KR20220159966A - Dna 합성 수율 개선 - Google Patents

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KR20220159966A
KR20220159966A KR1020227031012A KR20227031012A KR20220159966A KR 20220159966 A KR20220159966 A KR 20220159966A KR 1020227031012 A KR1020227031012 A KR 1020227031012A KR 20227031012 A KR20227031012 A KR 20227031012A KR 20220159966 A KR20220159966 A KR 20220159966A
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폴 로스웰
다니엘 키쉬
닐 포터
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터치라이트 아이피 리미티드
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Abstract

본 발명은 개선된 수율 및/또는 개선된 효율을 갖는, 바람직하게는 대규모 또는 산업적 규모의 데옥시리보핵산 (DNA)의 합성, 특히, DNA의 무세포 효소적 합성(cell-free enzymatic synthesis)의 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명은 뉴클레오티드가 2가 양이온 및 1가 양이온의 혼합물과 회합되는 것인 뉴클레오티드 복합체의 사용을 요건으로 한다. 바람직하게는, 상기 2가 양이온은 마그네슘 또는 망간일 수 있다.

Description

DNA 합성 수율 개선
본 발명은 개선된 수율 및/또는 개선된 효율로, 바람직하게는 대규모 또는 산업적 규모로, 데옥시리보핵산 (DNA)의 합성, 특히 DNA의 무세포 효소적 합성을 위한 개선된 방법에 관한 것이다.
데옥시리보핵산 (DNA)의 증폭은 발효조에서 증폭될 DNA를 증식하는 박테리아의 배양과 같은 세포 기반 공정의 사용을 통해 수행될 수 있다. 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 및 가닥 치환 반응(strand-displacement reactions)을 포함하여 출발 주형으로부터 DNA를 증폭하기 위한 무세포 효소적 방법도 기술되었다.
과거에는 마이크로타이터 플레이트 및 요구되는 반응 성분을 첨가하기 위한 로봇 제어 피펫에 기반한 장치를 사용하여 테스트 규모의 DNA 증폭을 수행했다. 이러한 장치 및 공정은 테스트 목적으로 소량의 DNA를 제조하기에 적합하나, 다른 목적으로는 충분한 양을 제공하지 않는다. 특정 핵산 및 단백질의 대규모 증폭 및 제조는 대부분 세포 기반 방법을 통해 수행되었다. 이러한 방법은 일반적으로 대량의 산물을 생산하는 데 효과적이나 설치 비용이 많이 든다. 또한 임상 및 치료 목적을 위해 무세포 환경에서 DNA를 합성하는 것이 바람직하다. 당해 기술 분야에서 발효와 같은 통상적인 방법을 이용한 플라스미드의 증폭의 측면에서, 상업적 규모 작업은 2.6g/l를 제조할 수 있다. 이는 당업자에 의해 "산업적 규모(industrial scale)"로 간주된다.
포스포로아미다이트(phosphoroamidite) 방법과 같은 화학적 합성을 이용한 대규모 DNA 합성이 알려져 있으나 결점이 없는 것은 아니다. 반응은 일반적으로 유기 용매에서 수행되어야 하고, 이들 중 다수는 대부분은 독성이 있거나 아니면 위험하다. 화학적 합성의 또 다른 단점은 각 뉴클레오티드 첨가 후에, 성장하는 올리고뉴클레오티드 사슬의 일정 퍼센트가 캡핑되어 수율 손실이 발생하기 때문에 완전히 효율적이지 않다는 것이다. 따라서 합성되는 뉴클레오티드 사슬의 총 수율 손실은 각 뉴클레오티드가 서열에 추가될 때마다 증가한다. 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성에 있어서 이러한 내재된 비효율성은 효율적으로 생산될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 길이를 궁극적으로 50 개 이하의 핵산 잔기를 갖는 올리고뉴클레오티드로 제한하고, 더욱이 합성의 정확성에 영향을 미친다.
현재까지 폴리머라아제와 같은 생물학적 촉매는 인 비트로 DNA 산물의 산업적 규모의 제조에 일상적으로 활용되지 않았으며 반응은 대개 마이크로리터 규모의 부피로 제한되었다. DNA의 효소적 합성을 이용하여 공정을 스케일업(scale-up)하는 것은 문제가 있는 것으로 입증되었으며, 특히 DNA 산물의 기대에 못미치는 수율이 문제였다.
본 출원인은 이전에 상업적으로 이용 가능한 뉴클레오티드를 사용하여 스케일업하는 능력을 해결했다. 본원에 참조에 의해 포함된 WO2016/034849에 기재된 바와 같이, 뉴클레오티드가 고갈되거나 산물의 농도가 역치에 도달함에 따라 반응 혼합물에 신선한 뉴클레오티드를 첨가하는 것을 포함하는 새로운 방법을 개발하였다. 그러나, 훨씬 더 높은 수율이 달성될 수 있다는 것이 확립되어 본 발명자들은 효소적 DNA 합성으로부터 수율을 더욱 향상시키기 위해 본원에 기술된 새로운 방법을 개발했다.
효소적 DNA 합성은 일반적으로 초기(nascent) 핵산 사슬에 뉴클레오티드의 부가를 촉매하기 위해 폴리머라아제 또는 폴리머라아제 유사 효소의 사용을 필요로 한다. 일반적으로 반응에서 증폭되는 주형 DNA가 필요하다. 그러나, 혼입(incorporation)이 신생(de novo)으로 발생하는, 주형-프리 DNA 합성을 수행하는 것도 가능하다.
핵산의 고도로 하전된 특성으로 인해, 이들은 대부분의 전하를 중화하기 위해 지속적으로 반대-이온에 의해 둘러싸여서 서열의 섹션간 정전기적 반발을 감소시켜 세포 내에서 깔끔하고 조밀한 구조로 응축될 수 있다는 점을 주목하는 것이 중요하다. 핵산의 빌딩 블록인 뉴클레오티드도 이온성 종(species)이며 전기적 중성을 유지하기 위해 양성 반대-이온의 존재를 필요로 한다. 따라서 전부는 아니지만 대부분의 뉴클레오티드는 양성의 반대-이온을 가진 염으로서 공급된다. 염으로부터의 양성 반대-이온이 없는 경우, 뉴클레오티드는 전기적 중성이 수소 이온에 의해 유지되는 것인 그들의 유리 산 형태로 제시된다. 뉴클레오티드가 4개의 음전하를 갖기 때문에 염은 전형적으로 2개의 2가 양이온, 또는 4개의 1가 양이온으로 제조된다. 뉴클레오티드 (염 또는 산)가 물 또는 기타 용매에 분산되면 이들이 용액에서 음이온성 성분과 양이온성 성분으로 해리될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
일반적으로 뉴클레오티드는 리튬 또는 소듐 염으로서 DNA 합성, 증폭 또는 시퀀싱을 위해 공급된다. 리튬 염이 소듐 염보다 더 큰 용해도와 반복된 동결 및 해동 주기에 대한 안정성을 부여하고 다양한 미생물에 대한 리튬의 정균 활성으로 인해 멸균 상태를 유지하여 더 큰 신뢰성과 장기간의 저장 수명(extended shelf life)을 제공하므로, 리튬이 일반적으로 선호된다. 이러한 염의 사용은 매우 일상적이어서 당업자는 뉴클레오티드와 함께 존재하는 반대-이온에 의문을 제기하지 않는 것으로 보인다. 실제로, WO2016/034849의 실시예에서 사용된 모든 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 리튬 염이고, 이들이 당업자에게 탁월한 선택으로 마케팅되기 때문이다. 마그네슘 이온과 같은 2가 양이온의 염으로만 공급되는 뉴클레오티드가 매우 바람직하고, 이는, 이들이 효소적 DNA 합성 동안 보조-인자(co-factor)로서 요구되기 때문이다. 안타깝게도, 마그네슘 염으로 제공되는 뉴클레오티드는 매우 불용성이고, 이는 그들의 이용을 제한한다. 대신에, 마그네슘은 1가 양이온 종에 의해 반대-이온화 회합된(counter-ioned) 뉴클레오티드와 조합되어, 클로라이드 염으로서 별개로 반응에 공급된다.
본 발명자들은, 참조에 의해 본원에 포함된 PCT/GB2019/052307에 상술된 바와 같이, 이전에 반대-이온으로서 뉴클레오티드 염에 존재하는 양이온의 종이 고수율 효소적 DNA 합성 반응의 수율, 효율성, 및 정확도(fidelity)에 결정적이라는 것을 발견했다. 상업적으로 입수가능한 뉴클레오티드는 일반적으로 리튬 염 또는 소듐 염으로서만 입수가능하므로, 이는 다소 예상하지 못한 것이었다. 그러나, 이온성 뉴클레오티드를 위한 반대-이온으로서 대안적인 양이온을 이용하는 것이, 뉴클레오티드를 반대-이온으로 상쇄시키기 위해 포타슘, 암모늄, 및 세슘을 포함한, 다양한 1가 양이온을 이용하는, PCT/GB2019/052307에 포함된 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이, DNA 합성에 대한 큰 영향을 갖는다. 또한, 본 발명자들은 이전에 뉴클레오티드 염에서 사용된 특정한 반대-이온이 DNA의 고수율을 달성하기 위해 DNA 합성 효소의 마그네슘에 대한 요구를 변화시킬 수 있다는 것을 입증했다.
본 발명자들은 2가 양이온과 1가 양이온의 혼합물에 의해 효과적으로 반대-이온화된(counter-ioned) 뉴클레오티드의 이용에 의해, DNA 합성 반응의 최대 수율을 여전히 더 증가시킬 수 있는 방법을 개발했다. 뉴클레오티드를 효과적으로 반대-이온화하기 위해, 상이한 독립체(entity)의 혼합물을 사용하는 경우, 순효과는 존재하는 1가 양이온의 양을 감소시키는 것이다. 1가 양이온이 고농도에서 DNA 합성을 억제하는 것으로 본 발명자들에 의해 가정되기 때문에, 이는 중요하다. 또한, 뉴클레오티드에, 구체적으로 마그네슘 또는 망간의 경우에, 반대-이온으로서 2가 양이온을 제공하는 것에 의해, 이는 또한 합성 효소에 의해 요구되는 보조-인자를 제공한다. 따라서, 추가적인 또는 부가적인 2가 양이온을 제공하는 것이 반드시 필요한 것은 아니다. 마그네슘 또는 망간이 일반적으로 (하나 이상의 음이온에 있는 2개의 음전하를 포함하는) 염으로서 상기 반응에 첨가되기 때문에, 이들을 뉴클레오티드를 위한 반대-이온 대신에 포함하는 것은 존재하는 음이온이 양을 본질적으로 감소시킨다. 따라서, 1가 및 2가 반대-이온의 혼합물과 회합된 뉴클레오티드를 제공하는 것에 의해, 다수의 유익이 도출된다. 추가적으로, 1가 및 2가 반대-이온의 혼합물을 사용하는 것은 뉴클레오티드 복합체의 형성을 가능하게 했고, 상기 복합체에서 4개 미만의 양전하가 본원에 기재된 1가 또는 2가 양이온에 의해 공급된다. 이는 또한, 반응 혼합물에 존재하는 1가 양이온의 양의 추가적인 감소를 가능하게 하고, 상기 반응 혼합물의 이온 강도를 더 감소시키므로, 유용하다. 그러한 감소는, 합성 반응의 완료시, 추가적인 가공을 위해 DNA를 제조하는 더 적은 개수의 단계들을 가능하게 할 것이므로, 하류 DNA 가공 효소를 위해 유용할 수 있다.
실시예에 표시된 데이터는 신규한 뉴클레오티드 복합체가 수율 및 효율성 측면에서, 특히, 뉴클레오티드 독립체(nucleotide entity)의 더 높은 농도에서 1가 양이온에 의한 뉴클레오티드 염을 능가한다는 것을 보여준다. 본 발명자들은 DNA 합성이 개선된 뉴클레오티드 복합체를 이용하는 경우 더 빠르다는 것을 확인했고, 이는 상업적 양의 DNA를 생산하기 위해 소요되는 시간이 감소된다는 것을 의미한다. 이는 중요하고, 치료 및 비-의료 적용에서 합성 생물학의 증진을 크게 향상시킨다. 특히, DNA는 다량의 RNA, 특히, mRNA를 제조하기 위해 주형으로 사용되고, DNA를 상업적 규모로 생산하는 것이 따라서, 예를 들면, RNA 백신의 대량 생산을 위해 중요하다. 따라서, 산업적 규모로 순수하고, 효율적인 DNA 제조에 대한 요구가 현재 기하급수적으로 증가하고 있다. 본 발명을 이용하여 생산되는 DNA는 SARS-Cov-2 mRNA 백신 등을 제조하기 위한 주형으로 이용될 수 있다.
요약
본 발명은 DNA의 무세포 생산 또는 합성을 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 현재의 방법론에 비해 향상된 DNA 생산 즉, 현재의 방법론에서 가능하다고 생각되는 것보다 더 적은 수의 추가 성분을 갖는 환경에서 증가되거나 더 높은 수율, 더 효율적인 공정, 또는 효소적 DNA 합성을 수행할 수 있는 능력을 가능하게 할 수 있다. 이는 DNA를 합성하는, 특히, 대규모로 합성하는 비용을 줄이면서 생산성을 크게 향상시킨다.
산업적 규모에서 고수율을 달성하기 위해, DNA의 "빌딩 블록(building block)", 뉴클레오티드 (특히, dNTP)의 고농도를 이용하는 것이 필요하다. 반응 조건의 파라미터를 변화시키는 것만으로는 효소적 반응으로부터 수율을 증가시키지 않을 것이다.
효소적 반응으로의 뉴클레오티드의 제공이 염으로서 이루어진다는 것을 고려하면, 뉴클레오티드의 양을 증가시키는 것은 반응 혼합물의 이온 강도(ionic strength)에 있어서 상당한 증가를 초래한다. 이온 강도는 존재하는 모든 이온의 농도의 함수이다. DNA 합성 반응을 촉매하는 효소는 단백질이고, 증가된 이온 강도는 단백질의 언폴딩(unfolding), 및 따라서 효소 활성의 불활성화를 초래할 수 있기 때문에 이는 중요한 고려사항이다.
또한, 염의 존재가 반응 혼합물의 pH에 영향을 미칠 수 있다는 것이 고려될 수 있다. 성분 이온들의 산-염기 특성에 따라, 염이 물에 용해되어 중성 용액 (강산/강염기), 염기성 용액 (약산/강염기), 또는 산성 용액 (강산/약염기)을 제공할 수 있다. 따라서, 반응 혼합물에 뉴클레오티드 염 또는 기타 염(예를 들면, 염화마그네슘)의 농도를 증가시키는 것에 의해, 이는 또한, pH에 영향을 미치고, 존재하는 완충제의 pH 안정화 성능을 더 제한할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 더 높은 농도의 뉴클레오티드 염의 첨가가 차선의 pH 조절을 초래할 수 있고, 이는 특히 DNA 수율의 저하 또는 DNA 합성의 정확도에 대한 부정적 작용의 측면에서 효소적 DNA 합성에 영향을 미친다. 따라서, 효소적 DNA 제조의 "확장(scaling up)"과 관련하여 고려되어야 하는 수많은 사항이 있고, 본 발명자들은 DNA 합성 반응에 유해하게 영향을 미치지 않으면서 수율을 증가시킬 수 있는 방법을 고안하였다.
일반적으로, 본 발명은 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제, 예를 들면, 폴리머라아제 효소 또는 기타 DNA 합성 효소를 이용한 효소적 DNA 합성에 관한 것이고, 상기 효소는 선택적으로 특정한 특성을 부여하기 위해 조작될 수 있다. .
본 발명은 사용되는 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제에 따라, 핵산 주형으로부터의 DNA 합성, 또는 주형 없는, 신생 DNA 합성에 관한 것일 수 있다.
본 발명은 증폭 동안 가열 및 냉각을 통해 온도가 순환되는 것을 요구하지 않으나, 존재하는 경우, 초기에 주형을 변성시키기 위해 열의 사용을 허용할 수 있는 DNA 합성의 등온 방법에 관한 것일 수 있다. 본 발명은 바람직하게는 독립적으로, 또는 다른 효소의 보조로, 가닥-치환 복제(strand-displacement replication)를 통해 핵산 주형을 복제할 수 있는 폴리머라아제 효소의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 회합된(associated) 이온과의 복합체의 형태인 뉴클레오티드의 사용을 포함하고, 상기 회합된 이온은 또한 본원에서 반대-이온(counter-ion)으로 지칭될 수 있다. 뉴클레오티드 복합체는 일반적으로 용액으로 존재하고, 따라서, 회합된 반대-이온은 용액에 분산되거나 또는 분산되지 않을 수 있다. 그들의 제조(preparation)의 속성 때문에, 정수가 아닌 반대-이온 대 뉴클레오티드의 비율이 되도록 반대-이온이 뉴클레오티드들 간에 효과적으로 "공유될" 수 있다. 뉴클레오티드 이온 종을 포함하는 용액에, 각 뉴클레오티드에 대한 부분적 또는 완전한 전하 균형(charge balance)이 1가 양이온과 2가 양이온의 혼합물에 의해 제공되도록, 2가 반대-이온 및 1가 반대-이온이 존재한다. 뉴클레오티드 이온 종과 양이온 "반대-이온" 종의 혼합물의 그러한 복합체의 이용은 현재까지 알려진 바 없으며, 따라서, 독특한 제안(proposition)이다. 상기 복합체가 전기적으로 중성이도록 또는 순 음전하를 가질 수 있도록 제공이 이루어질 수 있다. 뉴클레오티드 복합체는 용액으로 공급될 수 있거나, 또는 용액 중 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제에 고체 뉴클레오티드 복합체를 첨가하는 것에 의해 용액에 분산될 수 있다.
본 발명의 뉴클레오티드 복합체는 용액에 존재하고, 2종 이상의 상이한 양성 반대-이온(양이온)과 회합된 뉴클레오티드(본원에서 뉴클레오티드 이온 또는 이온종으로도 기술됨)를 포함한다. 이러한 반대-이온들 중 하나는 1가 양이온인 것, 즉, 하나의 전자의 상실 때문에 단일 양전하를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 반대-이온들 중 하나는 2가 양이온이고, 즉, 2개의 전자의 상실 때문에 이중 양전하(double positive charge)를 갖는 것이 바람직하다. DNA 합성의 수율 및/또는 효율을 증가시키기 위해, 뉴클레오티드가 1가 양이온과 2가 양이온의 혼합 반대-이온의 제공을 갖는 복합체로 제공된다.
뉴클레오티드가 4개의 음전하를 가지므로, 전기적 중성을 유지하기 위해, 일반적으로 4개의 1가 양이온을 통해, 4개의 양전하를 제공하는 것이 일반적이고, 대부분의 상업용 뉴클레오티드 염은 이 기준에서 수득되는 것으로 이해될 것이다. 상업적으로 입수가능한 염은 일반적으로 리튬 염 또는 소듐 염에 한정된다. 그러나, 본 발명의 방법에서, 뉴클레오티드 복합체가 용액에 존재하는 경우, 4개 미만의 양전하가 반대-이온으로 사용되는 1가 또는 2가 양이온에 의해 공급될 수 있다. 이론에 의해 한정되기를 원치 않으면서, 본 발명자들은 나머지 전하는 필요한 경우, 전기적 중성에 도달하기 위해, 히드로늄 이온과 같은 독립체(entity)에 의해 제공될 수 있다는 것으로 가정한다.
따라서, 용액 중 뉴클레오티드 복합체의 이용을 포함하는 DNA의 효소적 합성을 위한 무세포 방법으로서, 상기 용액 중 복합체는 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드당 0.2 내지 2개의 2가 양이온 및 0.2 내지 2.5개의 1가 양이온을 포함하는 것인 무세포 방법이 제공된다.
본원에서 사용된 용어 뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 이온 또는 뉴클레오티드 이온 종(ionic species)으로 읽힐 수 있고, 이는 존재하는 반대-이온이 없는 뉴클레오티드 독립체라는 것으로 이해될 것이다.
달리 표현하면, 하기가 제공된다:
용액 중 뉴클레오티드 복합체를 수득하는 단계로서, 상기 복합체는 뉴클레오티드당 0.2 내지 2개의 2가 양이온 및 0.2 내지 2.5개의 1가 양이온과 회합된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계, 및 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제를 첨가하는 단계를 포함하는, DNA의 효소적 합성을 위한 무세포 방법.
용액 중 뉴클레오티드 복합체를 수득하는 단계로서, 상기 복합체는 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제와 조합된, 뉴클레오티드당 0.2 내지 2개의 2가 양이온 및 0.2 내지 2.5개의 1가 양이온과 회합된 뉴클레오티드인 것인 단계를 포함하는, DNA의 효소적 합성을 위한 무세포 방법.
뉴클레오티딜트랜스퍼라아제와 용액 중 뉴클레오티드 복합체를 조합하는 단계를 포함하는, 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제를 이용한 DNA의 효소적 합성의 무세포 방법으로서, 상기 복합체는 뉴클레오티드당 0.2 내지 2개의 2가 양이온 및 0.2 내지 2.5개의 1가 양이온과 회합된 뉴클레오티드인 것인 무세포 방법.
또한, 뉴클레오티드당 0.2 내지 2개의 2가 양이온 및 0.2 내지 2.5개의 1가 양이온과 회합된 뉴클레오티드를 포함하는, 용액 중 신규한 뉴클레오티드 복합체가 제공된다.
본원에서 사용된 용어 뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 이온 또는 뉴클레오티드 이온 종으로 읽힐 수 있고, 이는 존재하는 반대-이온이 없는 뉴클레오티드 독립체라는 것으로 이해될 것이다.
용액에서 복합체를 형성하는 이온은 해리될 수 있거나 또는 해리되지 않을 수 있는 것으로 이해될 것이다.
효소적 DNA 합성은 랩-스케일 증폭 (리터당 ng 내지 mg의 규모)보다, 더 큰 규모의, 즉, 치료 또는 예방 용도(반응 혼합물 리터당 그램으로 기재됨)를 위한 DNA의 제조용인 것이 바람직하다. 이러한 랩 스케일 증폭의 규모 확장(scaling-up)에서 본 발명자들은 보다 많은 기질 및 기타 성분들을 제공하고 수율이 그에 따라 증가된다는 것을 확인하는 것처럼 간단하지 않다는 것을 발견했다. 따라서, 상기 방법은 일반적으로 30 mM 이상의 농도에서 뉴클레오티드 복합체의 사용을 포함하고, 상기 농도는 뉴클레오티드 복합체가 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제와 조합될 때 결정된다. 뉴클레오티드 복합체와 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제의 혼합은 반응 혼합물의 형성을 가져온다. 상기 방법이 수행되는 반응 혼합물에서 농도가 결정된다. 따라서, 뉴클레오티드 복합체의 농도는 뉴클레오티드 복합체가 첨가되는 때에 반응 혼합물에서 결정된다. 따라서, 상기 농도는 초기 농도 또는 반응의 개시시 농도이다.
따라서, 용액 중 30 mM 이상의 농도에서 뉴클레오티드 복합체의 사용을 포함하는 효소적 DNA 합성의 무세포 방법으로서, 상기 복합체 각각은 뉴클레오티드당 0.2 내지 2개의 2가 양이온 및 0.2 내지 2.5개의 1가 양이온과 회합된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 무세포 방법이 제공된다.
따라서, 30 mM 이상의 농도에서 용액 중 뉴클레오티드 복합체를 수득하는 단계로서, 상기 복합체는 뉴클레오티드당 0.2 내지 2개의 2가 양이온 및 0.2 내지 2.5개의 1가 양이온과 회합된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계, 및 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제를 첨가하는 단계를 포함하는, DNA의 효소적 합성의 무세포 방법이 제공된다. 효소적 DNA 합성은 DNA를 합성할 수 있는 임의의 효소, 특히 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제를 포함할 수 있고, 본원에서 상기 효소의 정의는 주형에 기초하여 또는 신생으로, 초기(nascent) 폴리뉴클레오티드 사슬의 말단에 뉴클레오티드를 전달할 수 있는 모든 효소를 포함한다. 상기 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제는 폴리머라아제 또는 변형된 폴리머라아제, 예를 들면, DNA 폴리머라아제 또는 RNA 폴리머라아제를 포함할 수 있다. 상기 폴리머라아제는 패밀리 A, B, C, D, X, Y 및 RT를 포함한, DNA 폴리머라아제의 공지된 패밀리로부터 유래될 수 있다. 패밀리 X로부터의 DNA 폴리머라아제의 예는 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제이다.
뉴클레오티딜트랜스퍼라아제는 용액에 존재할 수 있고, 뉴클레오티드 복합체가 용액 중 상기 효소에 고체 제제, 예를 들면, 동결건조된 분말로 첨가될 수 있다.
효소적 DNA 합성은 주형의 사용 없이 신생으로 일어날 수 있다.
효소적 DNA 합성은 주형, 예를 들면, DNA 주형을 포함한, 핵산 주형을 포함할 수 있다.
효소적 DNA 합성은 본원에서 기술된 성분들을 포함하는, 반응 혼합물에서 일어날 수 있다.
달리 말하면, 하나 이상의 뉴클레오티드 복합체의 존재 하에 주형을 하나 이상의 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제와 접촉시키는 단계로서, 상기 뉴클레오티드 복합체는 뉴클레오티드당 0.2 내지 2개의 2가 양이온 및 0.2 내지 2.5개의 1가 양이온과 회합된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계를 포함하는 것인 용액에서 DNA를 합성하는 무세포 방법이 제공된다. 선택적으로, 상기 뉴클레오티드 복합체의 농도는 30 mM 이상, 바람직하게는 40 mM이다.
달리 말하면, 상기 뉴클레오티드 복합체는 뉴클레오티드 자체와 함께, 2가 양이온과 1가 양이온의 혼합물을 포함한다. 따라서, 하나 이상의 뉴클레오티드 복합체의 존재 하에 주형을 하나 이상의 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제와 접촉시켜 반응 혼합물을 형성시키는 단계를 포함하는, DNA를 합성하는 무세포 방법으로서, 상기 뉴클레오티드 복합체는 30 mM 이상의 농도로 존재하고, 뉴클레오티드당 0.2 내지 2개의 2가 양이온 및 0.2 내지 2.5개의 1가 양이온과 회합된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 무세포 방법이 제공된다.
뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 복합체의 농도가 언급될 때, 이는 방법이 개시될 때 뉴클레오티드 (또는 그의 복합체)의 농도, 즉, 뉴클레오티드 (또는 뉴클레오티드 복합체)의 개시 또는 초기 농도인 것이 바람직하다. 따라서, 이는 반응 혼합물로의 첨가 후 농도이다. 기타 성분들의 첨가가 방법 동안 이루어질 수 있고; 농도를 보충하기 위해 추가적인 뉴클레오티드/뉴클레오티드 복합체가 공급되지 않으면, 그러한 첨가가 뉴클레오티드/뉴클레오티드 복합체의 농도를 희석시킬 수 있는 것으로 이해될 것이다. 또한, 뉴클레오티드/뉴클레오티드 복합체가 상기 방법, 즉, DNA 합성 반응에 의해 사용되거나 소비될 것이므로, 상기 방법이 진행되면서 뉴클레오티드/뉴클레오티드 복합체의 농도가 감소할 것이다. 특정한 구체예에서, 효소 반응을 위해 기질을 보충하기 위해 상기 방법이 진행되면서 추가적인 뉴클레오티드/뉴클레오티드 복합체가 첨가될 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 뉴클레오티드 복합체가 1가 양이온과 2가 양이온의 혼합물을 포함하는 경우, 수율이 더 개선될 수 있다는 것을 발견했다. 이러한 추가적인 개선은 통상적인 4개의 1가 양이온에 의한 뉴클레오티드 염과 비교된다. 비교예가 본원에 포함된다. 이 효과는 뉴클레오티드 복합체의 더 높은 농도, 예를 들면, 30 mM 초과의 농도에 대해 가장 두드러진다. 본 발명자들은 또한 마그네슘 또는 망간 양이온과 뉴클레오티드 복합체의 회합은 DNA를 합성하기 위해 반응 혼합물에서 추가적인 마그네슘 또는 망간이 요구되지 않는다는 것을 의미한다는 것을 주목했다. 이는 성분 및 따라서 비용을 감소시키는데 유용하다.
통상적으로, 예를 들면, 마그네슘 (2가 양이온)은 뉴클레오티드와 적어도 1:1의 최소비로 DNA 합성 반응에 존재한다. 이는 마그네슘이 일부 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제 효소의 활성 부위에서 요구될 수 있고; 혼입(incorporation) 전에 복합체를 형성할 수 있고 또한 DNA 합성 동안 방출되는 포스페이트 이온 종과 그 자신의 염을 형성할 수 있기 때문일 수 있다. 뉴클레오티드 복합체 중 마그네슘 또는 망간의 포함의 유익은 이것이 추가적인 마그네슘 또는 망간에 대한 요구를 감소시키거나 또는 제거한다는 것이다. 이는 마그네슘 또는 망간 대 뉴클레오티드의 약 1:1 비율 (또는 1:1 비율 미만)을 유지하는 것을 지원하고, 이는 본 발명자들이 이전에 대규모 DNA 합성 반응에서 바람직한 것으로 확인한 것이다. DNA 합성에 포함되는 성분들을 감소시키는 것은 특히 비용을 감소시키기 때문에 이는 중요하나, 또한, 더 높은 농도의 마그네슘 (1:1 초과)은 DNA 합성에서 감소된 정확성(fidelity)과 관련된다.
상기 복합체에서 뉴클레오티드와 회합된 2가 양이온은 마그네슘 (Mg2+), 베릴륨 (Be2+), 칼슘 (Ca2+), 스트론튬 (Sr2+), 망간 (Mn2+) 또는 아연 (Zn2+)으로 구성된 목록으로부터 선택된 하나 이상의 금속, 바람직하게는 Mg2+ 또는 Mn2+를 포함할 수 있다. 2가 금속 양이온과 뉴클레오티드 (뉴클레오티드 이온 또는 뉴클레오티드 이온 종)간 비율은 용액에서 약 1:1 일 수 있으나, 바람직하게는 0.2:1 내지 2:1, 선택적으로 0.5:1 내지 1.5:1이다. 1:1 보다 더 높은 비율은 DNA 합성에서 어느 정도의 부정확성(infidelity)을 초래할 수 있기 때문에, DNA 합성에서 1:1보다 더 낮은 비율이 바람직하고, 선호된다. 따라서, 뉴클레오티드 복합체에 대해 2가 양이온의 제공은 반응 혼합물에 추가적인 2가 양이온을 첨가해야 하는 필요를 감소시커거나 또는 제거할 수 있다. 그러나, 더 요구되는 경우, 이러한 2가 양이온은 적절한 염의 형태로 효소적 DNA 합성에 제공될 수 있다.
또한, 본 발명자들에 의해 개발된 방법은 존재하는 나머지 성분들에 대해 다양한 조건에서 수행될 수 있다. 이러한 조건들은 물 중 요구되는 성분들과 반응을 효과적으로 수행하는, 통상적인 수준의 완충제 제공 내지 추가적인 완충제의 무제공까지 다양하다. 완충제의 농도를 증가시키는 것은 완충능(buffering capacity)을 증가시켜서 직접적으로 pH 제어를 개선할 수 있으나, 화학적 완충제는 또한 마그네슘 이온을 포함한 다양한 금속 이온을 킬레이팅할 수 있고 최적 DNA 수율을 위해 요구되는 1가 및 2가 양이온의 균형(balance)을 유해하게 방해할 수 있다. 따라서, 최적 DNA 생산을 위해 허용가능한 밴드 내에서 pH를 유지하기 위해 다른 필수적인 반응 성분들을 균형을 유지하면서, 완충제의 농도를 가능한 최저 수준으로 유지하는 것이 바람직할 수 있다. 당업자는 본원에서 제안되는 반대-이온의 일부가 그들 자신의 완충 능력을 갖거나, 또는 DNA 합성 동안 방출되거나 생산되는 독립체(entity)(예를 들면, 피로포스페이트 및 포스페이트)가 또한 과다한 pH 변화에 대해 완충하는 것을 보조할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
완충제 제공과 무관하게, 요구되는 성분들은 폴리머라아제와 같은 DNA 합성 효소 (뉴클레오티딜트랜스퍼라아제), 염으로 제공되는 2가 금속 양이온으로부터 선택된, 반응의 조건에 따라 요구되는 선택적인 추가적 성분을 포함하는 뉴클레오티드 복합체, 주형, 변성제, 피로포스파타아제(pyrophosphatase), 또는 하나 이상의 프라이머/프리마아제를 포함할 수 있다. 이러한 성분들은 반응 복합체를 형성할 수 있다. 따라서, 가장 기본적인 형태로, 반응 혼합물은 단순히 뉴클레오티드 복합체 및 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제이다. 이온종은 DNA 합성에 부정적으로 영향을 미칠 수 있기 때문에, 반응 혼합물이 과잉의 이온종을 포함하지 않는 것이 바람직한 것으로 이해될 것이다. 뉴클레오티드 복합체에 존재하는 이온 이외의 것, 기타 이온들은 예를 들면, 변성제 (예를 들면, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨) 또는 완충제에 최소량으로 존재할 수 있다. 반응에 포함되는 효소 및 선택된 뉴클레오티드 복합체에 따라, 마그네슘 또는 망간 염을 더 보충하는 것이 필요할 수 있다. 반응 혼합물 중 "추가적 이온(additional ions)"의 농도는 예를 들면, 반응의 개시 시에, 최소 수준, 예를 들면, 50mM 미만, 40mM 미만, 30 mM 미만, 20mM 미만, 또는 10mM 미만으로 유지될 수 있는 것이 바람직하다. 그러한 추가적 이온은 뉴클레오티드 복합체와 함께 공급되거나 또는 반응의 진행 동안 그로부터 생성되는 것이 아닌 이온이다.
따라서, 혼합된 반대 이온 공급과 복합체인 뉴클레오티드의 반응, 즉, 반응 혼합물로의 공급이 놀랍게도 개선된 DNA 수율 및/또는 뉴클레오티드의 DNA로의 전환의 개선된 효율을 가능하게 하기 때문에, 이는 유리하다. 이러한 개선은 모든 뉴클레오티드가 요구되는 1가 양이온 단독에 의한 통상적인 염으로 공급되는 것인 유사한 반응 산물과 비교될 수 있다. 통상적으로 사용되는 뉴클레오티드 염 대신, 신규한 뉴클레오티드 복합체의 제공은 일부 추가적인 놀라운 장점, 예를 들면, 반응 혼합물 중 완충제의 농도를 낮추고, 일부 경우에 0으로 낮추고, 및/또는 반응 혼합물을 위한 2가 양이온 보조인자, 특히, 통상적으로 염으로 첨가되는, 마그네슘에 대한 요구를 낮추거나, 감소시키거나, 또는 완전히 제거하는 능력을 갖는다. 이 염이 더 이상 요구되지 않을 수 있다는 것을 고려할 때, 본 발명은, 2가 양이온 염이 첨가되지 않으면, 회합된 음이온의 반응 혼합물로의 공급이 없기 때문에(예를 들면, MgCl2 - 따라서, 2개의 클로라이드 이온의 추가가 회피됨), 반응 혼합물의 이온 강도(ionic strength)를 감소시키는 효과를 갖는다. 용액의 이온 강도는 해당 용액에서 이온의 농도의 척도이다. 물에 용해되는 경우, 이온성 화합물은 이온으로 해리된다. 본원에서 사용된, 측정의 단위는 몰 농도(molar)(mol/L)이다. 본 발명자들은 반응 혼합물의 이온 강도의 감소가 상기 방법에 유용할 수 있는 것으로 간주한다. 뉴클레오티드 독립체와 함께 제공되는 1가 양이온이 고 농도에서 상기 방법에 억제성이라는 것이 가능하다. 대안적으로 또는 추가적으로, 표준 방법에서, 마그네슘 또는 망간이 염으로 공급되고, 이 염으로부터의 회합된 음이온, 예를 들면, 클로라이드 이온의 고 농도가 또한 상기 방법에 억제성일 수 있다. 또한, 본 발명을 이용하여 생산된 DNA를 조작하는 것이 바람직한 경우, 본 발명자들은 반응 혼합물에 도입된 효소, 예를 들면, 표적 서열을 절단하고 라이게이션시키는 효소 (DNA 가공 효소)는, 이들이 일반적으로, 이온 강도가 통상적인 뉴클레오티드 및 2가 염에 의해 크게 증가되었을 수 있는 DNA 합성 반응의 종료시 첨가되기 때문에, 더 낮은 이온 강도의 조건을 선호한다는 것을 확인했다. 따라서, 그러한 DNA 합성 반응으로부터의 산물은 효소에 의한 추가적인 가공(예를 들면, RNA 폴리머라아제를 이용하여 RNA를 생산하기 위한 주형으로서의 용도)에 적합할 수 있다.
일 양태에서, 주형이 상기 방법에서 효소적 DNA 합성을 지시한다. 이 주형은 임의의 핵산 주형, 예를 들면, DNA 또는 RNA 주형일 수 있다. 주형은 천연 핵산, 인공 핵산, 또는 이들의 조합일 수 있다. 주형의 증폭은 바람직하게는 가닥 치환(strand-displacement)을 통해 이루어진다. 주형의 증폭은 바람직하게는 등온이며, 즉 증폭을 진행시키기 위해 저온과 고온 사이를 순환할 필요가 없다. 이 시나리오에서, 필요한 경우 주형을 변성하기 위해 처음에 열을 사용하거나, 화학적 수단으로 주형을 변성시킬 수 있다. 그러나 적절한 경우, 임의의 프라이머 또는 실제로 프리마아제(primase) 효소가 이중 가닥 주형 사이에 들어갈 수 있도록 일단 주형이 변성되면 온도는 주형과 산물의 변성에 영향을 미치지 않는 온도 범위에서 유지될 수 있다. 등온 온도 조건은 (주형 및 산물을 변성시키기 위해 열의 순환이 필요한 PCR 대비) 주형 및 산물이 변성되는 지점까지 반응이 가열되지 않을 것을 요구한다. 일반적으로 그러한 반응은 효소 자체의 선호도에 따라 일정한 온도에서 수행된다. 온도는 효소에 적합한 임의의 온도일 수 있다.
무세포 방법은 바람직하게는 가닥 치환 복제를 통한 주형의 증폭을 포함한다. 이 합성은 단일 가닥 DNA를 방출하고, 이는 뒤이어 폴리머라아제를 사용하여 이중 가닥 DNA로 복사될 수 있다. 용어 가닥 치환는 합성 중에 직면하는 하류 DNA를 대체하는 능력을 기술하며, 여기서 폴리머라아제는 초기 단일 가닥을 연장시키기 위해 이중 가닥 DNA를 푼다. 다양한 정도의 가닥 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제가 상업적으로 이용 가능하다. 대안적으로 DNA 폴리머라아제 및 별도의 헬리카제를 공급하여 가닥 치환을 달성할 수 있다. 복제성 헬리카제(replicative helicase)는 이중 DNA를 풀고 선도 가닥 폴리머라아제(leading strand polymerase)의 진행을 촉진할 수 있다.
독립적으로, 본 발명의 임의의 양태의 선택적 특징은 다음과 같을 수 있다:주형은 환형일 수 있다. DNA는 주형의 증폭에 의해, 선택적으로 가닥 치환 복제에 의한 증폭에 의해 합성될 수 있다. 상기 DNA 주형의 가닥 치환 증폭은 RCA (rolling circle amplification)에 의해 수행될 수 있다. 폴리머라아제는 Phi29, 또는 그의 변이체일 수 있다. DNA의 증폭은 등온 증폭, 즉 일정한 온도에서 이루어질 수 있다. 프라이머 또는 프리마아제가 증폭을 개시하기 위해 이용될 수 있다. 니카아제(nickase)가 이중가닥 환형 주형 상에서 "인 시투(in situ)"로 프라이머를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 랜덤 프라이머일 수 있다. 한 쌍 또는 한 세트의 프라이머가 사용될 수 있다. 합성된 DNA는 DNA 주형으로부터 증폭된 DNA 서열의 탠뎀 유닛(tandem units)을 포함하는 콘카티머(concatamers)를 포함할 수 있다. DNA 주형은 닫힌 선형 DNA 일 수 있다; 바람직하게는 DNA 주형은 폐쇄된 환형 단일 가닥 DNA를 형성하기 위해 변성 조건 하에서 인큐베이트된다.
합성될 수 있는 DNA의 양은 반응 혼합물 1 리터당 3g 이상, 특히 16g/l 이상, 바람직하게는 최대 25g/l 이상이다.
합성될 수 있는 DNA의 양은 반응 혼합물에 대해 계산된 최대 수율의 60%를 초과할 수 있다. 바람직하게는, 합성될 수 있는 DNA의 양은 계산된 최대 수율의 80%를 초과할 수 있다. 계산된 최대 수율은 모든 뉴클레오티드가 산물에 혼입되어야하는 이론적 수율에 근거하여, 이는 당업자에 의해 계산될 수 있다.
뉴클레오티드 (또는 뉴클레오티드 복합체)로부터의 DNA 합성 효율은 반응 과정에 걸쳐 산물에 성공적으로 혼입되는, 반응 혼합물에 공급되는 뉴클레오티드 또는 그의 복합체의 백분율로 기술될 수 있다.
DNA 합성의 속도는 또한 본 발명에 의해 개선될 수 있어서, 상당한 DNA 수율을 달성하기 위해 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다.
무세포 방법에는 적어도 하나의 뉴클레오티드 복합체가 요구된다. 그 후, 하나 이상의 추가적인 뉴클레오티드 복합체가 첨가될 수 있다. 필요한 경우, 적절한 개수의 포스페이트기가 존재할 수 있다. 그러나, 뉴클레오티드/뉴클레오티드 복합체 또는 추가적인 뉴클레오티드/뉴클레오티드 복합체는 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (dNTP), 또는 그의 유도체 또는 변형된 버전인 것이 바람직하다. 뉴클레오티드 또는 추가 뉴클레오티드는 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (dCTP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) 및 이들의 유도체 중 하나 이상이다. 뉴클레오티드 또는 추가적인 뉴클레오티드는 그의 복합체로 제공된다. 각각의 개별 뉴클레오티드 복합체는 전기적 중성을 유지하기 위해 4 개의 양전하를 제공하는 다양한 양이온과 전하적으로 균형을 이룰 수 있으나, 반드시 요구되는 것은 아니다. 상기 방법에 사용되는 뉴클레오티드 복합체는 하나 이상의 1가 양이온, 즉 하나 이상의 1가 양이온 종 및 하나 이상의 2가 양이온, 즉, 하나 이상의 2가 양이온 종을 포함할 수 있다. 이들은 용액에서 해리될 수 있고, 이 때문에, 용액에서 이온들이 해리될 수 있으므로, 각 뉴클레오티드 복합체와 회합된 양이온의 갯수가 정수이지 않아도 된다는 것이 이해될 것이다. 뉴클레오티드 복합체는 전하가 완전히 균형을 이루는 경우 염으로 간주될 수 있다.
일반적으로, 본 발명자들은 본 발명의 방법에서 사용되는 뉴클레오티드 복합체를 제조하기 위해 2개의 상이한 뉴클레오티드 복합체 (하나는 2가 양이온만을 갖고, 나머지 하나는 1가 양이온만을 가짐)를 함께 혼합하였다. 상기 뉴클레오티드 복합체는 각각 독립적으로 모든 음전하가 균형을 이루는 것은 아닌 복합체를 포함할 수 있다. 이는 여러 장점을 갖는다. 2가 양이온과 복합체화된 뉴클레오티드는 낮은 용해도를 가지며, 따라서, 응용을 위해 통상적으로 사용되지 않는다. 마그네슘 이온과 복합체를 형성한 뉴클레오티드에 대해 특정한 이슈들이 있다; 그들은 용액에 존재하지 않고 그들의 현재 형태로 사용될 수 없다. 그러나, 1가 양이온 또는 양이온들과 회합된 뉴클레오티드 복합체와 혼합되는 경우, 그 혼합물은 가용성이고 용액을 형성한다. 따라서, 이는 이전에 요구되나, 실현불가능한 뉴클레오티드 복합체를 이용하는 명쾌한 방법을 제공한다.
1가 이온은 단일 종의 이온 또는 상이한 종의 이온들의 혼합물일 수 있다. 2가 양이온은 단일 종의 이온 또는 상이한 종의 이온들의 혼합물일 수 있다.
0.2 내지 2.5개의 1가 양이온이 일반적으로본 발명에 따른 뉴클레오티드 복합체에 존재하거나 또는 그와 회합된다. 이 범위는 뉴클레오티드 복합체당 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 및 2.5개 1가 양이온을 포함한다. 뉴클레오티드 이온 간에 이온들이 공유되는 것이 가능하다. 그러나, 2가 양이온과 회합된 뉴클레오티드 복합체의 용해도를 보장하기 위해 완충제의 대안적 사용에 의해 1가 양이온의 수준이 최소 수준, 또는 심지어 완전한 부재까지 감소되는 것이 가능하다. 뉴클레오티드 복합체와 회합된 1가 양이온의 수준이 0.2:1 미만으로 낮아지고, 심지어 0.1:1 또는 0에 도달될 수 있기 때문에, 이는 추가적인 유익한 효과를 가질 것이다. 본 구체예를 위한 적절한 완충제는, 완충제가 금속 이온과 복합체를 형성하는 경우 양성자가 방출되기 때문에, 반응 혼합물에 존재하는 금속 양이온과 복합체를 형성할 수 없는 것들을 포함한다. 예를 들면, 완충제 HEPES 및 HEPPS는 모두 미미한 금속 이온 친화도를 갖거나, 또는 BES는 마그네슘과 상호작용하지 않는다.
상기 방법에서, 즉 반응 혼합물에서 뉴클레오티드 또는 그의 복합체의 농도는 30mM 초과 및 최대 적어도 300mM일 수 있는 것이 바람직하다. 그러한 농도는 더 높은 수율의 DNA 생산에 중요하며, 주어진 두 농도의 경우 9.75g/l 내지 97.5g/l까지 높을 수 있다. 언급된 뉴클레오티드 또는 그의 복합체의 농도는 상기 방법의 개시 농도이고, 즉 DNA 합성에 필요한 효소도 포함하는 반응 혼합물에서 뉴클레오티드 또는 그의 복합체의 개시 또는 초기 농도인 것이 바람직하다. 추가적인 성분의 후속적 첨가는 이 농도를 감소시킬 수 있으며, DNA 합성 효소에 의한 이들의 사용은 또한 개시 농도로부터 농도를 감소시킬 것이다. 당업자는 나머지 성분의 부피 및 사용된 스톡 뉴클레오티드 복합체 용액/분말에 기초하여 상기 방법이 준비될 때 뉴클레오티드/뉴클레오티드 복합체의 농도를 계산하는 방법을 알고 있을 것이다.
DNA 합성에서 임의의 형태의 반대-이온 없이, 뉴클레오티드의 제공 및 이용은 현재 가능하지 않기 때문에, DNA 합성 또는 증폭의 기술에서, "뉴클레오티드 염"을 의미하는 경우 용어 "뉴클레오티드"가 사용된다는 것이 주목되어야 한다. 상기 방법은 회분(bacth) 공정 또는 연속 흐름(continuous flow) 공정일 수 있다. 회분은 폐쇄 회분(closed batch) (즉, 모든 반응 성분이 DNA 합성의 개시 시에 제공됨)이거나, 또는 본원에 참조로서 통합되는 WO2016/034849에 설명된 것과 같이 공정 중에 필요에 따라 추가적인 성분이 반응에 공급될 수 있다. 추가적인 첨가가 필요한 경우, 농도를 보충하거나 증가시키기 위해 추가적인 뉴클레오티드 복합체가 추가되지 않는 경우, 이는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 복합체의 농도를 희석시킬 것이다.
본 발명자들은 각각의 상이한 반대-이온이 효소적 DNA 합성 반응에 특별한 특징을 추가할 수 있음을 발견하였다. 예를 들면, 뉴클레오티드 복합체에서 암모늄 이온의 사용이 보다 높은 농도의 뉴클레오티드의 사용을 가져올 수 있다.
이러한 이온을 이용한 DNA의 효소적 무세포 합성은 최소 완충제에서 수행할 수 있으며, DNA 합성을 증진시키거나 프라이머 결합을 보조하는 것으로 확인된 추가 염, 또는 디터전트(detergent)가 첨가되지 않는다. 이 최소 완충액은 pH를 안정화시키는 작용제 (완충제)를 포함할 수 있다. 최소 완충제는 주형을 변성시키는 데 사용되는 화학 물질, 예를 들어 수산화나트륨, 수산화칼륨, 또는 수산화 암모늄의 존재에 의해 제공되는 소량의 양이온을 함유할 수 있다. 실시예에서, 5mM 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 변성제로서 사용했으나, 이 농도는 DNA 변성을 수행하기 위해 사용되는 당업자의 기술 범위 내에서, 반응의 조건에 적합하도록 변경될 수 있고, 주형의 속성에 따라, 2.5mM 내지 최대 5mM, 최대 10mM, 15mM, 20mM 또는 25mM 또는 그 이상의 양의 수산화나트륨, 수산화칼륨, 또는 수산화암모늄이 제공될 수 있다. 따라서, 반응 혼합물은 원래 뉴클레오티드 복합체와 회합되지 않았던 소량 또는 최소량의 양이온 및 음이온을 포함할 수 있다.
추가적인 장점이 하기에 기술된다.
본 발명은 예시적인 구체예 및 첨부된 도면을 참조하여 하기에서 더 설명될 것이다:
도 1의 A 및 B는 소듐 단독 (dNTP:4Na+)(연속선) 또는 혼합된 소듐/마그네슘 dNTP (dNTP:2Na+/Mg2+)(점선)에 대한 뉴클레오티드 염의 다양한 개시 농도를 이용한 실험에서 수득된 결과를 보여주는 도면이다. 도면은 사용된 개시 dNTP 농도 대비 플롯팅된 dNTP의 각 타입에 대한 g/l의 반응 수율 (A) 및 % 반응 효율 (B)을 도시한다. 도 1의 C는 RCA의 1주 후 생산된 DNA를 보여주고, 더 높은 수율에 해당하는 보다 높은 점성의 DNA 용액은 뒤집힌 경우 Eppendorf 튜브의 바닥에 부착된 상태로 남아있다.
도 2의 A 및 B는 암모늄 단독 (dNTP:4NH4 +)(연속선) 또는 혼합된 암모늄/마그네슘 dNTP (dNTP:2NH4 +/Mg2+)(점선)에 대한 뉴클레오티드 염의 다양한 개시 농도를 이용한 실험에서 수득된 결과를 보여주는 도면이다. 도면은 사용된 개시 dNTP 농도 대비 플롯팅된 dNTP의 각 타입에 대한 g/l의 반응 수율 (A) 및 % 반응 효율 (B)을 도시한다. 도 2의 C 및 D는 각각 18시간 및 106시간의 RCA 후 생산된 DNA의 점도를 보여준다.
도 3의 A 내지 C는 1가 dNTP (점선) 또는 혼합된 1가/마그네슘 dNTP (연속선)에 대한 뉴클레오티드 염의 다양한 개시 농도를 이용한 실험에서 수득된 결과를 보여주는 도면이다. 도면은 개시시 dNTP 독립체의 농도 (mM) 대 g/l인 반응 수율을 도시한다. 도시된 데이터는 반응의 과정 동안 dNTP에 대한 피크 수율(peak yield)이다. 도 3의 A는 6일의 과정 동안 암모늄 dNTP (점선) 및 혼합된 암모늄/마그네슘 dNTP (연속선)에 대한 피크 수율 결과를 보여준다. 도 3의 B는 6일의 과정 동안 포타슘 dNTP (점선) 및 혼합된 포타슘/마그네슘 dNTP (연속선)에 대한 피크 수율 결과를 보여준다. 도 3의 C는 5일의 과정 동안 세슘 dNTP (점선) 및 혼합된 세슘/마그네슘 dNTP (연속선)에 대한 피크 수율 결과를 보여준다.
도 4는 1가 dNTP 또는 혼합된 1가/마그네슘 dNTP에 대한 뉴클레오티드 염의 다양한 개시 농도를 이용하여 수득된 결과를 보여주는 차트이다. 상기 차트는 개시시 표시된 dNTP 독립체의 농도 대 g/l로 표시된 피크 반응 수율을 도시한다. 각 dNTP 독립체는 5, 10, 20, 30, 80, 100 및 120 mM의 개시 농도로 테스트된다.
도 5의 A 및 B는 1가 dNTP (점선 및 파선) 또는 혼합된 1가/마그네슘 dNTP (연속선)에 대한 뉴클레오티드 염의 다양한 개시 농도를 이용하여 수득된 결과를 보여주는 도면이다. 도면은 개시시 dNTP 독립체의 개시 농도 (mM) 대 g/l로 표시된 반응 수율을 도시한다. 점선은 1가 dNTP가 아세트산 마그네슘으로 보충되었다는 것을 나타내고, 파선은 1가 dNTP가 염화마그네슘으로 보충되었다는 것을 나타낸다. 혼합된 dNTP는 추가적인 마그네슘 염으로 보충되지 않았다. 도 5의 A는 암모늄 dNTP (점선 및 파선) 및 혼합된 암모늄/마그네슘 dNTP (연속선)에 대한 피크 수율 결과를 보여준다. 도 5의 B는 소듐 dNTP (점선 및 파선) 및 혼합된 소듐/마그네슘 dNTP (연속선)에 대한 피크 수율 결과를 보여준다.
도 6의 A 및 B는 1가 dNTP (염화마그네슘 또는 아세트산 마그네슘으로 보충됨) 또는 혼합된 1가/마그네슘 dNTP (추가적인 마그네슘 없음)에 대한 뉴클레오티드 염의 다양한 개시 농도를 이용하여 수득된 결과를 보여주는 차트이다. 상기 차트는 개시시 dNTP 독립체의 개시 농도 (mM) 대 g/l로 표시된 반응 수율을 도시한다. 도 6의 A는 암모늄 dNTP 및 혼합된 암모늄/마그네슘 dNTP에 대한 피크 수율 결과를 보여준다. 도 6의 B는 소듐 dNTP 및 혼합된 소듐/마그네슘 dNTP에 대한 피크 수율 결과를 보여준다.
도 7의 A 및 B는 30mM Tris 완충액 pH 8.0 또는 물 중 암모늄:마그네슘 dNTP (2 암모늄: 1 마그네슘)의 다양한 개시 농도를 이용하여 수득된 결과를 보여주는 차트이다. 바 차트(bar chart)는 dNTP의 개시 농도 (mM: 측정된 각 일자가 함께 표시됨) 대 g/l로 표시된 수득된 DNA의 수율의 플롯이다. 도 7의 A는 30mM Tris 완충액 pH 8.0에서의 결과를 도시하고, 도 7의 B는 물(추가된 완충제 불포함)에서의 결과를 도시한다.
본 발명은 대규모 DNA 합성을 위한 무세포 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 DNA의 높은 처리량(throughput) 합성을 가능하게 할 수 있다.
본 발명에 따라 합성되는 데옥시리보핵산 (DNA)은 임의의 DNA 분자일 수 있다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 선형일 수 있다. DNA는 환형, 특히 미니환형, 단일 가닥 폐쇄 환형, 이중 가닥 폐쇄 환형, 이중 가닥 개방 환형 또는 폐쇄 선형 이중 가닥 DNA를 형성하도록 가공될 수 있다. DNA는 헤어핀 루프 (스템 루프(stem loop)), 불완전한 헤어핀 루프, 유사 매듭(pseudoknot), 또는 다양한 유형의 이중 나선 (A-DNA, B-DNA 또는 Z-DNA) 중 어느 하나와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 특정 2차 구조를 형성하거나 형성하도록 가공될 수 있다. DNA는 또한 헤어핀 및 압타머(aptamer) 구조를 형성할 수 있다.
합성된 DNA는 임의의 적절한 길이일 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 77 킬로베이스까지 또는 그 초과의 길이가 가능할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 방법에 따라 합성될 수 있는 DNA의 길이는 최대 60 킬로베이스, 또는 최대 50 킬로베이스, 또는 최대 40 킬로베이스, 또는 최대 30 킬로베이스일 수 있다. 바람직하게는 합성되는 DNA는 100 베이스 내지 77 킬로베이스 이상, 500 베이스 내지 60 킬로베이스, 200 베이스 내지 20 킬로베이스, 보다 바람직하게 200 베이스 내지 15 킬로베이스, 가장 바람직하게 2 킬로베이스 내지 15 킬로베이스일 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 합성되는 DNA의 양은 9.75g/l를 초과할 수 있다. 합성되는 DNA의 양은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30g/l보다 큰 것이 바람직하다. 합성되는 DNA의 바람직한 양은 5g/l이다. 생산되는 DNA의 양은 대규모 또는 대량 생산에서 산업적 또는 상업적 수량으로 설명될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 DNA는 품질, 즉 DNA 길이 및 서열이 균일할 수 있다. 따라서 상기 방법은 대규모 DNA 합성에 적합할 수 있다. 상기 방법은 합성의 정확도 측면에서 균일할 수 있다.
대안적으로, 합성 반응에서 생성된 DNA의 양은 100 % 뉴클레오티드가 합성된 DNA에 혼입된 경우 달성될 이론적 최대 수율에 대비될 수 있다. 본 발명의 방법은 수득된 총 수율을 개선할 뿐만 아니라 공정의 효율성도 개선하고, 이는 이전 방법에서보다 공급된 뉴클레오티드 중 더 많은 뉴클레오티드가 합성된 DNA 산물에 혼입된다는 것을 의미한다. 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 수율은 이론적 최대값의 50%를 초과하거나 이론적 최대값의 최대 90 %에 이르거나 이를 초과한다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 달성된 이론적 최대 수율의 비율은 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 및 95% 이상을 포함한다. 통상적으로, 상업적으로 이용 가능한 뉴클레오티드 염을 사용하면, 공정을 억제할 수 있는 이온의 효과로 인해 달성된 수율이 실망스러울 수 있다.
DNA는 효소 반응에서 합성된다. 이 효소적 합성은 DNA 합성 효소, 초기의 폴리뉴클레오티드 사슬에 뉴클레오티드를 첨가할 수 있는, 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제, 가장 현저하게, 폴리머라아제 효소 또는 변형된 폴리머라아제 효소의 사용을 포함할 수 있다. 이들은 하기에서 더 검토된다. DNA 합성은 신생(de novo)일 수 있고 주형이 필요하지 않을 수 있다. 효소적 합성은 또한 DNA 합성을 위한 주형의 사용을 필요로 할 수 있다. 이 주형은 폴리머라아제에 따라 적합한 핵산 일 수 있지만 바람직하게는 DNA 주형이다.
주형은 특정 서열을 포함하는 것에 의해 DNA 합성을 위한 지시를 단지 제공하는 임의의 적합한 주형일 수 있다. 주형은 단일 가닥 (ss) 또는 이중 가닥 (ds)일 수 있다. 주형은 선형 또는 환형일 수 있다. 주형은 천연, 인공 또는 변형된 염기 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
주형은 자연적으로 유래되거나 인공적인 임의의 서열을 포함할 수 있다.
주형은 임의의 적절한 길이일 수 있다. 특히, 주형은 최대 60 킬로베이스, 또는 최대 50 킬로베이스, 또는 최대 40 킬로베이스, 또는 최대 30 킬로베이스일 수 있다. 바람직하게는 DNA 주형은 10 베이스 내지 100 베이스, 100 베이스 내지 60 킬로베이스, 200 베이스 내지 20 킬로베이스, 보다 바람직하게 200 베이스 내지 15 킬로베이스, 가장 바람직하게 2 킬로베이스 내지 15 킬로베이스일 수 있다.
주형은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 본 방법에서 사용하기에 충분한 양으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 주형은 PCR에 의해 생성될 수 있다.
주형의 전체 또는 선택된 부분이 본 방법에서 증폭될 수 있다.
주형은 발현을 위한 서열을 포함할 수 있다. DNA는 세포 (즉, 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 형질감염된 세포)에서의 발현을 위한 것일 수 있거나, 무세포 시스템 (즉, 단백질 합성)에서의 발현을 위한 것일 수 있다. 발현을 위한 서열은 치료 목적, 즉, 유전자 치료 또는 DNA 백신을 위한 것일 수 있다. 발현을 위한 서열은 유전자일 수 있고, 상기 유전자는 DNA 백신, 치료 단백질 등을 코딩할 수 있다. 서열은 활성 RNA 형태, 즉 siRNA (small interfering RNA) 분자로 전사되는 서열을 포함할 수 있다. 서열은 mRNA, 더 구체적으로, 백신을 생산하기 위한 mRNA로 전사되는 서열을 포함할 수 있다.
필요한 경우, 주형은 아래에 설명된 바와 같이 적어도 하나의 폴리머라아제와 접촉할 수 있다.
효소적 DNA 합성 반응은 적어도 하나의 DNA 합성 효소(뉴클레오티딜트랜스퍼라아제)를 필요로 할 수 있다. 바람직하게는 상기 DNA 합성 효소는 폴리머라아제이다. 폴리머라아제는 뉴클레오티드들을 서로 연결하여 DNA 중합체를 형성한다. 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 상이한 효소 및/또는 폴리머라아제가 사용될 수 있다. 폴리머라아제는 DNA의 중합체를 합성하는 폴리머라아제 패밀리의 임의의 적합한 폴리머라아제일 수 있다. 폴리머라아제는 DNA 폴리머라아제일 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 DNA 폴리머라아제를 포함한, 임의의 DNA 폴리머라아제를 사용할 수 있다. 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 이상의 상이한 DNA 폴리머라아제, 예를 들어 교정 기능을 제공하는 것 및 그렇지 않은 하나 이상의 다른 것들이 사용될 수 있다. 상이한 메커니즘을 갖는 DNA 폴리머라아제, 예를 들어 가닥 치환형 폴리머라아제 및 다른 방법으로 DNA를 복제하는 DNA 폴리머라아제가 사용될 수 있다. 가닥 치환 활성이 없는 DNA 폴리머라아제의 적합한 예는 T4 DNA 폴리머라아제이다. 말단 트랜스퍼라아제(terminal transferase)와 같은 주형-비의존성 폴리머라아제가 사용될 수 있다.
변형된 폴리머라아제도 사용될 수 있다. 이들은 주형에 대한 의존성을 제거하거나, 온도 의존성을 변경하거나, 인 비트로에서 사용하기 위해 효소를 안정화하는 것과 같이 그들의 특징을 변형하도록 엔지니어링되었을 수 있다.
폴리머라아제는 매우 안정할 수 있어서 공정 조건 하에서 장기간 인큐베이션에 의해 활성이 실질적으로 감소하지 않는다. 따라서, 효소는 바람직하게는 온도 및 pH를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 공정 조건 하에서 긴 반감기를 갖는다. 폴리머라아제는 제조 공정에 적합한 하나 이상의 특징을 갖는 것이 또한 바람직하다. 폴리머라아제는 바람직하게는 예를 들어 교정 활성(proofreading activity)을 통해 높은 정확도(fidelity)를 갖는다. 또한, 폴리머라아제가 높은 처리율(processivity), 높은 가닥-치환 활성 및 dNTP 및 DNA에 대한 낮은 Km 중 하나 이상을 나타내는 것이 바람직하다. 폴리머라아제는 환형 및/또는 선형 DNA를 주형으로서 사용할 수 있다. 폴리머라아제는 dsDNA 또는 ssDNA를 주형으로서 사용할 수 있다. 폴리머라아제는 교정 활성과 관련이 없는 DNA 엑소뉴클레아제 활성을 나타내지 않는 것이 바람직하다. 또한, 폴리머라아제는 주형으로서 대안적인 핵산을 이용할 수 있다.
당업자는 시판되는 폴리머라아제, 예를 들어 Phi29 (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, US), Deep Vent® (New England Biolabs, Inc.), Bst(Bacillus stearothermophilus) DNA 폴리머라아제 I (New England Biolabs, Inc.), DNA 폴리머라아제 I의 Klenow 단편 (New England Biolabs, Inc.), M-MuLV 역전사 효소 (New England Biolabs, Inc.), VentR® (exo-minus) DNA 폴리머라아제 (New England Biolabs, Inc.), VentR® DNA 폴리머라아제 (New England Biolabs, Inc.), Deep Vent® (exo-) DNA 폴리머라아제 (New England Biolabs, Inc.) 및 Bst DNA 폴리머라아제 큰 단편 (New England Biolabs, Inc.)에 의해 나타나는 특성과 대비하여 주어진 폴리머라아제가 앞서 정의된 특징을 나타내는지 여부를 결정할 수 있다. 높은 처리율이 언급되는 경우, 이는 전형적으로 주형과의 회합/해리 당 폴리머라아제 효소에 의해 첨가된 뉴클레오티드의 평균 개수, 즉 단일 회합 이벤트에서 수득되는 초기 신장(nascent extension)의 길이를 나타낸다.
가닥 치환형(Strand displacement-type) 폴리머라아제가 바람직하다. 바람직한 가닥 치환형 폴리머라아제는 Phi29, Deep Vent 및 Bst DNA 폴리머라아제 I 또는 이들의 변이체이다. "가닥 치환(strand displacement)"은 합성 중에 이중 가닥 DNA 영역을 만나면 상보적 가닥을 대체하는 폴리머라아제의 능력을 기술한다. 따라서 주형은 상보적 가닥을 치환하고 새로운 상보적 가닥을 합성하는 것에 의해 증폭된다. 따라서, 가닥 치환 복제 동안, 새로 복제된 가닥이 치환되어 폴리머라아제가 추가로 상보적 가닥을 복제할 수 있는 길을 열어 준다. 프라이머 또는 단일 가닥 주형의 3' 유리 말단이 주형 상의 상보적 서열에 어닐링될 때(둘 다 프라이밍 이벤트) 증폭 반응이 개시된다. DNA 합성이 진행될 때 폴리머라아제가 추가적인 프라이머 또는 주형에 어닐링된 다른 가닥을 만나면 폴리머라아제가 이를 치환하면서 가닥 연장을 지속한다. 가닥 치환은 더 많은 프라이밍 이벤트를 위한 주형으로 작용할 수 있는 단일 가닥 DNA를 방출할 수 있다. 새로 방출된 DNA의 프라이밍은 과다 분지(hyper-branching), 및 산물의 고수율을 가져올 수 있다. 이중 가닥 DNA는 새로운 DNA 가닥의 지속적인 합성에 장애물이 아니므로 변성의 사이클이 효율적인 DNA 증폭에 필수적이지 않다는 점에서 가닥 치환 증폭 방법이 PCR 기반 방법과 다르다는 것이 이해되어야 한다. 가닥 치환 증폭은 프라이머가 사용되는 경우 프라이머가 프라이머 결합 부위에 어닐링되도록 하기 위해 이중 가닥인 경우 초기 주형을 변성시키기 위해 1 회의 초기 가열만 필요할 수 있다. 그 후, 더 이상 가열 또는 냉각이 필요하지 않기 때문에 증폭은 등온으로 기술될 수 있다. 대조적으로, PCR 방법은 이중 가닥 DNA를 용해시키고 새로운 단일-닥 주형을 제공하기 위해 증폭 과정 동안 변성(즉, 섭씨 94도 이상으로의 승온)의 사이클이 필요하다. 가닥 치환 동안 폴리머라아제는 이미 합성된 DNA 가닥을 치환한다. 또한 새로 합성된 DNA를 주형으로서 사용하여 DNA의 빠른 증폭을 보장한다.
본 발명의 방법에 사용되는 가닥 치환 폴리머라아제는 바람직하게는 적어도 20kb, 더 바람직하게는 적어도 30kb, 적어도 50kb, 또는 적어도 70kb 이상의 처리율을 갖는다. 일 구체예에서, 가닥 치환 DNA 폴리머라아제는 phi29 DNA 폴리머라아제에 유사하거나 그보다 더 큰 처리율을 갖는다.
따라서 가닥 치환 복제가 바람직하다. 가닥 치환 복제 동안, 주형은 폴리머라아제의 작용에 의해 합성된 이미 복제된 가닥을 치환하고, 이중 가닥 주형의 원래의 상보적 가닥 또는 새로 합성된 상보적 가닥일 수 있는 다른 가닥을 차례로 치환하여 증폭되는데, 후자는 주형에 어닐링된 초기 프라이머상에서 폴리머라아제의 작용에 의해 합성되는 것이다. 따라서, 주형의 증폭은 또다른 가닥의 가닥 치환 복제를 통해 복제된 가닥의 치환에 의해 일어날 수 있다. 이 과정은 가닥 치환 증폭 또는 가닥 치환 복제로 기술될 수 있다.
바람직한 가닥 치환 복제 방법은 루프-매개 등온 증폭(Loop-mediated isothermal amplification) 또는 LAMP이다. LAMP는 일반적으로 주형 DNA의 6-8개의 별개의 영역을 인식하는 4-6개의 프라이머를 사용하다. 요약하면, 가닥-변위 DNA 폴리머라아제가 합성을 개시하고 프라이머 중 2 개가 루프 구조를 형성하여 후속 증폭 라운드를 용이하게 한다. 표적 DNA의 센스 및 안티센스 가닥의 서열을 포함하는 내부 프라이머가 LAMP를 개시한다. 외부 프라이머에 의해 프라이밍된 후속 가닥 치환 DNA 합성은 단일-가닥 DNA를 방출하다. 이것은 표적의 다른 쪽 말단에 혼성화하는 제2 내부 및 외부 프라이머에 의해 프라이밍된 DNA 합성을 위한 주형으로서 작용하여, 스템-루프 DNA 구조를 생성한다. 후속 LAMP 사이클링에서, 하나의 내부 프라이머가 산물의 루프에 혼성화되고 치환 DNA 합성을 개시하여 원래의 스템-루프 DNA와 스템이 두 배 더 긴 새로운 스템-루프 DNA를 생성한다. 수정된 LAMP 절차도 채택할 수 있고, 이 절차는 더 적은 개수의 내부 프라이머를 필요로 한다.
바람직한 가닥 치환 복제 방법은 RCA(rolling circle amplification)이다. 용어 RCA는 RCA-형 폴리머라아제가 혼성화된 프라이머를 신장시키면서, 환형 DNA 주형 가닥을 따라 지속적으로 진행하는 능력을 기술한다. 프리마아제에 의해 생성되거나, 또는 이중 가닥 주형의 하나의 가닥의 절단(nicking)에 의해 생성된 "프라이머"가 첨가될 수 있다. 이 증폭이 증폭된 DNA의 다중 반복을 갖는 선형 단일 가닥 산물의 형성으로 이어진다. 환형 주형 (단일 유닛)의 서열은 선형 산물 내에서 복수로 반복된다. 환형 주형의 경우, 가닥 치환 증폭의 초기 산물은 단일 가닥 콘카티머(concatamer)이며, 이는 주형의 극성에 따라 센스 또는 안티센스이다. 이러한 선형 단일 가닥 산물은 다중 혼성화, 프라이머 연장 및 가닥 치환 이벤트의 기초로서 작용하여, 콘카티머(concatameric) 이중 가닥 DNA 산물을 형성하고, 이들은 다시 증폭된 DNA의 다중 반복을 포함한다. 따라서, 콘카티머 이중 가닥 DNA 산물에는 각 증폭된 "단일 유닛" DNA의 복수 카피가 존재한다. RCA 폴리머라아제는 본 발명의 방법에 사용하기에 특히 바람직하다. RCA-형 가닥 치환 복제 방법의 산물은 단일 유닛 DNA를 방출하기 위한 가공을 필요로 할 수 있다. 이것은 단일 유닛의 DNA가 필요한 경우 바람직하다. Phi29 DNA 폴리머라아제를 사용하는 전형적인 가닥 치환 조건은 높은 수준의 마그네슘 이온, 예를 들어 0.2 내지 4mM 뉴클레오티드(전형적인 리튬 염 또는 소듐 염으로서 제공되는 경우)와 조합된 10mM 마그네슘 (일반적으로 클로라이드 염으로서)을 포함한다.
증폭을 가능하게 하기 위해, 일부 양태에 따르면 하나 이상의 프라이머가 효소적 DNA 합성에 필요할 수도 있다. 주형을 사용하지 않는 경우, 프라이머가 DNA 합성의 개시점을 고려하고 합성 반응을 개시하도록 설계된다. 주형이 사용되는 경우, 프라이머는 비특이적일 수 있거나 (즉, 서열이 랜덤임) 또는 주형 내에 포함된 하나 이상의 서열에 대해 특이적일 수 있다. 대안적으로, 프라이머를 신생(de novo)으로 생성하기 위해 프리마아제 효소가 공급될 수 있다. 프라이머가 랜덤 서열인 경우, 주형의 어느 부위에서나 비-특이적 개시를 허용한다. 이는 각 주형 가닥에서 다중 개시 반응을 통한 증폭의 고효율을 가능하게 한다. 랜덤 프라이머의 예는 헥사머, 헵타머, 옥타머, 노나머, 데카머 또는 길이가 더 긴 서열, 예를 들어 길이가 12, 15, 18, 20 또는 30 개 뉴클레오티드인 서열이다. 랜덤 프라이머는 길이가 6 내지 30 개, 8 내지 30 개 또는 12 내지 30 개 뉴클레오티드일 수 있다. 랜덤 프라이머는 일반적으로 주형에서 예컨대 헥사머, 헵타머, 옥타머 또는 노나머의 모든 잠재적 조합을 대표하는 올리고뉴클레오티드의 혼합물로서 제공된다.
일 구체예에서, 프라이머 또는 프라이머 중 하나 이상은 특이적이다. 이는 프라이머가 증폭의 개시가 요구되는 주형의 서열에 상보적인 서열을 갖는다는 것을 의미하다. 이 구체예에서, 한 쌍의 프라이머가 2개의 프라이머 결합 부위의 사이에 있는 DNA 주형의 부분을 특이적으로 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 하나의 특이적 프라이머가 사용될 수 있다. 프라이머 세트가 사용될 수 있다.
프라이머는 임의의 핵산 조성일 수 있다. 프라이머는 표지되지 않거나 또는 하나 이상의 표지, 예를 들어 방사성핵종 또는 형광 염료를 포함할 수 있다. 프라이머는 또한 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 캡이 제거될 때까지, 즉 화학적 또는 물리적 수단에 의해 제거될 때까지, DNA 합성의 개시를 방지하기 위해 프라이머가 캡핑될 수 있다. 프라이머 길이/서열은 일반적으로 온도 고려 사항, 즉 증폭 단계에서 이용되는 온도에서 주형에 결합할 수 있는 지에 기초하여 선택할 수 있다. 프라이머는 RNA 프라이머, 예를 들면, 프리마아제에 의해 합성된 프라이머일 수 있다.
특정한 양태에서, 주형과 합성효소 및 하나 이상의 프라이머의 접촉은 주형에 대한 프라이머의 어닐링을 촉진하는 조건에서 일어날 수 있다. 상기 조건은 프라이머의 혼성화를 허용하는 단일-가닥 핵산의 존재를 포함한다. 상기 조건은 또한, 통상적으로 프라이머를 주형에 어닐링할 수 있게 하는 온도 및 완충액을 포함한다. 프라이머의 속성에 따라 적절한 어닐링/혼성화 조건을 선택할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 통상적인 어닐링 조건의 예는 30mM Tris-HCl pH 7.5, 20mM KCl, 8mM MgCl2를 포함하는 완충액을 포함한다. 실시예에서, 본 발명의 뉴클레오티드 복합체와의 반응은 단독 완충제로서 30 mM Tris pH 8.0에서 수행된다. 그러나, 본 발명자들은 프라이머 결합을 여전히 허용하는 감소된 완충액 및 2가 금속 이온 성분을 갖는 조건을 본원에서 기술했으며, 이들은 하기에서 더 검토된다. 어닐링은 열을 이용한 변성 및 뒤이은 원하는 반응 온도로의 점진적 냉각으로 수행될 수 있다.
그러나 가닥 치환 복제를 이용한 증폭은 프라이머 없이도 일어날 수 있고, 따라서, 혼성화 및 프라이머 연장이 일어날 것을 요구하지 않는다. 대신, 단일 가닥 주형은 연장을 위해 이용가능한 유리 3' 말단을 갖는 헤어핀을 형성하는 것에 의해 자가-프라이밍한다. 증폭의 나머지 단계는 동일하게 유지된다. 대안적으로, 이중가닥 주형이 가닥 치환 복제가 프라이머로서 주형의 하나의 가닥을 이용할 수 있도록 닉킹될 수 있다. 당업자는 주형으로부터 증폭의 개시를 제공하는 모든 방법을 알고 있다.
주형 및/또는 폴리머라아제는 또한 본원에서 정의된 뉴클레오티드 복합체로서 뉴클레오티드와 접촉된다. 주형, 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제 및 뉴클레오티드 복합체의 조합이 반응 혼합물을 형성하는 것으로 기술될 수 있다. 반응 혼합물은 또한 하나 이상의 프라이머 또는 프리마아제를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 복합체와 함께 충분히 공급되지 않는 경우, 반응 혼합물은 또한 독립적으로 하나 이상의 2가 금속 양이온을 포함할 수 있다. 반응 혼합물은 화학적 변성제를 더 포함할 수 있다. 이러한 변성제는 포타슘, 암모늄 또는 소듐 히드록시드일 수 있다. 반응 혼합물은 추가적인 효소, 예를 들면, 헬리카아제 또는 피로포스파타아제를 더 포함할 수 있다. 반응 혼합물은 pH 완충제를 포함할 수 있고, 일부 양태에서, 반응 혼합물은 추가적으로 첨가된 pH 완충제를 포함하지 않는다.
뉴클레오티드는 핵산의 단량체 또는 단일 유닛이며, 뉴클레오티드는 함질소 염기(nitrogenous base), 5-탄당 (리보오스 또는 데옥시리보오스), 및 하나 이상의 포스페이트 기로 구성된다. 임의의 적합한 뉴클레오티드를 사용할 수 있다.
뉴클레오티드는 복합체로 존재하고, 따라서, 2가 양이온 및 1가 양이온의 혼합물과 회합된다. 1가 양이온은 단일 양전하를 갖는 이온 종이고, 금속 이온 또는 다원자 이온 (polyatomic ion), 예를 들면, 옥소늄 이온일 수 있다. 2가 양이온은 이중 양전하를 갖는 이온 종이고, 금속 이온 또는 다원자 이온일 수 있다.
반대-이온(counter-ion)은 이온 종의 전하를 부분적으로 또는 완전하게 상쇄시키기 위해 이온 종(본 발명에서 뉴클레오티드)에 수반되거나 또는 그와 회합된 이온이다.
복합체(complex)는 일반적으로 2개 이상의 성분 분자 독립체(molecular entity) (이온성 또는 비전하성), 또는 상응하는 화학종을 포함하는 느슨한 회합에 의해 형성된 분자 독립체(molecular entity)로 이해된다. 복합체는 보다 단순한 물질 (화합물 또는 이온)의 결합(union)에 의해 형성되고, 물리적이 아닌, 화학적 (즉, 특정한 원자 구조의 특이적 특성에 의존적임)인 힘에 의해 유지되는 이온 또는 전기적 중성 분자일 수 있다.
성분들의 결합은 일반적으로 공유 결합에서보다 약하다.
뉴클레오티드 복합체는 알칼리 금속 (1족)을 포함하나, 이에 제한되지 않는 1가 금속 이온을 포함할 수 있다: 리튬 (Li+), 소듐 (Na+), 칼륨 (K+), 루비듐 (Rb+), 세슘 (Cs+) 또는 프란슘 (Fr+). 대안적으로 또는 추가적으로, 1가 금속 이온은 전이 금속 (11족)일 수 있다: 구리 (Cu+),은 (Ag+), 금 (Au+) 또는 뢴트게늄 (Rg+). 알칼리 금속이 바람직하고, 따라서 바람직한 반대-이온은 리튬 (Li+), 소듐(Na+), 칼륨 (K+), 루비듐 (Rb+), 세슘 (Cs+) 또는 프란슘 (Fr+)일 수 있다.
뉴클레오티드 복합체는 다원자 1가 이온을 포함할 수 있다. 다원자 이온은 1개보다 많은 원자를 포함하는 이온이다. 이는 다원자 이온을 단 하나의 원자만을 포함하는 1원자 이온(monatomic ion)으로부터 구별시킨다. 예시적인 다원자 양이온은 옥소늄 이온을 포함한다. 옥소늄 이온은 3개의 결합을 갖는 산소 양이온이다. 가장 단순한 옥소늄 이온은 히드로늄(hydronium) 이온 H3O+이다. 기타 주목할만한 옥소늄 이온은 암모늄 (NH4 +) 및 암모늄의 이온성 유도체를 포함한다. 암모늄의 유도체도 포함되며, 이들의 비-한정적, 예시적 목록은 모노알킬 암모늄, 디알킬 암모늄, 트리알킬 암모늄, 콜린, 4차 암모늄 및 이미다졸리움(imidazolium)을 포함한다. 당업자는 본 발명에서 사용하기에 적합한 단일 양전하를 갖는 암모늄의 추가적 유도체를 알 것이다.
뉴클레오티드 복합체는 2가 양이온을 포함할 수 있다. 복합체에서 뉴클레오티드와 회합된 2가 양이온은 Mg2+, Be2+, Ca2+, Sr2+, Mn2+ 또는 Zn2+,으로 구성된 목록으로 선택된 하나 이상의 금속, 바람직하게는 Mg2+ 또는 Mn2+을 포함할 수 있다. 2가 금속 양이온 대 뉴클레오티드 (뉴클레오티드 이온 또는 뉴클레오티드 이온성 종) 간의 비율은 용액 중 약 1:1일 수 있으나, 바람직하게는 0.2:1 내지 2:1, 선택적으로 0.5:1 내지 1.5:1이다. 1:1보다 높은 비율은 DNA 합성에서 일부 부정확성(infidelity)을 초래할 수 있기 때문에, DNA 합성에서 1:1보다 낮은 비율이 바람직하고 선호된다. 뉴클레오티드 복합체에 대한 2가 양이온의 제공은 따라서 반응 혼합물에 추가적인 2가 양이온을 추가할 필요를 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 그러나, 더 요구되는 경우, 이러한 2가 양이온이 임의의 적절한 염의 형태로 효소에 의한 DNA 합성에 제공될 수 있다.
0.2 내지 2개의 2가 양이온이 뉴클레오티드 복합체와 회합될 수 있다. 이 범위는 뉴클레오티드 복합체당 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 및 2개의 2가 양이온을 포함한다. 당업자는 비-정수는 뉴클레오티드 유리 산 간에 2가 이온의 공유를 나타낸다는 것을 이해할 것이다.
함질소 염기는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C), 및 우라실 (U)일 수 있다. 함질소 염기는 또한 5-메틸시토신 (m5C), 슈도우리딘 (Ψ), 디히드로우리딘 (D), 이노신 (I), 및 7-메틸구아노신 (m7G)과 같은 변형된 염기일 수 있다. 함질소 염기는 또한 인공 염기일 수 있다. 뉴클레오티드 복합체의 농도는 다양한 함질소 염기의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
5-탄당은, 뉴클레오티드가 데옥시뉴클레오티드가 되도록 데옥시리보오스인 것이 바람직하다.
뉴클레오티드는 dNTP로 표시되는 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트의 형태일 수 있다. 이것은 본 발명의 바람직한 구체예이다. 적합한 dNTP는 dATP (데옥시아데노신 트리포스페이트), dGTP (데옥시구아노신 트리포스페이트), dTTP (데옥시티미딘 트리포스페이트), dUTP (데옥시우리딘 트리포스페이트), dCTP (데옥시시티딘 트리포스페이트), dITP (데옥시이노신 트리포스페이트), dXTP (데옥시크산토신 트리포스페이트), 및 그의 유도체 및 변형된 버전을 포함할 수 있다. dNTP는 dATP, dGTP, dTTP 또는 dCTP, 또는 그의 변형된 버전 또는 유도체 중 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하다. dATP, dGTP, dTTP 및 dCTP의 혼합물 또는 그의 변형된 버전을 사용하는 것이 바람직하다. 반응의 필요에 따라 이러한 dNTP의 적절한 비율이 사용될 수 있다.
뉴클레오티드 복합체는 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제와의 혼합 전에 이미 용액에 있을 수 있거나, 또는 분말로서, 예를 들어 분말로서 공급되어야 할 수 있다. 뉴클레오티드 복합체는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 복합체는 하나 이상의 적합한 염기의 혼합물, 바람직하게는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C) 중 하나 이상의 혼합물로 제공될 수 있다. 2종, 3종, 또는 바람직하게는 4종의 뉴클레오티드 (A, G, T 및 C) 모두가 DNA를 합성하는 방법에서 사용된다. 뉴클레오티드 복합체는 모두 실질적으로 동일한 양으로 존재할 수 있거나, 합성될 DNA의 속성에 따라 1종 또는 2종의 더 많은 양이 제공될 수 있다.
뉴클레오티드는 모두 천연 뉴클레오티드 (즉, 변형되지 않음)일 수 있거나, 천연 뉴클레오티드처럼 작용하고 생물학적으로 활성인 변형된 뉴클레오티드 (즉, LNA(locked nucleic acid) 뉴클레오티드-LNA)일 수 있거나, 변형되고 생물학적으로 비활성이거나, 또는 비변형 및 변형 뉴클레오티드의 혼합물, 및/또는 생물학적으로 활성인 뉴클레오티드 및 생물학적으로 비활성인 뉴클레오티드의 혼합물일 수 있다. 뉴클레오티드의 각 타입(즉, 염기)은 하나 이상의 형태, 즉 비변형 및 변형, 또는 생물학적 활성 및 생물학적 비활성 형태로 제공될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 모두가 적절한 복합체를 형성할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 복합체는 적어도 30mM의 농도로 존재한다. 이러한 양태에 따르면, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염은 30mM 초과, 35mM 초과, 40mM 초과, 45mM 초과, 50mM 초과, 55mM 초과, 60mM 초과, 65mM 초과, 70mM 초과, 75mM 초과, 80mM 초과, 85mM 초과, 90mM 초과, 95mM 초과, 또는 100mM 초과의 농도로 반응 혼합물에 존재할 수 있다. 이러한 농도는 공정 개시 또는 시작시의 뉴클레오티드 복합체의 농도로서 제공된다. 농도는 뉴클레오티드/뉴클레오티드 복합체의 첨가 후에 주어지며, 상기 첨가는 반응 혼합물로의 첨가일 수 있다. 뉴클레오티드 복합체는 다양한 함질소 염기와 함께 뉴클레오티드 복합체의 임의의 적절한 혼합물일 수 있다. 농도는, 뉴클레오티드 복합체의 조성과 무관하게, 방법의 개시 시에 존재하는 뉴클레오티드 복합체의 총합에 적용된다. 따라서, 예를 들어, 30mM 농도의 뉴클레오티드 염은 적절한 1가 및 2가 양이온에 의해 반대-이온 회합된(counter-ioned) dCTP, dATP, dGTP 및 dTTP의 임의의 혼합물일 수 있다.
복합체로서 공급되는 뉴클레오티드는 물 및 기타 용매에서 해리되어 음이온성 뉴클레오티드 독립체(entity)(뉴클레오티드 이온, 뉴클레오티드 이온 종)와 회합된 양이온을 형성할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
뉴클레오티드 복합체가 반대-이온의 혼합물에 의해 형성된다는 것이 본 발명의 양태의 바람직한 부분이다.
본 발명의 방법에서 사용되는 뉴클레오티드 복합체는 상이한 양이온 종의 혼합물; 특히, 1종 이상의 2가 양이온과 1종 이상의 1가 양이온을 포함한다. 바람직하게는, 1가 양이온:뉴클레오티드의 비는 0.2:1 내지 2.5:1, 선택적으로, 0.5:1 내지 2:1이다. 바람직하게는, 2가 양이온:뉴클레오티드의 비는 0.2:1 내지 2:1, 선택적으로, 0.5:1 내지 1.5:1, 바람직하게는 0.5:1 내지 최대 1:1이다. 효소적 DNA 합성은 DNA의 합성을 촉진하는 조건 하에 유지될 수 있고, 이는 선택된 특정한 방법에 의존적일 것이다.
가닥 치환을 통한 주형의 증폭이 바람직하다. 바람직하게는, 조건이 또 다른 가닥의 가닥 치환 복제를 통해, 복제된 가닥의 치환에 의해 상기 주형의 증폭을 촉진한다. 상기 조건은 DNA 증폭을 허용하는 임의의 온도, 일반적으로 20 내지 90℃의 범위의 온도의 이용을 포함한다. 바람직한 온도 범위는 약 20℃ 내지 약 40℃, 또는 약 25℃ 내지 약 35℃일 수 있다. LAMP 증폭을 위한 바람직한 온도는 약 50℃ 내지 약 70℃이다.
대체로, 효소적 DNA 합성을 위한 적절한 온도는 특정 폴리머라아제가 최적의 활성을 갖는 온도에 기초하여 선택된다. 이 정보는 일반적으로 이용가능하며 당업자의 일반적인 지식의 일부를 형성한다. 예를 들어, phi29 DNA 폴리머라아제가 사용되는 경우 적절한 온도 범위는 약 25℃ 내지 약 35℃, 바람직하게는 약 30℃이다. 그러나, 열안정성(thermostable) phi29는 더 높은 일정한 온도에서 작동할 수 있다. 당업자는 본 발명의 방법에 따라 효율적인 증폭에 적합한 온도를 일상적으로 확인할 수 있을 것이다. 예를 들어, 상기 방법은 다양한 온도에서 수행될 수 있으며, 주어진 폴리머라아제에 대한 최적 온도 범위를 확인하기 위해 증폭된 DNA의 수율이 모니터링될 수 있다. 증폭은 일정한 온도에서 수행할 수 있으며, 상기 방법은 등온인 것이 바람직하다. 가닥 치환 증폭이 바람직하므로, DNA 가닥을 분리하기 위해 온도를 변경하는 것이 요구되지 않는다. 따라서, 상기 방법은 등온 방법일 수 있다.
DNA 합성을 촉진하는 기타 조건은 통상적으로 효소 성능 또는 안정성을 위해 요구되는 적절한 완충제/pH 및 기타 요인의 존재를 포함하는 것으로 사료된다. 적합한 통상적인 조건은 당해 분야에서 공지된 폴리머라아제 효소의 활성을 제공하기 위해 이용되는 임의의 조건을 포함한다.
예를 들어, 반응 혼합물의 pH는 3 내지 10, 바람직하게는 5 내지 8, 또는 약 7, 예를 들면, 약 7.5의 범위 내에 있을 수 있다. pH는 하나 이상의 완충제(또는 pH 완충제로도 지칭됨)를 사용하여 이 범위로 유지될 수 있다. 완충제의 기능은 pH의 변화를 방지하는 것이다. 이러한 버퍼(완충제)는 MES, Bis-Tris, ADA, ACES, PIPES, MOBS, MOPS, MOPSO, Bis-Tris 프로판, BES, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, Trizma, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, 트리신(Tricine), Gly-Gly, 비신(Bicine), HEPBS, TAPS, AMPD, TABS, AMPSO, CHES, CAPSO, AMP, CAPS, CABS, 포스페이트, 시트르산-인산 수소 나트륨, 시트르산-시트르산 나트륨, 아세트산 나트륨-아세트산, 이미다졸 및 탄산나트륨-중탄산 나트륨을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 앞서 검토된 바와 같이, 반응 혼합물에 추가적인 양이온을 제공하지 않고, 반응 혼합물에 존재하는 금속 양이온과 복합체를 형성하지 않는 완충제가 바람직하다.
완충제는 일반적으로 반응 성분의 혼합물로 정의된다. 일반적으로는 안정된 pH를 유지하기 위한 완충제; 양이온성 및 음이온성 종으로 구성된 하나 이상의 추가 염, 즉 염화나트륨, 염화칼륨; 및/또는 효소의 최적 활성 또는 안정성을 보장하기 위한 Triton-X-100과 같은 디터전트가 포함된다. 최소 완충제(minimal buffer)는 추가 염이나 세제가 제공되지 않은 완충 시약으로만 구성되며, 단, 소량의 양이온성 종이 화학적 변성이 필요한 DNA 합성을 위해 존재할 수 있다. 놀랍게도, 본 발명의 방법에서 더 높은 농도의 뉴클레오티드 염의 사용은 이러한 최소 완충제의 사용을 가능하게 한다.
"무완충제(no buffer)" 시스템은 반응 성분의 혼합물에 제공되거나 또는 정의된 pH 완충제가 없고 추가 염 또는 디터전트가 없다. 이 "완충제 무첨가(no-added buffering agent)" 시스템은 오직 DNA 합성에 필요한 반응 성분만을 포함하고, (필요한 경우) 화학적 변성을 위해서만 제공되는 양이온 종을 포함한다. 따라서, 이 시스템에서는 DNA 합성 반응에서 특정 목적에 사용되는 이온 외에 첨가되는 추가적인 이온이 없다. 뉴클레오티드 (복합체로서)와 함께 제공되는 반대-이온은 방법에서 사용되기 전에 뉴클레오티드를 안정화시키는 역할을 한다.
열의 적용 (95℃에 수분 동안 노출)이 이중 가닥 DNA를 변성시키기 위해 이용되나, DNA 합성에 더 적합한 다른 접근법이 이용될 수 있다. 이중 가닥 DNA는 높거나 낮은 pH 환경, 탈 이온수와 같이 양이온이 없거나 또는 매우 낮은 농도로 존재하는 환경으로의 노출에 의해 쉽게 변성될 수 있다. 폴리머라아제는 복제를 개시하기 위해 짧은 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열의 DNA 주형의 단일 가닥 영역으로의 결합을 필요로 한다. 이러한 상호 작용의 안정성과 따라서 DNA 합성의 효율은 그 방법의 필수적 부분으로 보일 수 있는, 특히 금속 양이온, 및 특히, 마그네슘 (Mg2+) 이온과 같은 2가 양이온에 의해 영향을 받을 수 있다.
효소적 DNA 합성은 추가적인 2가 금속 이온, 즉, 뉴클레오티드 복합체에 외래로 공급되는 2가 양이온의 존재를 필요로 할 수 있다. 이 방법은 2가 금속 이온: 마그네슘 (Mg2+), 망간 (Mn2+), 칼슘 (Ca2+), 베릴륨 (Be2+), 아연 (Zn2+) 및 스트론튬 (Sr2+)의 염의 사용을 포함할 수 있다. DNA 합성에서 가장 자주 사용되는 2가 이온은 마그네슘 또는 망간이고, 이들이 DNA 합성에서 보조-인자로 작용하기 때문이다. 임의의 적절한 음이온이 그러한 염에서 이용될 수 있으나, 음이온의 선택은 반응 혼합물의 pH에 영향을 미칠 수 있고, 적절히 고려되어야 한다는 것에 주의해야 한다.
디터전트가 또한 특정 양태에서 반응 혼합물에 포함될 수 있다. 적합한 디터전트의 예는 Triton X-100TM, Tween 20TM 및 이들의 유도체를 포함한다. 안정화제도 반응 혼합물에 포함될 수 있다. 임의의 적합한 안정화제, 특히 소 혈청 알부민 (BSA) 및 기타 안정화 단백질이 사용될 수 있다. 반응 조건도 DNA를 이완시키고 주형 변성을 더 용이하게 하는 작용제를 첨가하는 것에 의해 개선될 수 있다. 이러한 작용제는 예를 들어 디메틸 술폭시드 (DMSO), 포름아미드, 글리세롤 및 베타인을 포함한다. DNA 축합제(DNA condensing agent)가 또한 반응 혼합물에 포함될 수 있다. 이러한 작용제는 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 또는 양이온성 지질 또는 양이온성 중합체를 포함한다.
그러나, 특정 구체예에서, 이러한 성분들이 예를 들어 최소 완충제 시스템 또는 완충제 무첨가 시스템에서 반응 혼합물로부터 감소되거나 제거될 수 있다.
당업자가 그들의 일반적인 지식에 기초하여 이러한 추가 성분 및 조건을 이용하여 본 발명의 방법을 위한 합성 조건을 변형하고 최적화할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 마찬가지로, 특정한 작용제의 특정 농도는 당해 분야의 이전 예들에 근거하여 선택될 수 있고 일반적인 지식에 근거하여 더 최적화될 수 있다.
예로서, 당해 분야에서 RCA-기반 방법에 사용되는 적합한 반응 완충제는 50mM Tris HCl, pH 7.5, 10mM MgCl2, 20mM (NH4)2SO4, 5 % 글리세롤, 0.2mM BSA, 1mM dNTP이다. RCA 증폭에 사용되는 바람직한 반응 완충제는 일반적으로 30mM Tris-HCl pH 7.9, 30mM KCl, 7.5mM MgCl2, 10mM (NH4)2SO4, 4mM DTT, 2mM dNTP들이다. 이 완충제는, 통상적인 뉴클레오티드가 구입되는 경우, Phi29 DNA 폴리머라아제와 함께 사용하기에 특히 적합하다.
본 발명의 뉴클레오티드 복합체와 함께 사용하기에 적합한 반응 완충제는 60mM Tris pH 8.0이다. 또 다른 적합한 반응 완충제는 60mM Tris pH 8.0이다. 또 다른 적합한 반응 완충제는 30 mM Tris pH 8.0이다. 대안적인 조건은 30mM Tris HCl, pH 7.9, 5mM (NH4)2SO4, 및 30mM KCl을 포함한다. 특정 상황에서, 효소적 DNA 합성은 물에서 수행될 수 있다( "완충제 무첨가(non-added buffering agent)").
효소적 DNA 합성은 또한 하나 이상의 추가적인 단백질의 사용을 포함할 수 있다. 주형은 효모 무기 피로포스파타아제와 같은 적어도 하나의 피로포스파타아제 의 존재하에 증폭될 수 있다. 2종, 3종, 4종, 5종, 또는 그 이상의 상이한 피로포스파타아제가 사용될 수 있다. 이들 효소는 가닥 복제 동안 dNTP로부터 폴리머라아제에 의해 생성된 피로포스페이트를 분해할 수 있다. 반응 중 피로포스페이트의 축적은 DNA 폴리머라아제의 억제를 유발하고, DNA 증폭의 속도 및 효율이 저하시킬 수 있다. 피로인산가수분해효소는 피로인산염을 비-억제성 인산염으로 분해할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 피로포스파타아제의 예는 New England Biolabs, Inc.로부터 상업적으로 이용가능한 사카로마이세스 세레비지에 피로포스파타아제(Saccharomyces cerevisiae pyrophosphatase)이다.
단일 가닥 DNA를 안정화시키기 위해 임의의 단일 가닥 결합 단백질 (SSBP)이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. SSBP는 살아있는 세포의 필수 구성 요소이며 DNA 복제, 복구 및 재조합과 같이 ssDNA와 관련된 모든 과정에 참여하다. 이러한 과정에서, SSBP는 일시적으로 형성된 ssDNA에 결합하여 ssDNA 구조를 안정화하는 것을 도와줄 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 SSBP의 예는 New England Biolabs, Inc.로부터 상업적으로 이용가능한 T4 유전자 32 단백질이다.
반응의 수율은 합성된 DNA의 양과 관련된다. 본 발명에 따른 방법으로부터 예상되는 수율은 3g/l를 초과할 수 있다. 합성되는 DNA의 양은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30g/l 이상인 것이 바람직하다. 합성되는 DNA의 바람직한 양은 5g/l이다. 30 mM 뉴클레오티드 복합체가 9.74 g/l DNA를 생성할 수 있다. 본 발명은 DNA의 효소적 합성으로부터 가능한 수율을 개선시킨다. 본 발명의 목적은 비용 효율적인 방식으로 DNA를 대규모로 합성할 수 있도록 무세포 효소적 DNA 합성 방법의 수율을 개선시키는 것이다. 본 발명은 DNA 합성 효소 또는 폴리머라아제에 의해 촉매되는 효소 공정을 이용하여 산업적 규모로 경제적으로 DNA를 제조/합성할 수 있게 한다. 본 발명의 방법은 뉴클레오티드의 DNA 산물로의 효율적인 혼입을 가능하게 한다. 본 발명의 방법은 반응 혼합물이 수십 리터를 포함한, 수 리터로 확장될 수 있게 할 것으로 사료된다. 개선된 수율, 생산성 또는 공정성은 모든 뉴클레오티드가 1가 양이온 반대이온(일반적으로 리튬 또는 소듐)에 의한 염으로 공급되는 것인 동일한 반응 혼합물에 비교될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 DNA 합성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 증진은 사용된 모든 뉴클레오티드 복합체는 배타적으로 1가 양이온 반대이온 또는 이들의 혼합물인 것을 제외하고는 동일한 반응 혼합물에 비교될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 뉴클레오티드 복합체의 존재 하에 DNA 주형을 1종 이상의 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제와 접촉시키는 단계를 포함하는, DNA를 합성하는 무세포 방법으로서, 상기 뉴클레오티드 복합체 각각은 0.2 내지 2개의 2가 양이온 및 0.2 내지 2.5개의 1가 양이온과 회합되는 것인 방법을 제공한다.
본원에서 언급되는 뉴클레오티드의 농도는 방법의 개시 시 뉴클레오티드의 출발 농도, 반응 혼합물이 형성된 때의 초기 농도인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, 30 mM 초과의 농도의 하나 이상의 뉴클레오티드 복합체의 존재 하에 DNA 주형을 하나 이상의 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제와 접촉시키는 단계를 포함하는, DNA를 합성하는 무세포 방법에 관한 것일 수 있다. 본 발명은 복합체로서 공급되는 뉴클레오티드의 사용을 포함하는, DNA의 효소적 합성을 위한 무세포 방법으로서, 상기 복합체 각각은 0.2 내지 2개의 2가 양이온 및 0.2 내지 2.5개의 1가 양이온과 회합된 뉴클레오티드이고, 바람직하게는 상기 뉴클레오티드 복합체는 30 mM 초과의 농도로 수득되거나, 공급되거나, 또는 존재하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 뉴클레오티드 복합체의 사용을 포함하는, 추가적으로 공급되는 2가 양이온, 바람직하게는 마그네슘이 감소되거나, 또는 없는 조건 하에 수행되는 효소적 DNA 합성으로서, 상기 복합체 각각은 0.2 내지 2개의 2가 양이온 및 0.2 내지 2.5개의 1가 양이온과 회합된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 효소적 DNA 합성을 제공한다. 상기 뉴클레오티드 복합체 중 2가 양이온의 제공은 상기 방법에서 2가 양이온의 추가적 사용을 피한다. 그러나, 특정한 상황에서, 본 발명의 복합체를 사용하여, 2가 양이온 염, 예를 들면, 마그네슘의 양이 감소된다.
하기에서 본 발명은 여러 비-한정적 실시예를 참조하여 기술될 것이다.
실시예 1
DNA 합성에 대한 뉴클레오티드 복합체 중 1가 양이온 농도의 효과
재료 및 방법
시약
공급된 하기 시약들이 제시된 실시예들에서 사용되었다:
용액 1- 100mM dATP:4Na+
용액 2- 100mM dCTP:4Na+
용액 3- 100mM dGTP:4Na+
용액 4- 100mM dTTP:4Na+
용액 5- 100mM dATP:4NH4 +
용액 6- 100mM dCTP:4NH4 +
용액 7- 100mM dGTP:4NH4 +
용액 8- 100mM dTTP:4NH4 +
용액 9- 25mM dATP:1.6Mg2+
용액 10- 61mM dCTP:2.0Mg2+
용액 11- 34mM dGTP:1.8Mg2+
용액 12- 91mM dTTP:2.5 Mg2+
Phi29 DNA 폴리머라아제, 스톡 농도 5.6 g/L (자체 생산)
열안정성 피로포스파타아제, 스톡 농도 2000 U/ml (Enzymatics)
DNA 프라이머, 스톡 농도 5 mM (Oligofactory)
플라스미드 주형: ProTLx-K B5X4 LUX 15-0-15-10-15 AT-STEM, 스톡 농도 0.832 g/L (자체 생산)
뉴클레아제 프리 물(Nuclease free water) (Sigma Aldrich)
1M NaOH (Sigma Aldrich)
마그네슘 아세테이드, 스톡 농도 1M (Sigma Aldrich)
Tris-염기 (Thermo Fisher Scientific)
Tris-HCl (Sigma Aldrich)
NaCl (Sigma Aldrich)
EDTA, 스톡 농도 0.5 M (Sigma Aldrich)
PEG 8000 (AppliChem)
dNTP 믹스의 제조
소듐 복합체 (dNTP:4Na+) 및 암모늄 복합체 (dNTP: 4NH4 +)의 경우, 개별적인 dNTP (각각 용액 1, 2, 3, 4, 및 5, 6, 7, 8)를 1:1:1:1로 혼합하여 100mM dNTP 혼합물의 스톡 용액을 생성하였다. dNTP 믹스를 사용될 때까지 -20℃에 보관했다.
소듐/마그네슘 복합체 (dNTP:Na+/Mg2+) 및 암모늄/마그네슘 복합체 (dNTP:NH4 +/Mg2+)의 경우, dNTP를 하기와 같이 혼합하여 각각의 모노뉴클레오티드의 등몰량을 제공했다.
표 1: 1가:2가 dNTP 믹스를 형성하기 위해 사용된 dNTP의 부피
표 1
마그네슘 dNTP 복합체 암모늄 또는 소듐 dNTP 복합체
dNTP [dXTP] mM Volume (㎕) dNTP [dXTP] mM Volume (㎕)
dATP (용액 9) 25 1820 dATP (용액 1 또는 5) 100 455
dCTP (용액 10) 61 745 dCTP (용액 2 또는 6) 100 455
dGTP (용액 11) 34 1338.2 dGTP (용액 3 또는 7) 100 455
dTTP (용액 12) 91 500 dTTP (용액 4 또는 8) 100 455
표시된 부피로 표 1의 용액을 혼합하여 Mg2+와 1:1 및 Na+ 또는 NH4 +와 1:2의 비율인 58 mM dNTP의 스톡 용액을 생성한다. 100mM dNTP 믹스의 최종 스톡 농도를 달성하기 위해, 60℃의 온도에서 작동되는 Eppendorf SpeedVac Concentrator Plus를 이용하여 6223㎕의 최종 부피를 3640㎕로 감소시켰다.
dNTP:Mg2+의 낮은 용해도 때문에, dNTP와 복합체화된 마그네슘만을 이용하여 하기 실험을 수행하는 것은 가능하지 않았다.
DNA 증폭 반응 셋업
반응을 500 ㎕ 스케일로 하기와 같이 셋업했다: 변성 믹스를 제조하고, 반응 믹스를 조합하는 동안 실온에 두었다. 그 후, 이들을 혼합하고, DNA 폴리머라아제 및 피로포스파타아제를 첨가했다. 그 후, 60mM Tris, pH 8.0을 포함하는 반응 완충액에서 다양한 dNTP 농도에서 DNA 증폭 실험을 수행했다. 소듐 및 암모늄 복합체된 dNTP (즉, dNTP:4Na+ 및 dNTP:4NH4 +)를 위해, 등몰량의 마그네슘 아세테이트를 반응 믹스에 첨가하고, 전술된 바와 같이, 소듐과 마그네슘 또는 암모늄과 마그네슘과 복합체화된 dNTP를 위해, 추가적인 마그네슘을 반응 믹스에 공급하지 않았다. 표 2는 DNA 합성 반응을 위한 실험 프로토콜을 보여준다.
dNTP 상의 1가 반대 이온을 감소시키는 것이 더 높은 dNTP 사용을 초래하는지 여부를 결정하기 위해 실험을 수행했다. 30℃의 온도에서 168 시간 (1주) 동안 반응을 진행하고 뒤이어 가공 및 정량화를 수행했다.
표 2 - 1가- 및 2가-양이온 dNTP 복합체의 효과를 조사하기 위한 RCA (Rolling Circle Amplification) 반응 성분들에 의한 DNA 합성.
시약 스톡 농도 부피 최종 반응 농도
변성 믹스 (Denaturation mix) 플라스미드 주형 0.832 g/l 1.2 ㎕ 2 ng/㎕
NaOH 1 M 2.5 ㎕ 5 mM
DNA 프라이머 5 mM 5 ㎕ 50 μM
H2O 18.8 ㎕ 25 ㎕가 되게 하는 양
반응 믹스 Tris pH 8,0 1M 30㎕ 60mM
dNTP 염 100 mM 가변적 가변적- 표시된 바와 같음
H2O 가변적 총 500 ㎕가 되게 하는 양
효소 1 Phi29 DNA 폴리머라아제 5.6 g/l 0.25 ㎕
효소 2 피로포스파타아제 2000 U/ml 0.25 ㎕ 0.4 U
시료 처리 절차
900 ㎕의 부피까지 168시간의 RCA 후에 222 mM EDTA를 첨가했다. 300 ㎕의 물을 첨가하고 4시간 동안 "엔드 오버 엔드(end over end)" 회전 믹서에서 혼합시켰다. 400 ㎕의 5M NaCl을 첨가하고, 뒤이어 400 ㎕의 50 % PEG 8000 (w/v)을 첨가했다. 반응 튜브를 15분 동안 강하게 진탕시키고, 뒤이어 4시간 동안 더 회전 믹싱시켰다. 벤치-탑(bench-top) 원심분리기에서 10분 동안 13,000 rpm에서의 원심분리에 의해 침전된 DNA를 회수했다. 상층액을 조심스럽게 따라내고, 펠렛을 엔드-오버-엔드 믹서에서 9000 ㎕의 물에 밤새 재현탁시켰다. 나노드롭(nanodrop) 분광광도계에서 UV 흡광도 측정으로부터 반응 DNA 농도를 정량했다. 데이터를 반응 부피의 18x 배수(fold) 증가에 대해 보정하고, 농도를 사용된 dNTP 농도 대비 최초 부피의 l당 g (g/l)으로 표현한다.
결과
표 3- 상이한 농도에서 상이한 dNTP 양이온 복합체에 의한 DNA 수율. 피크 수율(peak yield)이 진하게 하이라이트됨
원시(Raw) DNA 수율 (g/l)

dNTP:4Na+ dNTP:2Na.Mg2+ dNTP:4NH4 + dNTP:2NH4 +.Mg2+
10mM 2.863 1.900 미 수행 미 수행
20mM 5.436 3.649 5.870 4.165
30mM 7.611 4.938 9.57 8.402
40mM 5.332 6.606 9.867 9.119
50mM 1.214 7.817 3.997 9.569
60mM 0.918 9.218 1.781 12.137
70mM 0.926 10.164 1.597 12.042
80mM 1.394 11.106 1.798 13.426
표 4- 상이한 농도에서 상이한 dNTP 양이온 복합체에 의한 DNA 효율.
혼합(incorporation) 효율 (%)
dNTP:4Na+ dNTP:2Na.Mg2+ dNTP:4NH4 + dNTP:2NH4 +.Mg2+
10mM 88.1 58.5 미 수행 미 수행
20mM 83.6 56.1 90.3 64.1
30mM 78.1 50.6 98.2 86.2
40mM 41.0 50.8 75.9 70.1
50mM 7.5 48.1 24.6 58.9
60mM 4.7 47.3 9.1 62.2
70mM 4.1 44.7 7.0 52.9
80mM 5.4 42.7 6.9 51.6
표 3의 데이터 (도 1에서 그래프로 및 물리적으로 나타냄)는 마그네슘 양이온의 첨가에 의해 dNTP 복합체 중 1가 소듐의 농도를 감소시키면, 생산된 원시 DNA(raw DNA)의 증가가 있다는 것을 보여준다. 1가/2가 혼합물, 즉, dNTP:2Na+.Mg2+에 의해 반대이온 처리된(counterioned) dNTP를 이용하는 것에 의해, 각각 dNTP 사용의 최고 수준이 표준 dNTP:4Na+에 의한 30 mM로부터 80 mM 이상으로 증가되고, DNA 수율은 7.611g/l의 피크로부터 11.106 g/l까지 증가된다. dNTP의 DNA로의 전환의 효율은 dNTP:4Na+ 대비 더 낮은 농도에서 dNTP:2Na+.Mg2+ 믹스에 대해 더 낮았으나, 실험 조건의 범위 전체에서, 전체 효율의 감소는 dNTP:2Na+.Mg2+의 경우 더 낮았다 (표 4). DNA 점도는 또한 168시간의 증식 후에 관찰되었고, dNTP:2Na+.Mg2+가 최대 80mM까지 점성 DNA 물질을 생산하고, dNTP:4Na+는 40 mM에서 피크에 도달하고, 더 높은 농도의 dNTP가 저 점도 물질을 생산한다는 것을 알 수 있다.
상응하는 소듐 복합체화 dNTP 대비, 암모늄 dNTP 복합체 (dNTP:4NH4 +)의 사용은 피크 생산을 더 높게 40 mM dNTP 농도까지 변화시켜 9.867g/l의 원시 수율(raw yield)을 생산하고, 이는 상응하는 소듐에 의해 균형된(counterbalanced) dNTP (dNTP:4Na+)보다 약 2배 더 높다. .
그러나, dNTP:2NH4 +.Mg2+ 복합체는 사용을 80 mM까지 더 증가시켰고 13.426 g/l 이상으로의 수율 증가를 초래했다. 또한, 도 2c 및 2d에서 알 수 있는 바와 같이, dNTP:2NH4 +.Mg2+ 복합체의 사용은 또한 DNA 점도에 의해 보여진 바와 같이 DNA 생산의 증가된 속도를 가져온다. 18시간 후에, dNTP:4NH4 + 반응은 최대 30 mM의 농도까지 고점도 물질(highly viscous material)을 생산했고, dNTP:2NH4 +.Mg2+ 반응은 60mM에 도달했다. 106 시간 후에, dNTP:2NH4 +.Mg2+의 모든 농도는 고점도 물질을 생산했고, dNTP:4NH4 +는 최대 40 mM까지 고점도 물질을 생산했다. 이 시점 이후로 점도의 추가적 증가는 관찰되지 않았다.
DNA가 합성된 후 반응 혼합물의 점도를 보여주는 도면이 해당 방법이 합성할 수 있는 DNA의 양의 시각적 표현이다. DNA 합성이 이루어지면, 튜브를 뒤집었다. DNA가 전혀 또는 거의 합성되지 않은 경우, 반응 혼합물은 점성화되지 않고, 반응 혼합물은 튜브의 캡에서 수집된다. 충분한 양의 DNA가 생산되는 경우, 반응 혼합물은 매우 점성화되어, 튜브를 뒤집을 수 있고, 상기 반응 혼합물이 튜브에서 제자리에 유지될 수 있게 한다. DNA가 많을수록, 반응 혼합물은 점도가 더 높고, 튜브에서의 유지가 더 크다. 약간 덜 점성인 산물은 튜브가 뒤집히면 튜브의 내부에서 흘러 내리기 시작한다는 것을 알 수 있다.
실시예 2
다양한 농도에서 마그네슘과의 뉴클레오티드 복합체 중 상이한 1가 양이온의 DNA 수율에 대한 효과
재료 및 방법
시약
공급된 하기 시약들을 제시된 실시예에서 사용했다:
용액 1 - 100mM dATP:4K+
용액 2 - 100mM dCTP:4K+
용액 3 - 100mM dGTP:4K+
용액 4 - 100mM dTTP:4K+
용액 5 - 100mM dATP:4Cs+
용액 6 - 100mM dCTP:4Cs+
용액 7 - 100mM dGTP:4Cs+
용액 8 - 100mM dTTP:4Cs+
용액 9 - 200mM dATP:4NH4 +
용액 10 - 200mM dCTP:4NH4 +
용액 11 - 200mM dGTP:4NH4 +
용액 12 - 200mM dTTP:4NH4 +
용액 13 - 66 mM dATP:2Mg2+
용액 14 - 59 mM dCTP:2Mg2+
용액 15 - 64 mM dGTP:2Mg2+
용액 16 - 74 mM dTTP:2Mg2+
Phi29 DNA 폴리머라아제, 스톡 농도 5.6 g/L (자체 생산)
열안정성 피로포스파타아제, 스톡 농도 2000 U/ml (Enzymatics)
DNA 프라이머, 스톡 농도 5 mM (Oligofactory)
플라스미드 주형: ProTLx-K B5X4 LUX 15-0-15-10-15 AT-STEM, 스톡 농도 0.832 g/L (자체 생산)
뉴클레아제 프리 물 (Sigma Aldrich)
1M NaOH (Sigma Aldrich)
PEG 8000 (Applichem)
Tris-Base (Thermo Fisher Scientific)
Tris-HCl (Sigma Aldrich)
NaCl (Sigma Aldrich)
dNTP 믹스의 제조
포타슘 (dATP:4K+), 세슘 (dATP:4Cs+) 및 암모늄 (dATP:4NH4 +) 복합체의 경우, 개별적인 dNTP (용액 1 내지 용액 12)를 1:1:1:1로 혼합하여 포타슘 및 세슘에 대한 100 mM dNTP 혼합물의 스톡 농도, 및 암모늄에 대한 200 mM dNTP 혼합물을 생성했다. 수득된 믹스를 -20℃에서 보관했다.
마그네슘 혼합 복합체 (즉, dNTP: K+/Mg2+ 또는 Cs+/Mg2+ 또는 NH4 +/Mg2+)의 경우, dNTP를 각각의 특정한 뉴클레오티드 (즉, dATP, dCTP, dGTP & dTTP)의 등몰량을 제공하도록 혼합했다.
표 5
마그네슘 dNTP 복합체 포타슘 또는 세슘 dNTP 복합체
dNTP [dXTP] mM 부피 (㎕) dNTP [dXTP] mM 부피 (㎕)
dATP (용액 13) 66 1515 dATP (용액 1 또는 5) 100 1000
dCTP (용액 14) 59 1695 dCTP (용액 2 또는 6) 100 1000
dGTP (용액 15) 64 1563 dGTP (용액 3 또는 7) 100 1000
dTTP (용액 16) 74 1351 dTTP (용액 4 또는 8) 100 1000
표 6
마그네슘 dNTP 복합체 암모늄 dNTP 복합체
dNTP [dXTP] mM Volume (㎕) dNTP [dXTP] mM Volume (㎕)
dATP (용액 13) 66 1515 dATP (용액 9) 200 500
dCTP (용액 14) 59 1695 dCTP (용액 10) 200 500
dGTP (용액 15) 64 1563 dGTP (용액 11) 200 500
dTTP (용액 16) 74 1351 dTTP (용액 12) 200 500
마그네슘 뉴클레오티드를 각 뉴클레오티드의 등몰량을 제공하도록 혼합했다. 부피는 각 뉴클레오티드의 100 mM에 해당하여, 최종 부피는 4000㎕였다.
세슘 및 포타슘 뉴클레오티드의 경우, 60℃에서 Speedvac에서 6124㎕의 최종 부피를 분말 (즉, 0 ㎕)로 감소시켰다. 수득된 분말을 표 5에 상술된 바와 같이 세슘 또는 포타슘 프리-믹스 뉴클레오티드를 이용하여 4000㎕의 최종 부피까지 재현탁시켜, 200mM K+/Mg2+ 또는 Cs+/Mg2+ dNTP를 생성시켰다.
암모늄 뉴클레오티드의 경우, 60℃에서 Speedvac에서 6124㎕의 최종 부피를 분말 (즉, 0 ㎕)로 감소시켰다. 수득된 분말을 표 6에 상술된 바와 같이 암모늄 프리-믹스 뉴클레오티드를 추가적인 2000㎕ H2O와 함께 이용하여 4000㎕의 최종 부피까지 재현탁시켜, 200mM NH4 +/Mg2+ dNTP를 생성시켰다.
DNA 증폭 반응 셋업
반응을 500 ㎕ 스케일로 하기와 같이 셋업했다: 변성 믹스를 제조하고, 반응 믹스를 조합하는 동안 실온에 15분 동안 두었다. 이들을 혼합하고, DNA 폴리머라아제 및 피로포스파타아제를 첨가했다. 그 후, 30mM pH 8.0 Tris 완충액을 첨가하고 다양한 dNTP 농도에서 DNA 증폭 실험을 수행했다. 반응을 5개의 100 ㎕ 분량(aliquot)으로 나누고, 48, 72, 96, 120 및 144 시간 후에 중단시켰다. 중단 후에, 시료를 즉시 하기에 상술된 바와 같이 가공했다.
1가-반대이온 복합체화 dNTP (예를 들면, 포타슘 dNTP)의 경우, 등몰량의 염화 마그네슘을 반응 믹스에 첨가했다. 전술된 바와 같이, 1가 반대이온 (즉, NH4 +, K+, Cs+) 및 마그네슘에 의해 복합체화된 dNTP의 경우, 반응 믹스에 추가적인 마그네슘을 공급하지 않았다. 표 5는 1가-복합체화 dNTP (NH4 +, K+ & Cs+) 반응 셋업을 위한 실험 프로토콜을 보여주고, 표 6은 혼합 복합체화 dNTP (NH4 +/Mg2+, K+/Mg2+ & Cs+/Mg2+)에 대한 반응 셋업을 보여준다.
dNTP 상 1가 반대 이온을 감소시키는 것이 더 높은 dNTP 사용을 초래하는지 여부를 결정하기 위해 실험을 수행했다. 30℃의 온도에서 특정된 시간 동안 반응을 진행시키고 뒤이어 가공 및 정량화를 수행했다.
표 7 - 1가- 및 2가-양이온 dNTP 복합체의 효과를 조사하기 위한 RCA (Rolling Circle Amplification) 반응 성분들에 의한 DNA 합성.
시약 스톡 농도 부피 최종 반응 농도
변성 믹스 (Denaturation mix) 플라스미드 주형 0.832 g/l 1.2 ㎕ 2 ng/㎕
NaOH 1 M 2.5 ㎕ 5 mM
DNA 프라이머 5 mM 5 ㎕ 50 μM
H2O 18.8 ㎕ 25 ㎕가 되게 하는 양
반응 믹스 Tris pH 8.0 1M 15 ㎕ 30mM
1가 dNTP 염 100 mM 가변적 가변적 - 표시된 바와 같음
MgCl2 2000 mM 가변적 dNTP 몰 농도와 등몰 수준
H2O 가변적 총 500 ㎕가 되게 하는 양
효소 1 Phi29
DNA 폴리머라아제		 5.6 g/L 0.25 ㎕
효소 2 피로포스파타아제 2000 U/mL 0.5 ㎕ 1U
표 8 - 1가- 및 2가-양이온 dNTP 복합체의 효과를 조사하기 위한 RCA (Rolling Circle Amplification) 반응 성분들에 의한 DNA 합성.
시약 스톡 농도 부피 최종 반응 농도
변성 믹스 플라스미드 주형 0.832 g/l 1.2 ㎕ 2 ng/㎕
NaOH 1 M 2.5 ㎕ 5 mM
DNA 프라이머 5 mM 5 ㎕ 50 μM
H2O 18.8 ㎕ 25 ㎕가 되게 하는 양
반응 믹스 Tris pH 8.0 1M 15 ㎕ 30mM
혼합 dNTP 염 200 mM 가변적 가변적 - 표시된 바와 같음
H2O 가변적 총 500 ㎕가 되게 하는 양
효소 1 Phi29
DNA 폴리머라아제		 5.6 g/L 0.25 ㎕
효소 2 피로포스파타아제 2000 U/mL 0.5 ㎕ 1U
시료 가공 절차
각 분량에, 희석을 위해 900 ㎕의 물을 첨가하고, 200㎕ 5M NaCl 및 500㎕의 25% PEG 8000를 첨가하고, 15분 동안 강하게 진탕시키고 뒤이어 1시간 동안 추가적인 회전 혼합을 수행하여 용액을 혼합했다. 마이크로원심분리기(microcentrifuge)에서 원심분리 (13,000rpm, 30분)에 의해 DNA를 펠렛화했다. 상층액을 조심스럽게 따라내고, 펠렛을 강한 진탕 및 공기-치환 피펫팅(air-displacement pipetting)에 의해 1000 ㎕ 물에 재현탁시켰다. 해당 일의 종료 시에 나노드랍 분광광도계에서 UV 흡광도 측정으로부터 반응 DNA 농도를 정량하고, 밤새 회전되도록 방치했다. 아침에 시료를 재확인했고, 전날로부터의 차이가 보고된 것은 없었다.
반응 부피의 10x 증가에 대해 데이터를 보정하고, 농도를 사용된 dNTP 농도 대비 최초 부피의 l당 g으로 표현한다. 그러나, 매우 높은 점성의 DNA 겔을 완전히 재현탁시키고 가용화시키는 것의 큰 어려움 때문에 높은 DNA 수율이 과소평가될 수 있다.
결과
표 9- 상이한 농도의 상이한 DNA 양이온 복합체에 의한 DNA 수율.
원시 DNA 수율(Raw DNA Yield) (g/l)
　 dNTP:4K+ dNTP:2K+.Mg2+ dNTP:4NH4 + dNTP:2NH4 +.Mg2+ dNTP:4Cs+ dNTP:2Cs+.Mg2+
5mM 1.65 1.11 1.24 1.10 1.18 1.12
10mM 3.09 2.16 2.64 2.54 2.95 2.52
20mM 5.52 4.65 5.18 3.98 5.69 3.88
30mM 7.76 7.40 7.39 5.88 7.55 5.45
40mM 1.41 7.60 9.78 9.26 7.65 7.68
80mM 1.76 11.12 1.62 13.35 1.90 9.40
100mM 미 수행(Not performed) 2.31 1.99 15.89 미 수행 7.75
120mM 미 수행 2.00 2.20 6.98 미 수행 2.15
표 10- 상이한 농도의 상이한 dNTP 양이온에 의한 DNA 효율.
　 혼입(Incorporation) 효율 (%)
　 dNTP:4K+ dNTP:2K+.Mg2+ dNTP:4NH4 + dNTP:2NH4 +.Mg2+ dNTP:4Cs+ dNTP:2Cs+.Mg2+
5mM 101.5% 68.3% 76.3% 67.7% 72.6% 68.9%
10mM 95.1% 66.5% 81.2% 78.2% 90.8% 77.5%
20mM 84.9% 71.5% 79.7% 61.2% 87.5% 59.7%
30mM 79.6% 75.9% 75.8% 60.3% 77.4% 55.9%
40mM 10.8% 58.5% 75.2% 71.2% 58.8% 59.1%
80mM 6.8% 42.8% 6.2% 51.3% 7.3% 36.2%
100mM 미 수행 7.1% 6.1% 48.9% 미 수행 23.8%
120mM 미 수행 5.1% 5.6% 17.9% 미 수행 5.5%
표 9의 데이터는 마그네슘 양이온의 첨가에 의해 dNTP 복합체 중 1가 반대이온의 농도를 감소시키는 것에 의해, 생산되는 원시 DNA의 증가가 있다는 것을 보여준다.
1가/2가 혼합물의 혼합된 반대이온을 갖는 dNTP, 즉, dNTP:2K+.Mg2+를 사용하는 것에 의해, dNTP 사용의 수준은 표준 dNTP:4K+에 의한 30mM로부터 80mM 이상까지 증가했고, DNA 수율은 7.76 g/l의 피크로부터 11.12 g/l까지 증가했다 (표 9).
dNTP의 DNA로의 전환의 효율은 dNTP:4K+에 비해 더 낮은 농도에서 dNTP:2K+.Mg2+ 믹스에 대해 더 낮았으나, 전체 효율의 감소는 실험 조건의 범위에서 dNTP:2K+.Mg2+의 경우가 더 낮았다 (표 10).
1가/2가 혼합물의 혼합된 반대이온을 갖는 dNTP를 사용하는 것에 의해, 암모늄 dNTP:2NH4 +.Mg2+의 경우, dNTP 사용의 수준이 표준 dNTP:4NH4 +에 의한 40mM로부터 100mM 이상까지 증가했고, DNA 수율은 9.78 g/l의 피크로부터 15.89 g/l까지 증가했다 (표 9).
dNTP의 DNA로의 전환의 효율은 dNTP:4NH4 +에 비해 더 낮은 농도에서 dNTP:2NH4 +.Mg2+ 믹스에 대해 더 낮았으나, 전체 효율의 감소는 실험 조건의 범위에서 dNTP:2NH4 +.Mg2+의 경우가 더 낮았다 (표 10).
1가/2가 혼합물의 혼합된 반대이온을 갖는 dNTP를 사용하는 것에 의해, 세슘 dNTP:2Cs+.Mg2+의 경우, dNTP 사용의 수준이 표준 dNTP:4Cs+에 의한 40mM로부터 100mM 이상까지 증가했고, DNA 수율은 7.65 g/l의 피크로부터 9.40 g/l까지 증가했다.
dNTP의 DNA로의 전환의 효율은 dNTP:4Cs+에 비해 더 낮은 농도에서 dNTP:2Cs+.Mg2+ 믹스에 대해 더 낮았으나, 전체 효율의 감소는 실험 조건의 범위에서 dNTP:2Cs+.Mg2+의 경우가 더 낮았다 (표 10).
이 실험은 소듐 (Na+) 대신에 1가 양이온 포타슘 (K+) 및 세슘 (Cs+)을 사용한 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 1의 반복이었다. 증가된 농도의 뉴클레오티드를 최대 120mM까지 테스트했고, 생산된 총 DNA를 측정하는 것에 의해 2 내지 6일 동안 반응을 모니터링했다. 이 실험은 또한 암모늄 양이온 (NH4 +)의 사용을 포함하여 실험 1을 반복했으나, 뉴클레오티드의 농도를 120mM로 증가시켰다.
뉴클레오티드 복합체 dNTP:2K+.Mg2+, dNTP:2Cs+.Mg2+ 및 dNTP:2NH4 +.Mg2+을 이용한 DNA 수율을 각각 대조군인 순수한 1가 양이온 뉴클레오티드 복합체 dNTP:4K+, dNTP:4Cs+ 및 dNTP:4NH4 +에 의해 수득된 DNA 수율과 비교했다. 대조군 실험에서, 뉴클레오티드에 대한 등몰량의 마그네슘 (Mg2+)을 염, 염화 마그네슘의 형태로 제공했다.
도 3a, 3b, 및 3c는 최대 6일의 기간 동안 상이한 1가 양이온/2가 양이온 뉴클레오티드 복합체를 이용한 DNA 생산의 그래프를 보여주고, 수집된 데이터로부터의 최대 수율을 플롯팅했다. 도 4는 뉴클레오티드 복합체의 각 농도에서 최대 DNA 수율을 보여주는 결과를 요약한다. 모든 경우에, 고수율의 DNA는 1가 양이온/마그네슘 뉴클레오티드 복합체가 사용된 경우 더 높은 개시 뉴클레오티드 농도에서만 생산될 수 있다는 것을 명확하게 알 수 있다. 가장 큰 효과는 암모늄/마그네슘 뉴클레오티드 복합체에서 관찰되었고, 100 mM의 개시 농도로부터 16g/l DNA가 생산되었다.
대조군 실험 대비 이 복합체들을 이용하는 것은 반응에서 1가 양이온의 농도를 감소시킬 뿐 아니라, 마그네슘 염 상의 음이온을 제거한다. 따라서, 이온 강도가 유의성있게 감소시킨다.
실시예 3
대조군 실험에서 마그네슘의 상이한 염의 마그네슘 수율에 대한 효과
이 실험은 마그네슘 염의 속성이 대조군 실험에서 DNA 수율에 대한 긍정적 또는 유해한 효과를 가질 수 있는지 여부를 결정하기 위해 수행했다. 마그네슘 클로라이드 및 마그네슘 아세테이트가 PCR과 같은 효소적 DNA 합성에서 널리 사용되기 때문에, 비교된 마그네슘 염은 마그네슘 클로라이드 및 마그네슘 아세테이트이었다.
이전 실시예에서와 같이 실험을 셋업하였고, 대조군은 마그네슘 아세테이트 또는 마그네슘 클로라이드를 이용하여 마그네슘이 뉴클레오티드에 등몰 농도로 공급되는 것이었다. 기준(reference)을 위해, 소듐 (dNTP:2Na+.Mg2+) 및 암모늄 (dNTP:2NH4 +.Mg2+)의 뉴클레오티드 복합체를 이용한 반응도 수행했다.
도 5(A 및 B) 및 6 (A 및 B)의 결과는 마그네슘이 클로라이드 염 또는 아세테이트 염으로 공급되는 경우 대조군에서 DNA 수율에 대한 유의한 효과가 없다는 명확하게 보여준다.
실시예 4
외래 완충재의 부재 하에 dNTP:2NH 4+. Mg 2+ 뉴클레오티드 복합체를 이용한 DNA 증폭
DNA 증폭 반응 셋업-시간 코스
반응을 1000 ㎕ 스케일로 하기와 같이 셋업했다: 변성 믹스를 제조하고, 반응 믹스를 조합하는 동안 실온에 두었다. 그 후, 이들을 혼합하고, DNA 폴리머라아제 및 피로포스파타아제를 첨가했다. 그 후, 추가적인 완충제의 첨가 없이, 다양한 dNTP 농도에서 DNA 증폭 실험을 수행했다. 반응을 10x 100 ㎕ 분량으로 나누고, 30℃에서 인큐베이션시키고, 24, 48, 72, 96, 120, 및 144 시간 후에, Mg2+에 대한 등몰량의 EDTA의 첨가에 의해 중단시켰다. 각 분량에, 25 ㎕의 5M NaCl 및 50 % PEG 8000을 첨가하고, 용액을 혼합하고 마이크로원심분리기에서 원심분리 (13,000rpm, 15 minutes)에 의해 DNA를 펠렛화했다. 상층액을 조심스럽게 따라내고, 펠렛을 엔드-오버-엔드 믹서에서 10000 ㎕ 물에 밤새 재현탁시켰다. 나노드랍 분광광도계에서 UV 흡광도 측정으로부터 반응 DNA 농도를 정량했다. 반응 부피의 100x 증가에 대해 데이터를 보정하고, 농도를 사용된 dNTP 농도 대비 최초 부피의 l당 g으로 표현한다.
Tris HCl 완충액의 존재 및 부재 시 다양한 dNTP:2NH4 +.Mg2+ 뉴클레오티드 복합체 농도로부터 DNA 증폭을 측정하기 위해 전술된 바와 같이 반응을 셋업했다. 대조군 실험은 30 mM의 최종 농도까지 Tris HCl 완충액, pH 8.0로 보충하고, 실험군에서는, Tris 완충액을 동등한 부피의 탈이온수로 대체했다.
개별적인 반응을 100 ㎕ 스케일로 셋업하고, 최대 6일까지 매일 DNA 측정을 위해 채취했다. dNTP:2NH4 +.Mg2+ 뉴클레오티드 복합체의 개시 농도는 25mM 내지 125mM 범위였다.
도 7a 및 7b의 결과는 완충된 반응과 비교시, Tris 완충액의 부재 하에 수행된 반응들 간에 약 50%의 DNA 수율의 매우 현저한 증가가 있다는 것을 보여준다. 이 차이는 dNTP:2NH4 +.Mg2+ 뉴클레오티드의 모든 유사한 농도에서 명확하다.

Claims (21)

  1. 용액 중 뉴클레오티드 복합체를 수득하는 단계로서, 상기 뉴클레오티드 복합체는 뉴클레오티드당 0.2 내지 2개의 2가 양이온 및 0.2 내지 2.5개의 1가 양이온과 회합된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계, 및 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제를 첨가하는 단계를 포함하는, DNA의 효소적 합성을 위한 무세포 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 뉴클레오티드 복합체는 염인 것인 무세포 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 뉴클레오티드 복합체는 전기적으로 중성인 것인 무세포 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 전기적 중성을 수득하기 위해, 상기 복합체는 1개 이상의 수소 또는 히드로늄 이온과 회합하는 것인 무세포 방법.
  5. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체는 뉴클레오티드(nucleotide entity) 당 약 0.5개 내지 1.5개의 2가 양이온, 바람직하게는 1개의 2가 양이온과 회합되는 것인 무세포 방법.
  6. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체는 약 0.2개 내지 2개의 1가 양이온과 회합되는 것인 무세포 방법.
  7. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2가 양이온은 마그네슘 (Mg2+), 베릴륨 (Be2+), 칼슘 (Ca2+), 스트론튬 (Sr2+), 망간 (Mn2+) 또는 아연 (Zn2+), 바람직하게는 Mg2+ 또는 Mn2+으로부터 독립적으로 선택되는 것인 무세포 방법.
  8. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1가 양이온은 알칼리 금속, 전이 금속 또는 다원자 이온(polyatomic ion)으로부터 독립적으로 선택되는 것인 무세포 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 1가 양이온은 옥소늄 이온과 같은 다원자 이온, 바람직하게는 암모늄 또는 그의 유도체로부터 독립적으로 선택될 수 있는 것인 무세포 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 1가 양이온은 리튬 (Li+), 소듐 (Na+), 포타슘 (K+), 루비듐 (Rb+), 세슘 (Cs+) 또는 프란슘 (Fr+)으로부터 독립적으로 선택된, 알칼리 금속일 수 있는 것인 무세포 방법.
  11. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액 중 뉴클레오티드 복합체는 2가 양이온과 복합체화된 뉴클레오티드와 1가 양이온과 복합체화된 뉴클레오티드의 용액을 혼합하는 것에 의해 수득되고, 바람직하게는 상기 2가 양이온과 1가 양이온은 4:1 미만의 양이온:뉴클레오티드, 선택적으로, 3.5:1, 3:1, 또는 2.5:1 또는 그 미만의 비율로 존재하는 것인 무세포 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 2가 양이온과의 뉴클레오티드 복합체는 1가 양이온과 복합체화된 뉴클레오티드와 혼합될 때까지 난용성인 것인 무세포 방법.
  13. 청구항 11 및 12에 있어서, 상기 뉴클레오티드 복합체는 가용성인 것인 무세포 방법.
  14. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 복합체는 30 mM 이상의 농도에서 수득되는 것인 무세포 방법.
  15. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 복합체는 40 mM 이상의 농도에서 수득되는 것인 무세포 방법.
  16. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 복합체 및 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제가 반응 혼합물을 형성하는 것인 무세포 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 하기 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는 추가적인 성분이 상기 반응 혼합물에 첨가되는 것인 무세포 방법:
    a) 주형 핵산;
    b) 프라이머;
    c) 프리마아제(primase);
    d) 변성제(denaturing agent), 예를 들면, 수산화나트륨 또는 수산화암모늄;
    e) 완충 염(buffering salt)을 포함한 완충제;
    f) 피로포스파타아제; 및/또는
    g) 마그네슘 또는 망간 염.
  18. 청구항 17에 있어서, 마그네슘 또는 망간 염이 상기 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제를 위한 보조-인자로서, 상기 마그네슘 및/또는 망간 대 뉴클레오티드의 총 비율이 2:1 을 초과하지 않도록 상기 반응 혼합물에 첨가되는 것인 무세포 방법.
  19. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제는 DNA 폴리머라아제, 바람직하게는 가닥-치환 DNA 폴리머라아제인 것인 무세포 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제는 등온 DNA 합성을 수행할 수 있는 것인 무세포 방법.
  21. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티딜트랜스퍼라아제는 주형을 요구하지 않는 것인 무세포 방법.
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