JP6108399B2 - 加水分解酵素の反応効率を高める酵素反応方法 - Google Patents
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Description
項1.一般式(1)に示すベタイン誘導体の存在下で、加水分解酵素による酵素反応を行うことを特徴とする、酵素反応方法。
項2.R1〜R3が同一又は異なって炭素数5又は6の直鎖状のアルキル基であり、且つnが1である、項1に記載の酵素反応方法。
項3.R1〜R3の内、少なくとも2つの基は、同一又は異なって、炭素数5又は6の直鎖状のアルキル基であり、残りの1つの基は、炭素数5〜8の直鎖状のアルキル基であり、且つnが1である、項1に記載の酵素反応方法。
項4.一般式(1)に示すベタイン誘導体及び下記一般式(2)に示すベタイン誘導体の存在下で酵素反応を行う、項1〜3のいずれかに記載の酵素反応方法。
項5.一般式(1)に示すベタイン誘導体が0.00001〜0.04Mの濃度で存在する、項1乃至4のいずれかに記載の酵素反応方法。
項6.加水分解酵素が、グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、スルファターゼ、リパーゼ及びプロテアーゼからなる群より選択される少なくとも1種である、項1乃至5のいずれかに記載の酵素反応方法。
項7.加水分解酵素がα−グルコシダーゼである項1乃至5のいずれかに記載の酵素反応方法。
項8.一般式(1)に示すベタイン誘導体を有効成分として含む、加水分解酵素の反応効率の向上剤。
項9.一般式(1)に示すベタイン誘導体が0.00001〜0.04Mの濃度で使用される、項8に記載の向上剤。
項10.更に、下記一般式(2)に示すベタイン誘導体を含む項8又は9に記載の向上剤。
項11.加水分解酵素が、グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、スルファターゼ、リパーゼ及びプロテアーゼからなる群より選択される少なくとも1種である、項8乃至10のいずれかに記載の向上剤。
項12.項1乃至7のいずれかに記載の酵素反応方法を行うためのキットであって、下記一般式(1)に示すベタイン誘導体と、加水分解酵素と、を含むことを特徴とする、キット。
項13.一般式(1)に示すベタイン誘導体が0.00001〜0.04Mの濃度で使用されることを示す実験手順書を含む、項12に記載のキット。
項14.加水分解酵素が、グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、スルファターゼ、リパーゼ及びプロテアーゼからなる群より選択される少なくとも1種である、項12又は13に記載のキット。
本発明は、一般式(1)に示すベタイン誘導体の存在下で、加水分解酵素による酵素反応を行うことを特徴とする。以下、本発明について、詳細に説明する。
本発明で使用するベタイン誘導体は、以下の一般式(1)に示す構造である。
本発明の酵素反応方法に使用される酵素は、加水分解酵素である。本発明で使用される加水分解酵素としては、具体的には、グルコシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、セロビナーゼ、キシラナーゼ、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、マンナーゼ、キチナーゼ等の糖加水分解酵素;アルカリホスファターゼ、リン酸ホスファターゼ、スルファターゼ、ヌクレオチダーゼ、リボヌクレアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ等のエステル加水分解酵素;エーテル加水分解酵素;ペプチダーゼ、サブチリン、ペクチナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン、カルボキシペプチダーゼ、サーモライシン等のペプチド(アミド)加水分解酵素等が挙げられる。本発明においては、これらの加水分解酵素から1種を選択して単独で使用してもよく、2種以上を組み合わせて使用してもよい。本発明で使用される加水分解酵素の由来についても、特に制限されず、微生物、植物、動物等の如何なる由来であってもよい。
本発明の酵素反応に使用される基質は、採用する加水分解酵素の種類や酵素反応の目的等に応じて適宜設定すればよい。
本発明の酵素反応では、上記加水分解酵素を上記基質に作用させる従来の酵素反応系に、上記一般式(1)に示すベタイン誘導体を添加することにより行われる。
一般式(1)に示すベタイン誘導体が、R1〜R3が炭素数5の直鎖状のアルキル基であり、且つnが1の化合物である場合、当該ベタイン誘導体の使用濃度として、好ましくは0.0001〜0.02M、更に好ましくは0.001〜0.01Mが挙げられる。
一般式(1)に示すベタイン誘導体が、R1〜R3が炭素数5の直鎖状のアルキル基であり、且つnが1の化合物である場合、当該ベタイン誘導体の使用濃度として、好ましくは0.00001〜0.04M、更に好ましくは0.0001〜0.04Mが挙げられる。
一般式(1)に示すベタイン誘導体が、R1〜R3が炭素数5の直鎖状のアルキル基であり、且つnが1の化合物である場合、当該ベタイン誘導体の使用濃度として、好ましくは0.00001〜0.01M、より好ましくは0.00005〜0.005M、更に好ましくは0.0002〜0.0005Mが挙げられる。
一般式(1)に示すベタイン誘導体が、R1〜R3が炭素数5の直鎖状のアルキル基であり、且つnが1の化合物である場合、当該ベタイン誘導体の使用濃度として、好ましくは0.00001〜0.04M、更に好ましくは0.0001〜0.02Mが挙げられる。
一般式(1)に示すベタイン誘導体が、R1〜R3が炭素数5の直鎖状のアルキル基であり、且つnが1の化合物である場合、当該ベタイン誘導体の使用濃度として、好ましくは0.00001〜0.04M、更に好ましくは0.0001〜0.02Mが挙げられる。
一般式(1)に示すベタイン誘導体が、R1〜R3が炭素数5の直鎖状のアルキル基であり、且つnが1の化合物である場合、当該ベタイン誘導体の使用濃度として、好ましくは0.00001〜0.04M、更に好ましくは0.0001〜0.02Mが挙げられる。
本発明の酵素反応は、使用する酵素や基質の種類に応じて、様々な分野で使用することができる。
また、本発明は、一般式(1)に示すベタイン誘導体を有効成分として含む、加水分解酵素の反応効率の向上剤を提供する。当該向上剤は、前記一般式(1)に示されるベタイン誘導体に加え、前記一般式(2)に示されるベタイン誘導体を更に含んでいてもよい。
更に、本発明は、上記酵素反応方法を行うためのキットをも提供する。本発明のキットは、一般式(1)に示すベタイン誘導体、及び加水分解酵素を含むものである。
300mlの三ツ口フラスコにトリペンチルアミン25mlを加え、酢酸エチル250mlに溶解させた。窒素気流下、ブロモ酢酸エチル8.64mLを6分間かけてゆっくりと滴下した。滴下終了後、反応溶液を室温で5日間攪拌した。5日後、反応を止め、溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、クロロホルム:メタノール=10:1)で精製し、褐色油状物の前駆体を得た。
300mlの三ツ口フラスコにトリヘキシルアミン25mlを加え、酢酸エチル100mlに溶解させた。窒素気流下、ブロモ酢酸エチル7.4mLを3分間かけてゆっくりと滴下した。滴下終了後、反応溶液を室温で5日間攪拌した。5日後、反応を止め、溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、クロロホルム:メタノール=10:1)で精製し、褐色油状物の前駆体を得た。
トリペンチルアミンの代わりにトリブチルアミンを使用し、合成時の諸条件を適宜変更した以外は、上記実施例1と同様の方法によってベタイン(N,N,N−トリ−n−ブチルグリシネート)(以下、ベタイン3と表記する)を得た。得られたベタイン3について、H NMR、ATR−IR、及びESI−MSにより分析した結果を表7〜9に示す。また、ベタイン3の構造式を以下に示す。
100mlの三ツ口フラスコにN,N,−ジ−n−ヘキシル−N−n−ブチルアミン3.07gを加え、酢酸エチル30mlに溶解させた。窒素気流下、ブロモ酢酸エチル1.26mLを3分間かけてゆっくりと滴下した。滴下終了後、反応溶液を室温で5日間攪拌した。2日後、反応を止め、溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、ヘキサン:酢酸エチル=50:1→クロロホルム→クロロホルム:メタノール=20:1)で精製し、淡黄色油状物の前駆体を得た。
300mlの三ツ口フラスコにN,N,−ジ−n−ヘキシル−N−n−オクチルアミン6.79gを加え、酢酸エチル68mlに溶解させた。窒素気流下、ブロモ酢酸エチル2.24mLを5分間かけてゆっくりと滴下した。滴下終了後、反応溶液を室温で5日間攪拌した。7日後、反応を止め、溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、ヘキサン:酢酸エチル=50:1→クロロホルム→クロロホルム:メタノール=20:1)で精製し、褐色油状物の前駆体を得た。
得られたベタイン誘導体(ベタイン1〜5)の添加による酵素活性向上効果を評価、検討するため、ベタイン誘導体存在下でのα−グルコシダーゼの加水分解速度を測定した。α−グルコシダーゼ(Bacillus Stearothermophilus由来)(型番G3651−250un、シグマアルドリッチ製)の基質としては、紫外可視分光測定から加水分解をモニターできるα−p−ニトロフェニル−D−グルコピラノシド(型番325−34671、和光純薬製)を用いた。
β−グルコシダーゼに与えるベタイン誘導体の添加効果を比較した。β−グルコシダーゼとしては、市販のβ−グルコシダーゼ(Almond由来(型番306−50981)和光純薬製)を用いて評価し、ベタイン誘導体としてはベタイン1、2及び3を用いた。β−グルコシダーゼの反応速度は、反応時間に対する405nmの吸光度変化のグラフの初期の傾きから算出し、加水分解物であるp−ニトロフェノールのモル吸光係数(pH7.0, 37℃)7660M-1cm-1を用いて加水分解速度を算出した。
ベタイン誘導体(ベタイン1及び3)の混合物の反応速度に対する効果について検討するため、ベタイン1とベタイン3の混合物を添加して、α−グルコシダーゼの活性比測定を行った。
グルコシダーゼ以外の加水分解酵素に与えるベタイン誘導体の添加効果を調べるため、リン酸エスエル加水分解酵素であるアルカリホスファターゼを用いて実験を行った。アルカリホスファターゼとしては、市販のアルカリホスファターゼ(E.coli由来(型番012−10691)、和光純薬製)を用いて評価し、ベタイン誘導体としてはベタイン1、2及び3を用いた。アルカリホスファターゼの反応速度は、反応時間に対する405nmの吸光度変化のグラフの初期の傾きから算出し、加水分解物であるp−ニトロフェノールのモル吸光係数(pH7.0, 37℃)7660M-1cm-1を用いて加水分解速
度を算出した。
エステル加水分解酵素であるスルファターゼに対するベタインの添加効果を検討するため、ベタイン非存在下、ベタイン1(5mM)、ベタイン3(100mM)の存在下においてリパーゼによる基質の加水分解反応を行った。
エステル加水分解酵素であるリパーゼに対するベタインの添加効果を検討するため、ベタイン非存在下、ベタイン1(5mM)、ベタイン3(100mM)の存在下においてリパーゼによる基質の加水分解反応を行った。
ペプチド結合(アミド結合)の加水分解酵素であるプロテアーゼに対するベタインの添加効果を検討するため、ベタイン非存在下、ベタイン1(5mM)、ベタイン3(100mM)の存在下においてプロテアーゼによる加水分解反応を行った。
Claims (13)
- 一般式(1)に示すベタイン誘導体の存在下で、加水分解酵素による酵素反応を行うことを特徴とする、酵素反応方法。
- R1〜R3が同一又は異なって炭素数5又は6の直鎖状のアルキル基であり、且つnが1である、請求項1に記載の酵素反応方法。
- 一般式(1)に示すベタイン誘導体及び下記一般式(2)に示すベタイン誘導体の存在下で酵素反応を行う、請求項1又は2に記載の酵素反応方法。
- 一般式(1)に示すベタイン誘導体が0.00001〜0.04Mの濃度で存在する、請求項1乃至3のいずれかに記載の酵素反応方法。
- 加水分解酵素が、グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、スルファターゼ、リパーゼ及びプロテアーゼからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1乃至4のいずれかに記載の酵素反応方法。
- 加水分解酵素がα−グルコシダーゼである請求項1乃至4のいずれかに記載の酵素反応方法。
- 一般式(1)に示すベタイン誘導体を有効成分として含む、加水分解酵素の反応効率の向上剤。
- 一般式(1)に示すベタイン誘導体が0.00001〜0.04Mの濃度で使用される、請求項7に記載の向上剤。
- 更に、下記一般式(2)に示すベタイン誘導体を含む請求項7又は8に記載の向上剤。
- 加水分解酵素が、グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、スルファターゼ、リパーゼ及びプロテアーゼからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項7乃至9のいずれかに記載の向上剤。
- 請求項1乃至6のいずれかに記載の酵素反応方法を行うためのキットであって、下記一般式(1)に示すベタイン誘導体と、加水分解酵素と、を含むことを特徴とする、キット。
- 一般式(1)に示すベタイン誘導体が0.00001〜0.04Mの濃度で使用されることを示す実験手順書を含む、請求項11に記載のキット。
- 加水分解酵素が、グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、スルファターゼ、リパーゼ及びプロテアーゼからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項11又は12に記載のキット。
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