生成黄色的对硝基苯酚，该产物在410nm的吸收峰最大。因此将反应后的酶液置于410nm处测定吸光值，可知产物对硝基苯酚的量，利用对硝基苯酚做标准曲线，定量计算相应酶活力。
酶反应体系组成：0.25mol/L Tris-HCl(pH 7.2)缓冲液，1mmol/L ZnCl2，60％山梨醇(w/v)，10mmol/L p-NPPC。将20μL的酶样品加入到200μL反应体系中，37℃保温30min。酶活单位的定义：在pH 7.2，温度为37℃的条件下，每分钟水解NPPC生成1nmol对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活单位(U)。原酶或修饰酶相对活力计算方法是将同组实验中的酶活与酶活最高的相比，以百分数表示。(5)修饰率的测定
SS-mPEG对PLC的修饰率可通过TNBS法测定修饰后蛋白残余的赖氨酸残基含量进行计算。将1mL1mg/mL PLC加入1mL 4％NaHCO3(pH 8.5)中，再加入1mL 0.1％TNBS溶液，置于40℃反应2h，在420nm处测定OD值，记为A。
将1mL 1mg/mL SS-mPEG-PLC加入1mL 4％NaHCO3(pH 8.5)中，再加入1mL 0.1％TNBS溶液，置于40℃反应2h，在420nm处测定OD值，记为B。将不同摩尔比修饰后的PLC分别进行此操作，测定其修饰率。
修饰率计算公式如下：修饰率(％)＝(1-B/A)*100％
(6)最佳作用温度和耐热性的研究
在pH7.2条件下，分别测定未修饰PLC及不同修饰率PLC在25℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃等温度下的酶活，确定其最适温度。将未修饰PLC及不同修饰率PLC分别在50℃，60℃，70℃，80℃温浴10min，20min，30min，40min，50min，对照4℃，测定剩余酶活，分析磷脂酶C的温度稳定性。
(7)最佳作用pH和pH稳定性的研究
分别测定未修饰PLC及不同修饰率PLC在pH4.0，5.0，6.0，6.8的250mM醋酸-醋酸钠缓冲液及pH6.8，7.2，7.6，8.0，9.0的250mM Tris-HCl缓冲液的酶活，确定该酶的最适pH。将未修饰PLC及不同修饰率PLC分别与pH4.0，5.0，6.0，7.2，8.0，9.0的缓冲液混匀，置于4℃孵育12h，测定剩余酶活，分析该酶的pH稳定性。
(8)修饰酶的纯化及酶动力学参数的变化
选择修饰率为10.68％的修饰酶液冻干粉，经SuperdexG-75凝胶柱层析，用20mmol/L pH7.5Tris-HCl缓冲液洗脱，流速为0.3mL/min，合并具有酶活的部分，经SDS-PAGE检测纯化结果，透析后冷冻干燥待用。将底物磷脂酰胆碱(PC)的浓度设置为1～10mM，测定修饰的磷脂酶C在不同底物浓度下的酶活。根据双倒数作图法，以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标作图，计算Km，Vmax及Kcat值。
(9)修饰酶的质谱鉴定及元二色谱分析
将纯化的修饰磷脂酶C蛋白样品送至深圳市微纳菲生物技术有限公司液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析及分子量测定。分别取0.5mg/mL未修饰的磷脂酶C和修饰率为10.68％的SS-mPEG-PLC进行圆二色谱检测。主要参数设置：波长185-260nm，步长1nm，宽带1nm，扫描光程0.05cm。
(10)修饰酶的贮藏稳定性
选择修饰率最佳的修饰酶在4℃放置4周，测定酶活，测试其贮藏稳定性。
4.实验结果
4.1不同摩尔比与修饰率的关系
SS-mPEG与PLC的不同摩尔比与修饰率关系如图1所示。从图中可以得出，SS-mPEG与PLC的摩尔比分别为0，10，20，30时，对应的修饰率分别为0，10.68，15.85，19.98％，剩余酶活依次为100，92.87，90.19，81.11％。随着摩尔比的增大，修饰率逐渐升高，而剩余酶活逐渐降低。当摩尔比为10和20时，修饰率相差不大，且剩余酶活均在90％以上；而当摩尔比为30时，修饰率最大，但是剩余酶活仅有80％。不同摩尔比下的电泳结果如图2，从图中可以看出，修饰后的蛋白样品电泳之后比为修饰的蛋白样品多一条带，且这一条带比未修饰蛋白大5KDa左右，说明蛋白被SS-mPEG修饰。用SuperdexG-75凝胶柱层析后，收集具有酶活力部分，然后进行SDS-PAGE，得到单一的蛋白条带，分子量约为33.6ku.
4.2最适作用温度及热稳定性
温度对不同修饰率的磷脂酶C活力和热稳定性的影响分别见图3和图4。由图3可知，三种修饰率下，最适温度与未修饰磷脂酶C一样，均为80℃，且修饰率为10.68时酶活最高。由图4可知，三种修饰率情况下，修饰率为19.98时酶的稳定性最好，在70℃保温50min后酶活由原来的63.2％升至78.7％。综合考虑最适作用温度及温度稳定性，修饰率为10.68最适合，此时剩余酶活为92.87％，在70℃保温50min后剩余酶活有原来的63.2％提高到70.24％。
4.3最适作用pH及其耐受性
不同pH条件下不同修饰率的SS-mPEG-PLC酶活力和pH耐受性结果见图5和6所示。由图5可以看出，不同修饰率的磷脂酶C的最适pH均为8.0。经修饰后的磷脂酶C在不同pH中的稳定性如图6所示，与未修饰的磷脂酶C一样，在pH7.2～8.0稳定性良好，修饰后的SS-mPEG-PLC的pH耐受性均有所增加，但变化幅度不是很大。综合考虑修饰后酶活及pH耐受性，修饰率为10.68最好。
4.4SS-mPEG修饰前后磷脂酶C的动力学参数变化
修饰前后磷脂酶C对磷脂酰胆碱(PC)的动力学结果如下：修饰后的SS-mPEG-PLC的Vmax为222mM/min，未修饰PLC的Vmax为131.57mM/min，虽然PLC的Km 0.27mM比SS-mPEG-PLC的Km 0.67mM小，但是SS-mPEG-PLC催化效率1003.2(μM-1s-1)远大于PLC的331.49(μM-1s-1)，提高了202％，如表1所示，在工业生产中，催化效率能够更加有效的反映酶的工作效率。
表1不同磷脂酶C的动力学参数
4.5贮藏稳定性
分别测定在4℃放置4周后未修饰磷脂酶C和修饰率为10.68％的SS-mPEG-PLC的剩余酶活。结果如图7所示。在放置4周后修饰前后磷脂酶C的剩余酶活都在90％以上，但未修饰的磷脂酶C比修饰后的磷脂酶C酶活下降明显(从97％降为95％)，说明SS-mPEG-PLC修饰的磷脂酶C在贮藏过程中酶活更稳定。
4.6SS-mPEG修饰磷脂酶C质谱分析结果
质谱采集到的原始wiff图谱文件，采用Paragon algorithm算法的Protein PilotSoftware v.4.5(ABSCIEX，USA)软件进行数据加工处理和检索分析，数据库为NCBInr下的Bacillus cereus物种蛋白数据库，检索参数设置如下：半胱氨酸烷基化为碘乙酰胺修饰、胰蛋白酶酶解、检索方式为Thorough检索分析，一级质谱质量容差为20ppm，二级质谱为0.1Da，假阳性率控制为1％FDR，蛋白质检索unusedscore>1.3视为可信结果，肽段置信度大于95％为可靠序列。具体结果如表2。由表可知，未修饰磷脂酶C与修饰率为10.68％的磷脂酶C氨基酸序列一致，没有变化。
表2修饰前后磷脂酶C LC-MS/MS鉴定结果
颜色 肽段置信度 覆盖百分比
灰色 未检测
红色 >0and<50 ％Cov,％Cov(50),and％Cov(95)
黄色 >＝50and<95 ％Cov(50),and％Cov(95)
绿色 >＝95 ％Cov(95)
蛋白质溶液样品经C18ziptip(Millipore)除盐后，80％乙腈/水洗脱，取1μL洗脱液样品在不锈钢样品板上点样，干燥后加1μL 10mg/ml的芥子酸(sinapic acid)基质溶液于样品点上，待室温完全干燥后使用美国ABSCIEX公司5800MALDI-TOF-TOF Analyzer飞行时间质谱仪进行检测分析。质谱操作参数如下：线形模式，正离子检测，加速电压为2000V，延迟时间600ns，质量扫描范围为10-50KDa。修饰前后分子量的变化如图8所示，修饰后的磷脂酶C分子量变为33.649KDa，较未修饰的磷脂酶C(28.475KDa)大5KDa。
4.7圆二色谱分析结果
用圆二色谱检测用SS-mPEG修饰前后的磷脂酶C，光谱图见图9。由图看出修饰前后圆二色谱图几乎重合，说明该修饰剂对磷脂酶C的二级结构没有什么影响。用软件计算修饰前后蛋白各二级结构的含量，结果如表3所示。由表可看出Helix，Parallel，Beta-Turn和Rndm.Coil的含量均没有变化，而Antiparallel的含量有所增加，因为Antiparallel的氢键能量最强，因而比Parallel更稳定。
表3修饰前后磷脂酶C二级结构计算结果
总之，本发明采用化学修饰剂SS-mPEG(琥珀酰亚胺酸酯)对大肠杆菌重组磷脂酶C进行化学修饰。当修饰率为10.68％，剩余酶活为92.87％，经LC-MS/MS鉴定，SS-mPEG对磷脂酶C进行了单点修饰，修饰酶的分子量为33.649KDa，比原酶增大了5KDa，修饰酶的热稳定性及pH稳定性均得到提高，在70℃保温50min后剩余酶活由原来的63.2％升至78.7％，提高了24.5％。修饰后的SS-mPEG-PLC的Vmax为222mM/min，未修饰PLC的Vmax为131.57mM/min，虽然PLC的Km 0.27mM比SS-mPEG-PLC的Km 0.67mM小，但是SS-mPEG-PLC催化效率1003.2(μM- 1s-1)远大于PLC的331.49(μM-1s-1)，提高了202％。圆二色谱Antiparallel的增加也进一步从结构上说明了修饰酶比原酶具有更好的稳定性和催化效率。在工业生产中，催化效率能够更加有效的反映酶的工作效率。
以上实施例是对本发明的具体描述，仅用于说明本发明的技术方案，并非本发明技术方案的穷举，故不用于限制本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种重组磷脂酶C的改性方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、修饰剂SS-mPEG的制备：
向烧瓶中加入2g分子量为5000的单甲氧基聚乙二醇mPEG，再加入4mL N，N-二甲基甲酰胺，充分溶解；随后加入0.12g丁二酸酐，密封混匀，于100℃边搅拌边加热3h；待反应物冷却后于层析柜中逐滴加入10mL乙醚，将所得沉淀过滤干燥；干燥后的沉淀用二氯甲烷复溶，再用乙醚沉淀，重复四次；所得沉淀产物真空干燥，在干燥器中保存备用；将上述终产物溶于4mL N，N-二甲基甲酰胺，加入0.46g N-羟基琥珀酰亚胺和0.825g二环己基碳二亚胺，30℃溶解过夜，将反应产物置于层析柜冷却至0℃，逐滴加入40mL乙醚，将所得沉淀过滤干燥；干燥后的沉淀用二氯甲烷复溶，再用乙醚沉淀，重复四次；终沉淀产物即为活化的聚乙二醇，将其干燥，备用；
步骤二、修饰酶的制备：
将SS-mPEG和磷脂酶C按0～30的摩尔比例溶解于体积为10mL，pH为7.2，浓度为25mM的Tris-HCl缓冲液中，在室温下震荡反应一定时间，用透析袋4℃透析过夜，所得的修饰酶液冷冻干燥后备用。
2.如权利要求1所述的一种重组磷脂酶C的改性方法，其特征在于：所述SS-mPEG与所述磷脂酶C的摩尔比分别设置为0、10、20和30。
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