JP4761265B2 - 核酸合成を促進する化合物を含む組成物およびその利用、並びに当該化合物の製造方法 - Google Patents
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Description
Nature, 324巻(6093), 1986年, p.13−19
J. W. Conforth, A. J. Henry, J. Chem. Soc., 9巻, 1952年, p.601−602 A. Le Berre, A. Delacroix, Bull. Soc. Chim. Fr.,1973年, p.2404−2410 A. Cosquer, V. Pichereau, D. Le Mee, M. Le Roch, J. Renault, B. Carboni, P. Uriac, T. Bernard, Toxicity and osmoprotective activities of analogues of glycine betaine obtained by solid phase organic synthesis towards Sinorhizobium meliloti, Bioorg. Med. Chem. Lett., 9巻, 1999年, p.49−54 A. Cosquer, M. Ficamos, M. Jebbar, J. - C. Corbel, G. Choquet, C. Fontenelle, P. Uriac, T. Bernard, Antibacterial acitivity of glycine betaine analogues: involvement of osmoporters, Bioorg. Med. Chem. Lett., 14巻, 2004年, p.2061−2065 そこで本発明は、DNAをはじめとする核酸の融解温度を降下する効果が高く、かつDNAポリメラーゼ等の核酸合成酵素を失活させない化合物を見出し、核酸合成の際に使用する組成物、核酸合成に使用するキット、並びに当該組成物を用いた核酸の変性方法および核酸の合成方法を提供することを目的とした。
当該組成物が、以下の一般式(1)および一般式(2)で表される化合物からなる群から選択される1つ以上の化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含むことを特徴としている:
R6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
A1は長周期型周期表における5B族元素、かつ、
Z1は−COO、−SO3、−NO3、または−HPO4を表し、かつ、
下記の(I)または(II)の1つ以上を満たす:
(I)R1、R2、およびR3のいずれか1つ以上が炭素数2以上の基である、
(II)R6が炭素数3以上の基である;
R15およびR16は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、また2つのR16は同一であっても異なっていてもよく、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
A11およびA12は長周期型周期表における5B族元素を表し、同一であっても異なっていてもよく、かつ、
Z11は−COO、−SO3、−NO3、または−HPO4を表し、2つのZ11は同一であっても異なっていてもよく、かつ、
下記の(III)または(IV)の1つ以上を満たす:
(III)R11、R12、R13およびR14のいずれか1つ以上が炭素数2以上の基である、
(IV)R15およびR16のいずれか1つ以上が炭素数3以上の基である。
当該該組成物が、以下の一般式(1’)および一般式(2’)で表される化合物からなる群から選択される1つ以上の化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含むことを特徴とする組成物であってもよい:
R6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
下記の(I)または(II)の1つ以上を満たす:
(I)R1、R2、およびR3のいずれか1つ以上が炭素数2以上の基である、
(II)R6が炭素数3以上の基である;
R15およびR16は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、また2つのR16は同一であっても異なっていてもよく、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
下記の(III)または(IV)の1つ以上を満たす:
(III)R11、R12、R13およびR14のいずれか1つ以上が炭素数2以上の基である、
(IV)R15およびR16のいずれか1つ以上が炭素数3以上の基である。
R7はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつX1はハロゲンを表し、
Z1は−COO、−SO3、−NO3、または−HPO4を表す。
R7はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつX1は、ハロゲンを表し、Z1は−COO、−SO3、−NO3、または−HPO4を表し、
さらに下記の(I)または(II)の1つ以上の条件を満たす:
(I)R1、R2、およびR3のいずれか1つ以上が炭素数2以上の基である、
(II)R6が炭素数3以上の基である。
R15は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、A11およびA12は長周期型周期表における5B族元素を表し、同一であっても異なっていてもよく;
R17はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつX11はハロゲンを表し、
Z11は−COO、−SO3、−NO3、または−HPO4を表す。
R15は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
A11およびA12は長周期型周期表における5B族元素を表し、同一であっても異なっていてもよく;
R17はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、
X11は、ハロゲンを表し、
Z11は−COO、−SO3、−NO3、または−HPO4を表し、
さらに下記の(III)または(IV)の1つ以上を満たす:
(III)R11、R12、R13およびR14のいずれか1つ以上が炭素数2以上の基である、
(IV)R15およびR16のいずれか1つ以上が炭素数3以上の基である。
R7はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつX1はハロゲンを表す。
R7はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつX1は、ハロゲンを表し、
さらに下記の(I)または(II)の1つ以上の条件を満たす:
(I)R1、R2、およびR3のいずれか1つ以上が炭素数2以上の基である、
(II)R6が炭素数3以上の基である。
R15は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり;
R17はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつX11は、ハロゲンを表す。
R15は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり;
R17はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、
X11は、ハロゲンを表し、
さらに下記の(III)または(IV)の1つ以上を満たす:
(III)R11、R12、R13およびR14のいずれか1つ以上が炭素数2以上の基である、
(IV)R15およびR16のいずれか1つ以上が炭素数3以上の基である。
本発明にかかる組成物は、核酸を合成する際に使用される組成物に関する。ここで「核酸を合成する」とは、PCRをはじめとする核酸増幅、逆転写反応、および塩基配列決定反応等の核酸合成反応を意味する。また上記「核酸」にはDNAおよびRNAが含まれる。ただし本発明にかかる組成物は、これまで融解温度が高いことが原因でPCR等の合成反応が困難であった核酸の融解温度を低下させることを原理として効果を奏するものであるため、本発明の説明における「核酸」は特に二本鎖を意味する。また本発明にかかる組成物は、特にGC含量の高い核酸を合成する際に有効である。ここで「GC含量が高い」とは、GC含量が50%以上、より好ましくは60%以上であることを意味する。
(I)R1、R2、およびR3のいずれか1つ以上が炭素数2以上の基である、
(II)R6が炭素数3以上の基である。
(III)R11、R12、R13およびR14のいずれか1つ以上が炭素数2以上の基である、
(IV)R15およびR16のいずれか1つ以上が炭素数3以上の基である。
上記で説示した、本発明にかかる組成物の製造方法は、特に限定されるものではなく、当業者が通常行い得る合成方法を用い、一般式(1)または(2)、あるいは一般式(1’)または一般式(2’)で表される化合物等を製造することによって達成される。なお、以後の説明において、一般式(1’)で表される化合物、および一般式(2’)で表される化合物の製造方法を一実施形態として説明するが、一般式(1)または(2)で表される他の化合物についても同様に製造することができる。なお、一般式(1’)で表される化合物のことを「ベタイン1」と称し、一般式(2’)で表される化合物のことを「ベタイン2」と便宜上称する。ベタイン1および2は、例えば、非特許文献2や3に記載された方法(液相合成)、または非特許文献4や5に記載された方法(固相合成)にしたがって合成され得る。ただし、目的とするベタイン1および2は双性イオン化合物であるため、極性が高い。よって上記液相合成でベタイン1および2を合成しても、分離精製が極めて困難である。一方、固相合成では、ベタイン1および2を大量に合成することができないという問題点もある。
(a)化合物IIIを酢酸エチルに溶解して溶液とし、化合物IVを当該溶液に滴下し反応させることによって前駆体1が溶液中に沈殿物として生成させる(反応工程)。
(b)反応工程で得られた前駆体1を濾別し、これを蒸留水(またはイオン交換水)に溶解する。この前駆体1の水溶液を、陰イオン交換カラム(陰イオン交換樹脂:Amberlite(アンバーライト:登録商標)IR-402、ローム アンド ハース社製)に通液する。陰イオン交換カラムに吸着したベタイン1を、蒸留水またはイオン交換水を用いて溶離させる。その後、溶離液を真空乾燥させて最終的にベタイン1を取得する(精製工程)。
(I)R1、R2、およびR3のいずれか1つ以上が炭素数2以上の基である。
(II)R6が炭素数3以上の基である。
(c)化合物Vをエタノールに溶解して溶液とし、化合物VIを当該溶液に滴下し反応させることによって前駆体2が溶液中に沈殿物として生成させる(反応工程)。
(d)反応工程で得られた前駆体2を濾別し、これを蒸留水(またはイオン交換水)に溶解する。この前駆体2の水溶液を、陰イオン交換カラム(陰イオン交換樹脂:Amberlite(アンバーライト:登録商標)IR-402、ローム アンド ハース社製)に通液する。陰イオン交換カラムに吸着したベタイン2を、蒸留水またはイオン交換水を用いて溶離させる。その後、溶離液を真空乾燥させて最終的にベタイン2を取得する(精製工程)。
本発明にかかる組成物は、核酸の融解温度を降下させる効果が極めて高いものである。それゆえ、これまで融解温度が高く熱変性させることが困難であった核酸、特にGC含量の高い核酸領域を容易に熱変性させることが可能である。融解温度が高く熱変性させることが困難であった核酸、特にGC含量の高い核酸領域を容易に熱変性させることが可能となることで、これまで熱変性させることができなかったことが原因で合成することが困難であった核酸領域を合成することが可能となる。ここで「熱変性させる」とは、二本鎖の核酸を熱作用によって一本鎖にすることを意味する。また「核酸の溶解温度を降下させる」とは、熱変性する温度を降下させる効果のことを意味する。
分子内に1組の双性イオンを持つベタイン(「ベタイン1」という)は、アルキル鎖長や組み合わせによらず、図2(a)に示すスキームに従って合成することが可能である。ここでは、一例として図2(a)のR1、R2、R3がエチル基で、R6がメチレン基である前駆体1(2-(N,N,N-トリエチルアンモニウム)-酢酸エチルエステル臭化物塩)の合成例を示す。なお、その他の前駆体1の合成は、下記に準じて行われた。
分子内に2組の双性イオンを持つベタイン(「ベタイン2」という)は、アルキル鎖長や組み合わせによらず、図2(b)のスキームに従って合成することが可能である。ここでは、一例として図2(b)のR11、R12、R13、R14がメチル基で、R15がエチレン基、R16がメチレン基である前駆体2(1,2-ビス{[N,N-ジメチル-N-(酢酸エチルエステル-2-イル)]-アンモニウム-N-イル}エタン二臭化物塩)の合成例を示す。なお、その他の前駆体2の合成は、下記に準じて行われた。
ベタイン1およびベタイン2は、共通の方法で定量的に合成することができる。ここでは、一例としてR1、R2、R3がエチル基でR6がメチレン基であるベタイン1(2-(N,N,N-トリエチルアンモニウム)-アセテート)の合成方法を示す。
図1に示す化合物2(スペーサー長:C3)および化合物3(スペーサー長:C5)を用いて、ベタインのカチオンとアニオンと間のスペーサー長が二本鎖DNAの安定性に与える影響を評価した。
アンモニウム基に連結した置換基の化学構造の効果を、図1に示す化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8を用いて検討した。
ベタインの分子内に存在する双性イオンの数の効果を、図1に示す化合物9を用いて検討した。測定条件は試験例1の条件と同一の条件で行った。比較例として、市販のグリシンベタイン(化合物1、双性イオン数:1)を用いた。
図1に示す化合物6を用いて添加濃度と融解温度を降下させる効果と関係を検討した。DNA3を使用し、化合物の添加濃度を種々変化させる以外は、試験例1と同一の条件下で行った。比較例として、市販のグリシンベタイン(化合物1)を用いた。
本発明にかかる組成物を構成するベタインのタンパク質の高次構造に与える影響を、図1に示す化合物6を用いて検討した。タンパク質としては、αへリックス、βシートなどの高次構造の含量の異なる3つの一般的なタンパク質(γグロブリン、コンカナバリンA、牛血清アルブミン)を用いて評価した。評価は、100mM NaCl存在下、10mMトリス緩衝溶液中(pH8.0)に、化合物6(添加濃度:0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5M)、および上記3種類のタンパク質(γグロブリン、コンカナバリンA、または牛血清アルブミン)を添加し、円二色性スペクトルを測定することにより行われた。タンパク質の添加濃度は、[γグロブリン]=1.0mg/ml、[コンカナバリンA]=0.8mg/ml、[牛血清アルブミン]=0.2mg/mlであった。
本発明にかかる組成物を構成するベタインを添加することによって、高いGC含量を有し、一般的なPCR条件下では増幅されないDNA配列を増幅し得るかどうかについて、図1に示す化合物6を用いて検討した。比較例として、市販のグリシンベタイン(化合物1)を用いた。
Claims (9)
- 以下の一般式(3’)で表される化合物と一般式(4’)で表される化合物とを、酢酸エチルの存在下で反応させて生成物を沈殿させる反応工程と、
上記反応工程によって得られた沈殿物を濾過によって分離し、当該沈殿物からベタインを精製する工程と、
を含むことを特徴とするベタインの製造方法:
当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
R7はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつX1はハロゲンを表す。 - 上記一般式(3’)は、さらに下記の(I)の条件を満たすことを特徴とする請求項1に記載のベタインの製造方法:
(I)R1、R2、およびR3が炭素数2以上の基である。 - 上記R1、R2、およびR3が炭素数2〜4の基であることを特徴とする請求項2に記載のベタインの製造方法。
- 上記一般式(3’)において、R1、R2、およびR3が同一の基であることを特徴とする請求項1から3の何れか1項に記載のベタインの製造方法。
- 核酸の融解温度を低下させるために使用される組成物であって、
当該組成物が、以下の化合物4、化合物5、化合物6および化合物8からなる群から選択される1つ以上の化合物、またはそれらの塩を含むことを特徴とする組成物。
- 核酸の融解温度を低下させるために使用されるキットであって、請求項5に記載の組成物を含むことを特徴とするキット。
- 請求項5に記載の組成物と核酸とを少なくとも含む混合物を、加熱する工程を含むことを特徴とする核酸の熱変性方法。
- 請求項5に記載の組成物、鋳型となる核酸分子、核酸合成酵素、少なくとも一対のプライマー、および1種類以上のヌクレオチドを少なくとも含む混合物を、加熱する工程を含むことを特徴とする核酸の合成方法。
- ポリメラーゼ連鎖反応により行われる、請求項8に記載の核酸の合成方法。
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