CN116615560A - 用于大规模平行核酸测序的试剂 - Google Patents
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Abstract
本公开内容提供了组合物和采用该组合物进行核酸测序工作流的方法,其中工作流包括文库制备,文库分子的固定和扩增以形成固定化模板分子,以及对模板分子进行测序。在一些实施方案中,组合物包含用于进行核酸测序工作流的试剂。
Description
交叉引用
本申请要求2020年10月30日提交的美国临时申请号63/108,207的权益,其通过引用整体并入于此。
背景技术
核酸分子的序列可使用大规模平行测序来确定。大规模平行测序可使用合成测序进行,其中在引物延伸反应中,聚合酶将核苷酸按顺序添加至增长的链中,以产生与模板链互补的链,并检测所掺入的核苷酸。这样的序列可用于各种应用,例如疾病(例如,癌症)诊断。
发明内容
本文公开的方面提供了分析核酸的方法,该方法包括:(a)使引发的核酸序列与荧光标记的核苷酸缀合物在足以形成结合复合体的条件下接触,该结合复合体包含与荧光标记的核苷酸缀合物的第二核苷酸结合的引发的核酸分子的第一核苷酸;(b)使结合复合体与成像试剂接触;以及(c)在成像试剂的存在下获得结合复合体的图像,从而与在不存在成像试剂的类似条件下的光漂白风险相比,降低荧光标记的核苷酸缀合物的光漂白风险。
在一些实施方案中,该方法进一步包括通过分析(c)中获得的图像来鉴定第一核苷酸。在一些实施方案中,成像试剂包含抗坏血酸。在一些实施方案中,抗坏血酸包含抗坏血酸钠。在一些实施方案中,抗坏血酸的浓度为至少20mM。在一些实施方案中,抗坏血酸的浓度为约10mM至约100mM。在一些实施方案中,抗坏血酸的浓度为约50mM。在一些实施方案中,荧光标记的核苷酸缀合物包含:(i)核心、(ii)与其偶联的多个第二核苷酸,和(iii)直接与核心偶联的一个或多个荧光团。在一些实施方案中,荧光标记的核苷酸缀合物进一步包含将多个第二核苷酸连接至核心的核心附接部分。在一些实施方案中,第二核苷酸包含约3至约10个磷酸基团。在一些实施方案中,第二核苷酸是包含可去除的链终止部分的核苷三磷酸。
在一些实施方案中,该方法进一步包括使引发的核酸序列与聚合酶在足以形成结合复合体的条件下接触,其中结合复合体进一步包含聚合酶。在一些实施方案中,聚合酶缺乏可检测标记。在一些实施方案中,聚合酶包含可检测标记。在一些实施方案中,结合复合体固定至支持物上。在一些实施方案中,支持物包含表面,并且其中表面包含与其偶联的亲水性涂层。在一些实施方案中,亲水性涂层包含小于50度的水接触角。
在一些实施方案中,该方法进一步包括使引发的核酸序列与第二荧光标记的核苷酸缀合物在足以形成第二结合复合体的条件下接触,该第二结合复合体包含与荧光标记的核苷酸缀合物的第三核苷酸结合的引发的核酸分子的下一个核苷酸,其中第三核苷酸不同于第二核苷酸。在一些实施方案中,引发的核酸序列包含在多联体核酸分子中,该多联体核酸分子包含引发的核酸序列的串联重复序列。在一些实施方案中,成像试剂包含抑制第二核苷酸掺入的非催化二价阳离子,其中非催化二价阳离子包含锶、钡、钪、钛、钙、钒、铬、铁、钴、镍、铜、锌、镓、锗、砷、硒、铑、铕、锡或铽离子。
在一些方面,本发明描述了一种用于在成像期间减少生物实体的光漂白的制剂,该制剂包含:至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂和抗坏血酸。在一些实施方案中,pH缓冲剂包含Tris-HCl。在一些实施方案中,Tris-HCl的pH为约8.8。在一些实施方案中,螯合剂包含EDTA。在一些实施方案中,一价阳离子包含NaCl、KCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾。在一些实施方案中,非催化二价阳离子包含锶、钡、钪、钛、钙、钒、铬、铁、钴、镍、铜、锌、镓、锗、砷、硒、铑、铕、锡或铽离子,或其组合。在一些实施方案中,制剂缺乏包含镁或锰或其组合的催化二价阳离子。在一些实施方案中,洗涤剂包含Triton X-100。在一些实施方案中,制剂进一步包含糖。在一些实施方案中,制剂进一步包含黏度剂,该黏度剂包含甘油。在一些实施方案中,制剂进一步包含1,3,5,7环辛四烯(COT)。在一些实施方案中,COT的浓度为约2毫摩尔(micromolar,mM)。在一些实施方案中,抗坏血酸包含抗坏血酸钠。在一些实施方案中,抗坏血酸的浓度为至少10mM。在一些实施方案中,抗坏血酸的浓度为至少20mM。在一些实施方案中,抗坏血酸的浓度为约10mM至约100mM。在一些实施方案中,抗坏血酸的浓度为约50mM。在一些实施方案中,制剂进一步包含Trolox。在一些实施方案中,Trolox的浓度为约2mM。在一些实施方案中,制剂进一步包含3-硝基苯甲酸(NBA)。在一些实施方案中,制剂进一步包含半胱胺。
本文公开的方面提供了制剂,其包含(i)至少一种溶剂、(ii)pH缓冲剂、(iii)螯合剂、(iv)至少一种一价阳离子、(v)非催化二价阳离子、(vi)洗涤剂、(vii)多个多价分子和(viii)测序聚合酶,其中多个多价分子中的每一个包含(1)核心,和(2)与核心偶联的多个核苷酸和多个可检测部分,并且其中测序聚合酶包含与SEQ ID NO:2-5中的任一者具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,多个多价分子中的每一个进一步包含将多个核苷酸偶联至核心的接头,并且其中接头包含具有2-6个亚基的脂族链或具有2-6个亚基的低聚乙二醇链。在一些实施方案中,核心是球形的。在一些实施方案中,多个核苷酸是选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP的相同类型的核苷酸。在一些实施方案中,多个多价分子包含两种或更多种不同类型的多价分子,其中两种或更多种不同类型的多价分子中的每一种包含不同的多个核苷酸。在一些实施方案中,测序聚合酶在氨基酸序列中包含突变,该氨基酸序列相对于包含Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567的SEQ IDNO:1在一个或多个位置处包含取代。在一些实施方案中,测序聚合酶包含SEQ ID NO:2-5中任一者的氨基酸序列。
本文公开的方面提供了试剂盒,其包含一个或多个容器,该一个或多个容器含有本文所述的制剂。在一些实施方案中,试剂盒进一步包含在制剂存在下在生化反应期间在对生物实体进行成像的同时减少对生物实体的光损伤的用法说明。在一些实施方案中,生化反应包括测序反应。在一些实施方案中,用法说明包括在对生物实体进行成像之前在生化反应期间将生物实体浸没在制剂中。
本文公开的方面提供了试剂盒,其包含:捕获试剂,该捕获试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂、多个荧光标记的核苷酸缀合物和第一测序聚合酶;捕获后试剂,该捕获后试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂和第一测序聚合酶;成像试剂,该成像试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂和抗坏血酸;以及步进试剂,该步进试剂包含至少一种溶剂、至少一种pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、催化二价阳离子、洗涤剂、第二测序聚合酶和多个核苷酸,其中多个核苷酸中的每个核苷酸包含附接至3’糖位置的可切割终止子部分。
在一些实施方案中,试剂盒进一步包含使用捕获试剂的用法说明,其中用法说明包括使多个固定化模板核酸分子与(i)捕获试剂和(ii)多个测序引物在足以形成多个固定化荧光标记的三元复合体而不将多个荧光标记的核苷酸缀合物掺入测序引物中的条件下接触。
在一些实施方案中,试剂盒进一步包含使用捕获后试剂的用法说明,其中用法说明包括使多个固定化荧光标记的三元复合体与捕获后试剂在足以保存多个固定化荧光标记的三元复合体而不将多个固定化荧光标记的三元复合体掺入测序引物中的条件下接触。
在一些实施方案中,试剂盒进一步包含使用步进试剂的用法说明,其中用法说明包括使多个固定化模板核酸分子与步进试剂在足以使固定化模板核酸分子延伸的条件下接触。
在一些实施方案中,试剂盒进一步包含第一扩增试剂,该第一扩增试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、铵离子、多个核苷酸和扩增聚合酶;以及第二扩增试剂,该第二扩增试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、铵离子和多个核苷酸。
在一些实施方案中,试剂盒进一步包含使用第一扩增试剂和第二扩增试剂的用法说明,其中用法说明包括:使固定化模板核酸分子与第一扩增试剂在抑制扩增聚合酶活性的条件下接触;以及使固定化模板核酸分子与第二扩增试剂在适于恢复扩增聚合酶活性的条件下接触以进行多个核酸扩增反应。
在一些实施方案中,试剂盒进一步包含洗脱试剂,该洗脱试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、洗涤剂和离液剂。
在一些实施方案中,试剂盒进一步包含核酸杂交试剂,该核酸杂交试剂包含:至少一种溶剂、pH缓冲剂和至少一种一价阳离子;以及洗涤剂、还原剂、离液剂、螯合剂、醇、两性离子、糖醇或拥挤剂,或其组合。
援引并入
在本申请中,引用了各种出版物、专利和/或专利申请。出版物、专利和/或专利申请的公开内容通过引用整体并入于此,其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地且单独地表明通过引用整体并入。在本文中的术语与并入的参考文献中的术语之间存在冲突的情况下,以本文中的术语为准。
附图说明
本发明构思的一些新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参照以下对其中利用了本发明构思的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图,将更好地理解本发明构思的特征和优点,在附图中:
图1是共价或非共价地黏附至支持物结构(例如,玻璃、塑料或其他聚合物材料)的亲水性涂层交替层的一个实施方案的示例性示意图,其中涂层包含充当寡核苷酸引物(例如,表面捕获引物)的附接位点的化学反应性官能团。
图2A是示出多价分子的核苷酸臂的示例性示意图。
图2B是包含与多个核苷酸臂附接的核心的多价分子的示例性示意图,其中每个核苷酸臂包含(i)核心附接部分、(ii)间隔区、(iii)接头和(iv)核苷酸单元。
图2C是包含与多个核苷酸臂附接的通用核心的示例性多价分子的示意图。
图2D是包含与多个核苷酸臂附接的树状大分子核心的示例性多价分子的示意图。
图3是来自Candidatus altiarchaeales古细菌的野生型DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
图4是来自Candidatus altiarchaeales古细菌的突变型DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:2),其包含氨基酸取代突变。
图5是来自Candidatus altiarchaeales古细菌的突变型DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3),其包含氨基酸取代突变。
图6是来自Candidatus altiarchaeales古细菌的突变型DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:4),其包含氨基酸取代突变。
图7是来自Candidatus altiarchaeales古细菌的突变型DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:5),其包含氨基酸取代突变。
图8是野生型9°N DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。
图9是突变型9°N DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。
图10是变体9°N DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。
图11是Vent DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。
图12是Deep Vent DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)。
图13是Pfu DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)。
图14是深海火球菌(Pyrococcus abyssi)DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)。
图15是RB69 DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)。
图16是示出包含不同制剂的成像试剂对平均信号强度随时间的影响的一系列图。不同的制剂不含有减少光损伤的化合物或含有减少光损伤的化合物的不同组合。染料1是AF647,染料2是CF532,染料3是CF570,染料4是CD680。制剂1-4包含Tris-HCl(pH 8.8)、EDTA、NaCl、Triton X-100、蔗糖、乙酸锶和甘油。制剂1不含有减少光损伤的化合物。制剂2包含Trolox(2mM)和抗坏血酸钠(50mM)。制剂3包含Trolox(2mM)和甲基紫精(2mM)。制剂4包含Trolox(2mM)、甲基紫精(2mM)和抗坏血酸钠(50mM)。
图17是示出包含不同制剂的成像试剂对平均信号强度随时间的影响的一系列图。不同的制剂含有减少光损伤的化合物的不同组合。染料1是AF647,染料2是CF532,染料3是CF570,染料4是CD680。制剂5-8包含Tris-HCl(pH 8.8)、EDTA、NaCl、Triton X-100、蔗糖、乙酸锶和甘油。制剂5包含1,3,5,7环辛四烯(COT)(2mM)。制剂6包含COT(2mM)和抗坏血酸钠(50mM)。制剂7包含COT(2mM)、抗坏血酸钠(50mM)和Trolox(2mM)。制剂8包含抗坏血酸钠(50mM)和Trolox(2mM)。
图18是染料标记的核苷酸的一系列图像,其中核苷酸经由可切割部分(CM)与染料连接。在暴露于高激光功率90秒后,图像示出没有残留的荧光信号。成像试剂包含Tris-HCl(pH 8.8)、EDTA、NaCl、Triton X-100、蔗糖、乙酸锶、甘油、1,3,5,7环辛四烯(COT)(2mM)、抗坏血酸钠(50mM)和Trolox(2mM)。
图19是示出各种成像试剂对来自荧光标记的多价分子的残留信号随重复循环的影响的图。成像试剂包含Tris-HCl(pH 8.8)、EDTA、NaCl(100mM)、Triton X-100、蔗糖(1M)、乙酸锶和甘油。
图20是示出各种成像试剂对来自荧光标记的多价分子的残留信号随重复循环的影响的图。成像试剂包含Tris-HCl(pH 8.8)、EDTA、NaCl(100mM)、Triton X-100、蔗糖(1M)、乙酸锶、甘油、Trolox(2mM)和抗坏血酸钠(50mM)。与图19所示的结果进行比较。
图21A-图21H示意性地图示了根据一些实施方案的使用本公开内容的试剂对核酸进行测序的方法。
图22A-图22B图示了根据一些实施方案的包含本公开内容的试剂的试剂盒。
图23示意性地图示了根据一些实施方案的表面上夹板连接。
图24示出了根据一些实施方案的用于使核酸文库环化的流程图。
图25示出了示例性间隔区的化学结构(上图),以及各种示例性接头的化学结构,包括11-原子接头、16-原子接头、23-原子接头和N3接头(下图)。
图26示出了各种示例性接头的化学结构,包括接头1-9。
图27示出了连接/附接至核苷酸单元的各种示例性接头的化学结构。
图28示出了连接/附接至核苷酸单元的各种示例性接头的化学结构。
图29示出了连接/附接至核苷酸单元的各种示例性接头的化学结构。
图30示出了连接/附接至核苷酸单元的各种示例性接头的化学结构。
图31示出了示例性生物素化核苷酸臂的化学结构。在该示例中,核苷酸单元经由嘧啶碱基的第5位或嘌呤碱基的第7位处的炔丙基胺附接来与接头连接。
图32是示出包含不同制剂的成像试剂对平均信号强度随时间的影响的一系列图。不同的制剂含有减少光损伤的化合物的不同组合。染料1是AF647,染料2是CF532,染料3是CF570,染料4是CD680。制剂9-12包含Tris-HCl(pH 8.8)、EDTA、NaCl、Triton X-100、蔗糖、乙酸锶和甘油。制剂9包含抗坏血酸钠(50mM)。制剂10包含老化3小时的Trolox(2mM)。制剂11不包含减少光损伤的化合物。制剂12包含Trolox(未老化)(2mM)。
图33是示出包含不同制剂的成像试剂对平均信号强度随时间的影响的一系列图。不同的制剂含有减少光损伤的化合物的不同组合。染料1是AF647,染料2是CF532,染料3是CF570,染料4是CD680。制剂13-16包含Tris-HCl(pH 8或8.8)、EDTA、NaCl、Triton X-100、乙酸锶和甘油(并且无蔗糖)。制剂13包含Tris-HCl(pH 8)、Trolox(2mM)和抗坏血酸钠(10mM)。制剂14包含Tris-HCl(pH 8)、Trolox(2mM)和抗坏血酸钠(20mM)。制剂15包含Tris-HCl(pH 8)、Trolox(2mM)和抗坏血酸钠(50mM)。制剂16包含Tris-HCl(pH 8.8)、Trolox(2mM)和抗坏血酸钠(50mM)。
图34是随着NaCl滴定的增加,抗坏血酸钠(pH 8.8)的微晶形成的一系列图像。微晶形成可以指示抗坏血酸钠的不稳定性。所有图像测试的制剂包含Tris-HCl(pH 8)、EDTA、NaCl、Triton X-100、蔗糖、乙酸锶和甘油(并且无蔗糖)。
图35是示出包含不同制剂的成像试剂对平均信号强度随时间的影响的一系列图。不同的制剂含有减少光损伤的化合物的不同组合。染料1是AF647,染料2是CF532,染料3是CF570,染料4是CD680。制剂17-20包含Tris-HCl(pH 8.8)、EDTA、NaCl、Triton X-100、蔗糖、乙酸锶和甘油。制剂17包含半胱胺(10mM)。制剂18包含3-硝基苯甲酸(NBA)(2mM)。制剂19不包含减少光损伤的化合物。制剂20包含对苯二胺(PPD)(1mM)。
图36是示出包含不同制剂的成像试剂对平均信号强度随时间的影响的一系列图。不同的制剂含有减少光损伤的化合物的不同组合。染料1是AF647,染料2是CF532,染料3是CF570,染料4是CD680。制剂21-24包含Tris-HCl(pH 8)、EDTA、NaCl、Triton X-100、乙酸锶和甘油(并且含或不含蔗糖)。制剂21包含蔗糖(1M)、Trolox(2mM)和抗坏血酸钠(50mM)。制剂22不包含蔗糖,包含Trolox(2mM)和抗坏血酸钠(50mM)。制剂23不包含蔗糖,包含Trolox(5mM)和抗坏血酸钠(50mM)。制剂24不包含蔗糖,包含Trolox(8mM)和抗坏血酸钠(50mM)。
图37是示出包含不同制剂的成像试剂对平均信号强度随时间的影响的一系列图。不同的制剂含有减少光损伤的化合物的不同组合。染料1是AF647,染料2是CF532,染料3是CF570,染料4是CD680。制剂25和26包含Tris-HCl(pH 8)、EDTA、NaCl(从100mM降至75mM)、Triton X-100、蔗糖(从1M降至0.5M)、乙酸锶和甘油。制剂25包含Trolox(2mM)和抗坏血酸钠(50mM)。制剂26包含Trolox醌(2mM)和抗坏血酸钠(50mM)。
图38是示出包含不同制剂的成像试剂对平均信号强度随时间的影响的一系列图。不同的制剂含有减少光损伤的化合物的不同组合。染料1是AF647,染料2是CF532,染料3是CF570,染料4是CD680。制剂27-30包含Tris-HCl(pH 8)、EDTA、NaCl(从100mM降至75mM)、Triton X-100、乙酸锶和甘油(并且含或不含蔗糖)。制剂27包含Trolox醌(1mM)、Trolox(3mM)、抗坏血酸钠(25mM),并且无蔗糖。制剂28包含Trolox醌(2mM)、抗坏血酸钠(25mM),并且无蔗糖。制剂29包含Trolox醌(3mM)、抗坏血酸钠(25mM),并且无蔗糖。制剂30包含Trolox(2mM)、抗坏血酸钠(50mM)和蔗糖(1M)。
图39是示出包含不同制剂的成像试剂对平均信号强度随时间的影响的一系列图。不同的制剂含有减少光损伤的化合物的不同组合。染料1是AF647,染料2是CF532,染料3是CF570,染料4是CD680。制剂31-34包含Tris-HCl(pH 8)、EDTA、NaCl(从100mM降至75mM)、Triton X-100、蔗糖(从1M降至0.5M)、乙酸锶和甘油。制剂31包含Trolox(2mM)和抗坏血酸钠(25mM)。制剂32包含Trolox醌(2mM)和抗坏血酸钠(25mM)。制剂33包含Trolox(老化16小时)(2mM)和抗坏血酸钠(25mM)。制剂34包含Trolox(老化3小时)(2mM)和抗坏血酸钠(25mM)。
图40是示出包含不同制剂(含不同浓度的乙二醇)的成像试剂对标记的多价分子的信号强度的影响的一系列箱线图。标记的多价分子:dG-CF57(上图)和dA-AF647(下图)。成像试剂包含Tris-HCl(pH 8)、EDTA、NaCl(从100mM降至75mM)、Triton X-100、乙酸锶、甘油、不同浓度的乙二醇、Trolox(2mM)和抗坏血酸钠(25mM)(并且无蔗糖)。
图41是示出包含不同制剂(含不同浓度的乙二醇)的成像试剂对标记的多价分子的信号强度的影响的一系列箱线图。标记的多价分子:dU-CF532(上图)和dC-CF680(下图)。成像试剂包含Tris-HCl(pH 8)、EDTA、NaCl(从100mM降至75mM)、Triton X-100、乙酸锶、甘油、不同浓度的乙二醇、Trolox(2mM)和抗坏血酸钠(25mM)(并且无蔗糖)。
图42是示出包含不同制剂的成像试剂对平均信号强度随时间的影响的一系列图。不同的制剂含有减少光损伤的化合物的不同组合。染料1是AF647,染料2是CF532,染料3是CF570,染料4是CD680。制剂35和36包含Tris-HCl(pH 7.2-7.5)、EDTA、NaCl(从100mM降至75mM)、Triton X-100、乙酸锶、甘油、乙二醇(30%),并且无蔗糖。制剂35包含Tris-HCl(pH7.5)、Trolox(老化的)(2mM)和抗坏血酸钠(25mM)。制剂36包含Tris-HCl(pH 7.5)、Trolox(未老化)(2mM)和抗坏血酸钠(25mM)。制剂37包含Tris-HCl(pH 8)、EDTA、NaCl(从100mM降至75mM)、Triton X-100、乙酸锶、甘油、乙二醇(30%)、无蔗糖、Trolox(老化的)(2mM)和抗坏血酸钠(25mM)。制剂38包含Tris-HCl(pH 8.8)、EDTA、NaCl(100mM)、Triton X-100、蔗糖(1M)、乙酸锶、甘油、Trolox(未老化)(2mM)和抗坏血酸钠(25mM)。
图43是染料标记的核苷酸的一系列图像,其中核苷酸经由可切割部分(CM)与染料连接。在暴露于高激光功率90秒后,图像示出没有残留的荧光信号。成像试剂包含Tris-HCl(pH 8.8)、EDTA、NaCl、Triton X-100、蔗糖、乙酸锶、甘油、1,3,5,7环辛四烯(COT)(2mM)、抗坏血酸钠(50mM)和Trolox(2mM)。
图44是来自Candidatus altiarchaeales古细菌的野生型DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:221)。
图45是来自Candidatus altiarchaeales古细菌的突变型DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:222)。
图46是来自Candidatus altiarchaeales古细菌的突变型DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:223)。
图47是来自Candidatus altiarchaeales古细菌的突变型DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:224)。
图48是来自Candidatus altiarchaeales古细菌的突变型DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:225)。
图49是9°N聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:226)。
图50是9°N聚合酶UniProtKB-Q56366(DPOL_THES9)的氨基酸序列(SEQ ID NO:227)。
图51是therminator聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:228)。
图52是vent聚合酶UniProtKB-P30317(DPOL_THELI)的氨基酸序列(SEQ ID NO:229)。
图53是deep vent聚合酶UniProtKB-Q51334(DPOL_PYRSD)的氨基酸序列(SEQ IDNO:230)。
图54是Pfu聚合酶UniProtKB-P61875(DPOL_PYRFU)的氨基酸序列(SEQ ID NO:231)。
图55是深海火球菌聚合酶UniProtKB-P0CL77(DPOL_PYRAB)的氨基酸序列(SEQ IDNO:232)。
图56是RB69聚合酶UniProtKB-Q38087(DPOL_BPR69)的氨基酸序列(SEQ ID NO:233)。
具体实施方案
本文提供的标题不是对本公开内容各个方面的限制,这些方面可以通过参照说明书整体来理解。
除非本文上下文另有要求,否则单数术语应包括复数,并且复数术语应包括单数。除非清楚且明确地限制在一个指代上,否则单数形式“一个”、“一种”和“该”以及任何词语的单数使用包括复数指代。
应理解,替代术语(例如,“或”)的使用是指替代方案中的一个或两个或其任何组合。
本文所用的术语“和/或”是指指定特征或组分中每一个在有或无另一特征或组分的情况下的具体公开内容。例如,如本文中“A和/或B”等的短语中所用的术语“和/或”旨在包括:“A和B”;“A或B”;“A”(单独的A);和“B”(单独的B)。以类似的方式,如“A、B和/或C”等的短语中所用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个:“A、B和C”;“A、B或C”;“A或C”;“A或B”;“B或C”;“A和B”;“B和C”;“A和C”;“A”(单独的A);“B”(单独的B);和“C”(单独的C)。
如本文和所附权利要求中所用,术语“包含”、“包括”、“具有”和“含有”以及它们的语法变体,如本文所用,旨在是非限制性的,使得列表中的一个项目或多个项目不排除可以替代或添加至所列项目的其他项目。应理解,在本文中用语言“包含”描述的任何方面,另外还提供以“由…组成”和/或“基本上由…组成”描述的类似方面。
如本文所用,术语“约”或“近似”是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成,其将部分取决于如何测量或确定该值或组成,即,测量系统的限制。例如,根据本领域的实践,“约”或“近似”可以指在一个或超过一个标准偏差内。可替代地,取决于测量系统的限制,“约”或“近似”可以指至多10%(即,±10%)或更大的范围。例如,约5mg可以包括4.5mg至5.5mg的任何数量。此外,特别是对于生物系统或过程,术语可以指至多一个数量级或至多5倍的值。当在本公开内容中提供了特定值或组成时,除非另有说明,否则“约”或“近似”的含义应假定在该特定值或组成的可接受误差范围内。此外,在提供了值的范围和/或子范围的情况下,该范围和/或子范围可以包括范围和/或子范围的端点。
术语“细胞生物样品”是指单个细胞、多个细胞、组织、器官、生物体或这些细胞生物样品中任一者的部分。细胞生物样品可以从生物体中提取(例如,活检),或从液体或培养皿中生长的细胞培养物中获得。细胞生物样品包含新鲜、冷冻、新鲜冷冻或存档(例如,福尔马林固定石蜡包埋;FFPE)的样品。细胞生物样品可以包埋在蜡、树脂、环氧树脂或琼脂中。细胞生物样品可以被固定例如在丙酮、乙醇、甲醇、甲醛、多聚甲醛-Triton或戊二醛中的任一种或两种或更多种的任何组合中。细胞生物样品可以是切片或非切片。细胞生物样品可以是染色的、脱染色的或非染色的。
可以使用本领域技术人员已知的许多技术中的任一种从细胞或细胞生物样品中提取感兴趣核酸。例如,典型的DNA提取程序包括(i)收集待提取DNA的细胞样品或组织样品,(ii)破坏细胞膜(即,细胞裂解),以释放DNA和其他细胞质组分,(iii)用浓缩的盐溶液处理裂解的样品,以沉淀蛋白质、脂质和RNA,随后离心分离出沉淀的蛋白质、脂质和RNA,和(iv)从上清液中纯化DNA,以去除洗涤剂、蛋白质、盐或细胞膜裂解期间所用的其他试剂。多种合适的商业核酸提取和纯化试剂盒与本文的公开内容一致。示例包括但不限于来自Qiagen(日耳曼敦市,马里兰州)的QIAamp试剂盒(用于从人样品中分离基因组DNA)和DNAeasy试剂盒(用于从动物或植物样品中分离基因组DNA),或来自Promega(麦迪逊市,威斯康星州)的和ReliaPrepTM系列试剂盒。
本文所用的术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”以及其他相关术语可互换使用,并且是指核苷酸的聚合物,不限于任何特定长度。核酸包括重组和化学合成形式。核酸可以分离。核酸包括DNA分子(例如,cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如,mRNA)、使用核苷酸类似物生成的DNA或RNA类似物(例如,肽核酸(PNA)和非天然存在的核苷酸类似物),以及含有DNA和RNA的嵌合形式。核酸可以是单链或双链的。核酸包含核苷酸的聚合物,其中核苷酸包括天然或非天然的碱基和/或糖。核酸包含天然存在的核苷间键,例如磷酸二酯键。核酸可以缺乏磷酸基团。核酸包含非天然的核苷间键,包括硫代磷酸酯(phosphorothioate)、硫醇磷酸酯(phosphorothiolate)或肽核酸(PNA)键。在一些实施方案中,核酸包含一种类型的多核苷酸或两种或更多种不同类型的多核苷酸的混合物。
术语“模板核酸”、“模板多核苷酸”、“靶核酸”、“靶多核苷酸”、“模板链”和其他变体是指充当本文所述分析方法(例如,杂交、扩增和/或测序)中任一种的基础核酸分子的核酸链。模板核酸可以是单链或双链的,或者模板核酸可以具有单链或双链部分。模板核酸可以克隆扩增。模板核酸可以是具有与至少一个衔接子序列可操作地连接的感兴趣核酸序列的串联重复序列的多联体。模板核酸可以从天然存在的来源、重组形式或化学合成中获得,以包括任何类型的核酸类似物。模板核酸可以是线性、环状或其他形式。模板核酸可以包括具有插入序列的插入部分。模板核酸还可以包括至少一个衔接子序列。插入部分可以以任何形式分离,包括染色体、基因组、细胞器(例如,线粒体、叶绿体或核糖体)、重组分子、克隆的、扩增的、cDNA、RNA(诸如前体mRNA或mRNA)、寡核苷酸、全基因组DNA、从新鲜冷冻的石蜡包埋组织中获得、针刺活检、循环肿瘤细胞、无细胞循环DNA或任何类型的核酸文库。插入部分可以从任何来源分离,包括生物体诸如原核生物、真核生物(例如,人、植物和动物)、真菌、病毒细胞、组织、正常或患病细胞或组织、体液包括血液、尿、血清、淋巴、肿瘤、唾液、肛门和阴道分泌物、羊膜样品、汗液、精液、环境样品、培养物样品,或使用重组分子生物学或化学合成方法制备的合成核酸分子。插入部分可以从任何器官中分离,包括头、颈、脑、乳腺、卵巢、子宫颈、结肠、直肠、子宫内膜、胆囊、肠、膀胱、前列腺、睾丸、肝、肺、肾、食道、胰腺、甲状腺、垂体、胸腺、皮肤、心脏、喉或其他器官。可以对模板核酸进行核酸分析,包括测序和组成分析。模板核酸可以是线性、多联体、环状或其他形式。
本文所用的术语“引物”和相关术语是指能够与DNA和/或RNA多核苷酸模板杂交以形成双链体分子的寡核苷酸。引物包含天然核苷酸和/或核苷酸类似物。引物可以是重组核酸分子。引物可具有任何长度,但通常为4-50个核苷酸。典型的引物包含5’端和3’端。引物的3’端可以包括在聚合酶催化的引物延伸反应中充当核苷酸聚合起始位点的3’OH部分。可替代地,引物的3’端可以缺乏3’OH部分,或可以包括在聚合酶催化反应中抑制核苷酸聚合的末端3’封闭基团。沿引物长度的任何一个核苷酸或超过一个核苷酸可以用可检测的报告部分标记。引物可以在溶液中(例如,可溶性引物)或可以固定至支持物上(例如,捕获引物)。引物可以沿其全长是单链的或具有单链和双链部分。
术语“通用序列”和相关术语是指核酸分子中两个或多个多核苷酸分子共有的序列。例如,具有通用序列的衔接子可以可操作地连接至多个多核苷酸,使得共连接分子的群体携带相同的通用衔接子序列。通用衔接子序列的示例包括扩增引物序列、测序引物序列或捕获引物序列(例如,可溶性或固定化捕获引物)。
术语“衔接子”和相关术语是指可以可操作地连接(附加)至靶多核苷酸的寡核苷酸,其中衔接子赋予共连接的衔接子-靶分子功能。衔接子包含DNA、RNA、嵌合DNA/RNA或其类似物。衔接子可以包括至少一个核糖核苷残基。衔接子可以是单链的、双链的、或具有单链和/或双链部分。衔接子可以配置为线性、茎环、发夹或Y形形式。衔接子可以是任何长度,包括4-100个核苷酸或更长。衔接子可以具有平端、突出端或两者的组合。突出端包括5’突出端和3’突出端。单链衔接子的5’端或双链衔接子的一条链可以具有5’磷酸基团或缺乏5’磷酸基团。衔接子可以包括不与靶多核苷酸杂交的5’尾(例如,加尾的衔接子),或者衔接子可以是非加尾的。衔接子可以包括通用序列。衔接子的至少一部分包含已知和预定的序列。衔接子可以包括与诸如扩增引物、测序引物或捕获引物(例如,可溶性或固定化捕获引物)等引物的至少一部分互补的序列。衔接子可以包括随机序列或简并序列。衔接子可以包括至少一个肌苷残基。衔接子可以包括至少一个硫代磷酸酯、硫醇磷酸酯和/或氨基磷酸酯键。衔接子可以包括条形码序列,其可以用于在多重测定中区分来自不同样品来源的多核苷酸(例如,插入序列)。衔接子可以包括独特的识别序列(例如,独特的分子指标,UMI;或独特的分子标签),其可以用于独特地鉴定附加有衔接子的核酸分子。在一些实施方案中,独特的识别序列可以用于提高错误纠正和准确性、降低假阳性变体调用的比率和/或提高变体检测的灵敏度。衔接子可以包括至少一个限制性酶识别序列,包括选自I型、II型、III型、IV型、Hs型或IIB型中的任一种或两种或更多种的任何组合。
如本文所用的术语“可操作地连接”或相关术语是指组分的并置。并置的组分可以共价连接在一起。例如,两个核酸组分可以酶促地连接在一起,其中将两个组分连接在一起的键包含磷酸二酯键。第一和第二核酸组分可以连接在一起,其中第一核酸组分可以赋予第二核酸组分功能。例如,引物结合序列和感兴趣序列之间的连接形成具有可以结合引物的部分的核酸文库分子。在另一示例中,可以将转基因(例如,编码多肽的核酸或感兴趣核酸序列)连接至载体,其中连接允许包含在载体中的转基因序列表达或发挥功能。在一些实施方案中,转基因可操作地连接至影响转基因表达的宿主细胞调控序列(例如,启动子序列)。在一些实施方案中,载体包含至少一种宿主细胞调控序列,包括启动子序列、增强子、转录和/或翻译起始序列、转录和/或翻译终止序列、多肽分泌信号序列等。在一些实施方案中,宿主细胞调控序列控制转基因的表达水平、时间和/或位置。
术语“连接”、“附接”、“附加”及其变体包含化合物或分子的任何组合之间的任何类型的融合、键合、黏附或缔合,其具有足够的稳定性以承受在特定程序中的使用。程序可以包括但不限于:核苷酸结合;核苷酸掺入;去封闭(例如,去除链终止部分);洗涤;去除;流动;检测;成像和/或鉴定。这样的连接可以包含例如共价、离子、氢、偶极-偶极、亲水、疏水或亲和键合、涉及范德华力的键或缔合、机械键合等。在一些实施方案中,这样的连接发生在分子内,例如将单链或双链线性核酸分子的末端连接在一起以形成环状分子。在一些实施方案中,这样的连接可以发生在不同分子的组合之间,或在分子和非分子之间,包括但不限于:核酸分子和固体表面之间的连接;蛋白质和可检测的报告部分之间的连接;核苷酸和可检测的报告部分之间的连接;等等。连接的一些示例可以见于例如Hermanson,G.,“Bioconjugate Techniques”,第二版(2008);Aslam,M.,Dent,A.,“Bioconjugation:Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences”,London:Macmillan(1998);Aslam,M.,Dent,A.,“Bioconjugation:Protein Coupling Techniques for theBiomedical Sciences”,London:Macmillan(1998)。
当用于浓度时,符号“%”可以指体积%。当用于浓度时,符号“%”可以指质量%。当用于浓度时,符号“%”可以指摩尔%。
当用于核酸分子时,术语“杂交”或其他相关术语是指两个不同核酸之间形成双链体核酸的氢键合。杂交还包括单个核酸分子的两个不同区域之间形成具有双链体区域的自杂交分子的氢键合。杂交可以包括沃森-克里克(Watson-Crick)或Hoogstein结合以形成双链体双链核酸或核酸分子内的双链区。双链核酸或单个核酸的两个不同区域可以是完全互补的或部分互补的。互补核酸链不需要在其整个长度上彼此杂交。互补碱基配对可以是标准的A-T或C-G碱基配对,或者可以是其他形式的碱基配对相互作用。双链体核酸可以包括错配的碱基配对核苷酸。
当用于核酸时,术语“延伸”和其他变体是指将一个或多个核苷酸掺入核酸分子中。核苷酸掺入包括将一个或多个核苷酸聚合至核酸链的末端3’OH端中,从而导致核酸链的延伸。核苷酸掺入可以用天然核苷酸和/或核苷酸类似物进行。通常,但不是必须地,核苷酸掺入以模板依赖性方式发生。可使用任何合适的延伸核酸分子的方法,包括由DNA聚合酶或RNA聚合酶催化的引物延伸。
在一些实施方案中,扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列(捕获寡核苷酸)、靶捕获序列、环化锚定序列、样品条形码序列、空间条形码序列或锚定区序列中任一者的长度可以为约3-50个核苷酸,或约5-40个核苷酸,或约5-25个核苷酸。
如本文所用,术语“聚合酶”及其变体包含含有结合核苷酸(或核苷)的结构域的酶,其中聚合酶可以形成具有模板核酸和互补核苷酸的复合体。聚合酶可以具有一种或多种活性,包括但不限于碱基类似物检测活性、DNA聚合活性、逆转录酶活性、DNA结合、链置换活性和核苷酸结合和识别。聚合酶可以是能够催化核苷酸(包括其类似物)聚合为核酸链的任何酶。通常但不是必须地,这样的核苷酸聚合可以以模板依赖性方式发生。通常,聚合酶包含可以发生核苷酸结合和/或催化核苷酸聚合的一个或多个活性位点。在一些实施方案中,聚合酶包括其他酶活性,例如,3’至5’核酸外切酶活性或5’至3’核酸外切酶活性。在一些实施方案中,聚合酶具有链置换活性。聚合酶可以包括但不限于天然存在的聚合酶及其任何亚基和截短物、突变型聚合酶、变体聚合酶、重组的、融合的或以其他方式工程化的聚合酶、化学修饰的聚合酶、合成分子或组装体,以及保留催化核苷酸聚合能力的其任何类似物、衍生物或片段(例如,催化活性片段)。聚合酶包括无催化活性聚合酶、催化活性聚合酶、逆转录酶和包含核苷酸结合结构域的其他酶。在一些实施方案中,聚合酶可以从细胞中分离,或使用重组DNA技术或化学合成方法生成。在一些实施方案中,聚合酶可以在原核生物、真核生物、病毒或噬菌体生物体中表达。在一些实施方案中,聚合酶可以是翻译后修饰的蛋白质或其片段。聚合酶可以来源于原核生物、真核生物、病毒或噬菌体。聚合酶包含DNA指导的DNA聚合酶和RNA指导的DNA聚合酶。
术语“链置换”是指聚合酶局部分离双链核酸的链并以基于模板的方式合成新链的能力。链置换聚合酶从模板链置换互补链并催化新链合成。链置换聚合酶包括嗜温和嗜热聚合酶。链置换聚合酶包括野生型酶和变体,变体包括核酸外切酶缺失突变体、突变形式、嵌合酶和截短酶。链置换聚合酶的示例包括phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶的大片段、Bsu DNA聚合酶(exo-)的大片段、Bca DNA聚合酶(exo-)、大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶的Klenow片段、T5聚合酶、M-MuLV逆转录酶、HIV病毒逆转录酶、Deep Vent DNA聚合酶和KODDNA聚合酶。phi29 DNA聚合酶可以是野生型phi29 DNA聚合酶(例如,来自Expedeon的MagniPhi),或变体EquiPhi29 DNA聚合酶(例如,来自Thermo Fisher Scientific),或嵌合QualiPhi DNA聚合酶(例如,来自4basebio)。
术语“核苷酸”和相关术语是指包含芳族碱基、五碳糖(例如,核糖或脱氧核糖)和至少一个磷酸基团的分子。规范或非规范核苷酸与该术语的使用一致。在一些实施方案中,磷酸酯包含单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或相应的磷酸酯类似物。术语“核苷”是指包含芳族碱基和糖的分子。核苷酸和核苷可以未标记或用可检测的报告部分标记。核苷酸可以具有1-10个磷酸基团。
核苷酸(和核苷)通常包含杂环碱基,杂环碱基包括取代或未取代的含氮母体杂芳环,其通常存在于核酸中,包括天然存在的、取代的、修饰的或工程化的变体或其类似物。核苷酸(或核苷)的碱基能够与合适的互补碱基形成沃森-克里克和/或Hoogstein氢键。示例性碱基包括但不限于嘌呤和嘧啶,诸如:2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、腺嘌呤(A)、乙烯桥腺嘌呤、N6-Δ2-异戊烯基腺嘌呤(6iA)、N6-Δ2-异戊烯基-2-甲基硫基腺嘌呤(2ms6iA)、N6-甲基腺嘌呤、鸟嘌呤(G)、异鸟嘌呤、N2-二甲基鸟嘌呤(dmG)、7-甲基鸟嘌呤(7mG)、2-硫代嘧啶、6-硫代鸟嘌呤(6sG)、次黄嘌呤和O6-甲基鸟嘌呤;7-脱氮嘌呤,诸如7-脱氮腺嘌呤(7-deaza-A)和7-脱氮鸟嘌呤(7-deaza-G);嘧啶,诸如胞嘧啶(C)、5-丙炔基胞嘧啶、异胞嘧啶、胸腺嘧啶(T)、4-硫代胸腺嘧啶(4sT)、5,6-二氢胸腺嘧啶、O4-甲基胸腺嘧啶、尿嘧啶(U)、4-硫代尿嘧啶(4sU)和5,6-二氢尿嘧啶(二氢尿嘧啶;D);吲哚,诸如硝基吲哚和4-甲基吲哚;吡咯,诸如硝基吡咯;水粉蕈素;肌苷;羟甲基胞嘧啶;5-甲基胞嘧啶;碱基(Y);以及甲基化、糖基化和酰化的碱基部分;等等。附加的示例性碱基可以见于Fasman,1989的“PracticalHandbook of Biochemistry and Molecular Biology”,第385-394页,CRC Press,BocaRaton,Fla。
核苷酸(和核苷)通常包含糖部分,诸如碳环部分(Ferraro和Gotor2000Chem.Rev.100:4319-48)、无环部分(Martinez等人,1999Nucleic AcidsResearch 27:1271-1274;Martinez等人,1997Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters第7卷:3013-3016)和其他糖部分(Joeng等人,1993J.Med.Chem.36:2627-2638;Kim等人,1993J.Med.Chem.36:30-7;Eschenmosser 1999Science 284:2118-2124;和美国专利号5,558,991)。糖部分包含:核糖基;2’-脱氧核糖基;3’-脱氧核糖基;2’,3’-二脱氧核糖基;2’,3’-二脱氢二脱氧核糖基;2’-烷氧基核糖基;2’-叠氮基核糖基;2’-氨基核糖基;2’-氟代核糖基;2’-巯基核糖基;2’-烷基硫基核糖基;3’-烷氧基核糖基;3’-叠氮基核糖基;3’-氨基核糖基;3’-氟代核糖基;3’-巯基核糖基;3’-烷基硫代核糖基碳环;无环或其他修饰糖。
在一些实施方案中,核苷酸包含一个、两个或三个磷原子的链,其中链通常经由酯键或磷酰胺键附接至糖部分的5’碳。在一些实施方案中,核苷酸是具有磷链的类似物,其中磷原子与中间的O、S、NH、亚甲基或亚乙基连接在一起。在一些实施方案中,链中的磷原子包括取代的侧基,包括O、S或BH3。在一些实施方案中,链包括磷酸基团,该磷酸基团被包括氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和O-甲基亚磷酰胺基团的类似物取代。
术语“报告部分”或相关术语是指生成或导致生成可检测信号的化合物。报告部分有时称为“标记”。可使用任何合适的报告部分,包括发光、光致发光、电致发光、生物发光、化学发光、荧光、磷光、发色团、放射性同位素、电化学、质谱、拉曼、半抗原、亲和标签、原子或酶。报告部分生成由化学或物理变化(例如,热、光、电、pH、盐浓度、酶活性或接近事件)产生的可检测信号。接近事件包括两个报告部分彼此接近,或彼此缔合,或彼此结合。本领域技术人员公知的是,选择报告部分,使得每个报告部分在与其他报告部分可区分的波长下吸收激发辐射和/或发射荧光,以允许监测相同反应或不同反应中不同报告部分的存在。可以选择具有光谱上不同的发射分布或具有最小重叠的光谱发射分布的两种或更多种不同的报告部分。报告部分可以连接(例如,可操作地连接)至核苷酸、核苷、核酸、酶(例如,聚合酶或逆转录酶)或支持物(例如,表面)。
报告部分(或标记)包含荧光标记或荧光团。可充当荧光标记或荧光团的示例性荧光部分包括但不限于荧光素及荧光素衍生物(诸如羧基荧光素、四氯荧光素、六氯荧光素、羧基萘荧光素、异硫氰酸荧光素、NHS-荧光素、碘乙酰胺基荧光素、荧光素马来酰亚胺、SAMSA-荧光素、荧光素氨基硫脲、联氨基羰基甲基硫代乙酰氨基荧光素)、罗丹明及罗丹明衍生物(诸如TRITC、TMR、丽丝胺罗丹明、德克萨斯红(Texas Red)、罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明10、NHS-罗丹明、TMR-碘乙酰胺、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、丽丝胺罗丹明B磺酰肼、德克萨斯红磺酰氯、德克萨斯红酰肼)、香豆素及香豆素衍生物(诸如AMCA、AMCA-NHS、AMCA-磺基-NHS、AMCA-HPDP、DCIA、AMCE-酰肼)、BODIPY及衍生物(例如BODIPY FL C3-SE、BODIPY 530/550C3、BODIPY 530/550C3-SE、BODIPY 530/550C3酰肼、BODIPY 493/503C3酰肼、BODIPY FLC3酰肼、BODIPY FL IA、BODIPY 530/551IA、Br-BODIPY 493/503、Cascade Blue及衍生物(诸如Cascade Blue乙酰叠氮化物、Cascade Blue尸胺、Cascade Blue乙二胺、CascadeBlue酰肼)、荧光黄(Lucifer Yellow)及衍生物(诸如荧光黄碘乙酰胺、荧光黄CH)、花菁及衍生物(诸如吲哚鎓基花菁染料、苯并吲哚鎓基花菁染料、吡啶鎓基花菁染料、噻唑鎓基花菁染料、喹啉鎓基花菁染料、咪唑鎓基花菁染料、Cy3、Cy5)、镧系元素螯合物及衍生物(诸如BCPDA、TBP、TMT、BHHCT、BCOT、铕螯合物、铽螯合物)、Alexa Fluor染料、DyLight染料、Atto染料、LightCycler Red染料、CAL Flour染料、JOE及其衍生物、俄勒冈绿(Oregon Green)染料、WellRED染料、IRD染料、藻红蛋白和藻胆素染料、孔雀石绿、芪、DEG染料、NR染料、近红外染料和其他例诸Haugland,Molecular Probes Handbook,(尤金市,俄勒冈州)第6版;Lakowicz,Principles of Fluorescence Spectroscopy,第2版,Plenum Press New York(1999)或Hermanson,Bioconjugate Techniques,第2版中描述的那些,或其衍生物,或其任何组合。花菁染料可以以磺化或非磺化形式存在,并且由两个氮原子之间的聚甲炔桥分开的两个假吲哚、苯并吲哚鎓、吡啶鎓、噻唑鎓或喹啉鎓基团组成。市售花菁荧光团包括例如Cy3(其可包含1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-2-(3-{1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-3,3-二甲基-1,3-二氢-2H-吲哚-2-基亚基}丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚鎓或1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-2-(3-{1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-3,3-二甲基-5-磺基-1,3-二氢-2H-吲哚-2-基亚基}丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚鎓-5-磺酸酯)、Cy5(其可包含1-(6-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-2-((1E,3E)-5-((E)-1-(6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-3,3-二甲基-5-吲哚-2-基亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-3,3二甲基-3H-吲哚-1-鎓或1-(6-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-2-((1E,3E)-5-((E)-1-(6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-3,3-二甲基-5-磺基吲哚-2-基亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-鎓-5-磺酸酯)和Cy7(其可包含1-(5-羧基戊基)-2-[(1E,3E,5E,7Z)-7-(1-乙基-1,3-二氢-2H-吲哚-2-基亚基)庚-1,3,5-三烯-1-基]-3H-吲哚鎓或1-(5-羧基戊基)-2-[(1E,3E,5E,7Z)-7-(1-乙基-5-磺基-1,3-二氢-2H-吲哚-2-基亚基)庚-1,3,5-三烯-1-基]-3H-吲哚鎓-5-磺酸酯),其中“Cy”代表“花菁”,第一个数字表示两个假吲哚基团之间的碳原子数。Cy2是噁唑衍生物而非假吲哚,并且苯衍生的Cy3.5、Cy5.5和Cy7.5是该规则的例外。
在一些实施方案中,报告部分可以是FRET对,使得可以在单激发和成像步骤下进行多重分类。如本文所用,FRET可包括激发交换(Forster)转移或电子交换(Dexter)转移。
如本文所用的术语“支持物”是指设计用于沉积生物分子或生物样品以用于测定和/或分析的基质。待沉积至支持物上的生物分子的示例包括核酸(例如,DNA、RNA)、多肽、糖类、脂质、单细胞或多细胞。生物样品的示例包括但不限于唾液、痰、黏液、血液、血浆、血清、尿、粪便、汗液、泪液和来自组织或器官的流体。
在一些实施方案中,支持物是固体、半固体或两者的组合。在一些实施方案中,支持物是多孔的、半多孔的、无孔的或多孔性的任何组合。在一些实施方案中,支持物可以是基本上平的、凹的、凸的或其任何组合。在一些实施方案中,支持物可以是圆柱形的,例如包括毛细管或毛细管的内表面。
在一些实施方案中,支持物的表面可以是基本上平滑的。在一些实施方案中,支持物可以是规则或不规则纹理的,包括凸起、蚀刻、孔、三维支架或其任何组合。
在一些实施方案中,支持物包含具有任何形状的珠,包括球形、半球形、圆柱形、桶形、环形、盘形、杆状、圆锥形、三角形、立方体、多边形、管状或线状。
支持物可以由任何材料制造,包括但不限于玻璃、熔融二氧化硅、硅、聚合物(例如,聚苯乙烯(PS)、大孔聚苯乙烯(MPPS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET))或其任何组合。考虑玻璃和塑料基质的各种组合物。
支持物可以具有固定在其上的多个(例如,两个或更多个)核酸模板。多个固定化核酸模板具有相同的序列或具有不同的序列。在一些实施方案中,多个核酸模板中的单个核酸模板分子被固定至支持物上的不同位点。在一些实施方案中,多个核酸模板中的两个或更多个单个核酸模板分子被固定至支持物上的位点。
术语“阵列”是指包含位于支持物上预定位置处的多个位点以形成位点阵列的支持物。位点可以是离散的,并由间质区隔开。在一些实施方案中,支持物上的预定位点可以以行或列一维排列,或以行和列二维排列。在一些实施方案中,多个预定位点以有组织的方式排列在支持物上。在一些实施方案中,多个预定位点以任何有组织的图案排列,包括直线、六边形图案、网格图案、具有反射对称性的图案、具有旋转对称性的图案等。不同位点对之间的间距可以相同或可以变化。在一些实施方案中,支持物包含至少102个位点、至少103个位点、至少104个位点、至少105个位点、至少106个位点、至少107个位点、至少108个位点、至少109个位点、至少1010个位点、至少1011个位点、至少1012个位点、至少1013个位点、至少1014个位点、至少1015个位点或更多,其中位点位于支持物上的预定位置处。在一些实施方案中,支持物上的多个预定位点(例如,102-1015个位点或更多)固定有核酸模板,以形成核酸模板阵列。在一些实施方案中,核酸模板通过与固定化表面捕获引物杂交而固定在多个预定位点处,或核酸模板共价附接至表面捕获引物。在一些实施方案中,核酸模板固定在多个预定位点处,例如固定在102-1015个位点处或更多。在一些实施方案中,克隆扩增固定化核酸模板,以在多个预定位点处生成固定化核酸簇。在一些实施方案中,单个固定化核酸簇包含线性簇,或包含单链或双链多联体。
在一些实施方案中,包含位于支持物上随机位置处的多个位点的支持物在本文中称为其上具有随机定位位点的支持物。支持物上随机定位位点的位置不是预定的。多个随机定位位点以无序和/或不可预测的方式排列在支持物上。在一些实施方案中,支持物包含至少102个位点、至少103个位点、至少104个位点、至少105个位点、至少106个位点、至少107个位点、至少108个位点、至少109个位点、至少1010个位点、至少1011个位点、至少1012个位点、至少1013个位点、至少1014个位点、至少1015个位点或更多,其中位点随机位于支持物上。在一些实施方案中,支持物上的多个随机定位位点(例如,102-1015个位点或更多)固定有核酸模板,以形成固定有核酸模板的支持物。在一些实施方案中,核酸模板通过与固定化表面捕获引物杂交而固定在多个随机定位位点处,或核酸模板共价附接至表面捕获引物。在一些实施方案中,核酸模板固定在多个随机定位位点处,例如固定在102-1015个位点处或更多。在一些实施方案中,克隆扩增固定化核酸模板,以在多个随机定位位点处生成固定化核酸簇。在一些实施方案中,单个固定化核酸簇包含线性簇,或包含单链或双链多联体。
当用于支持物时,术语“特征”是指支持物上的区域。在一些实施方案中,特征是在涂层上的区域,该涂层层叠在支持物上。在一些实施方案中,特征是在低非特异性结合涂层上的区域,该涂层层叠在支持物上。支持物或涂层可以具有位于支持物或涂层上不同预定位置处的多个区域(例如,特征)(图3,右)。支持物上的不同特征可以置于支持物上的非重叠位置或重叠位置处。特征可以配置为具有任何形状,例如圆形、卵形、正方形、矩形或多边形。这些特征可以以具有行和列的网格图案排列,或可以以行或列排列。在一些实施方案中,任何给定的特征含有固定至支持物或涂层的多个捕获寡核苷酸和/或多个环化寡核苷酸。多个特征包括至少第一和第二特征。
在一些实施方案中,支持物上的多个固定化表面捕获引物彼此流体连通,以允许试剂溶液(例如,核酸模板分子、可溶性引物、酶、核苷酸、二价阳离子、缓冲液等)流至支持物上,使得支持物上的多个固定化表面捕获引物可以基本上同时与试剂以大规模平行方式进行反应。在一些实施方案中,多个固定化表面捕获引物的流体连通可以用于在多个固定化表面捕获引物上基本上同时进行核酸扩增反应(例如,RCA、MDA、PCR和桥式扩增)。
在一些实施方案中,支持物上的多个固定化核酸簇彼此流体连通,以允许试剂溶液(例如,酶、核苷酸、二价阳离子等)流至支持物上,使得支持物上的多个固定化核酸簇可以基本上同时与试剂以大规模平行方式进行反应。在一些实施方案中,多个固定化核酸簇的流体连通可以用于在多个固定化核酸簇上基本上同时进行核苷酸结合测定和/或进行核苷酸聚合反应(例如,引物延伸或测序),并且任选地进行用于大规模平行测序的检测和成像。
当用于固定化酶时,术语“固定化”和相关术语是指通过共价键或非共价相互作用附接至支持物、或附接至支持物上的涂层、或包埋在由支持物上的涂层形成的基质内的酶(例如,聚合酶)。
当用于固定化核酸时,术语“固定化”和相关术语是指通过共价键或非共价相互作用附接至支持物、或附接至支持物上的涂层、或包埋在由支持物上的涂层形成的基质内的核酸分子,其中核酸分子包括表面捕获引物、核酸模板分子和捕获引物的延伸产物。捕获引物的延伸产物包括具有一个拷贝的插入序列和至少一个衔接子序列的核酸单拷贝分子,并且包括具有重复串联拷贝的插入序列和衔接子序列的多联体。核酸分子可以固定在支持物上的预定或随机位置处。核酸分子可以固定在支持物上钝化的涂层上或涂层内的预定或随机位置处。在一些实施方案中,术语“固定化”和相关术语是指通过共价键或非共价相互作用附接至支持物、或附接至支持物上的涂层、或包埋在由支持物上的涂层形成的基质内的酶(例如,聚合酶)。酶可以固定在支持物上的预定或随机位置处。酶可以固定在支持物上钝化的涂层上或涂层内的预定或随机位置处。
在一些实施方案中,一个或多个核酸模板固定在支持物上,例如固定在支持物上的位点处。在一些实施方案中,克隆扩增一个或多个核酸模板。在一些实施方案中,一个或多个核酸模板从支持物上克隆扩增(例如,在溶液中),然后沉积至支持物上并固定在支持物上。在一些实施方案中,一个或多个核酸模板的克隆扩增反应在支持物上进行,从而导致固定在支持物上。在一些实施方案中,使用核酸扩增反应克隆扩增一个或多个核酸模板(例如,在溶液中或在支持物上),核酸扩增反应包括以下中的任一种或任何组合:聚合酶链反应(PCR)、多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、桥式扩增、等温桥式扩增、滚环扩增(RCA)、环至环(circle-to-circle)扩增、解旋酶依赖性扩增、重组酶依赖性扩增和/或单链结合(SSB)蛋白依赖性扩增。
术语“表面捕获引物”、“捕获引物”、“捕获寡核苷酸”和相关术语是指固定至支持物上并包含可以与核酸模板分子的至少一部分杂交的序列的单链寡核苷酸。表面捕获引物可以用于经由杂交将模板分子固定至支持物上。表面捕获引物可以以在流动、洗涤、抽吸以及温度、pH、盐、化学和/或酶条件变化期间抵抗引物去除的方式固定至支持物上。通常,但不是必须地,表面捕获引物的5’端可以固定至支持物上。可替代地,表面捕获引物的内部或3’端可以固定至支持物上。
表面捕获引物的序列可以沿其长度与核酸模板分子的至少一部分完全或部分互补。支持物可以包括具有相同序列或具有两个或更多个不同序列的多个固定化表面捕获引物。表面捕获引物可以是任何长度,例如4-50个核苷酸,或50-100个核苷酸,或100-150个核苷酸,或更长的长度。
表面捕获引物可以具有末端3’核苷酸,其具有可延伸用于核苷酸聚合(例如,聚合酶催化的聚合)的3’糖部分。表面捕获引物可以具有末端3’核苷酸,该核苷酸具有与抑制核苷酸聚合的链终止部分连接的3’糖位置。可以使用去封闭剂去除(例如,去封闭)3’链终止部分,以将3’端转化为可延伸的3’OH端。链终止部分的示例包括烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苄基、叠氮基、胺基、酰胺基、酮基、异氰酸酯基、磷酸基团、硫基、二硫化物基、碳酸酯基、脲基或甲硅烷基。叠氮化物型链终止部分包括叠氮化物、叠氮基和叠氮甲基。去封闭剂的示例包括膦化合物,诸如三(2-羧乙基)膦(TCEP)和双磺基三苯基膦(BS-TPP),用于链终止基团叠氮化物、叠氮基和叠氮甲基。去封闭剂的示例包括四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)与哌啶,或与2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯并-醌(DDQ),用于链终止基团烷基、烯基、炔基和烯丙基。去封闭剂的示例包括Pd/C,用于链终止基团芳基和苄基。去封闭剂的示例包括膦、β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT),用于链终止基团胺、酰胺、酮、异氰酸酯、磷酸酯、硫基和二硫化物。去封闭剂的示例包括碳酸钾(K2CO3)的MeOH溶液、三乙胺的吡啶溶液和Zn的乙酸(AcOH)溶液,用于碳酸酯链终止基团。去封闭剂的示例包括四丁基氟化铵、吡啶-HF与氟化铵,和三乙胺三氟化氢,用于链终止基团脲和甲硅烷基。
术语“支链聚合物”和相关术语是指具有有助于缀合生物活性分子(诸如核苷酸)的多个官能团的聚合物,并且官能团可以在聚合物的侧链上或直接附接至聚合物的中央核心或中央主链。支链聚合物可以具有线性主链,其中一个或多个官能团离开主链用于缀合。支链聚合物也可以是具有一个或多个侧链的聚合物,其中侧链具有适于缀合的位点。官能团的示例包括但不限于羟基、酯、胺、碳酸酯、乙缩醛、醛、醛水合物、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、酰肼、硫醇、链烷酸、酰基卤、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙基磺酸酯(tresylate)。
术语“测序”和相关术语是指通常通过确定核酸分子内至少一些核苷酸(包括它们的核碱基组分)的身份,从核酸分子获得核苷酸序列信息的方法。在一些实施方案中,核酸分子的给定区域的序列信息包括鉴定待测序区域内的每个核苷酸。在一些实施方案中,测序信息仅确定区域中的一些核苷酸,而一些核苷酸的身份仍未确定或未正确确定。可使用任何合适的测序方法。在示例性实施方案中,测序可以包括无标记或基于离子的测序方法。在一些实施方案中,测序可以包括标记的或含染料的核苷酸或基于荧光的核苷酸测序方法。在一些实施方案中,测序可以包括基于簇的测序或桥式测序方法。在一些实施方案中,测序采用聚合酶和多价分子来生成至少一种亲合力复合体,其中单个多价分子包含拴系于核心的多个核苷酸单元。在一些实施方案中,测序采用聚合酶和游离核苷酸来进行合成测序。在一些实施方案中,测序采用连接酶和多个序列特异性寡核苷酸来进行连接测序。
术语“持续时间”和相关术语是指在靶核酸、聚合酶、缀合或非缀合的核苷酸之间形成的结合复合体保持稳定而无任何结合组分从结合复合体解离的时间长度。持续时间表示结合复合体的稳定性和结合相互作用的强度。可以通过观察结合复合体的开始和/或持续时间,诸如通过观察来自结合复合体的标记组分的信号来测量持续时间。例如,标记的核苷酸或包含一个或多个核苷酸的标记的试剂可存在于结合复合体中,从而允许在结合复合体的持续时间期间检测来自标记的信号。一种示例性标记是荧光标记。
当用于核酸时,术语“扩增”和其他相关术语包括产生原始多核苷酸模板分子的多个拷贝,其中拷贝包含与模板序列互补的序列,或者拷贝包含与模板序列相同的序列。在一些实施方案中,拷贝包含与模板序列基本上相同的序列,或与互补于模板序列的序列基本上相同。
术语“滚环”扩增通常是指采用环状核酸模板分子的扩增方法,该环状核酸模板分子含有感兴趣靶序列、扩增引物结合序列以及任选的一个或多个衔接子序列,诸如测序引物结合序列和/或条形码。滚环扩增反应可以在等温扩增条件下进行,并且包括环状核酸模板分子、扩增引物、链置换聚合酶和多个核苷酸,以生成含有环状模板分子的串联重复序列和存在于原始环状核酸模板分子中的任何衔接子序列的多联体。多联体可以自塌陷形成核酸纳米球。通过在环状模板分子中包括一对反向重复序列,或通过用一个或多个压缩寡核苷酸(compaction oligonucleotide)进行滚环扩增反应,可以进一步压缩纳米球的形状和大小。使用滚环扩增生成用于测序工作流的克隆扩增子的优点之一是可以同时对纳米球中靶序列的重复拷贝进行测序以增加信号强度。在一些实施方案中,滚环扩增反应可以在具有至少四个连续鸟嘌呤的多个压缩寡核苷酸的存在下进行。滚环扩增反应生成包含压缩寡核苷酸的通用结合序列的重复拷贝的多联体。至少一个压缩寡核苷酸可以形成鸟嘌呤四联体并与压缩寡核苷酸的通用结合序列杂交,所得多联体可以折叠以形成分子内G-四链体结构。多联体可以自塌陷以形成紧凑的纳米球。在纳米球中形成鸟嘌呤四联体和G-四联体可增加纳米球的稳定性,以保持其紧凑的大小和形状,其可以承受用于进行本文所述测序工作流中任一种的试剂的重复流动。
当用于核酸时,术语“扩增”和其他相关术语包括产生原始多核苷酸模板分子的多个拷贝,其中拷贝包含与模板序列互补的序列,并且/或者拷贝包含与模板序列相同的序列。在一些实施方案中,拷贝包含与模板序列基本上相同的序列,并且/或者与互补于模板序列的序列基本上相同。
本文所用的术语“共振能量转移”和“RET”以及相关术语是指激发能量从作为供体部分的第一部分到作为受体部分的第二部分的无辐射传输。一种类型的RET包括荧光共振能量转移(FRET),其中处于激发态的供体荧光团通过非辐射偶极-偶极相互作用将其能量转移至近端受体分子。FRET的描述可以见于T.Forster,1948,“Intermolecular EnergyMigration and Fluorescence”,Ann.Phys.,2:55-75;和J.R.Lakowicz,1999,“Principlesof Fluorescence Spectroscopy”,第2版Plenum,New York.367-394。RET还包括发光共振能量转移、生物发光共振能量转移、化学发光共振能量转移和不严格遵循Forster理论的类似类型的能量转移,诸如利用非重叠受体时发生的非重叠能量转移。参见例如Anal.Chem.2005,77:1483-1487。
本文所用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”以及其他相关术语可互换使用,并且是指氨基酸的聚合物,不限于任何特定长度。多肽可包含天然和非天然氨基酸。多肽包括重组或化学合成的形式。多肽还包括尚未经历翻译后修饰(诸如蛋白水解切割、由于核糖体跳跃的切割、羟基化、甲基化、脂化、乙酰化、SUMO化、泛素化、糖基化、磷酸化和/或二硫键形成)的前体分子。这些术语涵盖天然和人工蛋白、蛋白片段和蛋白质序列的多肽类似物(诸如突变蛋白、变体、嵌合蛋白和融合蛋白)以及翻译后或其他共价或非共价修饰的蛋白。
本公开内容提供了用于进行大规模平行核酸聚合酶集落(polony)形成和测序的各种试剂和采用该试剂的方法。各种试剂可以包括至少一种pH缓冲剂。本文列出了pH缓冲剂的全称。
术语“Tris”是指pH缓冲剂三(羟甲基)-氨基甲烷。
术语“Tris-HCl”是指pH缓冲剂三(羟甲基)-氨基甲烷盐酸盐。术语“Tris-乙酸盐”是指包含三(羟甲基)-氨基甲烷乙酸盐的pH缓冲剂。
术语“Tricine”是指pH缓冲剂N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸。
术语“Bicine”是指pH缓冲剂N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸。
术语“Bis-Tris丙烷”是指pH缓冲剂1,3双[三(羟甲基)甲基氨基]丙烷。
术语“HEPES”是指pH缓冲剂4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。
术语“MES”是指pH缓冲剂2-(N-吗啉基)乙磺酸。
术语“MOPS”是指pH缓冲剂3-(N-吗啉基)丙磺酸。
术语“MOPSO”是指pH缓冲剂3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸。
术语“BES”是指pH缓冲剂N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸。
术语“TES”是指pH缓冲剂2-[(2-羟基-1,1双(羟甲基)乙基)氨基]乙磺酸。
术语“CAPS”是指pH缓冲剂3-(环己基氨基)-1-丙磺酸。
术语“TAPS”是指pH缓冲剂N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸。
术语“TAPSO”是指pH缓冲剂N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基-2-羟基丙磺酸。
术语“ACES”是指pH缓冲剂N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸。
术语“PIPES”是指pH缓冲剂哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)。
术语“Tris-乙酸盐”是指包含三(羟甲基)-氨基甲烷的乙酸盐的pH缓冲剂。
术语“多价分子”是指包含多个结合基序的分子。在一些实施方案中,多个结合基序各自配置为结合核酸碱基(例如,A、C、T、G或U)。在一些情况下,多价分子包含:(a)核心;和(b)多个核苷酸臂,其各自包含(i)核心附接部分、(ii)包含PEG部分的间隔区、(iii)接头和(iv)核苷酸单元。图2B示出了根据一些实施方案的多价分子的示例。
术语“三元复合体”或“三元结合复合体”是指包含三个组分的复合体。在一些实施方案中,三元复合体包含:(a)本文公开的多价分子、(b)引发的核酸序列和(c)聚合酶。
引言
本公开内容提供了组合物和采用该组合物进行大规模平行核酸测序工作流的方法,其中工作流包括但不限于核酸文库制备、文库环化、文库分子扩增、文库固定至支持物上、核酸模板分子的聚合酶集落形成以及对核酸模板分子进行测序。
本公开内容提供了包含用于进行核酸测序工作流的试剂的组合物,其中该组合物包括:通用洗涤试剂;核酸杂交试剂;第一和第二扩增试剂;洗脱试剂;捕获试剂;捕获后试剂;成像试剂;步进试剂;以及切割试剂。
本公开内容提供了一种采用上述各种试剂的核酸测序工作流,其中测序工作流通常包括聚合酶集落形成和序列确定反应。
在一些实施方案中,聚合酶集落形成工作流通常包括:使核酸模板分子与扩增引物杂交以形成核酸双链体;扩增核酸双链体以形成多个多联体,其中多个多联体中的单个多联体是聚合酶集落。
在一些实施方案中,序列确定反应工作流通常包括:通过使多联体模板分子与测序引物、测序聚合酶和多价分子在适于抑制来自多价分子聚合酶催化的核苷酸单元掺入的条件下结合在一起来形成三元复合体;对来自三元复合体中结合的多价分子的信号进行成像;解离三元复合体;通过使多联体模板分子与测序引物、测序聚合酶和核苷酸(例如,链终止子核苷酸)在适于促进聚合酶催化的核苷酸掺入从而用核苷酸延伸测序引物以形成新生测序引物链的条件下结合在一起来形成三元复合体;以及形成新生测序引物链的3’端可延伸末端。
核酸片段化
本公开内容提供了用于制备片段化核酸群体的试剂、试剂盒和方法。在一些实施方案中,单个片段化核酸将与至少一个通用衔接子序列共价连接,以用于文库制备。
核酸文库分子的插入区包含从任何来源提取的感兴趣序列,包括生物样品(例如,新鲜或活的样品),诸如单个细胞、多个细胞或组织。插入区可以从健康或患病细胞或组织中分离。插入区可从存档的样品(诸如新鲜冷冻石蜡包埋(FFPE)样品)或从针刺活检、循环肿瘤细胞、无细胞循环DNA(例如,从肿瘤细胞或胎儿)中获得。通常用裂解缓冲液处理细胞或组织以释放它们的DNA和RNA,并将所需核酸与非所需的大分子(诸如蛋白质)分离。
核酸文库分子的插入区可以以任何形式分离,包括染色体、基因组(例如,全基因组)、细胞器(例如,线粒体、叶绿体或核糖体)、重组分子,克隆的或扩增的。核酸文库分子的插入区可以是甲基化的或非甲基化的。
插入区可以从任何生物体中分离,包括病毒、真菌、原核生物或真核生物。插入区可以从任何生物体中分离,包括人、猴、猿、犬、猫、牛、马、鼠、猪、山羊、狼、蛙、鱼、植物、昆虫或细菌。插入区可以从空气、水、土壤或食物中携带的生物体中分离。
插入区可以从任何生物流体中分离,包括血液、尿、血清、淋巴、肿瘤、唾液、肛门分泌物、阴道分泌物、羊膜样品、汗液、精液、环境样品或培养样品。插入区可以从任何器官中分离,包括头、颈、脑、乳腺、卵巢、子宫颈、结肠、直肠、子宫内膜、胆囊、肠、膀胱、前列腺、睾丸、肝、肺、肾、食道、胰腺、甲状腺、垂体、胸腺、皮肤、心脏、喉或其他器官。
插入区可以使用重组核酸技术制备,包括但不限于载体克隆、转基因宿主细胞制备、宿主细胞培养和/或PCR扩增的任何组合。
插入区可以是片段化或非片段化的形式。片段化插入区可以通过机械力、酶促或化学片段化方法获得。片段化插入区可以使用产生具有重叠序列或非重叠序列的片段群体的程序生成。
机械片段化通常生成随机片段化的核酸分子。机械片段化方法包括机械剪切(诸如流体剪切)、恒定剪切和脉动剪切。机械片段化方法还包括机械应力,包括声处理、雾化和声空化。在一些实施方案中,聚焦声能可以用于随机片段化核酸分子。市售的设备(例如,Covaris)可以用于使用聚焦声能片段化核酸分子。
可以在适于生成随机或非随机片段化核酸分子的条件下进行酶促片段化程序。例如,可以进行完全限制性核酸内切酶消化,以生成非随机片段化核酸分子。可替代地,可以进行部分或不完全限制性酶消化,以生成随机片段化核酸分子。使用限制性核酸内切酶进行的酶促片段化包括选自I型、II型、IIs型、IIB型、III型或IV型限制性酶中的任一种或两种或更多种限制性酶的任何组合。酶促片段化包括用稀有切割限制性酶消化核酸,包括NotI、Asc I、Bae I、AspC I、Pac I、Fse I、Sap I、Sfi I或Psr I。酶促片段化包括使用切口限制性核酸内切酶、核酸内切酶和/或核酸外切酶的任何组合。酶促片段化可以通过进行切口平移反应来实现。
在一些实施方案中,酶促片段化可以通过使核酸与酶混合物(例如生成单链切口的酶和催化双链切割的另一种酶)反应来实现。示例性酶混合物是FRAGMENTASE(例如,来自New England Biolabs)。
可以使用与基因组DNA样品中的靶区域杂交的序列特异性引物通过PCR生成插入区的片段,以生成具有已知片段长度和序列的插入区。
使用CRISPR/Cas9的靶向基因组片段化方法可以用于生成片段化的插入区。
插入部分的片段也可以使用NEXTERA(来自Epicentre)使用基于转座酶的标签化(tagmentation)方法来生成。
插入区可以是单链或双链的。双链插入区的末端可以是平端,或5’突出端或3’突出端,或其任何组合。插入区的一端或两端可以通过采用末端转移酶反应进行酶促加尾反应,以生成非模板聚-A尾。插入区的末端可以与至少一个通用衔接子序列的连接相容。
插入区可以是任何长度,例如插入区的长度可以为约50-250,或约250-500,或约500-750,或约750-1000个碱基或碱基对。
可以对含有插入区的片段进行大小选择过程,或者不选择片段的大小。例如,可以通过凝胶电泳和凝胶切片提取来选择片段的大小。可以使用固相黏附/固定方法来选择片段大小,该方法通常采用包被有化学官能团的微顺磁珠,该化学官能团在有或无聚乙二醇或聚亚烷基二醇的某些离子强度条件下与核酸相互作用。市售的固相黏附珠包括来自Beckman Coulter的SPRI(固相可逆固定)珠(AMPUR XP顺磁珠,货号B23318)、MAGNA PURE磁性玻璃颗粒(Roche Diagnostics,货号03003990001)、来自Promega的MAGNASIL顺磁珠(货号MD1360)、来自Precision system Science的MAGTRATION顺磁珠和系统(货号A1120和A1060)、来自Omega Bio-Tek的MAG-BIND(货号M1378-01)、来自Millapore的MAGPREP二氧化硅(货号101193)、来自Bangs Laboratories的SNARE DNA纯化系统(货号BP691、BP692和BP693),以及来自Perkin Elmer的CHEMAGEN M-PVA珠(货号CMG-200)。
在一些实施方案中,可以对片段化核酸进行酶促反应,以进行末端修复和/或加A尾。片段化核酸可以与多种酶在适于生成具有平端5’磷酸化末端的核酸片段的条件下接触。在一些实施方案中,多种酶生成在其3’端具有非模板A尾的平端片段。多种酶包含能够催化核酸末端修复、磷酸化和/或加A尾的两种或更多种酶。末端修复酶包括DNA聚合酶(例如,T4 DNA聚合酶)和Klenow片段。5’端磷酸化酶包含T4多核苷酸激酶。加A尾的酶包括Taq聚合酶(例如,非校正(non-proof-reading)聚合酶)和dATP。在一些实施方案中,片段化、末端修复、磷酸化和加A尾可以使用酶的混合物在一锅法反应中进行。
将衔接子附加至片段化核酸
本公开内容提供了用于将一个或多个衔接子序列附加至片段化核酸的试剂、试剂盒和方法。在一些实施方案中,单个片段化核酸将与至少一个通用衔接子序列共价连接,以用于文库制备。通常,核酸片段在两端与一个或多个通用衔接子共价连接,以生成具有排列左衔接子-插入-右衔接子的线性文库分子。在一些实施方案中,片段化核酸群体中的至少一个片段包含感兴趣序列。文库分子群体中的单个文库分子可以具有与群体中的其他文库分子相同或不同的插入区。在一些实施方案中,可以将约1-10ng、或约10-50ng、或约50-100ng的输入片段化核酸附加至一个或多个通用衔接子,以生成线性文库。
单个核酸片段可以在一端或两端附加至至少一个通用衔接子序列,以形成具有通用排列左衔接子-插入-右衔接子的重组核酸线性文库分子。
在一些实施方案中,核酸片段可以附加有衔接子序列中的任一种或两种或更多种的任何组合,该衔接子序列包含具有第一表面引物的结合序列的左通用衔接子序列、具有第二表面引物的结合序列的右通用衔接子序列、具有第一测序引物的结合序列的左通用衔接子序列、具有第二测序引物的结合序列的右通用衔接子序列、左样品索引序列、右样品索引序列、左独特识别序列、右独特识别序列和/或用于结合压缩寡核苷酸的通用衔接子序列。
通用衔接子可以使用化学合成程序制备,该化学合成程序使用有或无核苷酸类似物或修饰的核苷酸键的天然核苷酸,核苷酸类似物或修饰的核苷酸键赋予某些特性,包括对酶消化的抗性或增加的热稳定性。抑制核酸酶消化的核苷酸类似物和修饰的核苷酸键的示例包括硫代磷酸酯、2’-O-甲基RNA、反向dT和2’3’双脱氧-dT。包括锁核酸(LNA)的插入区具有增加的热稳定性。
可以使用连接酶和/或引物延伸反应将插入区的一端或两端连接至至少一个通用衔接子序列,以生成线性文库分子。插入区和通用衔接子之间的共价连接可以用DNA或RNA连接酶实现。可以连接双链DNA分子的示例性DNA连接酶包括T4 DNA连接酶和T7 DNA连接酶。可以使用具有携带通用衔接子序列的5’区和与插入序列的一部分互补的3’区的加尾引物通过PCR将通用衔接子序列附加至插入序列。可以使用具有携带第三通用衔接子序列的5’区和与第一或第二衔接子序列的一部分互补的3’区的加尾引物,通过PCR将通用衔接子序列附加至一侧或两侧与第一和第二通用衔接子序列侧接的插入序列。
核酸杂交试剂和使用方法
本公开内容提供了一种或多种核酸杂交试剂,以及采用核酸杂交试剂的方法,其中该方法包括使核酸模板分子与扩增引物杂交以形成多个核酸双链体(例如,本文所述方法的步骤(a))。杂交试剂可以促进感兴趣模板分子与扩增引物之间的特异性杂交。当在下游步骤中确定扩增的模板分子的序列时,核酸杂交试剂可以减少背景信号。
在一些实施方案中,核酸杂交试剂可以用于使文库分子与固定至支持物上的扩增引物杂交。支持物可以是平面支持物或至少一个珠。核酸杂交试剂可以用于如下所述的大规模平行测序工作流步骤(a)。
在一些实施方案中,核酸杂交试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂和至少一种一价阳离子。杂交试剂进一步包含洗涤剂、还原剂、离液剂、螯合剂、醇、两性离子、糖醇和/或拥挤剂中的任一种或两种或更多种的任何组合。
在一些实施方案中,核酸杂交试剂进一步包含至少一个核酸模板分子,其包含DNA或RNA,或RNA和DNA的混合物。在一些实施方案中,核酸模板分子包含线性或环状分子,或线性和环状分子的混合物。在一些实施方案中,核酸模板分子包含单链分子、双链分子或具有单链和双链部分的核酸分子。在一些实施方案中,单个核酸模板分子可操作地连接至至少一个衔接子,其中该衔接子包括捕获引物结合序列、扩增引物结合序列和/或测序引物结合序列。在一些实施方案中,单个核酸模板分子可操作地连接至具有样品条形码序列或独特分子标签序列的至少一个衔接子。在一些实施方案中,单个核酸模板分子可操作地连接至具有结合缩合寡核苷酸(condenser oligonucleotide)的至少一部分的序列的至少一个衔接子。
在一些实施方案中,核酸杂交试剂进一步包含至少一个核酸扩增双链体,其包含与扩增寡核苷酸引物杂交的核酸模板分子。扩增引物可以与核酸模板分子的至少一部分杂交。扩增引物包含3’可延伸末端或3’不可延伸末端。
在一些实施方案中,扩增引物包含可溶性寡核苷酸引物(例如,在溶液中),或者扩增引物固定至支持物或固定至支持物上的涂层(例如,聚合物涂层)上。
在一些实施方案中,核酸杂交试剂进一步包含固定至支持物上的至少一个核酸双链体,其中该核酸双链体包含与扩增引物杂交的核酸模板分子,并且其中模板分子和/或扩增引物固定至支持物或固定至支持物上的涂层(例如,聚合物涂层)上。在一些实施方案中,支持物可以涂覆有至少一层亲水性聚合物涂层。在一些实施方案中,亲水性聚合物涂层的水接触角不超过45-50度。在一些实施方案中,多个扩增引物固定至支持物上的一层或多层涂层上,其中固定化扩增引物的密度为约100-100,000个扩增引物/mm2。
在一些实施方案中,支持物上的多个固定化核酸扩增双链体彼此流体连通以允许核酸杂交试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化扩增双链体可以以大规模平行的方式基本上同时与核酸杂交试剂反应。在一些实施方案中,多个固定化扩增双链体的流体连通可以用于在支持物上以大规模平行的方式进行核酸杂交反应。
在一些实施方案中,核酸杂交试剂可包含MES(50mM,pH 8.8)、EDTA(0.5mM)、NaCl(50mM)和Triton-X(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂HR-A。
在一些实施方案中,核酸杂交试剂可包含MES(100mM,pH 8.8)、EDTA(0.25mM)、MgCl2(75mM)、乙二醇(5%)和吐温-20(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂HR-B。
在一些实施方案中,核酸杂交试剂可包含MES(200mM,pH 8.3)、EDTA(0.5mM)、NaCl(100mM)、SDS(0.5M)、甘油(5%)和吐温-20(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂HR-C。
在一些实施方案中,核酸杂交试剂可包含MES(50mM,pH 7.7)、EDTA(5mM)、NaCl(200mM)、SDS(0.25M)和Triton-X(0.03%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂HR-D。
在一些实施方案中,核酸杂交试剂可包含MES(50mM,pH 8.2)、EDTA(50mM)、MgCl2(1M)和吐温-20(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂HR-E。
在一些实施方案中,核酸杂交试剂可包含MES(50mM,pH 7.6)、EDTA(0.5mM)、NaCl(100mM)、氯化胍(1M)和吐温-20(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂HR-F。
在一些实施方案中,核酸杂交试剂可包含MES(50mM,pH 8)、EDTA(0.5mM)、NaCl(100mM)、氯化胍(1M)和吐温-20(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂HR-G。
在一些实施方案中,核酸杂交试剂可包含MES(50mM,pH 8)、EDTA(5mM)、NaCl(100mM)、甲醇(1M)和Triton-X(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂HR-H。
在一些实施方案中,核酸杂交试剂可包含MES(50mM,pH 7.9)、EDTA(2mM)、NaCl(200mM)、苯酚(2M)和Triton-X(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂HR-I。
在一些实施方案中,核酸杂交试剂可包含MES(50mM,pH 8)、EDTA(0.5mM)、NaCl(10mM)、氯化胍(1M)和吐温-20(1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂HR-J。
核酸扩增试剂和使用方法
本公开内容提供了一种或多种核酸扩增试剂,以及采用核酸扩增试剂的方法,其中该方法包括形成多个复合的扩增聚合酶,每一个复合的扩增聚合酶包含扩增聚合酶和与核酸扩增双链体结合的核苷酸(例如,与扩增引物杂交的核酸模板分子)。在一些实施方案中,核酸扩增反应可以作为分别采用第一和第二扩增试剂的两阶段扩增反应进行。第一扩增试剂可以在抑制扩增的条件下用扩增聚合酶接种多个核酸双链体。第二扩增试剂可以促进多个核酸双链体的扩增,使得扩增同时在多个双链体上发生。在一些实施方案中,可以使用两阶段扩增反应来生成从文库分子中拷贝的克隆扩增的模板分子,其中克隆扩增的模板分子固定至支持物上。
在一些实施方案中,核酸扩增试剂包含第一扩增试剂,以及采用第一扩增试剂的方法,其中该方法包括使多个核酸双链体与第一扩增试剂在适于形成多个复合的扩增聚合酶但扩增被抑制的条件下接触,每一种复合的扩增聚合酶包含扩增聚合酶和与核酸双链体结合的核苷酸。第一扩增试剂可以用于如下所述的步骤(c)的大规模平行测序工作流。在一些实施方案中,第一扩增试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、铵离子、多个核苷酸和扩增聚合酶。在一些实施方案中,第一扩增试剂进一步包含洗涤剂、还原剂、黏度剂中的任一种或两种或更多种的任何组合。在一些实施方案中,第一扩增试剂的pH适于使扩增聚合酶与核酸双链体结合,该核酸双链体包含与扩增寡核苷酸引物杂交的核酸模板分子。在一些实施方案中,第一扩增试剂的pH可以降低/抑制扩增聚合酶的活性(例如,聚合酶催化的核苷酸掺入活性)。例如,第一扩增试剂的pH可以是约pH 8或更低(例如,pH 7-8)。
在一些实施方案中,扩增聚合酶具有链置换活性。扩增聚合酶包含野生型或突变型氨基酸序列。
在一些实施方案中,多个核苷酸包含选自dATP、dGTP、dCTP和dTTP的两种或更多种核苷酸的混合物。在一些实施方案中,多个核苷酸包含包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP的四种类型的核苷酸的混合物。
在一些实施方案中,第一扩增试剂进一步包含至少一个核酸模板分子,其包含DNA或RNA,或RNA和DNA的混合物。在一些实施方案中,核酸模板分子包含线性或环状分子,或线性和环状分子的混合物。在一些实施方案中,核酸模板分子包含单链分子、双链分子或具有单链和双链部分的核酸分子。在一些实施方案中,单个核酸模板分子可操作地连接至至少一个衔接子,其中该衔接子包括捕获引物结合序列、扩增引物结合序列和/或测序引物结合序列。在一些实施方案中,单个核酸模板分子可操作地连接至具有样品条形码序列或独特分子标签序列的至少一个衔接子。在一些实施方案中,可以与第一扩增试剂反应的环状或线性文库分子的量为约1-10fmol、或约10-25fmol、或约25-50fmol、或约50-100fmol、或约100-200fmol。在一些实施方案中,可以与第一扩增试剂反应的环状或线性文库分子的量为约1-10pmol、或约10-25pmol、或约25-50pmol、或约50-100pmol、或约100-200pmol。
在一些实施方案中,第一扩增试剂进一步包含至少一个核酸扩增双链体,其包含与扩增寡核苷酸引物杂交的核酸模板分子。扩增引物可以与核酸模板分子的至少一部分杂交。扩增引物包含3’可延伸末端或3’不可延伸末端。
在一些实施方案中,扩增引物包含可溶性寡核苷酸引物(例如,在溶液中),或者扩增引物固定至支持物或固定至支持物上的涂层(例如,聚合物涂层)上。
在一些实施方案中,第一扩增试剂进一步包含固定至支持物上的至少一个核酸双链体,其中该核酸双链体包含与扩增引物杂交的核酸模板分子,并且其中模板分子和/或扩增引物固定至支持物或固定至支持物上的涂层(例如,聚合物涂层)上。在一些实施方案中,支持物可以涂覆有至少一层亲水性聚合物涂层。在一些实施方案中,亲水性聚合物涂层的水接触角不超过45-50度。在一些实施方案中,多个扩增引物固定至支持物上的一层或多层涂层上,其中固定化扩增引物的密度为约100-100,000个扩增引物/mm2。
在一些实施方案中,支持物上的多个固定化核酸扩增双链体彼此流体连通以允许第一扩增试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化扩增双链体可以以大规模平行的方式基本上同时与第一扩增试剂反应。在一些实施方案中,多个固定化扩增双链体的流体连通可以用于在支持物上以大规模平行的方式进行核酸扩增反应。
在一些实施方案中,核酸扩增试剂包含第二扩增试剂,以及采用核酸扩增试剂的方法,其中该方法包括使多个复合的扩增聚合酶与第二扩增试剂在适合于保留复合的扩增聚合酶并促进扩增的条件下接触,以生成具有与其各自文库分子互补的序列的扩增子。第二扩增试剂可以用于下文所述的步骤(d)的大规模平行测序工作流。
在一些实施方案中,扩增反应可以生成含有环状文库分子的串联重复序列的多联体模板分子,该环状文库分子包括存在于原始环状核酸文库分子中的任何插入和衔接子序列。在一些实施方案中,扩增反应可以生成线性模板分子,该线性模板分子具有线性文库分子的一个拷贝,该线性文库分子包括存在于原始线性核酸文库分子中的任何插入和衔接子序列。在一些实施方案中,第二扩增试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、铵离子和多个核苷酸。在一些实施方案中,第二扩增试剂缺乏扩增聚合酶。在一些实施方案中,第二扩增试剂进一步包含洗涤剂、还原剂、黏度剂中的任一种或两种或更多种的任何组合。在一些实施方案中,第一和第二扩增试剂具有不同的pH。在一些实施方案中,第二扩增试剂的pH适于保留具有与核酸双链体结合的扩增聚合酶(例如,来自第一扩增试剂)的复合体,该核酸双链体包含与扩增寡核苷酸引物杂交的核酸模板分子。在一些实施方案中,第二扩增试剂的pH可以适于促进扩增聚合酶的活性(例如,聚合酶催化的核苷酸掺入活性)。例如,第二扩增试剂的pH可以为约pH 8.5或更高(例如,pH 8.5-8.8)。
在一些实施方案中,多个核苷酸包含选自dATP、dGTP、dCTP和dTTP的两种或更多种核苷酸的混合物。在一些实施方案中,多个核苷酸包含包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP的四种类型的核苷酸的混合物。在一些实施方案中,多个核苷酸包含包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP的五种类型的核苷酸的混合物。
在一些实施方案中,第二扩增试剂进一步包含至少一个核酸扩增双链体,其包含与扩增寡核苷酸引物杂交的核酸模板分子(例如,线性或环状模板分子)。扩增引物可以与核酸模板分子的至少一部分杂交。扩增引物包含3’可延伸末端或3’不可延伸末端。
在一些实施方案中,扩增引物包含可溶性寡核苷酸引物(例如,在溶液中),或者扩增引物固定至支持物或固定至支持物上的涂层(例如,聚合物涂层)上。
在一些实施方案中,第二扩增试剂进一步包含固定至支持物上的至少一个核酸双链体,其中该核酸双链体包含与扩增引物杂交的核酸模板分子(例如,线性或环状模板分子),并且其中模板分子和/或扩增引物固定至支持物或固定至支持物上的涂层(例如,聚合物涂层)上。在一些实施方案中,支持物可以涂覆有至少一层亲水性聚合物涂层。在一些实施方案中,亲水性聚合物涂层的水接触角不超过45-50度。在一些实施方案中,多个扩增引物固定至支持物上的一层或多层涂层上,其中固定化扩增引物的密度为约100-100,000个扩增引物/mm2。
在一些实施方案中,支持物上的多个固定化核酸扩增双链体彼此流体连通以允许第二扩增试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化扩增双链体可以以大规模平行的方式基本上同时与第二扩增试剂反应。在一些实施方案中,多个固定化扩增双链体的流体连通可以用于在支持物上以大规模平行的方式进行核酸扩增反应。
在一些实施方案中,第二扩增试剂进一步包含固定至支持物上的至少一个多联体,并且其中该多联体固定至支持物或固定至支持物上的涂层(例如,聚合物涂层)上。在一些实施方案中,支持物可以涂覆有至少一层亲水性聚合物涂层。在一些实施方案中,亲水性聚合物涂层的水接触角不超过45-50度。在一些实施方案中,多个多联体固定至支持物上的一层或多层涂层上,其中固定化多联体的密度为约100-100,000个扩增引物/mm2。
在一些实施方案中,支持物上的多个固定化多联体彼此流体连通以允许第二扩增试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化多联体可以以大规模平行的方式基本上同时与第二扩增试剂反应。在一些实施方案中,多个固定化多联体的流体连通可以用于在支持物上以大规模平行的方式进行核酸扩增反应。
在一些实施方案中,第一扩增试剂可包含Tris(50mM,pH 8)、MgSO4(20mM)、KCl(50mM)、(NH4)SO4(30mM)、吐温-80(0.5%)、DTT(1mM)、甜菜碱(0.8M)、蔗糖(0.3M)、dATP(2mM)、dGTP(2mM)、dCTP(2mM)、dTTP(2mM)、dUTP(0.01mM)和扩增聚合酶(120nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂AR1-A。
在一些实施方案中,第一扩增试剂可包含Tris(10mM,pH 8)、MgSO4(30mM)、KCl(20mM)、Triton-X(0.2%)、DTT(2mM)、甜菜碱(0.8M)、蔗糖(0.1M)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(0.99mM)、dUTP(0.02mM)和扩增聚合酶(240nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂AR1-B。
在一些实施方案中,第一扩增试剂可包含Tris(50mM,pH 8)、MgSO4(5mM)、KCl(50mM)、NaCl(40mM)、(NH4)SO4(5mM)、吐温-80(0.5%)、DTT(2mM)、甜菜碱(0.1M)、蔗糖(0.1M)、dATP(2mM)、dGTP(2mM)、dCTP(2mM)、dTTP(0.99mM)、dUTP(0.02mM)和扩增聚合酶(120nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂AR1-C。
在一些实施方案中,第一扩增试剂可包含Tris(50mM,pH 7)、MgSO4(10mM)、KCl(90mM)、(NH4)SO4(10mM)、吐温-80(0.1%)、DTT(5mM)、甜菜碱(0.4M)、蔗糖(0.4M)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(0.99mM)、dUTP(0.01mM)和扩增聚合酶(240nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂AR1-D。
在一些实施方案中,第一扩增试剂可包含Tris(50mM,pH 7)、MgSO4(70mM)、KCl(30mM)、NaCl(40mM)、(NH4)SO4(20mM)、吐温-80(0.5%)、DTT(5mM)、甜菜碱(0.4M)、蔗糖(1M)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(0.99mM)、dUTP(0.01mM)和扩增聚合酶(500nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂AR1-E。
在一些实施方案中,第一扩增试剂可包含Tris(25mM,pH 7)、MgSO4(10mM)、KCl(90mM)、(NH4)SO4(20mM)、Triton-X(0.1%)、DTT(5mM)、甜菜碱(0.4M)、蔗糖(0.4M)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(0.99mM)、dUTP(0.01mM)和扩增聚合酶(500nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂AR1-F。
在一些实施方案中,第一扩增试剂可包含Tris(50mM,pH 7.5)、MgSO4(10mM)、KCl(10mM)、(NH4)SO4(30mM)、吐温-80(0.1%)、DTT(5mM)、甜菜碱(0.4M)、蔗糖(0.4M)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(0.99mM)、dUTP(0.01mM)和扩增聚合酶(120nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂AR1-G。
在一些实施方案中,第一扩增试剂可包含Tris(50mM,pH 7.5)、KCl(90mM)、(NH4)SO4(100mM)、Triton-X(0.1%)、DTT(10mM)、甜菜碱(0.4M)、蔗糖(0.4M)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(0.99mM)、dUTP(0.01mM)和扩增聚合酶(240nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂AR1-H。
在一些实施方案中,第二扩增试剂可包含Tris(75mM,pH 8.5)、MgSO4(10mM)、KCl(200mM)、(NH4)SO4(30mM)、吐温-80(0.3%)、DTT(10mM)、甜菜碱(0.4M)、蔗糖(0.4M)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(0.99mM)和dUTP(0.01mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂AR2-A。
在一些实施方案中,第二扩增试剂可包含Tris(50mM,pH 8.5)、MgSO4(10mM)、KCl(90mM)、(NH4)SO4(10mM)、吐温-80(0.1%)、DTT(5mM)、甜菜碱(0.4M)、蔗糖(0.4M)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(0.99mM)和dUTP(0.01mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂AR2-B。
在一些实施方案中,第二扩增试剂可包含Tris(50mM,pH 8.5)、MgSO4(20mM)、KCl(150mM)、(NH4)SO4(10mM)、吐温-80(0.1%)、DTT(5mM)、甜菜碱(0.4M)、蔗糖(0.4M)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(0.99mM)和dUTP(0.01mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂AR2-C。
在一些实施方案中,第二扩增试剂可包含Tris(50mM,pH 8.5)、MgSO4(10mM)、KCl(90mM)、(NH4)SO4(10mM)、Triton-X(0.5%)、DTT(5mM)、甜菜碱(0.4M)、蔗糖(0.4M)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(0.99mM)和dUTP(0.01mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂AR2-D。
在一些实施方案中,第二扩增试剂可包含Tris(50mM,pH 8.5)、MgSO4(50mM)、NaCl(150mM)、(NH4)SO4(10mM)、Triton-X(0.1%)、DTT(5mM)、甜菜碱(0.4M)、蔗糖(0.4M)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(0.99mM)和dUTP(0.01mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂AR2-E。
在一些实施方案中,第二扩增试剂可包含Tris(50mM,pH 8.5)、MgSO4(10mM)、NaCl(200mM)、(NH4)SO4(30mM)、吐温-80(0.3%)、DTT(5mM)、甜菜碱(0.4M)、蔗糖(0.4M)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(0.99mM)和dUTP(0.01mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂AR2-F。
在一些实施方案中,第二扩增试剂可包含Tris(50mM,pH 8.5)、MgSO4(5mM)、NaCl(90mM)、(NH4)SO4(10mM)、SDS(0.5%)、DTT(5mM)、甜菜碱(0.4M)、蔗糖(0.4M)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(0.99mM)和dUTP(0.01mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂AR2-G。
在一些实施方案中,第二扩增试剂可包含Tris(50mM,pH 8.5)、MgSO4(20mM)、KCl(15mM)、(NH4)SO4(10mM)、SDS(0.3%)、DTT(5mM)、甜菜碱(0.4M)、蔗糖(0.4M)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(0.99mM)和dUTP(0.01mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂AR2-H。
在一些实施方案中,第二扩增试剂可包含Tris(50mM,pH 8.5)、NaCl(45mM)、(NH4)SO4(50mM)、吐温-80(0.1%)、DTT(5mM)、甜菜碱(0.4M)、蔗糖(0.8M)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(0.99mM)和dUTP(0.05mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂AR2-I。
通用洗涤试剂和使用方法
本公开内容提供了一种或多种通用洗涤试剂,以及采用通用洗涤试剂的方法。通用洗涤试剂可以用于在本文所述步骤中的任一个之后洗去未反应的组分。在一些实施方案中,通用洗涤试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子和洗涤剂。
如下所述,通用洗涤试剂可以在步骤(a)、步骤(b)、步骤(f)、步骤(l)、步骤(o)和/或步骤(q)之前用于大规模平行测序工作流。
在一些实施方案中,使用通用洗涤试剂的方法包括:在进行步骤(a)的核酸杂交之前进行步骤pre-(a)。步骤pre(a)包括:用洗涤试剂洗涤固定化扩增引物。
在一些实施方案中,使用通用洗涤试剂的方法包括:进行洗涤步骤(b),其包括用通用洗涤试剂洗涤多个固定化核酸双链体。
在一些实施方案中,使用通用洗涤试剂的方法包括:进行洗涤步骤(f),其包括用通用洗涤试剂洗涤多个多联体。
在一些实施方案中,使用通用洗涤试剂的方法包括:进行洗涤步骤(l),其包括用通用洗涤试剂洗涤多个固定化核酸双链体。
在一些实施方案中,使用通用洗涤试剂的方法包括:进行洗涤步骤(o),其包括用通用洗涤试剂洗涤具有延伸的测序引物的多个固定化核酸双链体。
在一些实施方案中,使用通用洗涤试剂的方法包括:进行洗涤步骤(q),其包括用通用洗涤试剂洗涤具有延伸的测序引物的多个固定化核酸双链体。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8)、EDTA(0.5mM)、NaCl(100mM)、吐温-20(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-A。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(20mM,pH 8)、EDTA(0.5mM)、NaCl(100mM)、吐温-20(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-B。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(30mM,pH 8)、EDTA(0.5mM)、NaCl(100mM)、吐温-20(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-C。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(40mM,pH 8)、EDTA(0.5mM)、NaCl(100mM)、吐温-20(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-D。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8.2)、EDTA(0.5mM)、NaCl(100mM)、吐温-20(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-E。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8.4)、EDTA(0.5mM)、NaCl(100mM)、吐温-20(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-F。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8.6)、EDTA(0.5mM)、NaCl(100mM)、吐温-20(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-G。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8.8)、EDTA(0.5mM)、NaCl(100mM)、吐温-20(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-H。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8)、EDTA(1mM)、NaCl(100mM)、吐温-20(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-I。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8)、EDTA(1.5mM)、NaCl(100mM)、吐温-20(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-J。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8)、EDTA(2mM)、NaCl(100mM)、吐温-20(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-K。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8)、EDTA(2.5mM)、NaCl(100mM)、吐温-20(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-L。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8)、EDTA(0.5mM)、NaCl(100mM)、吐温-20(0.5%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-M。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8)、EDTA(0.5mM)、NaCl(100mM)、吐温-20(1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-N。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8)、EDTA(0.5mM)、NaCl(100mM)、吐温-20(2%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-O。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8)、EDTA(0.5mM)、NaCl(100mM)、吐温-20(3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-P。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8.2)、EDTA(0.1mM)、NaCl(100mM)、Triton-X(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-Q。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8.6)、EDTA(0.2mM)、NaCl(100mM)、Triton-X(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-R。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8.4)、EDTA(0.3mM)、NaCl(100mM)、Triton-X(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-S。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8.0)、EDTA(0.4mM)、NaCl(100mM)、Triton-X(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-T。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8.8)、EDTA(0.5mM)、NaCl(10mM)、Triton-X(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-U。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8.8)、EDTA(0.5mM)、NaCl(25mM)、Triton-X(1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-V。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8.8)、EDTA(0.5mM)、NaCl(50mM)、Triton-X(0.2%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-W。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8.8)、EDTA(0.5mM)、NaCl(75mM)、Triton-X(2%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-X。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(40mM,pH 8.8)、EDTA(0.4mM)、NaCl(100mM)、Triton-X(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-Y。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(30mM,pH 8.8)、EDTA(0.1mM)、NaCl(100mM)、Triton-X(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-Z。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(20mM,pH 8.8)、EDTA(0.3mM)、NaCl(100mM)、Triton-X(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AA。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8.0)、EDTA(0.1mM)、NaCl(100mM)、Triton-X(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AB。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8.2)、EDTA(0.2mM)、NaCl(100mM)、Triton-X(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AC。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8.4)、EDTA(0.5mM)、NaCl(100mM)、Triton-X(0.2%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AD。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8.6)、EDTA(1mM)、NaCl(100mM)、Triton-X(0.4%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AE。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8.4)、EDTA(0.3mM)、NaCl(100mM)、Triton-X(0.2%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AF。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris(10mM,pH 8.8)、EDTA(0.5mM)、NaCl(100mM)、Triton-X(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AG。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(5mM,pH8.8)、EDTA(0.1mM)、NaCl(50mM)、Triton-X-100k(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AH。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(25mM,pH8.5)、EDTA(0.5mM)、NaCl(60mM)、Triton-X-100k(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AI。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(10mM,pH8.2)、EDTA(0.2mM)、NaCl(70mM)、Triton-X-100k(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AJ。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(25mM,pH8.7)、EDTA(0.7mM)、NaCl(80mM)、Triton-X-100k(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AK。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(50mM,pH8.4)、EDTA(0.4mM)、NaCl(90mM)、Triton-X-100k(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AL。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(25mM,pH8.8)、EDTA(0.1mM)、NaCl(100mM)、Triton-X-100k(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AM。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(5mM,pH8.5)、EDTA(0.4mM)、NaCl(75mM)、Triton-X-100k(0.4%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AN。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(20mM,pH8.2)、EDTA(0.2mM)、NaCl(75mM)、Triton-X-100k(0.7%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AO。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(40mM,pH8.4)、EDTA(0.7mM)、NaCl(200mM)、Triton-X-100k(0.3%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AP。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(100mM,pH8.6)、EDTA(0.3mM)、NaCl(50mM)、Triton-X-100k(2%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AQ。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(30mM,pH8.1)、EDTA(0.2mM)、NaCl(20mM)、Triton-X-100k(0.1%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AR。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(50mM,pH8)、EDTA(0.1mM,pH7.5)、NaCl(750mM)、吐温-20(0.01%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AS。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(60mM,pH8)、EDTA(0.1mM,pH7.8)、NaCl(50mM)、吐温-20(0.05%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AT。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(70mM,pH8)、EDTA(0.2mM,pH7.8)、NaCl(250mM)、吐温-20(0.07%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AU。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(70mM,pH8)、EDTA(0.2mM,pH7.7)、NaCl(100mM)、吐温-20(0.04%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AV。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(50mM,pH8)、EDTA(0.3mM,pH7.6)、NaCl(300mM)、吐温-20(0.02%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AW。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(60mM,pH8)、EDTA(0.3mM,pH7.5)、NaCl(20mM)、吐温-20(0.01%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AX。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(70mM,pH8)、EDTA(0.4mM,pH7.7)、NaCl(10mM)、吐温-20(0.05%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AY。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(80mM,pH8)、EDTA(0.4mM,pH7.5)、NaCl(100mM)、吐温-20(0.07%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-AZ。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(30mM,pH8)、EDTA(0.5mM,pH7.6)、NaCl(50mM)、吐温-20(0.04%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-BA。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(40mM,pH8)、EDTA(0.5mM,pH7.7)、NaCl(750mM)、吐温-20(0.02%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-BB。
在一些实施方案中,通用洗涤试剂可包含Tris-HCl(50mM,pH8)、EDTA(0.6mM,pH7.6)、NaCl(1M)、吐温-20(0.01%)。在一些情况下,该制剂可称为制剂UWR-BC。
洗脱试剂和使用方法
本公开内容提供了一种或多种洗脱试剂,以及采用洗脱试剂的方法。
在一些实施方案中,采用洗脱试剂的方法包括在使用第一和第二扩增试剂后,使多个多联体与洗脱试剂接触,以去除扩增聚合酶和未反应的核苷酸。洗脱试剂可以用于如下文所述的步骤(e)的大规模平行测序工作流。
在一些实施方案中,使用洗脱试剂的方法包括使多个固定化荧光标记的三元复合体与洗脱试剂接触,以去除未结合的测序聚合酶和未结合的多价分子。洗脱试剂可以用于如下所述的步骤(k)的大规模平行测序工作流。
在一些实施方案中,洗脱试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、洗涤剂和离液剂。
在一些实施方案中,洗脱试剂包含Tris(50mM,pH 8.4)、EDTA(10mM,pH 7.2)、SDS(0.1%)、吐温-20(0.5%)和KCl(300mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂WRR-A。
在一些实施方案中,洗脱试剂包含Tris(40mM,pH 8.2)、EDTA(50mM,pH 7.3)、SDS(0.5%)、吐温-20(0.5%)和LiCl(250mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂WRR-B。
在一些实施方案中,洗脱试剂包含Tris(30mM,pH 8.6)、EDTA(100mM,pH 7.4)、SDS(1%)、吐温-20(0.4%)和KCl(350mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂WRR-C。
在一些实施方案中,洗脱试剂包含Tris(20mM,pH 8.4)、EDTA(100mM,pH 7.5)、SDS(2%)、吐温-20(0.2%)和LiCl(200mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂WRR-D。
在一些实施方案中,洗脱试剂包含Tris(10mM,pH 8.2)、EDTA(50mM,pH 7.6)、SDS(0.3%)、吐温-20(0.1%)和KCl(300mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂WRR-E。
在一些实施方案中,洗脱试剂包含Tris(50mM,pH 8.6)、EDTA(20mM,pH 7.3)、SDS(1%)、Triton X-100(0.5%)和KCl(250mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂WRR-F。
在一些实施方案中,洗脱试剂包含Tris(40mM,pH 8.4)、EDTA(10mM,pH 7.4)、Triton X-100(2%)和LiCl(350mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂WRR-G。
在一些实施方案中,洗脱试剂包含Tris(30mM,pH 8.2)、EDTA(50mM,pH 7.5)、SDS(0.3%)、Triton X-100(1%)和KCl(200mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂WRR-H。
在一些实施方案中,洗脱试剂包括Tris(20mM,pH 8.4)、EDTA(20mM,pH 7.5)、SDS(0.5%)、Triton X-100(0.1%)和LiCl(300mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂WRR-I。
在一些实施方案中,洗脱试剂包含Tris(10mM,pH 8.2)、EDTA(200mM,pH 7.6)、SDS(0.3%)、Triton X-100(0.5%)和KCl(350mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂WRR-J。
捕获试剂和使用方法
本公开内容提供了一种或多种捕获试剂,以及采用捕获试剂的方法,其中该方法包括通过使多个模板分子(例如,多联体或单拷贝模板分子)与杂交至模板分子上的测序引物结合位点的多个测序引物和捕获试剂接触来形成多个三元复合体。捕获试剂包含多个第一测序聚合酶和核苷酸试剂(例如,多价分子)以及促进三元复合体形成的化合物,其中聚合酶催化的核苷酸单元掺入被抑制。模板分子和测序引物在捕获试剂的存在下形成三元复合体。捕获试剂可以用于如下所述的步骤(g)的大规模平行测序工作流。
在一些实施方案中,捕获试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂、多个多价分子和第一测序聚合酶。第一测序聚合酶可以用可检测部分(例如,荧光团)标记或可以是未标记的。在一些实施方案中,捕获试剂进一步包含至少一种黏度剂。在一些实施方案中,捕获试剂进一步包含与核酸模板分子的至少一部分杂交的多个测序引物。测序引物包含3’可延伸末端或3’不可延伸末端。在一些实施方案中,测序引物包含可溶性寡核苷酸引物(例如,在溶液中)。
在一些实施方案中,捕获试剂包含多个核苷酸试剂,该核苷酸试剂包含多个多价分子。多价分子通常包含:(1)核心,和(2)多个核苷酸臂,其包含(i)核心附接部分、(ii)包含PEG部分的间隔区、(iii)接头和(iv)核苷酸单元。参见图2A至2D。
在一些实施方案中,多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中,间隔区附接至接头,其中接头附接至核苷酸单元。在一些实施方案中,核苷酸单元包含碱基、糖和至少一个磷酸基团。在一些实施方案中,接头通过碱基附接至核苷酸单元。在一些实施方案中,接头包含具有2-6个亚基的脂族链或具有2-6个亚基的低聚乙二醇链,并且任选地,接头包括芳族部分(图2A至图2D)。在一些实施方案中,多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心,并且其中多个核苷酸臂具有相同类型的核苷酸单元,其选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。在一些实施方案中,多个多价分子包含具有两种或更多种不同类型的核苷酸单元的不同类型多价分子的混合物,该核苷酸单元选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。例如,该混合物包含多个第一种类型的多价分子,每个多价分子具有一种类型的核苷酸单元,该核苷酸单元选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。该混合物还包含多个第二种类型的多价分子,每个多价分子具有不同类型的核苷酸单元,该核苷酸单元选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP,其不同于第一多个多价分子中的第一种类型的核苷酸单元。
在一些实施方案中,多个多价分子中的至少一个是荧光标记的,其中荧光团附接至核心或附接至核苷酸单元上的至少一个碱基。在一些实施方案中,附接至多价分子的荧光团对应于核苷酸单元的碱基,以允许区分不同荧光标记的多价分子的核苷酸碱基单元。
在一些实施方案中,多价分子中的至少一个包含具有可切割部分的至少一个核苷酸臂。在一些实施方案中,多价分子包含1、2、3、4或更多个核苷酸臂,其中每个核苷酸臂包括可切割部分。核苷酸臂中的可切割部分可以用可切割剂切割,以将核苷酸臂与核心分离。
在一些实施方案中,多个多价分子中的至少一个包括抑制聚合酶催化的核苷酸单元掺入的链终止部分。链终止部分可以附接至核苷酸单元的2’或3’糖位置。通过使多价分子与切割/去除链终止部分以形成具有2’或3’可延伸基团的核苷酸单元的化合物接触,可以从核苷酸单元去除链终止部分。
在一些实施方案中,捕获试剂配制为促进稳定的三元复合体的形成,该三元复合体包含与核酸双链体结合的聚合酶(例如,第一测序聚合酶)和多价分子的互补核苷酸单元,该核酸双链体包括与测序引物杂交的核酸模板分子(例如,多联体)。在一些实施方案中,在三元复合体中,核苷酸单元在与模板链中的互补核苷酸相对的位置处与测序引物的3’端结合。在一些实施方案中,捕获试剂配制为促进三元复合体的形成而不将互补核苷酸单元掺入测序引物的3’端(例如,无聚合酶催化的核苷酸掺入)。在一些实施方案中,捕获试剂包含促进三元复合体形成而不发生核苷酸单元掺入的非催化二价阳离子。在一些实施方案中,非催化二价阳离子包含锶离子和/或钡离子。在一些实施方案中,捕获试剂缺乏促进聚合酶催化的互补核苷酸单元掺入的催化二价阳离子。示例性催化二价阳离子包括镁和/或锰。
在一些实施方案中,捕获试剂还可以包括一价盐,该一价盐可以促进三元复合体的形成。一价盐可包含例如以下中的一种或多种:钠、钾、锂、铷、铯、银或其他一价阳离子,诸如NaCl、KCl、LiCl、CsCl、AgCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾或其他这样的一价盐溶液。在一些实施方案中,一价盐包含NaCl、KCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾。在一些实施方案中,捕获试剂可以包括浓度为约25-500mM、或约50-250mM、或约100-200mM的一价盐。
在测序反应期间使用的多价分子提供了游离核苷酸所无法提供的许多优点。多价分子包含附接至多个臂的核心,每个臂拴系于核苷酸单元。多价分子增加了聚合酶/模板结合位点附近的核苷酸单元的局部浓度,这有利于三元复合体的形成。在不促进核苷酸单元掺入测序引物的条件下进行三元复合体的形成。多价分子还增加了形成和保存稳定三元复合体的持续时间。当用标记有可检测部分(例如,荧光部分)的多价分子进行测序反应时,三元复合体的较长持续时间提供了较短的成像时间,并且增加了测序反应期间的信号强度。来自三元复合体的高信号强度在整个结合和成像步骤中保持不变。聚合酶、引发的模板链和核苷酸单元之间的强结合也提供了在后续洗涤步骤期间保持完整的稳定三元复合体。当在洗涤步骤期间去除未反应的或非互补核苷酸单元时,高强度信号保留。在信号成像步骤(例如,参见下文成像试剂描述)之后,三元复合体可以去稳定,并且测序引物可以在后续掺入/延伸反应中延伸一个核苷酸碱基(例如,参见下文核苷酸掺入试剂描述)。在掺入/延伸反应之后,可以使用与多价分子结合的另一循环再次重复结合和成像步骤,以确定模板分子中下一个碱基的身份。
持续时间是指稳定的复合体(例如,三元复合体)保持完整(例如,无解离)的时间长度,其中该复合体包含与引物、聚合酶和来自多价分子的游离核苷酸或核苷酸单元杂交的核酸模板分子。持续时间表示复合体的稳定性以及核酸模板分子与引物、聚合酶和游离核苷酸或核苷酸单元之间的杂交的结合相互作用的强度。可以通过观察复合体的开始和/或持续时间,例如通过观察来自复合体的标记组分的信号来测量持续时间。例如,标记的核苷酸或标记的多价分子可存在于复合体中,从而允许在复合体的持续时间期间检测来自标记的信号。示例性标记是荧光标记。稳定的三元复合体可以表现出超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1秒,或长于1秒的持续时间。
多价分子与聚合酶/双链体复合体结合以形成三元复合体,其速率是时间依赖性的,虽然显著低于已知的溶液中游离核苷酸的缔合速率。多价分子的结合速率(Kon)显著低于游离核苷酸的结合速率。重要的是,多价分子的解离速率(Koff)显著低于游离核苷酸所观察到的解离速率。因此,与使用游离核苷酸形成的三元复合体相比,多价分子提供了三元复合体持续时间的令人惊讶和意想不到的有益改进。因此,多价分子形成不容易解离的稳定三元复合体,从而在测序工作流期间改善三元复合体的成像质量。三元复合体在暴露于解离条件之前是稳定的。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶可以结合多价分子的互补核苷酸单元和核酸双链体,以形成三元复合体。第一测序聚合酶包含重组野生型或突变型聚合酶,其包含与来自Candidatus altiarchaeales古细菌的聚合酶的主链序列具有至少80%同一性的氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:2、3、4或5中的任一者)。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含来自Candidatus altiarchaeales古细菌的重组野生型或突变型聚合酶。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含具有来自Candidatus altiarchaeales古细菌的DNA聚合酶的氨基酸序列主链的DNA聚合酶。第一测序聚合酶包含与SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中突变型DNA聚合酶在选自Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567的一个或多个位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含(i)选自Leu416Ser、Leu416Phe和Leu416Tyr的氨基酸取代;以及(ii)Tyr417Ala、Pro418Gly、Ala493Ser、Ile529His、Arg515Leu和Asn567Asp的氨基酸取代。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含SEQ IDNO:2、3、4或5中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含来自9°N的DNA聚合酶,其包含SEQ IDNO:6、7或8的氨基酸序列。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含突变型9°N聚合酶,该聚合酶具有来自9°N的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:6、7或8),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列(Vent聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Vent聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:9),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列(Deep Vent聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Deep Vent聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:10),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:10。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列(Pfu聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Pfu聚合酶,该聚合酶具有来自Pfu的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:11),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:11。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列(深海火球菌聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型深海火球菌聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:12),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:12。
在一些实施方案中,捕获试剂进一步包含至少一个核酸模板分子,其包含DNA或RNA,或RNA和DNA的混合物。在一些实施方案中,核酸模板分子包含线性或环状分子,或线性和环状分子的混合物。在一些实施方案中,模板分子包含多联体或单拷贝模板分子。在一些实施方案中,核酸模板分子包含单链分子、双链分子或具有单链和双链部分的核酸分子。在一些实施方案中,核酸模板分子是可溶性的或固定至支持物或固定至支持物上的涂层上。在一些实施方案中,核酸模板分子包含多联体,每个多联体包含感兴趣序列的串联重复序列和可操作地连接至感兴趣序列的任何衔接子序列。在一些实施方案中,核酸模板分子包含扩增的分子(例如,克隆扩增的分子)。
在一些实施方案中,核酸模板分子包含单拷贝模板分子(例如,线性分子),每个模板分子包含感兴趣序列的一个拷贝,并且任何衔接子序列可操作地连接或连接至感兴趣序列。在一些实施方案中,核酸模板分子包含扩增的分子(例如,克隆扩增的分子)。
在一些实施方案中,捕获试剂进一步包含与模板分子上的通用测序引物结合位点杂交的多个测序引物。
在一些实施方案中,单个核酸模板分子与至少一个衔接子连接,其中衔接子包括捕获引物结合序列、扩增引物结合序列和/或测序引物结合序列。在一些实施方案中,单个核酸模板分子可操作地连接至具有样品条形码序列或独特分子标签序列的至少一个衔接子。在一些实施方案中,核酸模板分子是可溶性的或固定至支持物或固定至支持物上的涂层上。
在一些实施方案中,核酸模板分子包含多联体,每个多联体包含感兴趣序列的串联重复序列和可操作地连接至感兴趣序列的任何衔接子序列。在一些实施方案中,核酸模板分子包含扩增的分子(例如,克隆扩增的分子)。
在一些实施方案中,捕获试剂进一步包含多个三元复合体,每个三元复合体包含与核酸双链体结合的第一测序聚合酶和多价分子的互补核苷酸单元,该核酸双链体包括与测序引物杂交的核酸模板分子(例如,多联体)。在一些实施方案中,多价分子用荧光团标记,其中多价分子是三元复合体的一部分。
在一些实施方案中,捕获试剂进一步包含固定至支持物上的多个三元复合体,其中三元复合体内的模板分子(例如,多联体)固定至支持物或固定至支持物上的涂层(例如,聚合物涂层)上。在一些实施方案中,支持物可以涂覆有至少一个亲水性聚合物涂层。在一些实施方案中,亲水性聚合物涂层的水接触角不超过45-50度。在一些实施方案中,多个三元复合体固定至支持物上的一层或多层涂层上,其中固定化三元复合体的密度为约100-100,000/mm2。
在一些实施方案中,多个固定化三元复合体彼此流体连通,以允许捕获试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化三元复合体可以以大规模平行的方式基本上同时与捕获试剂反应。在一些实施方案中,多个固定化三元复合体的流体连通可以用于在支持物上以大规模平行的方式进行核酸测序反应(例如,捕获反应)。
在一些实施方案中,捕获试剂包含HEPES(25mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、NaCl(25mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、吐温-20(0.02%)、Gd-HCl(0.08M)、乙二醇(10%)、dATP(0.04μM)、dGTP(0.04μM)、dCTP(0.04μM)、dUTP(0.04μM)和测序聚合酶(200nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂TR-A。
在一些实施方案中,捕获试剂包含Bicine(25mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、NaCl(50mM)、Ba-乙酸盐(10mM)、吐温-20(0.02%)、Gd-HCl(0.06M)、乙二醇(10%)、dATP(0.04μM)、dGTP(0.04μM)、dCTP(0.04μM)、dUTP(0.04μM)和测序聚合酶(100nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂TR-B。
在一些实施方案中,捕获试剂包含MOPS(25mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、KCl(25mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、吐温-20(0.02%)、Gd-HCl(0.04M)、乙二醇(10%)、dATP(0.02μM)、dGTP(0.02μM)、dCTP(0.02μM)、dUTP(0.02μM)和测序聚合酶(500nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂TR-C。
在一些实施方案中,捕获试剂包含BES(25mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、KCl(50mM)、Ba-乙酸盐(10mM)、吐温-20(0.02%)、Gd-HCl(0.02M)、乙二醇(10%)、dATP(0.02μM)、dGTP(0.02μM)、dCTP(0.02μM)、dUTP(0.02μM)和测序聚合酶(300nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂TR-D。
在一些实施方案中,捕获试剂包含TES(25mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、NaCl(25mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、吐温-20(0.02%)、Gd-HCl(0.08M)、乙二醇(10%)、dATP(0.04μM)、dGTP(0.04μM)、dCTP(0.04μM)、dUTP(0.04μM)和测序聚合酶(100nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂TR-E。
在一些实施方案中,捕获试剂包含CAPS(25mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、KCl(50mM)、Ba-乙酸盐(10mM)、Triton-X(0.02%)、脲(0.08M)、乙二醇(10%)、dATP(0.04μM)、dGTP(0.04μM)、dCTP(0.04μM)、dUTP(0.04μM)和测序聚合酶(200nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂TR-F。
在一些实施方案中,捕获试剂包含TAPS(25mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、KCl(25mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton-X(0.02%)、脲(0.08M)、乙二醇(10%)、dATP(0.04μM)、dGTP(0.04μM)、dCTP(0.04μM)、dUTP(0.04μM)和测序聚合酶(500nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂TR-G。
在一些实施方案中,捕获试剂包含ACES(25mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、NaCl(50mM)、Ba-乙酸盐(10mM)、Triton-X(0.02%)、脲(0.06M)、乙二醇(10%)、dATP(0.02μM)、dGTP(0.02μM)、dCTP(0.02μM)、dUTP(0.02μM)和测序聚合酶(400nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂TR-H。
在一些实施方案中,捕获试剂包含PIPES(25mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、KCl(25mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton-X(0.02%)、脲(0.04M)、乙二醇(10%)、dATP(0.02μM)、dGTP(0.02μM)、dCTP(0.02μM)、dUTP(0.02μM)和测序聚合酶(500nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂TR-I。
在一些实施方案中,捕获试剂包含Tris(25mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、KCl(50mM)、Ba-乙酸盐(10mM)、Triton-X(0.02%)、脲(0.02M)、乙二醇(10%)、dATP(0.04μM)、dGTP(0.04μM)、dCTP(0.04μM)、dUTP(0.04μM)和测序聚合酶(200nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂TR-J。
捕获后试剂和使用方法
本公开内容提供了一种或多种捕获后试剂,以及采用捕获后试剂的方法,其中该方法包括通过使多个三元复合体与捕获后试剂接触(例如,本文所述方法的步骤(h))来保存三元复合体而不发生聚合酶催化的核苷酸单元掺入。
在一些实施方案中,捕获后试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂和第一测序聚合酶。捕获后试剂缺乏多个多价分子。
在一些实施方案中,捕获后试剂进一步包含至少一种黏度剂。在一些实施方案中,捕获后试剂任选地包含与核酸模板分子的至少一部分杂交的多个测序引物。测序引物包含3’可延伸末端或3’不可延伸末端。在一些实施方案中,测序引物包含可溶性寡核苷酸引物(例如,在溶液中)。
在一些实施方案中,尽管捕获后试剂缺乏多个多价分子,但捕获后试剂配制为保存使用上述捕获试剂时形成的稳定三元复合体。
在一些实施方案中,捕获后试剂配制为保存三元复合体而不将互补核苷酸单元掺入测序引物的3’端(例如,不发生聚合酶催化的核苷酸单元掺入)。在一些实施方案中,捕获后试剂包含促进三元复合体形成而没有互补核苷酸单元掺入的非催化二价阳离子。在一些实施方案中,非催化二价阳离子包含锶离子和/或钡离子。在一些实施方案中,捕获后试剂缺乏促进聚合酶催化的互补核苷酸单元掺入的催化二价阳离子。示例性催化二价阳离子包括镁和/或锰。
在一些实施方案中,捕获后试剂还可以包括一价盐,该一价盐可以保存三元复合体。一价盐可包含例如钠、钾、锂、铷、铯、银或其他一价阳离子中的一种或多种,并且可作为NaCl、KCl、LiCl、CsCl、AgCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾或其他这样的一价盐溶液提供。捕获后试剂可以包括浓度为约25-500mM、或约50-250mM、或约100-200mM的一价盐。
在一些实施方案中,捕获后试剂含有第一测序聚合酶,其可以是捕获试剂中含有的相同类型或不同类型的第一测序聚合酶。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含来自Candidatus altiarchaeales古细菌的重组野生型或突变型聚合酶。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含具有来自Candidatus altiarchaeales古细菌的DNA聚合酶的氨基酸序列主链的DNA聚合酶。第一测序聚合酶包含与SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中突变型DNA聚合酶在选自Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567的一个或多个位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含(i)选自Leu416Ser、Leu416Phe和Leu416Tyr的氨基酸取代;以及(ii)Tyr417Ala、Pro418Gly、Ala493Ser、Ile529His、Arg515Leu和Asn567Asp的氨基酸取代。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含SEQ IDNO:2、3、4、5中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ IDNO:1。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:2、3、4或5中的任一者。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含来自9°N的DNA聚合酶,其包含SEQ IDNO:6、7或8的氨基酸序列。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含突变型9°N聚合酶,该聚合酶具有来自9°N的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:6、7或8),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:6、7或8中的任一者。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列(Vent聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Vent聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:9),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列(Deep Vent聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Deep Vent聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:10),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:10。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列(Pfu聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Pfu聚合酶,该聚合酶具有来自Pfu的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:11),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:11。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列(深海火球菌聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型深海火球菌聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:12),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:12。
在一些实施方案中,捕获后试剂进一步包含多个三元复合体,每个三元复合体包含与核酸双链体结合的第一测序聚合酶和多价分子的互补核苷酸单元,该核酸双链体包括与测序引物杂交的核酸模板分子(例如,多联体)。在一些实施方案中,多价分子用荧光团标记,其中多价分子是三元复合体的一部分。
在一些实施方案中,捕获后试剂进一步包含固定至支持物上的多个三元复合体,其中三元复合体内的模板分子(例如,多联体)固定至支持物或固定至支持物上的涂层(例如,聚合物涂层)上。在一些实施方案中,支持物可以涂覆有至少一个亲水性聚合物涂层。在一些实施方案中,亲水性聚合物涂层的水接触角不超过45-50度。在一些实施方案中,多个三元复合体固定至支持物上的一层或多层涂层上,其中固定化三元复合体的密度为约100-100,000/mm2。
在一些实施方案中,多个固定化三元复合体彼此流体连通,以允许捕获后试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化三元复合体可以以大规模平行的方式基本上同时与捕获后试剂反应。在一些实施方案中,多个固定化三元复合体的流体连通可以用于在支持物上以大规模平行的方式进行核酸测序反应。
在一些实施方案中,稳定的三元复合体包含与核酸双链体结合的第一测序聚合酶和多价分子的互补核苷酸单元,该核酸双链体包括与测序引物杂交的核酸模板分子(例如,多联体),其中多价分子是荧光标记的以允许检测稳定的三元复合体。通过捕获后试剂保存的稳定三元复合体足够稳定以通过使稳定的三元复合体(例如,荧光标记的)与成像试剂(参见下文所述的成像试剂)接触而成像。稳定的三元复合体在与含有离液剂的洗脱试剂(例如,参见上述洗脱试剂)接触之前不会解离。
在一些实施方案中,捕获后试剂包含TAPSO(25mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、NaCl(100mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton-X(0.01%)、蔗糖(0.2M)和测序聚合酶(100nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂PTR-A。
在一些实施方案中,捕获后试剂包含MES(25mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、NaCl(100mM)、Ba-乙酸盐(5mM)、Triton-X(0.02%)、蔗糖(0.2M)和测序聚合酶(200nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂PTR-B。
在一些实施方案中,捕获后试剂包含MOPS(25mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、KCl(100mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton-X(0.04%)、蔗糖(0.2M)和测序聚合酶(50nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂PTR-C。
在一些实施方案中,捕获后试剂包含MOPSO(25mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、NaCl(100mM)、Ba-乙酸盐(5mM)、Triton-X(0.08%)、蔗糖(0.2M)和测序聚合酶(200nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂PTR-D。
在一些实施方案中,捕获后试剂包含Tricine(25mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、KCl(100mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton-X(0.2%)、蔗糖(0.2M)和测序聚合酶(50nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂PTR-E。
在一些实施方案中,捕获后试剂包含Bicine(10mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、KCl(50mM)、Ba-乙酸盐(5mM)、吐温-20(0.01%)、蔗糖(0.1M)和测序聚合酶(100nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂PTR-F。
在一些实施方案中,捕获后试剂包含HEPES(25mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、NaCl(100mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、吐温-20(0.02%)、蔗糖(0.2M)和测序聚合酶(200nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂PTR-G。
在一些实施方案中,捕获后试剂包含TES(50mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、NaCl(200mM)、Ba-乙酸盐(5mM)、吐温-20(0.04%)、蔗糖(0.4M)和测序聚合酶(50nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂PTR-H。
在一些实施方案中,捕获后试剂包含ACES(75mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、KCl(300mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、吐温-20(0.08%)、蔗糖(0.8M)和测序聚合酶(100nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂PTR-I。
在一些实施方案中,捕获后试剂包含PIPES(100mM,pH 8)、EDTA(0.5mM,pH 7.5)、KCl(400mM)、Ba-乙酸盐(5mM)、吐温-20(0.2%)、蔗糖(2M)和测序聚合酶(200nM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂PTR-J。
成像试剂和使用方法
本公开内容提供了一种或多种成像试剂,以及采用成像试剂的方法。在一些实施方案中,可以在形成三元复合体之后,例如在捕获步骤之后和/或在步进步骤之后采用成像试剂。三元复合体的形成可以包括结合聚合酶、包含与测序引物杂交的核酸模板分子的核酸双链体和核苷酸试剂(例如,多价分子的核苷酸单元或非缀合核苷酸),以形成三元复合体。在一些实施方案中,在三元复合体中,核苷酸单元或核苷酸在与模板链中的互补核苷酸相对的位置处与测序引物的3’端结合。成像试剂可以配制为保存(例如,稳定)先前在捕获和/或步进步骤期间形成的三元复合体。
捕获和/或步进试剂可以配制为促进三元复合体的形成,但这些试剂可配制为或可不配制为减少在后续成像/检测步骤期间由三元复合体暴露于激发光照引起的三元复合体的光损伤。因此,成像试剂制剂可以不同于捕获和步进试剂。成像试剂可以配制为减少三元复合体组分中任一种的光损伤,其中损伤可在成像/检测步骤期间由三元复合体暴露于激发光照引起。成像试剂还可以配制为通过减少在不存在成像试剂的情况下原本将发生的三元复合体组分的解离来保存捕获和/或步进期间形成的三元复合体。成像试剂保存三元复合体,从而增加组装的三元复合体的持续时间。稳定的三元复合体可以表现出超过0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1秒,或长于1秒的持续时间。通过减少三元复合体的解离,成像试剂增加了成像可检测标记的三元复合体的时间段。成像试剂还可以配制为保存三元复合体,同时抑制聚合酶催化的核苷酸掺入反应。
成像试剂增加了组装的三元复合体的持续时间,并减少了模板分子的光损伤,与在不存在成像试剂的情况下在后续测序循环中检测到的信号强度相比,这有效地减少了第一测序循环中形成的三元复合体和后续测序循环中形成的三元复合体的荧光信号强度的衰减。
在一些实施方案中,成像试剂可以配制为保存(例如,稳定)在本文所述的捕获和/或捕获后试剂中任一种的存在下形成的三元复合体。例如,三元复合体包含与核酸双链体结合的聚合酶(例如,第一测序聚合酶)和多价分子的互补核苷酸单元,该核酸双链体包括与测序引物杂交的核酸模板分子(例如,多联体或单拷贝模板分子)。在一些实施方案中,在三元复合体中,核苷酸单元在与模板链中的互补核苷酸相对的位置处与测序引物的3’端结合。在一些实施方案中,多价分子用荧光团可检测地标记。在一些实施方案中,成像试剂用于对由多个三元复合体发射的信号(例如,荧光信号)进行成像。
在一些实施方案中,成像试剂可以配制为保存(例如,稳定)在本文所述的步进试剂中任一种的存在下形成的三元复合体。例如,三元复合体包含与核酸双链体结合的聚合酶(例如,第二测序聚合酶)和互补核苷酸(例如,非缀合的游离核苷酸),该核酸双链体包括与测序引物杂交的核酸模板分子(例如,多联体或单拷贝模板分子)。在一些实施方案中,在三元复合体中,核苷酸在与模板链中的互补核苷酸相对的位置处与测序引物的3’端结合。在一些实施方案中,核苷酸用荧光团可检测地标记,或者核苷酸未标记。在一些实施方案中,核苷酸包含附接至3’糖位置处的链终止部分,或者核苷酸缺乏链终止部分。在一些实施方案中,成像试剂用于对由多个三元复合体发射的信号(例如,荧光信号)进行成像。
本公开内容提供了一种或多种成像试剂,以及采用成像试剂的方法,其中该方法包括(1)使多个稳定的三元复合体(例如,多个固定化荧光标记的三元复合体)与成像试剂在适于保存三元复合体的条件下接触;以及(2)通过将多个三元复合体暴露于激发光照并检测响应于激发光照由固定化荧光标记的三元复合体发射的荧光信号来检测多个三元复合体中至少一个的存在(例如,本文所述方法的步骤(i))。在一些实施方案中,该方法进一步包括鉴定与测序引物结合的多价分子的核苷酸单元,作为荧光标记的三元复合体的一部分(例如,本文所述方法的步骤(j))。成像试剂可以用于如下所述的步骤(i)的大规模平行测序工作流。在一些实施方案中,多个三元复合体包含与测序引物结合的非缀合核苷酸,作为三元复合体的一部分。成像试剂可以用于如下所述的步骤(m)的大规模平行测序工作流。
在一些实施方案中,三元复合体可以在捕获或步进试剂的存在下形成,并且捕获或步进试剂可以从三元复合体中去除,去除的试剂可以用成像试剂取代,成像试剂配制为保存三元复合体。
在一些实施方案中,三元复合体可以在捕获或步进试剂的存在下形成,并且将捕获或步进试剂与成像试剂混合,其中成像试剂配制为保存三元复合体。
成像试剂可以配制为包括用于减少由三元复合体暴露于激发光照引起的光损伤的至少一种化合物。激发光照可以诱导活性氧物质的形成,其可以损伤三元复合体的任何组分,包括核酸模板分子、测序引物、测序聚合酶、核苷酸单元、非缀合核苷酸、附接至多价分子的荧光团和/或附接至非缀合核苷酸的荧光团。
在成像试剂中包括一种或多种减少光损伤的化合物可以减少激发三线态的形成并抵消活性氧物质的损伤效应,从而改善荧光团的光稳定性,减少光漂白和/或保持荧光强度。在成像试剂中包括一种或多种减少光损伤的化合物还可减少荧光染料与其他生物分子(例如,聚合酶、核酸模板分子和/或测序引物寡核苷酸)的非特异性结合。在一些实施方案中,成像试剂包含减少光损的化合物中的任一种或者两种或更多种的任何组合,该化合物包含抗坏血酸(或其衍生物)、抗坏血酸棕榈酸酯、D-异抗坏血酸(异抗坏血酸)、抗坏血酸钠、柠檬酸、香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、绿原酸、芥子酸、鞣花酸、没食子酸、龙胆酸、水杨酸、香草酸、丁基羟基甲苯(BTH)、丁基羟基甲苯(BHT)、多酚抗氧化剂、聚乙烯醇、丁基羟基茴香醚(BHA)和/或Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸)。在一些实施方案中,Trolox包含维生素E类似物,包括硝化和硝基烯Trolox衍生物。在一些实施方案中,Trolox包含Trolox醌或Trolox氢醌。在一些实施方案中,成像试剂包含已经历老化过程的Trolox。在一些实施方案中,成像试剂包含1,3,5,7环辛四烯(COT)和/或甲基紫精。在一些实施方案中,没食子酸包含具有1、2或3个磺酸基团的磺化形式。
在一些实施方案中,成像试剂可以配制为包括至少一种还原化合物,其可以稳定存在于成像试剂中的减少光损伤的化合物中的任一种。例如,包括抗坏血酸(例如,作为减少光损伤的化合物)的成像试剂可以进一步包括至少一种还原化合物,以减少或抑制抗坏血酸的氧化。氧化的抗坏血酸可以形成脱氢抗坏血酸,其可以将颜色从透明变为黄色。氧化的抗坏血酸可以形成晶体。抗坏血酸可以在暴露于25-65℃的高温后氧化。在一些实施方案中,含有抗坏血酸的成像试剂还可以包括至少一种还原化合物,以抑制氧化、抑制结晶和/或抑制高温氧化。示例性还原化合物包括DTT(二硫苏糖醇)、2-β巯基乙醇、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、甲酰胺、DMSO(二甲亚砜)、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、谷胱甘肽、甲硫氨酸、甜菜碱、三(3-羟丙基)膦(THPP)和N-乙酰半胱氨酸。
在一些实施方案中,成像试剂可以配制为包括稳定抗坏血酸的至少一种化合物。在一些实施方案中,包括抗坏血酸的成像试剂可以进一步包括至少一种稳定化合物,以减少或抑制抗坏血酸暴露于光时的降解。示例性稳定剂化合物包括硼酸、酒石酸、柠檬酸和Tiron(4,5-二羟基-1,3-苯二磺酸;例如,二钠盐)。成像试剂可以包括浓度为约1-20mM、或约20-40mM、或约40-60mM、或约60-100mM的稳定化合物。
在一些实施方案中,成像试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂和用于减少光损伤的至少一种化合物。在一些实施方案中,成像试剂包括两种、三种、四种或五种减少光损伤的化合物。在一些实施方案中,成像试剂进一步包含或缺乏至少一种黏度剂。在一些实施方案中,高黏度成像试剂包括一种、两种或更多种黏度剂。在一些实施方案中,低黏度成像试剂缺乏黏度剂。
在一些实施方案中,成像试剂配制为保存使用上述捕获试剂和捕获后试剂时形成的稳定三元复合体。
在一些实施方案中,成像试剂配制为保存三元复合体而不将互补核苷酸单元掺入测序引物的3’端(例如,不发生聚合酶催化的核苷酸单元掺入)。在一些实施方案中,成像试剂包含促进三元复合体形成而没有互补核苷酸单元掺入的非催化二价阳离子。在一些实施方案中,非催化二价阳离子包含锶、钡、钪、钛、钙、钒、铬、铁、钴、镍、铜、锌、镓、锗、砷、硒、铑、铕、锡和/或铽离子。在一些实施方案中,成像试剂缺乏促进聚合酶催化的互补核苷酸单元掺入的催化二价阳离子。示例性催化二价阳离子包括镁和/或锰。
在一些实施方案中,成像试剂还可以包括一价盐,该一价盐可以保存三元复合体。一价盐可包含例如钠、钾、锂、铷、铯、银或其他一价阳离子中的一种或多种,并且可作为NaCl、KCl、LiCl、CsCl、AgCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾或其他这样的一价盐溶液提供。在一些实施方案中,一价盐包含NaCl、KCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾。在一些实施方案中,成像试剂可以包括浓度为约25-500mM、或约50-250mM、或约100-200mM的一价盐。
在一些实施方案中,成像试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂和用于减少光损伤的至少一种化合物。在一些实施方案中,成像试剂进一步包含至少一种还原剂。在一些实施方案中,成像试剂进一步包含用于稳定抗坏血酸的至少一种稳定化合物。在一些实施方案中,成像试剂进一步包含用于增加成像试剂黏度的一种或多种化合物。
在一些实施方案中,成像试剂包含pH为约6.5-9、或pH为约7-8.5、或pH为约7.5-8的pH缓冲剂。在一些实施方案中,成像试剂包含pH为约7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或pH为约8的pH缓冲剂。
在一些实施方案中,成像试剂包含螯合剂,例如EDTA(乙二胺四乙酸)、EGTA(乙二醇四乙酸)、HEDTA(羟乙基乙二胺三乙酸)、DPTA(二亚乙基三胺五乙酸)或NTA(N,N-双(羧甲基)甘氨酸)。
在一些实施方案中,成像试剂包含一价阳离子,该一价阳离子包含钠,例如氯化钠、氟化钠、溴化钠、碘化钠、硫酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠或氨基钠。在一些实施方案中,成像试剂包含不促进成像试剂中晶体形成的量的钠。在一些实施方案中,成像试剂缺乏包含钠的一价阳离子。
在一些实施方案中,成像试剂包含非催化二价阳离子,例如锶、钡、钙和/或锡。在一些实施方案中,非催化二价阳离子包含氯化锶、乙酸锶、乙酸钡或氯化镍。
在一些实施方案中,成像试剂包含洗涤剂,例如非离子洗涤剂,诸如Triton X-100、吐温20、吐温80或Nonidet P-40。
在一些实施方案中,成像试剂包含还原剂,例如DTT(二硫苏糖醇)、TCEP(三(2-羧乙基)膦)或三(3-羟丙基)膦(THPP)。在一些实施方案中,成像试剂缺乏还原剂。
在一些实施方案中,成像试剂进一步包含或缺乏至少一种黏度剂。在一些实施方案中,高黏度成像试剂包括一种、两种或更多种黏度剂。在一些实施方案中,低黏度成像试剂缺乏黏度剂。在一些实施方案中,成像试剂包含至少一种黏度剂,该黏度剂包含蔗糖、乙二醇和/或甘油中的任一种或两种或更多种的任何组合。在一些实施方案中,成像试剂中蔗糖的浓度可以为约0.1-0.3M,或约0.3-0.6M,或约0.6-0.9M,或约0.9-1M,或约1-2M。在一些实施方案中,成像试剂中乙二醇的浓度可以为约1-5%,或约5-10%,或约10-20%,或约20-40%,或约40-60%,或约60-80%。在一些实施方案中,成像试剂中甘油的浓度可以为约1-2%,或约2-4%,或约4-6%,或约6-8%,或约8-10%。
在一些实施方案中,成像试剂包括两种、三种、四种或五种减少光损伤的化合物。减少光损伤的化合物可以是水溶性的,例如pH为约6.5-9,或pH为约7-8.5,或pH为约7.5-8。成像试剂至少包括减少成像试剂中晶体形成的浓度的减少光损伤的化合物。
在一些实施方案中,成像试剂包含减少光损伤的化合物,包括任何形式的抗坏血酸。抗坏血酸包括L-异构体和D-异构体以及L-和D-异构体的混合物,以及外消旋混合物。在一些实施方案中,抗坏血酸包含盐,例如L-抗坏血酸钠。在一些实施方案中,抗坏血酸包含脱氢抗坏血酸(DHA)。在一些实施方案中,包括抗坏血酸盐及其类似物和衍生物。在一些实施方案中,衍生物包括具有酯化的5-羟基和/或6-羟基的抗坏血酸盐。在一些实施方案中,衍生物包括其中5-羟基和/或6-羟基被卤素或氨基取代的抗坏血酸盐。在一些实施方案中,衍生物包括其中5-羟基和/或6-羟基缺乏羟基(例如氢原子取代羟基)的抗坏血酸盐。在一些实施方案中,抗坏血酸盐衍生物包括5-脱氧-L-抗坏血酸盐、6-溴-6-脱氧-L-抗坏血酸盐、6-氨基-6-脱氧-L-抗坏血酸盐、L-抗坏血酸6-羧酸盐、6-O-甲苯磺酰基-L-抗坏血酸盐和6-O-抗坏血酸链烷酸酯,例如6-抗坏血酸棕榈酸酯(棕榈酰抗坏血酸盐)。成像试剂中抗坏血酸盐的浓度可以为约1-10mM,或约10-20mM,或约20-30mM,或约30-40mM,或约40-50mM,或约50-60mM,或约60-70mM,或约70-80mM,或约80-90mM,或约90-100mM。
在一些实施方案中,成像试剂包含减少光损伤的化合物,包括Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸)或其他维生素E类似物,包括硝化和硝基烯Trolox衍生物。在一些实施方案中,Trolox包含Trolox醌或Trolox氢醌。在一些实施方案中,Trolox已经历老化过程。成像试剂中Trolox或Trolox衍生物的浓度可以为约0.1-1mM,或约1-2mM,或约2-3mM,或约3-4mM,或约4-5mM,或约5-10mM,或约10-15mM。
在一些实施方案中,成像试剂包含具有或不具有抗坏血酸盐的Trolox化合物。在一些实施方案中,成像试剂包含减少光损伤的化合物的组合,包括抗坏血酸盐(例如,抗坏血酸钠)和Trolox化合物(例如,Trolox或Trolox醌或Trolox氢醌或老化的Trolox)。在一些实施方案中,Trolox可以暴露于UV光数分钟或数小时,以产生老化的Trolox,其被羟基化且可以表现出增加的水溶性。例如,Trolox可以暴露于UV光15-30分钟,或30-45分钟,或45-60分钟。Trolox可以暴露于UV光1-4小时,或4-8小时,或8-12小时,或12-16小时,或16-20小时,或至多60小时。与不包括这些Trolox化合物的测序工作流相比,使用包括Trolox(非老化)、Trolox醌、Trolox氢醌或老化的Trolox的成像试剂进行测序工作流可以降低测序定相和预定相速率。定相和/或预定相速率可以降低约1-3%,或约3-6%,或约6-9%,或超过9%。
在一些实施方案中,成像试剂包含抗坏血酸盐(例如,抗坏血酸钠)和Trolox(或Trolox醌或Trolox氢醌或老化的Trolox),以及乙二醇。
图17-图18和图35-图42示出了各种成像试剂对荧光染料的信号强度随时间的影响的数据。不同的制剂不含有减少光损伤的化合物或含有减少光损伤的化合物的不同组合。
在一些实施方案中,成像试剂进一步包含多个三元复合体,每个三元复合体包含与核酸双链体结合的第一测序聚合酶和多价分子的互补核苷酸单元,该核酸双链体包括与测序引物杂交的核酸模板分子(例如,多联体)。在一些实施方案中,多价分子用荧光团标记,其中多价分子是三元复合体的一部分。在三元复合体中,多价分子的核苷酸单元在与模板链中的互补核苷酸相对的位置处与测序引物的3’端结合。
在一些实施方案中,成像试剂进一步包含多个三元复合体,每个三元复合体包含与核酸双链体结合的测序聚合酶(例如,第二测序聚合酶)和核苷酸试剂(例如,互补非缀合核苷酸),该核酸双链体包括与测序引物杂交的核酸模板分子。在一些实施方案中,非缀合核苷酸是未标记或用荧光团标记的。在一些实施方案中,在三元复合体中,非缀合核苷酸在与模板链中的互补核苷酸相对的位置处与测序引物的3’端结合。
成像试剂配制为包括用于减少由三元复合体暴露于激发光照引起的光损伤的至少一种化合物。激发光照可以诱导活性氧物质的形成,其可以损伤三元复合体的任何组分,包括核酸模板分子、测序引物、测序聚合酶和/或附接至多价分子的荧光团。
在成像试剂中包括一种或多种减少光损伤的化合物可以减少激发三线态的形成并抵消活性氧物质的损伤效应,从而提高荧光团的光稳定性,减少光漂白和/或保持荧光强度(参见图17和18)。在成像试剂中包括一种或多种减少光损伤的化合物还可减少荧光染料与其他生物分子(例如,聚合酶、核酸模板分子和/或测序引物寡核苷酸)的非特异性结合。
在一些实施方案中,成像试剂进一步包含固定至支持物上的多个三元复合体,其中三元复合体内的模板分子(例如,多联体或单拷贝模板分子)固定至支持物或固定至支持物上的涂层(例如,聚合物涂层)上。在一些实施方案中,支持物可以涂覆有至少一个亲水性聚合物涂层。在一些实施方案中,亲水性聚合物涂层的水接触角为约45-50度。在一些实施方案中,多个三元复合体固定至支持物上的一层或多层涂层上,其中固定化三元复合体的密度为约100-100,000/mm2。在一些实施方案中,多个固定化三元复合体彼此流体连通,以允许成像试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化三元复合体可以以大规模平行的方式基本上同时与成像试剂反应。在一些实施方案中,多个固定化三元复合体的流体连通可以用于在支持物上以大规模平行的方式进行成像反应。
在成像试剂中包括一种或多种减少光损伤的化合物还可以在一个或多个后续核酸测序循环(例如,重复测序循环)中的成像步骤期间减轻/减少来自荧光标记的多价分子的残留信号,或者可以在一个或多个后续核酸测序循环(例如,重复测序循环)中的成像步骤期间减轻/减少来自荧光标记的非缀合核苷酸的残留信号。例如,在第一循环中,成像步骤包括在成像试剂的存在下检测由固定化荧光标记的三元复合体发射的荧光信号。在后续步骤中,使用洗脱试剂洗涤荧光标记的三元复合体以去除荧光标记的多价分子和测序聚合酶,该洗脱试剂解离三元复合体以生成与测序引物杂交的模板(例如,多联体)的核酸双链体。在另一后续步骤中,在适于将互补核苷酸掺入测序引物的条件下,将多个游离核苷酸和第二测序聚合酶与核酸双链体结合,从而使聚合酶前进至下一个碱基位置。在第二循环中,测序工作流可以通过使用捕获前、捕获和捕获后试剂将测序聚合酶和荧光标记的多价分子结合至核酸双链体上而重复。接下来是另一个成像步骤,其中来自第一循环中剩余的残留荧光标记的多价分子的荧光信号可以增加第二循环中的背景信号,并干扰当前成像循环中的精确信号检测(参见图19-21)。因此,本文所述的成像试剂可以在后续核酸测序循环中的成像步骤期间减轻来自荧光标记的多价分子的残留信号。
本发明提供了用于在核酸测序反应的检测步骤期间抑制三元复合体的光损伤的方法,其包括以下步骤:(a)提供三元复合体,该三元复合体包含聚合酶、具有与引物杂交的核酸模板分子的核酸双链体和与引物杂交的模板分子的下一个碱基互补的核苷酸试剂,其中(i)互补核苷酸试剂和/或聚合酶用荧光染料标记,并且(ii)三元复合体是稳定的三元复合体,其在不发生核苷酸试剂的掺入的情况下维持长于1秒的持续时间;(b)在包含抗坏血酸或其盐的成像试剂的存在下用光照射三元复合体;以及(c)确定三元复合体中互补核苷酸试剂的身份。
在一些实施方案中,在用于抑制三元复合体的光损伤的方法中,荧光标记的核苷酸试剂包含多价分子,该多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心,其中每个核苷酸臂包含(i)核心附接部分、(ii)间隔区、(iii)接头和(iv)核苷酸单元。
在一些实施方案中,在用于抑制三元复合体的光损伤的方法中,荧光标记的核苷酸试剂包含具有3-10个磷酸基团的核苷酸多磷酸酯。
在一些实施方案中,在用于抑制三元复合体的光损伤的方法中,荧光标记的核苷酸试剂包含具有可去除的链终止部分的核苷酸三磷酸酯。
在一些实施方案中,在用于抑制三元复合体的光损伤的方法中,(i)核苷酸试剂是荧光标记的并且聚合酶缺乏荧光标记,(ii)核苷酸试剂缺乏荧光标记并且聚合酶是荧光标记的,或(iii)核苷酸试剂是荧光标记的并且聚合酶是荧光标记的。
在一些实施方案中,在用于抑制三元复合体的光损伤的方法中,三元复合体固定至支持物上。在一些实施方案中,支持物涂覆有水接触角小于50度的亲水性涂层。
在一些实施方案中,用于抑制三元复合体的光损伤的方法进一步包括提供多个三元复合体,每个复合体包含聚合酶、具有与引物杂交的核酸模板分子的核酸双链体和与引物杂交的模板分子的下一个碱基互补的核苷酸试剂,其中多个三元复合体固定至支持物上。在一些实施方案中,多个三元复合体在支持物上的预定位置处固定至支持物上。在一些实施方案中,多个三元复合体在支持物上的随机位置处固定至支持物上。
在一些实施方案中,在用于抑制三元复合体的光损伤的方法中,核酸双链体包含与多个引物杂交的核酸多联体模板分子。
在一些实施方案中,在用于抑制三元复合体的光损伤的方法中,核酸双链体进一步包含核酸双链体簇,该簇中的每个双链体包含具有插入序列的一个拷贝和至少一个通用衔接子序列的单拷贝模板分子,其中单拷贝模板分子各自与引物杂交。
在一些实施方案中,在用于抑制三元复合体的光损伤的方法中,核酸双链体进一步包含固定至珠上的多个克隆扩增的核酸模板分子,并且其中每个模板分子与引物杂交。
在一些实施方案中,在用于抑制三元复合体的光损伤的方法中,成像试剂包含浓度为至少10mM的抗坏血酸或其盐。在一些实施方案中,成像试剂包含浓度为至少20mM的抗坏血酸或其盐。在一些实施方案中,成像试剂包含浓度至多100mM的抗坏血酸或其盐。
在一些实施方案中,在用于抑制三元复合体的光损伤的方法中,抗坏血酸包含抗坏血酸钠。
在一些实施方案中,在用于抑制三元复合体的光损伤的方法中,成像试剂包含抗坏血酸或其盐,并且进一步包含Trolox和/或Trolox醌。在一些实施方案中,成像试剂进一步包含乙二醇。
在一些实施方案中,在用于抑制三元复合体的光损伤的方法中,成像试剂包含抑制互补核苷酸试剂掺入的非催化二价阳离子,其中非催化二价阳离子包含锶、钡、钪、钛、钙、钒、铬、铁、钴、镍、铜、锌、镓、锗、砷、硒、铑、铕、锡或铽离子。
在一些实施方案中,成像试剂用于对由多个三元复合体发射的信号(例如,荧光信号)进行成像,每个三元复合体包含与核酸双链体结合的第一测序聚合酶和多价分子的互补核苷酸单元,该核酸双链体包括与测序引物杂交的核酸模板分子(例如,多联体)。在一些实施方案中,多价分子用荧光团标记,其中多价分子是三元复合体的一部分。在三元复合体中,多价分子的核苷酸单元在与模板链中的互补核苷酸相对的位置处与测序引物的3’端结合。
在一些实施方案中,多价分子通常包含:(1)核心,和(2)多个核苷酸臂,其包含(i)核心附接部分、(ii)包含PEG部分的间隔区、(iii)接头和(iv)核苷酸单元。参见图2A和B。
在一些实施方案中,多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中,间隔区附接至接头,其中接头附接至核苷酸单元。在一些实施方案中,核苷酸单元包含碱基、糖和至少一个磷酸基团。在一些实施方案中,接头通过碱基附接至核苷酸单元。在一些实施方案中,接头包含具有2-6个亚基的脂族链或具有2-6个亚基的低聚乙二醇链,并且任选地,接头包括芳族部分(图2A和2B)。在一些实施方案中,多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心,并且其中多个核苷酸臂具有相同类型的核苷酸单元,该核苷酸单元选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。在一些实施方案中,多个多价分子包含具有两种或更多种不同类型的核苷酸单元的不同类型多价分子的混合物,该核苷酸单元选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。例如,该混合物包含多个第一种类型的多价分子,每个分子具有一种类型的核苷酸单元,该核苷酸单元选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。该混合物还包含多个第二种类型的多价分子,每个分子具有不同类型的核苷酸单元,该核苷酸单元选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP,其不同于第一多个多价分子中的第一种类型的核苷酸单元。
在一些实施方案中,多个多价分子中的至少一个是荧光标记的,其中荧光团附接至核心或附接至核苷酸单元上的至少一个碱基。在一些实施方案中,附接至多价分子的荧光团对应于核苷酸单元的碱基,以允许区分不同荧光标记的多价分子的核苷酸碱基单元。
在一些实施方案中,至少一个多价分子包含具有可切割部分的至少一个核苷酸臂。在一些实施方案中,多价分子包含1、2、3、4或更多个核苷酸臂,其中每个核苷酸臂包括可切割部分。核苷酸臂中的可切割部分可以用可切割剂切割,以将核苷酸臂与核心分离。
在一些实施方案中,多个多价分子中的至少一个包括抑制聚合酶催化的核苷酸单元掺入的链终止部分。链终止部分可以附接至核苷酸单元的2’或3’糖位置。通过使多价分子与切割/去除链终止部分以形成具有2’或3’可延伸基团的核苷酸单元的化合物接触,可以从核苷酸单元去除链终止部分。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含来自Candidatus altiarchaeales古细菌的重组野生型或突变型聚合酶。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含具有来自Candidatus altiarchaeales古细菌的DNA聚合酶的氨基酸序列主链的DNA聚合酶。第一测序聚合酶包含与SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中突变型DNA聚合酶在选自Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567的一个或多个位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含(i)选自Leu416Ser、Leu416Phe和Leu416Tyr的氨基酸取代;以及(ii)Tyr417Ala、Pro418Gly、Ala493Ser、Ile529His、Arg515Leu和Asn567Asp的氨基酸取代。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含SEQ IDNO:2、3、4或5中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ IDNO:1。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:2、3、4或5中的任一者。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含来自9°N的DNA聚合酶,其包含SEQ IDNO:6、7或8的氨基酸序列。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含突变型9°N聚合酶,该聚合酶具有来自9°N的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:6、7或8),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:6、7或8中的任一者。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列(Vent聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Vent聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:9),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列(Deep Vent聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Deep Vent聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:10),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:10。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列(Pfu聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Pfu聚合酶,该聚合酶具有来自Pfu的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:11),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:11。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列(深海火球菌聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型深海火球菌聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:12),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:12。
在一些实施方案中,核酸模板分子包含多联体,每个多联体包含感兴趣序列的串联重复序列和可操作地连接至感兴趣序列的一个或多个衔接子序列。在一些实施方案中,感兴趣序列可操作地连接至衔接子序列中的任一个或两个或更多个的任何组合,该衔接子序列包括表面捕获引物结合序列、扩增引物结合序列、测序引物结合序列、样品条形码序列、独特的分子标签序列。在一些实施方案中,核酸模板分子包含扩增的分子(例如,克隆扩增的分子)。
在一些实施方案中,成像试剂进一步包含多个三元复合体,每个三元复合体包含与核酸双链体结合的第一测序聚合酶和多价分子的互补核苷酸单元,该核酸双链体包括与测序引物杂交的核酸模板分子(例如,多联体)。在一些实施方案中,多价分子用荧光团标记,其中多价分子是三元复合体的一部分。
在一些实施方案中,成像试剂进一步包含固定至支持物上的多个三元复合体,其中三元复合体内的模板分子(例如,多联体)固定至支持物或固定至支持物上的涂层(例如,聚合物涂层)上。在一些实施方案中,支持物可以涂覆有至少一个亲水性聚合物涂层。在一些实施方案中,亲水性聚合物涂层的水接触角不超过45-50度。在一些实施方案中,多个三元复合体固定至支持物上的一层或多层涂层上,其中固定化三元复合体的密度为约100-100,000/mm2。
在一些实施方案中,多个固定化三元复合体彼此流体连通,以允许成像试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化三元复合体可以以大规模平行的方式基本上同时与成像试剂反应。在一些实施方案中,多个固定化三元复合体的流体连通可以用于在支持物上以大规模平行的方式进行成像反应。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 8.8)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(100mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、蔗糖(1M)、甘油(5%)、Trolox(2mM)和抗坏血酸(50mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-A。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 8.8)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(100mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、蔗糖(1M)、甘油(5%)、Trolox(2mM)、抗坏血酸(50mM)和甲基紫精(2mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-B。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 8.8)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(100mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、蔗糖(1M)、甘油(5%)、Trolox(2mM)、抗坏血酸(50mM)和1,3,5,7环辛四烯(2mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-C。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 8.0)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(100mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、蔗糖(1M)、甘油(5%)、Trolox(2mM)和抗坏血酸(50mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-D。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 8.0)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(100mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、甘油(5%)、Trolox(8mM)和抗坏血酸(25mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-E。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 8.0)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(100mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、甘油(5%)、Trolox(5mM)和抗坏血酸(25mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-F。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 8.0)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(100mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、甘油(5%)、Trolox(2mM)和抗坏血酸(25mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-G。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 8.0)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(100mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、Trolox(8mM)和抗坏血酸(25mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-H。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 8.0)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(100mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、Trolox(5mM)和抗坏血酸(25mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-I。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 8.0)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(100mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、Trolox(2mM)和抗坏血酸(25mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-J。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 8.0)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(75mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、蔗糖(0.5M)、甘油(5%)、老化的Trolox(2mM)和抗坏血酸(25mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-K。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 8.0)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(75mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、甘油(5%)、老化的Trolox(2mM)和抗坏血酸(25mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-L。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 8.0)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(75mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、蔗糖(0.5M)、甘油(5%)、Trolox醌(2mM)和抗坏血酸(25mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂M。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 8.0)、EDTA(0.5mM;pH7.5),NaCl(75mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、甘油(5%)、Trolox醌(2mM)和抗坏血酸(25mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-N。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(20mM;pH 7.2-7.5)、EDTA(0.5mM;pH 7.5)、NaCl(75mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、吐温-20(0.02%)、乙二醇(30%)、甘油(5%)、Trolox(2mM)和抗坏血酸(50mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-O。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(20mM;pH 7.2)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(75mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、吐温-20(0.02%)、乙二醇(30%)、甘油(5%)、Trolox(2mM)和抗坏血酸(50mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-P。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 8.0)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(75mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、乙二醇(30%)、甘油(5%)、Trolox(2mM)和抗坏血酸(25mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-Q。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 8.0)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(75mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、乙二醇(30%)、甘油(5%)、老化的Trolox(2mM)和抗坏血酸(25mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-R。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 8.0)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(75mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、乙二醇(30%)、甘油(5%)、Trolox醌(2mM)和抗坏血酸(25mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-S。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 7.2-7.5)、EDTA(0.5mM;pH 7.5)、NaCl(75mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、乙二醇(30%)、甘油(5%)、Trolox(2mM)和抗坏血酸(25mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-T。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 7.2-7.5)、EDTA(0.5mM;pH 7.5)、NaCl(75mM)、Sr-乙酸酯(5mM)、Triton X-100(0.1%)、乙二醇(30%)、甘油(5%)、老化的Trolox(2mM)和抗坏血酸(25mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-U。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(10mM;pH 7.2-7.5)、EDTA(0.5mM;pH 7.5)、NaCl(75mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、Triton X-100(0.1%)、乙二醇(30%)、甘油(5%)、Trolox醌(2mM)和抗坏血酸(25mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-V。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(20mM;pH 7.2)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(25mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、吐温-20(0.02%)、乙二醇(30%)、甘油(5%)、Trolox(2mM,新鲜的Trolox)和抗坏血酸(50mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-W。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(20mM;pH 7.2)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、NaCl(25mM)、Sr-乙酸盐(5mM)、吐温-20(0.02%)、TCEP(0.5mM)、乙二醇(30%)、甘油(5%)、Trolox(2mM,新鲜的Trolox)和抗坏血酸(50mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-X。
在一些实施方案中,成像试剂可包含Tris-HCl(20mM;pH 7.2)、EDTA(0.5mM;pH7.5)、Sr-乙酸盐(5mM)、吐温-20(0.02%)、TCEP(0.5mM)、乙二醇(30%)、甘油(5%)、Trolox(2mM,新鲜的Trolox)和抗坏血酸(50mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂IR-Y。
步进试剂和使用方法
本发明提供了一种或多种步进试剂,以及采用步进试剂的方法,其中该方法包括使多个固定化核酸双链体与步进试剂在适于促进聚合酶催化的核苷酸掺入的条件下接触(例如,本文所述方法的步骤(m))。步进试剂可以用于如下所述的步骤(m)的大规模平行测序工作流。
在一些实施方案中,步进试剂包含:至少一种溶剂、至少一种pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、催化二价阳离子、洗涤剂、第二测序聚合酶和多个核苷酸(例如,游离核苷酸)。在一些实施方案中,第二测序聚合酶可以用可检测部分(例如,荧光团)标记或可以是未标记的。在一些实施方案中,催化二价阳离子包含镁和/或锰。在一些实施方案中,步进试剂缺乏非催化二价阳离子。示例性非催化二价阳离子包括锶和/或钡。在一些实施方案中,一价盐可以促进三元复合体的形成。一价盐可包含例如钠、钾、锂、铷、铯、银或其他一价阳离子中的一种或多种,并且可作为NaCl、KCl、LiCl、CsCl、AgCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾或其他这样的一价盐溶液提供。在一些实施方案中,一价盐包含NaCl、KCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾。在一些实施方案中,催化二价阳离子包含镁和/或锰。在一些实施方案中,步进试剂缺乏非催化二价阳离子。示例性非催化二价阳离子包括锶和/或钡。在一些实施方案中,一价盐可以促进三元复合体的形成。在一些实施方案中,一价盐包含NaCl、KCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾。
在一些实施方案中,步进试剂进一步包含至少一种黏度剂。
在一些实施方案中,步进试剂可以任选地包括与核酸模板分子的至少一部分杂交的多个测序引物。多个测序引物包含3’可延伸末端或3’不可延伸末端。在一些实施方案中,多个测序引物包含可溶性寡核苷酸引物(例如,在溶液中)。
在一些实施方案中,多个核苷酸中的单个核苷酸包含芳族碱基、五碳糖(例如,核糖或脱氧核糖)和至少一个磷酸基团。在一些实施方案中,核苷酸包含具有1-10个磷酸基团的多磷酸酯链。
在一些实施方案中,多个核苷酸包含选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP的至少一种类型的核苷酸。在一些实施方案中,多个核苷酸包含选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP的核苷酸的任何组合中的两种或更多种的混合物。
在一些实施方案中,多个核苷酸中的至少一个是荧光标记的。荧光团可以附接至核苷酸的碱基。在一些实施方案中,荧光团对应于核苷酸的碱基,以允许区分不同荧光标记的核苷酸的核苷酸碱基。在一些实施方案中,标记的核苷酸包含荧光团,该荧光团经由可切割接头附接至核苷酸的碱基,可切割接头可用切割/去除可切割接头的化合物切割,从而从核苷酸上去除荧光团标记。
在一些实施方案中,多个核苷酸中的至少一个核苷酸包括链终止部分,该链终止部分抑制后续聚合酶催化核苷酸掺入反应中的核苷酸掺入。链终止部分可以附接至核苷酸的2’或3’糖位置。通过使链终止核苷酸与切割/去除链终止部分的化合物接触,可以从核苷酸上去除链终止部分,以形成具有2’或3’可延伸基团的核苷酸。例如,通过使链终止核苷酸与切割/去除链终止部分的化合物接触,可以将包含附接至其3’糖位置的链终止部分的链终止核苷酸转化为具有可延伸的3’OH糖基团的核苷酸。
在一些实施方案中,步进试剂配制为促进稳定的三元复合体的形成,该三元复合体包含与核酸双链体结合的聚合酶(例如,第二测序聚合酶)和互补核苷酸,该核酸双链体包含与测序引物杂交的核酸模板分子(例如,多联体)。在一些实施方案中,在三元复合体中,核苷酸在与模板链中的互补核苷酸相对的位置处与测序引物的3’端结合。在一些实施方案中,步进试剂配制为促进互补核苷酸单元掺入测序引物的3’端(例如,聚合酶催化的核苷酸掺入)以生成多个核酸双链体,每个核酸双链体具有与新生链(例如,延伸的测序引物)杂交的模板分子(例如,多联体),其中新生链延伸一个核苷酸。在一些实施方案中,催化二价阳离子包含镁和/或锰。
在一些实施方案中,步进试剂还可以包括一价盐,该一价盐可以促进三元复合体的形成。一价盐可包含例如钠、钾、锂、铷、铯、银或本领域已知的其他一价阳离子中的一种或多种,并且可作为NaCl、KCl、LiCl、CsCl、AgCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾或本领域已知的其他这样的一价盐溶液提供。在一些实施方案中,一价盐包含NaCl、KCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾。步进试剂可以包括浓度为约5-200mM或约25-100mM的一价盐。
在一些实施方案中,第二测序聚合酶可以结合互补核苷酸和核酸双链体,以形成三元复合体。第二测序聚合酶包含重组野生型或突变型聚合酶,其包含与来自Candidatusaltiarchaeales古细菌(例如,SEQ ID NO:221-225中的任一者)、或来自9°N(例如,SEQ IDNO:226或227)、或来自Therminator(例如,SEQ ID NO:228)、或来自Vent(例如,SEQ ID NO:229)、或来自Deep Vent(例如,SEQ ID NO:230)、或来自Pfu(例如,SEQ ID NO:231)、或来自深海火球菌(例如,SEQ ID NO:232)、或来自RB69(SEQ ID NO:233)的聚合酶的主链序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。图16A和16B列出了各种聚合酶的示例性位置等同突变。
在一些实施方案中,步进试剂进一步包含至少一个核酸模板分子,其包含DNA或RNA,或RNA和DNA的混合物。在一些实施方案中,核酸模板分子包含多联体或单拷贝模板分子,或多联体和单拷贝模板分子的混合物。在一些实施方案中,核酸模板分子包含单链分子、双链分子或具有单链和双链部分的核酸分子。在一些实施方案中,单个核酸模板分子包括至少一个衔接子,其中衔接子包括捕获引物结合序列、扩增引物结合序列和/或测序引物结合序列。在一些实施方案中,单个核酸模板分子可操作地连接至具有样品条形码序列或独特分子标签序列的至少一个衔接子。在一些实施方案中,核酸模板分子是可溶性的或固定至支持物或固定至支持物上的涂层上。
在一些实施方案中,核酸模板分子包含多联体,每个多联体包含感兴趣序列的串联重复序列和可操作地连接至感兴趣序列的任何衔接子序列。在一些实施方案中,核酸模板分子包含扩增的分子(例如,克隆扩增的分子)。
在一些实施方案中,第二测序聚合酶包含来自Candidatus altiarchaeales古细菌的重组野生型或突变型聚合酶。在一些实施方案中,第二测序聚合酶包含具有来自Candidatus altiarchaeales古细菌的DNA聚合酶的氨基酸序列主链的DNA聚合酶。第二测序聚合酶包含与SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中突变型DNA聚合酶在选自Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567的一个或多个位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中,第二测序聚合酶包含(i)选自Leu416Ser、Leu416Phe和Leu416Tyr的氨基酸取代;以及(ii)Tyr417Ala、Pro418Gly、Ala493Ser、Ile529His、Arg515Leu和Asn567Asp的氨基酸取代。在一些实施方案中,第二测序聚合酶包含SEQ IDNO:2、3、4或5中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ IDNO:1。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:2、3、4或5中的任一者。
在一些实施方案中,第二测序聚合酶包含来自9°N的DNA聚合酶,其包含SEQ IDNO:6、7或8的氨基酸序列。在一些实施方案中,第二测序聚合酶包含突变型9°N聚合酶,该聚合酶具有来自9°N的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:6、7或8),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:6、7或8中的任一者。
在一些实施方案中,第二测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列(Vent聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Vent聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:9),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中,第二测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列(Deep Vent聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Deep Vent聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:10),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:10。
在一些实施方案中,第二测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列(Pfu聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Pfu聚合酶,该聚合酶具有来自Pfu的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:11),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:11。
在一些实施方案中,第二测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列(深海火球菌聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型深海火球菌聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:12),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:12。
在一些实施方案中,步进试剂进一步包含多个三元复合体,每个三元复合体包含与核酸双链体结合的第二测序聚合酶和互补核苷酸,该核酸双链体包含与测序引物杂交的核酸模板分子(例如,多联体)。在一些实施方案中,核苷酸用荧光团标记,其中核苷酸是三元复合体的一部分。在三元复合体中,核苷酸在与模板链中的互补核苷酸相对的位置处与测序引物的3’端结合。
在一些实施方案中,步进试剂进一步包含固定至支持物上的多个三元复合体,其中三元复合体内的模板分子(例如,多联体)固定至支持物或固定至支持物上的涂层(例如,聚合物涂层)上。在一些实施方案中,支持物可以涂覆有至少一个亲水性聚合物涂层。在一些实施方案中,亲水性聚合物涂层的水接触角不超过45-50度。在一些实施方案中,多个三元复合体固定至支持物上的一层或多层涂层上,其中固定化三元复合体的密度为约100-100,000/mm2。
在一些实施方案中,多个固定化三元复合体彼此流体连通,以允许步进试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化三元复合体可以以大规模平行的方式基本上同时与步进试剂反应。在一些实施方案中,多个固定化三元复合体的流体连通可以用于在支持物上以大规模平行的方式进行步进反应。
在一些实施方案中,步进试剂包含Bis-Tris丙烷(25mM,pH 8.8)、KCl(40mM)、NH4SO4(10mM)、MgSO4(10mM)、吐温-20(0.2%)、甜菜碱(250mM)、蔗糖(200mM)、N3-dATP(2μM)、N3-dGTP(2μM)、N3-dCTP(2μM)、N3-dTTP(2μM)、DMSO(0.5%)和测序聚合酶(0.24μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SR-A。
在一些实施方案中,步进试剂包含HEPES(25mM,pH 8.6)、KCl(40mM)、NH4SO4(10mM)、MgSO4(20mM)、Triton-X(0.5%)、谷胱甘肽(250mM)、蔗糖(200mM)、N3-dATP(2μM)、N3-dGTP(2μM)、N3-dCTP(2μM)、N3-dTTP(2μM)、DMSO(0.5%)和测序聚合酶(0.37μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SR-B。
在一些实施方案中,步进试剂包含MES(25mM,pH 8.4)、KCl(40mM)、NH4SO4(40mM)、MgSO4(30mM)、吐温-20(1%)、三(2-羧乙基)膦(250mM)、蔗糖(200mM)、N3-dATP(2μM)、N3-dGTP(2μM)、N3-dCTP(2μM)、N3-dTTP(2μM)、DMSO(0.5%)和测序聚合酶(0.48μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SR-C。
在一些实施方案中,步进试剂包含MOPS(25mM,pH 8.2)、KCl(40mM)、NH4SO4(10mM)、MgSO4(10mM)、Triton-X(1%)、TCEP(250mM)、蔗糖(200mM)、N3-dATP(2μM)、N3-dGTP(2μM)、N3-dCTP(2μM)、N3-dTTP(2μM)、DMSO(0.5%)和测序聚合酶(0.2μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SR-D。
在一些实施方案中,步进试剂包含MOPSO(25mM,pH 8.0)、KCl(40mM)、NH4SO4(40mM)、MgSO4(20mM)、Triton-X(1%)、连二亚硫酸钠(250mM)、蔗糖(200mM)、N3-dATP(2μM)、N3-dGTP(2μM)、N3-dCTP(2μM)、N3-dTTP(2μM)、DMSO(0.5%)和测序聚合酶(1.20μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SR-E。
在一些实施方案中,步进试剂包含Bis-Tris丙烷(25mM,pH 8.8)、NaCl(40mM)、NH4SO4(10mM)、MgSO4(10mM)、吐温-20(0.2%)、2-β巯基乙醇(50mM)、蔗糖(200mM)、N3-dATP(2μM)、N3-dGTP(2μM)、N3-dCTP(2μM)、N3-dTTP(2μM)、DMSO(2%)和测序聚合酶(0.88μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SR-F。
在一些实施方案中,步进试剂包含BES(25mM,pH 8.6)、NaCl(40mM)、NH4SO4(40mM)、MgSO4(20mM)、Triton-X(0.5%)、DTT(50mM)、蔗糖(200mM)、N3-dATP(2μM)、N3-dGTP(2μM)、N3-dCTP(2μM)、N3-dTTP(2μM)、DMSO(2%)和测序聚合酶(0.44μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SR-G。
在一些实施方案中,步进试剂包含TES(25mM,pH 8.4)、NaCl(40mM)、NH4SO4(10mM)、MgSO4(30mM)、吐温-20(1%)、甲酰胺(50mM)、蔗糖(200mM)、N3-dATP(2μM)、N3-dGTP(2μM)、N3-dCTP(2μM)、N3-dTTP(2μM)和测序聚合酶(0.42μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SR-H。
在一些实施方案中,步进试剂包含Bis-Tris丙烷(25mM,pH 8.2)、NaCl(40mM)、NH4SO4(40mM)、MgSO4(10mM)、Triton-X(1%)、谷胱甘肽(50mM)、蔗糖(200mM)、N3-dATP(2μM)、N3-dGTP(2μM)、N3-dCTP(2μM)、N3-dTTP(2μM)和测序聚合酶(0.52μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SR-I。
在一些实施方案中,步进试剂包含CAPS(25mM,pH 8.0)、NaCl(40mM)、NH4SO4(10mM)、MgSO4(20mM)、Triton-X(1%)、甜菜碱(50mM)、蔗糖(200mM)、N3-dATP(2μM)、N3-dGTP(2μM)、N3-dCTP(2μM)、N3-dTTP(2μM)、DMSO(2%)和测序聚合酶(0.88μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SR-J。
切割试剂和使用方法
本公开内容提供了一种或多种切割试剂,以及采用切割试剂的方法,其中该方法包括从新生链(例如,延伸的测序引物)的末端核苷酸上切割链终止部分,从而生成具有3’可延伸末端的延伸的测序引物(例如,本文所述方法的步骤(p))。
在一些实施方案中,切割试剂包含:至少一种溶剂、pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、洗涤剂、切割剂和切割催化剂。
切割试剂配制为保留多个核酸双链体,每个核酸双链体具有与新生链(例如,延伸的测序引物)杂交的模板分子(例如,多联体)。
在一些实施方案中,当切割试剂包括在2’或3’糖位置处具有链终止部分的至少一个核苷酸时,则切割试剂配制为包括从新生链(例如,延伸的测序引物)的末端核苷酸上切割链终止部分以生成具有3’可延伸末端的延伸的测序引物的切割剂。
在一些实施方案中,当步进试剂包括具有经由可切割接头附接至其碱基的荧光团的至少一个核苷酸时,则切割试剂配制为包括切割可切割接头以生成缺乏荧光团的核苷酸的切割剂。
在一些实施方案中,切割试剂进一步包含多个核酸双链体,每个核酸双链体具有与新生链(例如,延伸的测序引物)杂交的模板分子(例如,多联体),其中新生链延伸一个核苷酸。在一些实施方案中,一个核苷酸是新生链上的末端核苷酸,并且该核苷酸包含链终止部分。在一些实施方案中,一个核苷酸是新生链上的末端核苷酸,并且该核苷酸包含可延伸的3’OH基团。在一些实施方案中,核酸双链体各自与聚合酶(例如,第二测序聚合酶)结合。
在一些实施方案中,切割试剂进一步包含固定至支持物上的多个核酸双链体,其中核酸双链体内的模板分子(例如,多联体)固定至支持物或固定至支持物上的涂层(例如,聚合物涂层)上。在一些实施方案中,支持物可以涂覆有至少一个亲水性聚合物涂层。在一些实施方案中,亲水性聚合物涂层的水接触角不超过45-50度。在一些实施方案中,多个核酸双链体固定至支持物上的一层或多层涂层上,其中固定化核酸双链体的密度为约100-100,000/mm2。
在一些实施方案中,多个固定化核酸双链体彼此流体连通,以允许切割试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化核酸双链体可以以大规模平行的方式基本上同时与切割试剂反应。在一些实施方案中,多个固定化核酸双链体的流体连通可以用于在支持物上以大规模平行的方式进行切割反应。
在一些实施方案中,切割试剂包含HEPES(50mM,pH 9.2)、MgCl2(4mM)、NaCl(500mM)、Triton-X(0.1%)、Trolox(2mM)、抗坏血酸(50mM)、TCEP(50mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂CR-A。
在一些实施方案中,切割试剂包含MES(50mM,pH 9.2)、MgCl2(4mM)、KCl(500mM)、CHAPS(0.1%)、Trolox(2mM)、抗坏血酸棕榈酸酯(50mM)、THPP(50mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂CR-B。
在一些实施方案中,切割试剂包含Bis Tris丙烷(50mM,pH 9.2)、MgCl2(4mM)、NaCl(500mM)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)(0.1%)、Trolox(2mM)、抗坏血酸(50mM)、THPP(50mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂CR-C。
在一些实施方案中,切割试剂包含MOPS(50mM,pH 9.2)、MgCl2(4mM)、KCl(500mM)、CHAPS(0.1%)、Trolox(2mM)、柠檬酸(50mM)、甜菜碱(50mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂CR-D。
在一些实施方案中,切割试剂包含MOPSO(50mM,pH 9.2)、MgCl2(4mM)、NaCl(500mM)、CHAPS(0.1%)、Trolox(2mM)、丁基羟基甲苯(50mM)、2-β巯基乙醇(50mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂CR-E。
在一些实施方案中,切割试剂包含BES(50mM,pH 9.2)、MgCl2(4mM)、KCl(500mM)、吐温-20(0.1%)、Trolox(2mM)、Trolox(50mM)、N-乙酰半胱氨酸(50mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂CR-F。
在一些实施方案中,切割试剂包括TES(50mM,pH 9.2)、MgCl2(4mM)、NaCl(500mM)、吐温-20(0.1%)、Trolox(2mM)、丁基羟基甲苯(50mM)、谷胱甘肽(50mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂CR-G。
在一些实施方案中,切割试剂包括CAPS(50mM,pH 9.2)、MgCl2(4mM)、KCl(500mM)、吐温-20(0.1%)、Trolox(2mM)、丁基羟基茴香醚(50mM)、THPP(50mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂CR-H。
在一些实施方案中,切割试剂包含TAPS(50mM,pH 9.2)、MgCl2(4mM)、NaCl(500mM)、Triton-X(0.1%)、Trolox(2mM)、香豆酸(50mM)、甜菜碱(50mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂CR-I。
在一些实施方案中,切割试剂包含TAPSO(50mM,pH 9.2)、MgCl2(4mM)、KCl(500mM)、Triton-X(0.1%)、Trolox(2mM)、咖啡酸(50mM)、THPP(50mM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂CR-J。
方法
本发明提供了用于进行核酸测序工作流的方法。在一些实施方案中,方法可包括在核酸杂交试剂的存在下,使多个核酸模板分子与多个扩增引物在适于形成多个核酸双链体的条件下接触,每个双链体包含与扩增引物杂交的模板分子。在一些实施方案中,扩增引物是可溶性引物或固定至支持物上。在一些实施方案中,多个核酸双链体包含与第一扩增引物杂交以形成至少第一核酸双链体的至少第一核酸模板分子,和与第二扩增引物杂交以形成第二核酸双链体的至少第二核酸模板分子。
在一些实施方案中,核酸杂交试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂和至少一种一价阳离子。在一些实施方案中,杂交试剂进一步包含洗涤剂、还原剂、离液剂、螯合剂、醇、两性离子、糖醇和/或拥挤剂中的任一种或两种或更多种的任何组合。
在一些实施方案中,接触在约20-25℃、或约25-35℃、或约35-45℃、或约45-55℃、或约55-65℃、或约65-75℃的温度或更高温度下进行。
在一些实施方案中,多个核酸模板分子包含DNA、RNA或RNA和DNA的混合物。在一些实施方案中,多个核酸模板分子包含线性或环状分子,或线性和环状分子的混合物。在一些实施方案中,多个核酸模板分子包含单链分子、双链分子或具有单链和双链部分的核酸分子。在一些实施方案中,多个核酸模板分子中的单个核酸模板分子可操作地连接至至少一个衔接子序列,其中衔接子序列包括捕获引物结合序列、扩增引物结合序列和/或测序引物结合序列。在一些实施方案中,多个核酸模板分子中的单个核酸模板分子可操作地连接至具有样品条形码序列或独特的分子标签序列的至少一个衔接子序列。
在一些实施方案中,扩增引物可以与核酸模板分子的至少一部分杂交。扩增引物包含3’可延伸末端或3’末端包含链终止部分。
在一些实施方案中,扩增引物包含可溶性寡核苷酸引物(例如,在溶液中),或者扩增引物固定至支持物或固定至支持物上的涂层上。在一些实施方案中,支持物上的固定化扩增引物的密度为约104-1012/mm2。
在一些实施方案中,多个核酸双链体固定至支持物上,其中模板分子(例如,环状模板分子)和/或扩增引物固定至支持物或固定至支持物上的涂层上。在一些实施方案中,支持物可以涂覆有至少一个亲水性聚合物涂层。在一些实施方案中,亲水性聚合物涂层的水接触角不超过45-50度。在一些实施方案中,多个扩增引物固定至支持物上的一层或多层涂层上,其中固定化扩增引物的密度为约100-100,000个扩增引物/mm2。
在一些实施方案中,支持物上的多个固定化扩增引物彼此流体连通,以允许试剂(例如,杂交试剂)的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化扩增引物可以以大规模平行的方式基本上同时与试剂反应。在一些实施方案中,多个固定化扩增引物的流体连通可以用于在支持物上以大规模平行的方式进行核酸杂交反应。
在一些实施方案中,当扩增引物固定至支持物或固定至支持物上的涂层上时,在形成多个核酸双链体之前,用于进行核酸测序工作流的方法可包括(i)提供固定至支持物或固定至支持物上的涂层上的多个扩增引物,和(ii)用洗涤试剂洗涤固定化扩增引物。在一些实施方案中,洗涤试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子和洗涤剂。在一些实施方案中,洗涤试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子或洗涤剂。在一些实施方案中,洗涤在约20-45℃的温度下或约20-30℃的温度下进行。
在一些实施方案中,用于进行核酸测序工作流的方法可包括:用通用洗涤试剂洗涤多个固定化核酸双链体。在一些实施方案中,洗涤试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子和洗涤剂。在一些实施方案中,洗涤试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子或洗涤剂。在一些实施方案中,洗涤在约20-45℃的温度下或约20-30℃的温度下进行。
在一些实施方案中,用于进行核酸测序工作流的方法可包括采用第一和第二扩增试剂的两阶段扩增反应,其中第一扩增试剂的pH配制为抑制核酸扩增,并且第二扩增试剂的pH配制为促进核酸扩增。
在一些实施方案中,用于进行核酸测序工作流的方法可包括:使多个核酸双链体与第一扩增试剂接触,第一扩增试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、铵离子、多个核苷酸和/或扩增聚合酶。在一些实施方案中,第一扩增试剂进一步包含洗涤剂、还原剂和/或黏度剂中的任一种或两种或更多种的任何组合。在一些实施方案中,第一扩增试剂的pH适于使扩增聚合酶与核酸双链体结合,该核酸双链体包含与扩增寡核苷酸引物杂交的核酸模板分子。在一些实施方案中,第一扩增试剂的pH可以降低/抑制扩增聚合酶的活性。在一些实施方案中,第一扩增试剂的pH可以为约pH 8或更低(例如,pH 7-8)。
在一些实施方案中,接触在适于形成多个复合的扩增聚合酶的条件下进行,每个复合的扩增聚合酶包含扩增聚合酶和与核酸双链体结合的核苷酸。在一些实施方案中,条件不适于进行核酸扩增反应。
在一些实施方案中,多个核酸双链体固定至支持物上,其中模板分子包含与扩增引物杂交的环状模板分子。在一些实施方案中,扩增引物固定至支持物或固定至支持物上的涂层上。
在一些实施方案中,扩增聚合酶具有链置换活性,并且包含phi29DNA聚合酶、BstDNA聚合酶的大片段、Bsu DNA聚合酶的大片段和Bca(exo-)DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段、T5聚合酶、M-MuLV逆转录酶、HIV病毒逆转录酶或Deep Vent DNA聚合酶。在一些实施方案中,phi29 DNA聚合酶可以是野生型phi29DNA聚合酶(例如,来自Expedeon的MagniPhi),或变体EquiPhi29DNA聚合酶(例如,来自Thermo Fisher Scientific),或嵌合型QualiPhi DNA聚合酶(例如,来自4basebio)。
在一些实施方案中,多个核苷酸包含选自dATP、dGTP、dCTP和dTTP的两种或更多种核苷酸的混合物。在一些实施方案中,多个核苷酸包含选自dATP、dGTP、dCTP和dTTP的三种或更多种核苷酸的混合物。在一些实施方案中,多个核苷酸包含包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP的四种类型的核苷酸的混合物。
在一些实施方案中,用于进行核酸测序工作流的方法可包括:使多个复合的扩增聚合酶与第二扩增试剂接触,第二扩增试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、铵离子和/或多个核苷酸。在一些实施方案中,第二扩增试剂缺乏扩增聚合酶。在一些实施方案中,第二扩增试剂进一步包含洗涤剂、还原剂和/或黏度剂中的任一种或两种或更多种的任何组合。在一些实施方案中,第一扩增试剂和第二扩增试剂具有不同的pH。在一些实施方案中,第二扩增试剂的pH适于保留具有与核酸双链体结合的扩增聚合酶(例如,来自第一扩增试剂)的复合体,该核酸双链体包含与扩增寡核苷酸引物杂交的核酸模板分子。在一些实施方案中,第二扩增试剂的pH可以适于促进扩增聚合酶的活性。例如,第二扩增试剂的pH可以为约pH 8.5或更高(例如,pH 8.5-8.8)。
在一些实施方案中,接触在适于保留多个复合的扩增聚合酶的条件下进行,每个复合的扩增聚合酶包含扩增聚合酶和与核酸双链体结合的核苷酸,并且该条件适于进行多个核酸扩增反应以形成多个克隆扩增的模板分子(例如,多联体或单拷贝模板分子)。
在一些实施方案中,多个多联体包含至少第一多联体和第二多联体。在一些实施方案中,第一多联体固定至支持物上的第一位置处(或支持物上的涂层上的第一位置处)。在一些实施方案中,第二多联体固定至支持物上的第二位置处(或支持物上的涂层上的第二位置处),其不同于第一固定化多联体的位置。
在一些实施方案中,第二扩增反应包括滚环扩增反应以生成多个多联体,每个多联体含有环状模板分子的串联重复序列和存在于原始环状核酸模板分子中的任何衔接子序列。在一些实施方案中,滚环扩增反应可以在等温扩增条件下恒温进行,例如约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约37℃、约40℃、约42℃、约50℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃或更高温度,或在由上述温度中的任两个限定的温度范围内。
在一些实施方案中,多个核苷酸包含选自dATP、dGTP、dCTP和dTTP的两种或更多种核苷酸的混合物。在一些实施方案中,多个核苷酸包含选自dATP、dGTP、dCTP和dTTP的三种或更多种核苷酸的混合物。在一些实施方案中,多个核苷酸包含包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP的四种类型的核苷酸的混合物。
在一些实施方案中,用于进行核酸测序工作流的方法可包括:使多个多联体与洗脱试剂在适于保留固定化多联体的条件下接触,并且该条件适于去除(例如,洗去)第一反应(例如,第一扩增反应)和/或第二反应(例如,第二扩增反应)的组分,包括去除扩增聚合酶和核苷酸。在一些实施方案中,洗脱试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、洗涤剂和/或离液剂。在一些实施方案中,接触在约20-60℃的温度下或约25-45℃的温度下进行。
在一些实施方案中,用于进行核酸测序工作流的方法可包括:用通用洗涤试剂洗涤多个多联体。在一些实施方案中,洗涤可以从洗脱试剂中去除离液剂。在一些实施方案中,通用洗涤试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子和/或洗涤剂。在一些实施方案中,洗涤在约20-65℃的温度下或约25-45℃的温度下进行。
在一些实施方案中,用于进行核酸测序工作流的方法可包括:使多个多联体(例如,固定化多联体)与捕获试剂接触,其中捕获试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂、多个多价分子、多个测序引物和/或第一测序聚合酶。在一些实施方案中,捕获试剂进一步包含至少一种黏度剂。在一些实施方案中,非催化二价阳离子包括锶和/或钡。
在一些实施方案中,接触在适于通过将固定化多联体与测序引物、第一测序聚合酶和多个多价分子结合而形成多个固定化三元复合体的条件下进行,从而形成多个固定化三元复合体。
在一些实施方案中,固定化模板分子包含固定化多联体分子,该多联体分子包含感兴趣序列的串联重复序列和存在于原始环状核酸模板分子中的任何衔接子序列。步骤(g)的接触可以沿着相同的多联体分子生成多个三元复合体,其中单个三元复合体包含测序引物、第一测序聚合酶和多价分子的核苷酸单元。
在一些实施方案中,捕获试剂进一步包含一价盐,该一价盐可以促进三元复合体的形成。一价盐可包含例如钠、钾、锂、铷、铯、银或本领域已知的其他一价阳离子中的一种或多种,并且可作为NaCl、KCl、LiCl、CsCl、AgCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾或本领域已知的其他这样的一价盐溶液提供。在一些实施方案中,一价盐包含NaCl、KCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾。
在一些实施方案中,捕获试剂进一步包含与核酸模板分子的至少一部分杂交的多个测序引物。在一些实施方案中,测序引物包含3’可延伸末端或3’不可延伸末端。在一些实施方案中,测序引物包含可溶性寡核苷酸引物(例如,在溶液中)。
在一些实施方案中,接触在约20-65℃的温度下或约25-45℃的温度下进行。
在一些实施方案中,使多个固定化多联体与捕获试剂和多个测序引物在适于通过将第一固定化多联体(例如,第一固定化模板)与测序引物、第一测序聚合酶中的至少一个和多价分子中的至少一个结合而形成至少第一固定化三元复合体的条件下接触,从而形成第一固定化三元复合体。
在一些实施方案中,使多个固定化多联体与捕获试剂和多个测序引物在适于通过将第二固定化多联体(例如,第二固定化模板)与测序引物、第一测序聚合酶中的至少一个和多价分子中的至少一个结合而形成至少第二固定化三元复合体的条件下接触,从而形成第二固定化三元复合体。
在一些实施方案中,在多个三元复合体中的单个三元复合体中,来自多价分子的核苷酸单元在与模板链中的互补核苷酸相对的位置处与测序引物的3’端结合。
在一些实施方案中,使多个固定化多联体与捕获试剂在适于形成多个三元复合体(例如,至少第一和第二三元复合体)的条件下接触,并且在多个三元复合体中,合适的条件抑制核苷酸单元从多价分子掺入测序引物中。
在一些实施方案中,使多个固定化多联体与捕获试剂在适于形成多个稳定的三元复合体(例如,至少第一和第二稳定的三元复合体)的条件下接触,其中与通过将模板分子与测序引物、测序聚合酶和游离核苷酸结合而形成的多个三元复合体相比,多个稳定的三元复合体具有更长的持续时间(例如,很少或无解离)。
在一些实施方案中,多个多价分子中的单个多价分子包含(a)核心,和(b)多个核苷酸臂,其包含(i)核心附接部分、(ii)包含PEG部分的间隔区、(iii)接头和(iv)核苷酸单元。参见图2A至2D。
在一些实施方案中,多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中,间隔区附接至接头,其中接头附接至核苷酸单元。在一些实施方案中,核苷酸单元包含碱基、糖和至少一个磷酸基团。在一些实施方案中,接头通过碱基附接至核苷酸单元。在一些实施方案中,接头包含具有2-6个亚基的脂族链或具有2-6个亚基的低聚乙二醇链,并且任选地,接头包括芳族部分。
在一些实施方案中,多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中,间隔区附接至接头,其中接头附接至核苷酸单元。在一些实施方案中,核苷酸单元包含碱基、糖和至少一个磷酸基团。在一些实施方案中,接头通过碱基附接至核苷酸单元。在一些实施方案中,接头包含具有2-6个亚基的脂族链或具有2-6个亚基的低聚乙二醇链,并且任选地,接头包括芳族部分(图2A至2D)。在一些实施方案中,多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心,并且其中多个核苷酸臂具有相同类型的核苷酸单元,该核苷酸单元选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。在一些实施方案中,多个多价分子包含具有两种或更多种不同类型的核苷酸的多价分子的混合物,该核苷酸选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。在一些实施方案中,多个多价分子中的至少一个是荧光标记的,其中荧光团附接至核心或附接至核苷酸单元上的至少一个碱基。在一些实施方案中,荧光团对应于核苷酸单元的碱基,以允许区分不同荧光标记的多价分子的核苷酸碱基单元。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶可以结合多价分子的互补核苷酸单元和核酸双链体,以形成三元复合体。第一测序聚合酶包含重组野生型或突变型聚合酶,其包含与来自Candidatus altiarchaeales古细菌(例如,SEQ ID NO:221-225中的任一者)、或来自9°N(例如,SEQ ID NO:226或227)、或来自Therminator(例如,SEQ ID NO:228)、或来自Vent(例如,SEQ ID NO:229)、或来自Deep Vent(例如,SEQ ID NO:230)、或来自Pfu(例如,SEQ IDNO:231)、或来自深海火球菌(例如,SEQ ID NO:232)、或来自RB69(SEQ ID NO:233)的聚合酶的主链序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含来自Candidatus altiarchaeales古细菌的重组野生型或突变型聚合酶。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含具有来自Candidatus altiarchaeales古细菌的DNA聚合酶的氨基酸序列主链的DNA聚合酶。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含与SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中突变型DNA聚合酶在选自Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567的一个或多个位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含(i)选自Leu416Ser、Leu416Phe和Leu416Tyr的氨基酸取代;以及(ii)Tyr417Ala、Pro418Gly、Ala493Ser、Ile529His、Arg515Leu和Asn567Asp的氨基酸取代。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含SEQ ID NO:2、3、4或5中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:1。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:2、3、4或5中的任一者。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含来自9°N的DNA聚合酶,其包含SEQ IDNO:6、7或8的氨基酸序列。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含突变型9°N聚合酶,该聚合酶具有来自9°N的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:6、7或8),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:6、7或8中的任一者。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列(Vent聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Vent聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:9),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列(Deep Vent聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Deep Vent聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:10),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:10。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列(Pfu聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Pfu聚合酶,该聚合酶具有来自Pfu的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:11),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:11。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列(深海火球菌聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型深海火球菌聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:12),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:12。
在一些实施方案中,多个三元复合体固定至支持物上。在一些实施方案中,三元复合体内的模板分子(例如,多联体)固定至支持物或固定至支持物上的涂层(例如,聚合物涂层)上。在一些实施方案中,支持物可以涂覆有至少一个亲水性聚合物涂层。在一些实施方案中,亲水性聚合物涂层的水接触角不超过45-50度。在一些实施方案中,多个三元复合体固定至支持物上的一层或多层涂层上,其中固定化三元复合体的密度为约100-100,000/mm2。在一些实施方案中,多个固定化三元复合体中的至少一个是荧光标记的三元复合体,其包含具有与测序引物杂交的模板分子(例如,多联体)的核酸双链体,其中该双链体与第一测序聚合酶和荧光标记的多价分子结合。
在一些实施方案中,多个固定化三元复合体彼此流体连通,以允许捕获试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化三元复合体可以以大规模平行的方式基本上同时与捕获试剂反应。在一些实施方案中,多个固定化三元复合体的流体连通可以用于在支持物上以大规模平行的方式进行核酸测序反应。
在一些实施方案中,用于进行核酸测序工作流的方法可包括:使多个稳定的三元复合体(例如,固定化三元复合体)与捕获后试剂接触,其中捕获后试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂和第一测序聚合酶。在一些实施方案中,捕获后试剂缺乏多个多价分子。在一些实施方案中,捕获后试剂进一步包含至少一种黏度剂。在一些实施方案中,非催化二价阳离子包括锶和/或钡。
在一些实施方案中,捕获后试剂进一步包含一价盐,该一价盐可以促进三元复合体的形成。一价盐可包含例如钠、钾、锂、铷、铯、银或本领域已知的其他一价阳离子中的一种或多种,并且可作为NaCl、KCl、LiCl、CsCl、AgCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾或本领域已知的其他这样的一价盐溶液提供。在一些实施方案中,一价盐包含NaCl、KCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾。
在一些实施方案中,捕获后试剂任选地包含与核酸模板分子的至少一部分杂交的多个测序引物。在一些实施方案中,测序引物包含3’可延伸末端或3’不可延伸末端。在一些实施方案中,测序引物包含可溶性寡核苷酸引物(例如,在溶液中)。
在一些实施方案中,在步骤(g)期间形成的多个固定化三元复合体(例如,至少第一和第二三元复合体)与步骤(h)的捕获后试剂在适于保存三元复合体而不发生聚合酶催化的核苷酸单元掺入的条件下接触。在一些实施方案中,捕获后试剂缺乏多个多价分子。在一些实施方案中,捕获后试剂减少或消除了现有聚合酶从多价分子和核酸双链体中的解离,使得三元复合体保持完整。
在一些实施方案中,与通过将模板分子与测序引物、测序聚合酶和游离核苷酸结合而形成的多个三元复合体相比,多个稳定的三元复合体具有更长的持续时间(例如,很少或无解离)。
在一些实施方案中,接触在约20-65℃的温度下或约25-45℃的温度下进行。
在一些实施方案中,捕获后试剂含有第一测序聚合酶,其可以是捕获试剂中含有的第一测序聚合酶的相同类型或不同类型。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含来自Candidatus altiarchaeales古细菌的重组野生型或突变型聚合酶。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含具有来自Candidatus altiarchaeales古细菌的DNA聚合酶的氨基酸序列主链的DNA聚合酶。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含与SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中突变型DNA聚合酶在选自Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567的一个或多个位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含(i)选自Leu416Ser、Leu416Phe和Leu416Tyr的氨基酸取代;以及(ii)Tyr417Ala、Pro418Gly、Ala493Ser、Ile529His、Arg515Leu和Asn567Asp的氨基酸取代。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:1。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:2、3、4或5中的任一者。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含来自9°N的DNA聚合酶,其包含SEQ IDNO:6、7或8的氨基酸序列。在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含突变型9°N聚合酶,该聚合酶具有来自9°N的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:6、7或8),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:6、7或8中的任一者。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列(Vent聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Vent聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:9),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列(Deep Vent聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Deep Vent聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:10),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:10。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列(Pfu聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Pfu聚合酶,该聚合酶具有来自Pfu的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:11),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:11。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列(深海火球菌聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型深海火球菌聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:12),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:12。
在一些实施方案中,多个三元复合体固定至支持物上。在一些实施方案中,三元复合体内的模板分子(例如,多联体)固定至支持物或固定至支持物上的涂层(例如,聚合物涂层)上。在一些实施方案中,支持物可以涂覆有至少一个亲水性聚合物涂层。在一些实施方案中,亲水性聚合物涂层的水接触角不超过45-50度。在一些实施方案中,多个三元复合体固定至支持物上的一层或多层涂层上,其中固定化三元复合体的密度为约100-100,000/mm2。在一些实施方案中,多个固定化三元复合体中的至少一个是荧光标记的三元复合体,其包含具有与测序引物杂交的模板分子(例如,多联体)的核酸双链体,其中该双链体与第一测序聚合酶和荧光标记的多价分子结合。
在一些实施方案中,多个固定化三元复合体彼此流体连通,以允许捕获后试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化三元复合体可以以大规模平行的方式基本上同时与捕获后试剂反应。在一些实施方案中,多个固定化三元复合体的流体连通可以用于在支持物上以大规模平行的方式进行核酸测序反应。
在一些实施方案中,用于进行核酸测序工作流的方法可包括:(i)使多个稳定的三元复合体(例如,多个固定化荧光标记的三元复合体)与成像试剂接触,和(ii)通过将多个三元复合体暴露于激发光照并检测响应于激发光照由固定化荧光标记的三元复合体发射的荧光信号来检测多个三元复合体中至少一个的存在。
在一些实施方案中,成像试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂和/或用于减少光损伤的至少一种化合物。在一些实施方案中,成像试剂进一步包含至少一种黏度剂。
在一些实施方案中,成像试剂保存(例如,稳定)在捕获试剂存在下形成的三元复合体。在一些实施方案中,成像试剂抑制聚合酶催化的核苷酸掺入反应。在一些实施方案中,成像试剂减少或抑制三元复合体暴露于激发光照引起的光损伤。
在一些实施方案中,由固定化荧光标记的三元复合体发射的荧光信号可以通过采用包含激发光照源、检测器和光具组(optical train)的系统来检测。在一些实施方案中,系统可以以将激发光照引导至固定在支持物上的固定化荧光标记的三元复合体的方式配置,并且检测器可以检测响应于激发光照由固定化荧光标记的三元复合体发射的荧光信号。
在一些实施方案中,激发光照包含电磁辐射,包括红外光、可见光和紫外光。在一些实施方案中,电磁辐射可以由激光器提供。在一些实施方案中,激光器可以具有包括强度、辐射率(例如,亮度)、方向性、相干性、偏振和/或单色性的特征。在一些实施方案中,激光器可以是发射连续激光不间断光束的连续波激光器。在一些实施方案中,激光器可以是脉冲激光器,例如Q开关、锁模或脉冲泵浦激光器。在一些实施方案中,激光器可以是超快激光器,其可以在约5飞秒至100皮秒的时间范围内产生脉冲。在一些实施方案中,激光器可以以单光子或多光子激发模式采用。
在一些实施方案中,荧光标记的三元复合体可以暴露于适当的激发波长,该激发波长取决于附接至多价分子的荧光团。在一些实施方案中,激发光照的波长可以是约488-752nm范围内的任何波长。
在一些实施方案中,激光功率可以为约50-250mW,或约75-200mW。
在一些实施方案中,步骤(i)的成像可以在约20-65℃的温度下或约25-45℃的温度下进行。
在一些实施方案中,用于进行核酸测序工作流的方法可包括:鉴定与测序引物结合的多价分子的核苷酸单元(例如,荧光标记的核苷酸单元),作为检测的荧光标记的三元复合体的一部分。在一些实施方案中,与测序引物结合的核苷酸单元不掺入测序引物的3’端中。在一些实施方案中,在进行检测的荧光标记的三元复合体中,附接至多价分子的荧光团对应于核苷酸单元的碱基,以允许鉴定核苷酸碱基单元。
在一些实施方案中,鉴定可以在约20-65℃的温度下或约25-45℃的温度下进行。
在一些实施方案中,用于进行核酸测序工作流的方法可包括:使多个固定化荧光标记的三元复合体与洗脱试剂在适于通过从核酸双链体中去除荧光标记的多价分子和第一测序聚合酶而解离三元复合体(例如,荧光标记的三元复合体)的条件下接触。在一些实施方案中,洗脱试剂保留包含与模板分子(例如,多联体)杂交的测序引物的核酸双链体,并且该双链体保持固定至支持物上。
在一些实施方案中,洗脱试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、洗涤剂和/或离液剂。在一些实施方案中,接触在约20-65℃的温度下或约25-45℃的温度下进行。
在一些实施方案中,用于进行核酸测序工作流的方法可包括:通过在保留固定至支持物上的核酸双链体(例如,与测序引物杂交的核酸模板分子)的条件下用通用洗涤试剂洗涤多个固定化核酸双链体来进行预步进反应。在一些实施方案中,洗涤可以从洗脱试剂中去除离液剂。在一些实施方案中,通用洗涤试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子和洗涤剂。在一些实施方案中,洗涤在约20-65℃的温度下或约25-45℃的温度下进行。
在一些实施方案中,用于进行核酸测序工作流的方法可包括:通过使多个固定化核酸双链体与步进试剂接触来进行步进反应,步进试剂包含至少一种溶剂、至少一种pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、催化二价阳离子、洗涤剂、第二测序聚合酶和/或多个核苷酸(例如,游离核苷酸)。在一些实施方案中,催化二价阳离子可以促进聚合酶催化的核苷酸掺入。在一些实施方案中,催化二价阳离子包含镁和/或锰。在一些实施方案中,一价盐可以促进三元复合体的形成。一价盐可包含例如钠、钾、锂、铷、铯、银或本领域已知的其他一价阳离子中的一种或多种,并且可作为NaCl、KCl、LiCl、CsCl、AgCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾或本领域已知的其他这样的一价盐溶液提供。在一些实施方案中,一价盐包含NaCl、KCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾。
在一些实施方案中,步进试剂进一步包含至少一种黏度剂。在一些实施方案中,步进试剂任选地包含与核酸模板分子的至少一部分杂交的多个测序引物。在一些实施方案中,测序引物包含3’可延伸末端或3’不可延伸末端。在一些实施方案中,测序引物包含可溶性寡核苷酸引物(例如,在溶液中)。
在一些实施方案中,步进试剂保留包含与模板分子(例如,多联体)杂交的测序引物的核酸双链体,并且该双链体保持固定至支持物上。
在一些实施方案中,步骤(m)的接触在适于通过将来自步骤(l)的固定化核酸双链体与第二测序聚合酶和多个核苷酸(游离非缀合核苷酸)结合而形成多个固定化三元复合体的条件下进行,从而形成多个固定化三元复合体。
在一些实施方案中,第二测序聚合酶可以结合互补核苷酸和核酸双链体,以形成三元复合体。第二测序聚合酶包含重组野生型或突变型聚合酶,其包含与来自Candidatusaltiarchaeales古细菌(例如,SEQ ID NO:221-225中的任一者)、或来自9°N(例如,SEQ IDNO:226或227)、或来自Therminator(例如,SEQ ID NO:228)、或来自Vent(例如,SEQ ID NO:229)、或来自Deep Vent(例如,SEQ ID NO:230)、或来自Pfu(例如,SEQ ID NO:231)、或来自深海火球菌(例如,SEQ ID NO:232)、或来自RB69(SEQ ID NO:233)的聚合酶的主链序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,多个核苷酸包含选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP的两种或更多种核苷酸的混合物。在一些实施方案中,多个核苷酸包含选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP的三种或更多种核苷酸的混合物。在一些实施方案中,多个核苷酸包含选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP的四种或更多种核苷酸的混合物。在一些实施方案中,多个核苷酸包含dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP的混合物。
在一些实施方案中,多个核苷酸中的至少一个核苷酸包含附接至2’和/或3’糖部分的链终止部分。链终止子部分可以是叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基。在一些实施方案中,叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基可用化学剂切割/去除。在一些实施方案中,化学剂包含膦化合物。在一些实施方案中,膦化合物包含衍生的三烷基膦部分或衍生的三芳基膦部分。在一些实施方案中,膦化合物包含三(2-羧乙基)膦(TCEP)或双磺基三苯基膦(BS-TPP)。
在一些实施方案中,多个核苷酸中的至少一个核苷酸可以附接至可检测的报告部分。在一些实施方案中,可检测的报告部分可以是荧光团。在一些实施方案中,荧光团可以附接至核苷酸的碱基。在一些实施方案中,荧光团对应于核苷酸的碱基,以允许区分不同荧光标记的核苷酸的核苷酸碱基。
在一些实施方案中,接触在约20-75℃的温度下,或约30-65℃的温度下,或约40-50℃的温度下进行。
在一些实施方案中,多个固定化核酸双链体与步进试剂在适于通过将单个双链体与第二测序聚合酶和互补核苷酸结合而形成多个固定化三元复合体的条件下接触,从而形成固定化三元复合体。在一些实施方案中,在多个三元复合体中的单个三元复合体中,互补核苷酸在与模板链中的互补核苷酸相对的位置处与测序引物的3’端结合。在一些实施方案中,该条件还适于促进聚合酶催化的核苷酸掺入,从而使第二测序聚合酶前进至核酸双链体上的下一个碱基位置处以生成多个核酸双链体,每个核酸双链体具有与新生链(例如,延伸的测序引物)杂交的模板分子(例如,多联体),其中新生链延伸一个核苷酸。在一些实施方案中,当掺入的核苷酸包括2’或3’链终止子部分时,新生链的末端3’端不能在不去除链终止部分的情况下在后续步进反应中经历核苷酸掺入。
在一些实施方案中,用于进行核酸测序工作流的方法可包括:使形成的具有延伸的测序引物的多个固定化核酸双链体与洗脱试剂在适于去除(例如,洗去)步进反应的组分(包括去除第二测序聚合酶和未反应的核苷酸)的条件下接触。在一些实施方案中,洗脱试剂保留包含与模板分子(例如,多联体)杂交的测序引物的核酸双链体,并且该双链体保持固定至支持物上。在一些实施方案中,洗脱试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、洗涤剂和离液剂。在一些实施方案中,接触在约20-65℃的温度下或约25-45℃的温度下进行。
在一些实施方案中,用于进行核酸测序工作流的方法可包括:在从洗脱试剂中去除离液剂的条件下,用通用洗涤试剂洗涤具有延伸的测序引物的多个固定化核酸双链体。在一些实施方案中,洗涤条件适于保留多个固定化核酸双链体。在一些实施方案中,通用洗涤试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子和/或洗涤剂。在一些实施方案中,洗涤在约20-65℃的温度下或约25-45℃的温度下进行。
在一些实施方案中,用于进行核酸测序工作流的方法可包括:使多个固定化核酸双链体与切割试剂在适于从新生链(例如,延伸的测序引物)的末端核苷酸上切割链终止部分的条件下接触,从而生成具有3’可延伸末端的延伸的测序引物。在一些实施方案中,切割反应适于保留多个固定化核酸双链体。在一些实施方案中,切割试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、洗涤剂、切割剂和切割催化剂。在一些实施方案中,洗涤在约20-65℃的温度下或约25-45℃的温度下进行。
在一些实施方案中,用于进行核酸测序工作流的方法可包括:在去除切割剂和切割催化剂的条件下,用通用洗涤试剂洗涤具有延伸的测序引物的多个固定化核酸双链体。在一些实施方案中,通用洗涤试剂保留固定至支持物上的核酸双链体(例如,与延伸的测序引物杂交的核酸模板分子)。在一些实施方案中,通用洗涤试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子和/或洗涤剂。在一些实施方案中,洗涤在约20-65℃的温度下或约25-45℃的温度下进行。
在一些实施方案中,用于进行核酸测序工作流的方法可包括:重复以下中的任一项:(a)使多个固定化多联体与捕获试剂接触,(b)使多个固定化多联体与捕获后试剂接触,(c)使多个固定化荧光标记的三元复合体与成像试剂接触,(d)鉴定与测序引物结合的多价分子的荧光标记的核苷酸单元,(e)使多个固定化荧光标记的三元复合体与洗脱试剂接触,(f)用通用洗涤试剂洗涤多个固定化核酸双链体,(g)使多个固定化核酸双链体与步进试剂接触,(h)使多个固定化延伸的核酸双链体与洗脱试剂接触,(i)用通用洗涤试剂洗涤多个固定化延伸的核酸双链体,或(j)使多个固定化延伸的核酸双链体与切割试剂接触。在一些实施方案中,使多个固定化多联体与捕获试剂在不存在测序引物的情况下接触。
成对测序试剂和使用方法
本公开内容提供了一种或多种成对测序试剂,以及采用成对测序试剂的方法,其中该方法包括获得第一核酸链(例如,有义链)的第一区域的第一测序读段,以及获得与第一链互补的第二核酸链(例如,反义链)的第二区域的第二测序读段,其中第一和第二链对应于同一双链模板分子的两条互补链。第一测序区域的第一测序读段和第二测序区域的第二测序读段可以具有重叠序列,其对应于来自双链模板分子的第一和第二链的互补序列。可以对第一和第二测序读段进行比对,使得重叠的测序读段可以产生原始双链核酸来源中的配对区域(例如,基因组中的配对区域)的序列信息,并且可以以高水平的置信度从第一和第二测序读段确定序列信息的准确性。第一测序区域的第一测序读段和第二测序区域的第二测序读段不一定具有重叠序列,在这种情况下,不能以高水平的置信度确定原始双链核酸来源中的配对区域的序列信息。第一和第二测序读段可以在其各自模板分子的一端起始,或可以在内部位置处起始。
在一些实施方案中,第一核酸链包含具有易切割部分的至少一个核苷酸,该易切割部分可以被切割以在第一核酸链中生成至少一个无碱基位点。具有易切割部分的示例性核苷酸包括尿苷、8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤和脱氧肌苷。在一些实施方案中,包括具有易切割部分的一个或多个核苷酸的第一核酸链可以与至少一种可溶性正向测序引物杂交,并且可以对第一链进行测序以生成至少一条延伸的正向测序引物链,从而对第一核酸链进行测序。至少一条正向测序引物链可以通过使用第二链合成试剂和作为模板分子的第一核酸链进行引物延伸反应以生成作为第二核酸链的正向延伸链来取代。
在一些实施方案中,可以使用链降解试剂去除第一核酸链,其在具有易切割部分的核苷酸处生成无碱基位点。链降解试剂可以在无碱基位点处生成间隙,以生成含有间隙的第一链,同时保留正向延伸链(第二链)。含有间隙的第一链可以被去除,同时保留正向延伸链(第二链)。第二链可以与至少一种可溶性反向测序引物杂交并测序,以生成至少一条延伸的反向测序引物链,从而对第二核酸链进行测序。在一些实施方案中,第一核酸链缺乏具有易切割部分的核苷酸。
在一些实施方案中,第二链合成试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、铵离子(例如,(NH4)2SO4)、钾离子(例如,KCl)、镁离子(例如,MgCl2)、至少一种洗涤剂、至少一种还原剂、黏度剂、拥挤剂、核苷酸混合物和引物延伸聚合酶。在一些实施方案中,核苷酸混合物包含dATP、dGTP、dCTP、dTTP和/或dUTP的任何组合。在一些实施方案中,引物延伸聚合酶具有链置换活性。在一些实施方案中,第二链合成试剂进一步包含(或缺乏)多个可溶性扩增引物,该多个可溶性扩增引物可以与第一链中的通用衔接子序列杂交。在一些实施方案中,第二链合成试剂进一步包含至少一个压缩寡核苷酸。压缩寡核苷酸包含序列5’-CATGTAATGCACGTACTTTCAGGGTAAACATGTAATGCACGTAC TTT CAGGGTUUU-3(SEQ ID NO:215)或序列5’-GATCAGGTGAGGCTGCGAC GACTAAAGATCAGGTGAGGCTGCGACGACTUUU-3’(SEQ ID NO:216)。
在一些实施方案中,链降解试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、钾离子、镁离子和酶稳定剂。例如,链降解试剂包含Tris-乙酸盐(pH约7.9)、乙酸钾、乙酸镁和白蛋白(诸如牛血清白蛋白)。在一些实施方案中,链降解试剂至少进一步包含从含有脱氧尿苷的DNA分子中释放尿嘧啶的酶。例如,至少一种尿嘧啶释放酶包含尿嘧啶DNA糖基化酶、DNA糖基化酶-裂解酶和核酸内切酶VIII。在一些实施方案中,链降解试剂进一步包含T7核酸外切酶。
在一些实施方案中,第二链合成试剂包含Tris-HCl(40mM,pH7.5)、(NH4)SO4(15mM)、KCl(200mM)、MgSO4(5mM)、吐温-80(0.1%)、DTT(5mM)、甜菜碱(400mM)、蔗糖(400mM)、PEG 32K(5%)、dATP(3mM)、dGTP(3mM)、dCTP(3mM)、dTTP(3mM)、扩增聚合酶(0.37μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SSR-A。
在一些实施方案中,第二链合成试剂包含HEPES(20mM,pH7.8)、(NH4)SO4(25mM)、NaCl(200mM)、MgSO4(5mM)、吐温-80(0.1%)、DTT(5mM)、甜菜碱(400mM)、蔗糖(400mM)、PEG16K(5%)、dATP(2mM)、dGTP(2mM)、dCTP(2mM)、dTTP(2mM)、扩增聚合酶(0.57μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SSR-A。
在一些实施方案中,第二链合成试剂包含PIPES(50mM,pH 8)、(NH4)SO4(35mM)、KCl(200mM)、MgSO4(5mM)、吐温-80(0.1%)、DTT(5mM)、甜菜碱(400mM)、蔗糖(400mM)、PEG 8K(5%)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(1mM)、扩增聚合酶(1.22μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SSR-A。
在一些实施方案中,第二链合成试剂包含Tris(200mM,pH 8.2)、(NH4)SO4(50mM)、NaCl(200mM)、MgSO4(5mM)、吐温-80(0.1%)、DTT(5mM)、甜菜碱(400mM)、蔗糖(400mM)、PEG32K(5%)、dATP(5mM)、dGTP(5mM)、dCTP(5mM)、dTTP(5mM)、扩增聚合酶(0.83μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SSR-A。
在一些实施方案中,第二链合成试剂包含HEPES(150mM,pH7)、(NH4)SO4(50mM)、KCl(200mM)、MgSO4(5mM)、吐温-80(0.1%)、DTT(5mM)、甜菜碱(400mM)、蔗糖(400mM)、PEG 16K(5%)、dATP(4mM)、dGTP(4mM)、dCTP(4mM)、dTTP(4mM)、扩增聚合酶(0.60μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SSR-A。
在一些实施方案中,第二链合成试剂包含MOPS(100mM,pH7.5)、(NH4)SO4(10mM)、NaCl(200mM)、MgSO4(5mM)、吐温-80(0.1%)、DTT(5mM)、甜菜碱(400mM)、蔗糖(400mM)、PEG8K(5%)、dATP(3mM)、dGTP(3mM)、dCTP(3mM)、dTTP(3mM)、扩增聚合酶(0.42μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SSR-A。
在一些实施方案中,第二链合成试剂包含Tris-HCl(75mM,pH7.5)、(NH4)SO4(10mM)、KCl(200mM)、MgSO4(5mM)、吐温-80(0.1%)、DTT(5mM)、甜菜碱(400mM)、蔗糖(400mM)、PEG 16K(5%)、dATP(2mM)、dGTP(2mM)、dCTP(2mM)、dTTP(2mM)、扩增聚合酶(0.33μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SSR-A。
在一些实施方案中,第二链合成试剂包含Tris-HCl(50mM,pH7)、(NH4)SO4(5mM)、KCl(200mM)、MgSO4(5mM)、吐温-80(0.1%)、DTT(5mM)、甜菜碱(400mM)、蔗糖(400mM)、PEG8K(5%)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(1mM)、扩增聚合酶(0.24μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SSR-A。
在一些实施方案中,第二链合成试剂包含HEPES(20mM,pH7)、(NH4)SO4(50mM)、NaCl(200mM)、MgSO4(5mM)、吐温-80(0.1%)、DTT(5mM)、甜菜碱(400mM)、蔗糖(400mM)、PEG 16K(5%)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(1mM)、扩增聚合酶(0.15μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SSR-A。
在一些实施方案中,第二链合成试剂包含MOPS(40mM,pH 7.3)、(NH4)SO4(40mM),KCl(200mM)、MgSO4(5mM)、吐温-80(0.1%)、DTT(5mM)、甜菜碱(400mM)、蔗糖(400mM)、PEG8K(5%)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(1mM)、扩增聚合酶(0.1μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SSR-A。
在一些实施方案中,第二链合成试剂包含MES(100mM,pH 7.3)、(NH4)SO4(30mM)、NaCl(200mM)、MgSO4(5mM)、吐温-80(0.1%)、DTT(5mM)、甜菜碱(400mM)、蔗糖(400mM)、PEG16K(5%)、dATP(1mM)、dGTP(1mM)、dCTP(1mM)、dTTP(1mM)、扩增聚合酶(0.6μM)。在一些情况下,该制剂可称为制剂SSR-A。
在一些实施方案中,合成降解试剂包含乙酸钾(10mM)、Tris乙酸盐(20mM,pH7.9)、乙酸镁(10mM)、BSA(100μg/mL)和T7核酸外切酶。制剂SDR-A。
在一些实施方案中,合成降解试剂包含乙酸钾(50mM)、Tris乙酸盐(20mM,pH7.9)、乙酸镁(10mM)、BSA(100μg/mL)、T7核酸外切酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。制剂SDR-B。
在一些实施方案中,合成降解试剂包含乙酸钾(50mM)、Tris乙酸盐(20mM,pH7.9)、乙酸镁(10mM)、BSA(100μg/mL)、T7核酸外切酶、尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶。制剂SDR-C。
在一些实施方案中,合成降解试剂包含乙酸钾(50mM)、Tris乙酸盐(20mM,pH7.9)、乙酸镁(10mM)、BSA(100μg/mL)、T7核酸外切酶、尿嘧啶DNA糖基化酶和核酸内切酶VIII。制剂SDR-D。
在一些实施方案中,合成降解试剂包含乙酸钾(50mM)、Tris乙酸盐(20mM,pH7.9)、乙酸镁(10mM)、BSA(100μg/mL)、T7核酸外切酶、尿嘧啶DNA糖基化酶、DNA糖基化酶-裂解酶和核酸内切酶VIII。制剂SDR-E。
在一些实施方案中,合成降解试剂包含乙酸钾(50mM)、Tris乙酸盐(20mM,pH7.9)、乙酸镁(10mM)、重组白蛋白(100μg/mL)和T7核酸外切酶。制剂SDR-F。
在一些实施方案中,合成降解试剂包含乙酸钾(50mM)、Tris乙酸盐(20mM,pH7.9)、乙酸镁(10mM)、重组白蛋白(100μg/mL)、T7核酸外切酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。制剂SDR-G。
在一些实施方案中,合成降解试剂包含乙酸钾(50mM)、Tris乙酸盐(20mM,pH7.9)、乙酸镁(10mM)、重组白蛋白(100μg/mL)、T7核酸外切酶、尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶。制剂SDR-H。
在一些实施方案中,合成降解试剂包含乙酸钾(50mM)、Tris乙酸盐(20mM,pH7.9)、乙酸镁(10mM)、重组白蛋白(100μg/mL)、T7核酸外切酶、尿嘧啶DNA糖基化酶和核酸内切酶VIII。制剂SDR-I。
在一些实施方案中,合成降解试剂包含乙酸钾(50mM)、Tris乙酸盐(20mM,pH7.9)、乙酸镁(10mM)、重组白蛋白(100μg/mL)、T7核酸外切酶、尿嘧啶DNA糖基化酶、DNA糖基化酶-裂解酶和核酸内切酶VIII。制剂SDR-J。
含有试剂的盒
本公开内容提供了一个或多个盒,每个盒含有用于进行核酸测序工作流的一种或多种试剂。盒可以含有本文所述试剂的任何组合。盒可以细分为两个或更多个单独的储器,其中每个储器含有用于进行本文所述核酸测序工作流的一个或多个步骤的试剂。可以包含在盒中的试剂的示例包括用于制备线性核酸文库的试剂、环化线性文库分子的试剂、使文库分子与表面引物杂交的试剂、滚环扩增的试剂(例如,第一和第二扩增试剂)、核酸测序的试剂(例如,捕获、捕获后和/或步进试剂)、成像试剂、切割试剂、洗脱试剂和/或洗涤试剂的任何组合。盒还可以含有用于进行成对测序的试剂中的任一种,包括第二链合成试剂和链降解试剂。在一些实施方案中,盒含有至少一种流体试剂。在一些实施方案中,盒配置为装入核酸测序设备中。在一些实施方案中,盒连接至至少一个毛细管,该至少一个毛细管配置为将盒的内容物递送至集成或组装在微流体流动池上的一个或多个支持物上。
组合物
在一些实施方案中,本文公开了可用于对核酸文库进行测序的组合物。一些组合物可用于使核酸文库与寡核苷酸杂交。一些组合物可用于扩增核酸文库。一些组合物可用于洗涤其上包含官能化或杂交的核酸的表面。一些组合物可用于将荧光标记的多价分子与核酸结合。一些组合物可用于对包含荧光标记的多价分子的表面进行成像。一些组合物可用于将寡核苷酸延伸一个核苷酸。
溶剂
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括至少一种溶剂。在一些实施方案中,溶剂包含水。在一些实施方案中,溶剂包含醇,该醇包含具有1-6个碳主链的短链醇,包括线性或支链醇。在一些实施方案中,短链醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇或其结构异构体(例如,异丙醇、叔丁醇、正戊醇、2-戊醇、3-戊醇等)。在一些实施方案中,溶剂包含极性非质子溶剂,包括乙腈、二甘醇、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、乙二醇、甲酰胺、甘油、甲醇、N-甲基-2-吡咯烷酮、六甲基磷酰胺、硝基苯或硝基甲烷。在一些实施方案中,溶剂可包含本文所述的两种或更多种溶剂的混合物(例如,水和甲醇的混合物)。在一些实施方案中,溶剂可包含乙腈。在一些实施方案中,溶剂可包含甲酰胺。在一些实施方案中,溶剂可包含吡啶。在一些实施方案中,溶剂可包含甲酰胺和乙腈。在一些实施方案中,溶剂可包含乙醇和水。
可以包括至少一种溶剂的试剂包括通用洗涤试剂、核酸杂交试剂、第一扩增试剂、第二扩增试剂、洗脱试剂、捕获试剂、捕获后试剂、成像试剂、步进试剂和切割试剂。
pH缓冲剂
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括pH缓冲剂,该pH缓冲剂可以将试剂的pH维持在适于核酸杂交的范围内。在一些实施方案中,pH缓冲剂包含Tris、Tris-HCl、Tricine、Bicine、Bis-Tris丙烷、HEPES、MES、MOPS、MOPSO、BES、TES、CAPS、TAPS、TAPSO、ACES、PIPES、乙醇胺(也称为2-氨基甲醇;MEA)、柠檬酸盐化合物、柠檬酸盐混合物、NaOH和/或KOH中的任一种或两种或更多种的任何组合。在一些实施方案中,pH缓冲剂可以以约1-100mM、或约10-50mM、或约10-25mM的浓度存在于本文所述试剂中的任一种中。在一些实施方案中,可以将存在于本文所述试剂中的任一种中的pH缓冲剂的pH调节至pH为约4-9,或约5-9,或约5-8。
在一些实施方案中,在杂交试剂和杂交方法中,杂交试剂包含pH缓冲剂,其包含包括柠檬酸钠和氯化钠的柠檬酸钠盐水(SSC)。在一些实施方案中,SSC的浓度可以为20X SSC(例如,3M NaCl和0.3M柠檬酸钠),或10X SSC(例如,1.5M NaCl和0.15M柠檬酸钠),或5XSSC(例如,0.75M NaCl和0.075M柠檬酸钠),或2X SSC(例如,0.30M NaCl和0.003M柠檬酸钠),或1X SSC(例如,0.15M NaCl和0.015M柠檬酸钠)。在一些实施方案中,在杂交试剂和杂交方法中,杂交试剂包含pH范围为约4-9或约5-8或约6-7的至少一种pH缓冲剂。在一些实施方案中,杂交试剂包含浓度为约1mM-1M、或约5mM-0.5M、或约10mM-0.25M的至少一种pH缓冲剂。
可以包括至少一种pH缓冲剂的试剂包括通用洗涤试剂、核酸杂交试剂、第一扩增试剂、第二扩增试剂、洗脱试剂、捕获试剂、捕获后试剂、成像试剂、步进试剂和切割试剂。
一价阳离子
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括一价阳离子。在一些实施方案中,一价阳离子是钠或钾。在一些实施方案中,一价阳离子是NaCl或KCl的形式。在一些实施方案中,杂交试剂包含浓度为约25-200mM或约50-150mM的NaCl。在一些实施方案中,杂交试剂包含浓度为约1-200mM、或约25-150mM、或约50-100mM的KCl。
可以包括至少一种一价阳离子的试剂包括通用洗涤试剂、核酸杂交试剂、第一扩增试剂、第二扩增试剂、捕获试剂、捕获后试剂、成像试剂、步进试剂和切割试剂。
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括至少一种盐,该盐包含乙酸钾(例如,KCH3CO2)和/或MgCl2。在一些实施方案中,用于形成本文所述文库-夹板复合体(例如,(300)和(800))中的任一种的退火试剂或用于在多联体中生成无碱基位点的试剂包含浓度为约10-50mM、或约50-100mM、或约100-150mM、或约150-200mM的乙酸钾。在一些实施方案中,用于形成本文所述共价闭合环状分子(例如,(400)和(900))中的任一种的连接试剂包含浓度为约1-10mM、或约10-25mM、或约25-50mM、或约50-100mM的MgCl2。
铵离子
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括铵离子,例如,以硫酸铵的形式。在一些实施方案中,试剂包含浓度为约1-50mM或约10-25mM的铵离子。在一些实施方案中,试剂包含浓度为约1-50mM或约10-25mM的硫酸铵。
可以包括铵离子源的试剂包括第一扩增试剂和第二扩增试剂。
洗涤剂
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括洗涤剂。在一些实施方案中,洗涤剂包含离子洗涤剂,诸如SDS(十二烷基硫酸钠)。在一些实施方案中,洗涤剂包含非离子洗涤剂,诸如Triton X-100、吐温20、吐温80或Nonidet P-40。在一些实施方案中,洗涤剂包含两性离子洗涤剂,诸如CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐)或N-十二烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙硫酸盐(DetX)。在一些实施方案中,洗涤剂包含LDS(十二烷基硫酸锂)、牛磺脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘胆酸钠、脱氧胆酸钠或胆酸钠。在一些实施方案中,洗涤剂以约0.01%-0.05%、或约0.05%-0.1%、或约0.1%-0.15%、或约0.15%-0.2%、或约0.2%-0.25%的浓度包括在试剂中。
可以包括洗涤剂的试剂包括通用洗涤试剂、第一扩增试剂、第二扩增试剂、洗脱试剂、捕获试剂、捕获后试剂、成像试剂、步进试剂和切割试剂。
还原剂
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括至少一种还原剂,该还原剂包含DTT(二硫苏糖醇)、2-β巯基乙醇、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、甲酰胺、DMSO(二甲亚砜)、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、谷胱甘肽、甲硫氨酸或甜菜碱、三(3-羟丙基)膦(THPP)和/或N-乙酰半胱氨酸。在一些实施方案中,试剂可以包括浓度为约0.1-0.5M、或约0.5-1M、或约1-2M的还原剂。在一些实施方案中,试剂可以包括浓度为约0.1-1mM、或约1-2.5mM、或约2.5-5mM、或约5-7.5mM、或约7.5-9mM、或约9-12mM的还原剂。试剂可以包括浓度为约0.01-0.1mM、或约0.1-1mM、或约1-2.5mM、或约2.5-5mM、或约5-7.5mM、或约7.5-9mM、或约9-12mM、或约12-25mM、或约25-50mM的还原剂。
可以包括还原剂的试剂包括第一扩增试剂、第二扩增试剂、洗脱试剂、捕获试剂、捕获后试剂、成像试剂、步进试剂和切割试剂。
黏度剂
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括黏度剂,该黏度剂包含糖类,诸如海藻糖、蔗糖、纤维素、木糖醇、甘露醇、山梨醇或肌醇。在一些实施方案中,黏度剂包含甘油或二醇化合物,诸如乙二醇或丙二醇。在一些实施方案中,试剂可以包括浓度为基于体积的约0.1%-1%、或约1%-5%、或约5%-10%、或约10%-15%的黏度剂。在一些实施方案中,试剂可以包括浓度为约1-50mM、或约50-100mM、或约100-150mM、或约150-200mM的黏度剂。在一些实施方案中,试剂可以包括浓度为约0.1-0.5M、或约0.5-1M、或约1-2M、或约2-3M、或约3-5M的黏度剂。
可以包括至少一种溶剂的试剂包括第一扩增试剂、第二扩增试剂、捕获试剂、捕获后试剂、成像试剂和步进试剂。
离液剂
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括离液剂,该离液剂可以破坏非共价键,诸如氢键或范德华力。在一些实施方案中,离液剂包含SDS(十二烷基硫酸钠)、脲、硫脲、氯化胍、盐酸胍、硫氰酸胍、羟乙基磺酸胍、硫氰酸钾、氯化锂、碘化钠或高氯酸钠。在一些实施方案中,试剂可以包括浓度为约0.1-1M、或约1-2M、或约2-3M、或约3-4M、或约4-5M的离液剂。
可以包括至少一种离液剂的试剂包括核酸杂交试剂和洗脱试剂。
螯合剂
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括螯合剂,该螯合剂通过螯合、配位或共价键结合金属离子。在一些实施方案中,螯合剂包含EDTA(乙二胺四乙酸)、EGTA(乙二醇四乙酸)、HEDTA(羟乙基乙二胺三乙酸)、DPTA(二亚乙基三胺五乙酸)、NTA(N,N-双(羧甲基)甘氨酸)、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、二柠檬酸铵、柠檬酸、柠檬酸钾或柠檬酸镁。在一些实施方案中,杂交区包含浓度为约0.01-50mM、或约0.1-20mM、或约0.2-10mM的螯合剂。
可以包括至少一种螯合剂的试剂包括通用洗涤试剂、洗脱试剂、捕获试剂、捕获后试剂和成像试剂。
两性离子
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括两性离子源。在一些实施方案中,两性离子包含阳离子两性离子化合物,诸如甜菜碱,包括N,N,N-三甲基甘氨酸和椰油酰胺丙基甜菜碱。在一些实施方案中,两性离子包含包括卵清蛋白的类蛋白和来源于牛、马或人的血清白蛋白。在一些实施方案中,试剂可以包括浓度为约0.1-0.5M、或约0.5-1M、或约1-2M的两性离子。
可以包括至少一种两性离子源的试剂包括第一扩增试剂和第二扩增试剂。
糖醇
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括糖醇,该糖醇包含蔗糖、海藻糖、麦芽糖、鼠李糖、阿拉伯糖、岩藻糖、甘露醇、山梨醇或阿东糖醇。在一些实施方案中,试剂可以包括浓度为约1-50mM、或约50-100mM、或约100-150mM、或约150-200mM的糖醇。在一些实施方案中,试剂可以包括浓度为约0.1-0.5M、或约0.5-1M、或约1-2M、或约2-3M、或约3-5M的糖醇剂。
可以包括至少一种糖醇的试剂包括第一扩增试剂、第二扩增试剂、捕获试剂、捕获后试剂、成像试剂和步进试剂。
拥挤剂
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括拥挤剂,该拥挤剂增加分子拥挤。在一些实施方案中,拥挤剂包含聚乙二醇(PEG,例如,1-50K分子量)、右旋糖酐、硫酸右旋糖酐、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟乙基甲基纤维素(HEMC)、羟丁基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和羟甲基纤维素。在一些实施方案中,拥挤剂可以以基于杂交试剂总体积的约1%-10%、或约10%-25%、或约25%-50%、或更高的体积百分比存在于杂交试剂中。
可以包括至少一种拥挤剂的试剂包括核酸杂交试剂、第一扩增试剂和第二扩增试剂。
扩增聚合酶
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括扩增聚合酶。在一些实施方案中,扩增聚合酶具有链置换活性。在一些实施方案中,扩增聚合酶包含phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶的大片段、Bsu DNA聚合酶的大片段和Bca(exo-)DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段、T5聚合酶、M-MuLV逆转录酶、HIV病毒逆转录酶或Deep Vent DNA聚合酶。在一些实施方案中,phi29DNA聚合酶可以是野生型phi29 DNA聚合酶(例如,来自Expedeon的MagniPhi)、变体EquiPhi29 DNA聚合酶(例如,来自Thermo FisherScientific),或嵌合型QualiPhi DNA聚合酶(例如,来自4basebio)。在一些实施方案中,试剂可以包括浓度为约10-50nM、或约50-100nM、或约100-150nM、或约150-200nM、或约200-250nM的扩增聚合酶。
可以包括至少一种扩增聚合酶的试剂包括第一扩增试剂和/或第二扩增试剂。
缩合寡核苷酸
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括缩合寡核苷酸。在一些实施方案中,缩合寡核苷酸包含单链DNA。在一些实施方案中,缩合寡核苷酸包含三个区域:结合可操作地连接至模板分子的第一衔接子序列的一部分的5’区、不结合模板分子的一部分或衔接子序列的内部区,和结合可操作地连接至模板分子的第二衔接子序列的一部分的3’区。在一些实施方案中,缩合寡核苷酸的长度可以为20-150个核苷酸。在一些实施方案中,缩合寡核苷酸的3’末端是不可延伸的。在一些实施方案中,缩合寡核苷酸的3’端可以包括至少一个双脱氧核苷酸、至少一个2’O-甲基RNA碱基或反向dT。在一些实施方案中,缩合寡核苷酸包括增加缩合寡核苷酸刚性的部分。在一些实施方案中,缩合寡核苷酸包含增加刚性的内部PEG部分。在一些实施方案中,试剂可以包括浓度为约1-10nm、或约10-50nM、或约50-100nM、或约100-150nM、或约150-200nM的缩合寡核苷酸。
可以包括多个缩合寡核苷酸的试剂包括第一扩增试剂和/或第二扩增试剂。
非催化二价阳离子
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括非催化二价阳离子。在一些实施方案中,非催化二价阳离子可以促进三元复合体的形成。在一些实施方案中,非催化二价阳离子可以在聚合酶存在下促进互补核苷酸(例如,游离核苷酸)或互补核苷酸单元(例如,多价分子的互补核苷酸单元)与引物的3’端结合,该引物与模板分子杂交。在一些实施方案中,非催化二价阳离子不促进核苷酸或核苷酸单元聚合酶催化掺入引物中。在一些实施方案中,非催化二价阳离子包含锶、钡、钪、钛、钙、钒、铬、铁、钴、镍、铜、锌、镓、锗、砷、硒、铑、铕、锡或铽离子。在一些实施方案中,非催化二价阳离子可以以氯化锶、乙酸锶或氯化镍的形式提供。在一些实施方案中,捕获试剂、捕获后试剂和成像试剂包括浓度为约0.1-50mM、约1-25mM或约5-10mM的非催化二价阳离子。
可以包括至少一种非催化二价阳离子的试剂包括捕获试剂、捕获后试剂和成像试剂。
催化二价阳离子
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括催化二价阳离子。在一些实施方案中,催化二价阳离子可以促进三元复合体的形成。在一些实施方案中,催化二价阳离子可以在聚合酶存在下促进互补核苷酸(例如,游离核苷酸)或互补核苷酸单元(例如,多价分子的互补核苷酸单元)与引物的3’端结合,该引物与模板分子杂交。在一些实施方案中,催化二价阳离子促进核苷酸或核苷酸单元聚合酶催化掺入引物中。在一些实施方案中,催化二价阳离子包含镁和锰。在一些实施方案中,催化二价阳离子可以以约0.1-50mM、或约1-25mM、或约5-10mM的浓度存在于试剂中。
可以包括至少一种催化二价阳离子的试剂包括第一扩增试剂、第二扩增试剂、步进试剂和切割试剂。
多价分子
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括多个多价分子。在一些实施方案中,多价分子包含多个核苷酸臂,该核苷酸臂附接至核心并具有任意构型,包括星芒构型、混乱构型或瓶刷构型(例如,图2B)。在一些实施方案中,多个多价分子中的单个多价分子包含:(1)核心,和(2)多个核苷酸臂,其包含(i)核心附接部分、(ii)包含PEG部分的间隔区、(iii)接头和(iv)核苷酸单元,例如,参见图2A至2D。
在一些实施方案中,多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心。在一些实施方案中,间隔区附接至接头,其中接头附接至核苷酸单元。例如,参见图2A和2B。
在一些实施方案中,多价分子包含可以是亲和素样部分的核心,并且核心附接部分可以是生物素部分。在一些实施方案中,亲和素样部分包含链霉亲和素、N-酰基亲和素,例如,N-乙酰基亲和素、N-邻苯二甲酰基亲和素或N-琥珀酰基亲和素。在一些实施方案中,亲和素样部分包含市售产品,诸如ExtrAvidinTM、CaptavidinTM、NeutravidinTM或Neutralite AvidinTM。
在一些实施方案中,核苷酸单元包含碱基、五碳糖(例如,核糖)和至少一个磷酸基团。在一些实施方案中,接头通过碱基附接至核苷酸单元。在一些实施方案中,接头包含具有2-6个亚基的脂族链或具有2-6个亚基的低聚乙二醇链,并且任选地,接头包括芳族部分(例如,参见图2A和2B)。在一些实施方案中,多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心,并且其中多个核苷酸臂具有相同类型的核苷酸单元,该核苷酸单元选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。在一些实施方案中,多个多价分子包含具有两种或更多种不同类型的核苷酸的多价分子的混合物,该核苷酸选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。在一些实施方案中,多个多价分子包含具有三种或更多种不同类型的核苷酸的多价分子的混合物,该核苷酸选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。在一些实施方案中,多个多价分子包含具有四种或更多种不同类型的核苷酸的多价分子的混合物,该核苷酸选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。在一些实施方案中,该混合物包含多个第一种类型的多价分子,每个第一种类型的多价分子具有一种类型的核苷酸单元,该核苷酸单元选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。在一些实施方案中,该混合物还包含多个第二种类型的多价分子,每个第二种类型的多价分子具有不同类型的核苷酸单元,该核苷酸单元选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP,其不同于第一多个多价分子中的第一种类型的核苷酸单元。
在一些实施方案中,多价分子中的至少一个用可检测的报告部分标记。在一些实施方案中,标记的多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心,其中该核心用可检测的报告部分标记,或至少一个核苷酸单元用可检测的报告部分标记。在一些实施方案中,可检测的报告部分可以是荧光团。在一些实施方案中,附接至多价分子的荧光团对应于核苷酸单元的碱基,以允许区分不同荧光标记的多价分子的核苷酸碱基单元。在一些实施方案中,荧光标记的多价分子包含附接至荧光团的核心或核苷酸碱基,其中荧光团对应于核苷酸单元的碱基,以允许区分哪个核苷酸碱基与三元复合体中的测序聚合酶结合。
在一些实施方案中,多价分子中的至少一个包含具有可切割部分的至少一个核苷酸臂。在一些实施方案中,多价分子包含1、2、3、4或更多个核苷酸臂,其中每个核苷酸臂包括可切割部分。在一些实施方案中,核苷酸臂中的可切割部分可以用可切割剂切割,以将核苷酸臂与核心分离。
在一些实施方案中,多价分子包含至少一个核苷酸臂,该核苷酸臂具有含可切割部分的接头,该可切割部分选自烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苄基、叠氮基、胺基、酰胺基、酮基、异氰酸酯基、磷酸基团、硫基、二硫化物基、碳酸酯基、脲基或甲硅烷基。
在一些实施方案中,接头中的可切割部分与化学试剂反应。在一些实施方案中,可切割部分烷基、烯基、炔基和烯丙基与四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)、哌啶或2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)反应。在一些实施方案中,可切割部分芳基和苄基与H2 Pd/C反应。在一些实施方案中,可切割部分胺、酰胺、酮、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物与膦或与硫醇基(包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT))反应。在一些实施方案中,可切割部分碳酸酯与碳酸钾(K2CO3)的MeOH溶液、三乙胺的吡啶溶液或Zn的乙酸(AcOH)溶液反应。在一些实施方案中,可切割部分脲和甲硅烷基与四丁基氟化铵、吡啶-HF、氟化铵或三乙胺三氟化氢反应。
在一些实施方案中,接头中的可切割部分包含叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基。在一些实施方案中,接头中的叠氮化物,叠氮基或叠氮甲基与化学剂反应。在一些实施方案中,化学剂包含膦化合物。在一些实施方案中,膦化合物包含衍生的三烷基膦部分或衍生的三芳基膦部分。在一些实施方案中,膦化合物包含三(2-羧乙基)膦(TCEP)或双磺基三苯基膦(BS-TPP)。
在一些实施方案中,多个多价分子中的至少一个包括链终止部分,其抑制后续核苷酸单元或游离核苷酸聚合酶催化掺入新生链中。在一些实施方案中,多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心,其中单个核苷酸臂包含在糖2’位置、在糖3’位置、或在糖2’和3’位置处具有链终止部分(例如,封闭部分)的核苷酸单元。在一些实施方案中,通过使多价分子与切割/去除链终止部分的化合物接触,可以从核苷酸单元去除链终止部分,以形成具有2’或3’可延伸基团的核苷酸单元。
在一些实施方案中,多价分子包含链终止部分,该链终止部分选自烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苄基、叠氮基、胺基、酰胺基、酮基、异氰酸酯基、磷酸基团、硫基、二硫化物基、碳酸酯基、脲基或甲硅烷基。
在一些实施方案中,多价分子包含链终止部分,该链终止部分包含3’-O-烷基羟氨基、3’-硫代磷酸酯基、3’-O-丙二酰基或3’-O-苄基。
在一些实施方案中,多价分子包含链终止部分,该链终止部分选自3’-脱氧核苷酸、2’,3’-二脱氧核苷酸、3’-甲基、3’-叠氮基、3’-叠氮甲基、3’-O-叠氮烷基、3’-O-乙炔基、3’-O-氨烷基、3’-O-氟烷基、3’-氟甲基、3’-二氟甲基、3’-三氟甲基、3’-磺酰基、3’-丙二酰基、3’-氨基、3’-O-氨基、3’-巯基、3’-氨甲基、3’-乙基、3’-丁基、3’-叔丁基、3’-芴甲氧羰基、3’-叔丁氧羰基、3’-O-烷基羟氨基、3’-硫代磷酸酯和3-O-苄基或其衍生物。在一些实施方案中,链终止部分包含叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基。
在一些实施方案中,多价分子包含链终止部分,该链终止部分可从核苷酸臂切割/去除,例如用化学化合物、光或热。在一些实施方案中,链终止部分包含烷基、烯基、炔基或烯丙基,其可用四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)、哌啶或2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)切割。在一些实施方案中,链终止部分包含可用Pd/C切割的芳基或苄基。在一些实施方案中,链终止部分包含胺基、酰胺基、酮基、异氰酸酯基、磷酸基团、硫基或二硫化物基,其可用膦或硫醇基(包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT))切割。在一些实施方案中,链终止部分包含碳酸酯基,其可用碳酸钾(K2CO3)的MeOH溶液、三乙胺的吡啶溶液或Zn的乙酸(AcOH)溶液切割。在一些实施方案中,链终止部分包含脲基或甲硅烷基,其可用四丁基氟化铵、吡啶-HF、氟化铵或三乙胺三氟化氢切割。在一些实施方案中,链终止部分是叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基,其可用膦化合物切割。在一些实施方案中,膦化合物包含衍生的三烷基膦部分或衍生的三芳基膦部分。在一些实施方案中,膦化合物包含三(2-羧乙基)膦(TCEP)或双磺基三苯基膦(BS-TPP)。
试剂可以包括浓度为约1-25nM、或约25-50nM、或约50-75nM、或约75-100nM的多价分子。可以包括至少一个或多个多价分子的试剂包括捕获试剂和/或捕获后试剂。
第一和第二测序聚合酶
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括第一或第二测序聚合酶。在一些实施方案中,第一和第二测序聚合酶包含重组突变型DNA聚合酶,其与野生型聚合酶相比表现出核苷酸类似物的错配减少和/或错掺率降低(例如,保真度提高)。在一些实施方案中,突变型聚合酶包含衍生自重组工程化新B-家族和A-家族聚合酶的多肽或其片段,其中突变型聚合酶表现出特异性的改善,同时维持对正确的沃森-克里克碱基配对的高辨别力,这产生了极高的保真度。
在一些实施方案中,第一和第二测序聚合酶包含衍生自来自Candidatusaltiarchaeales古细菌的野生型聚合酶的重组突变型聚合酶,其中突变型聚合酶在约45-75℃的温度范围下表现出核苷酸结合和掺入活性。在一些实施方案中,工程化Candidatusaltiarchaeales古细菌聚合酶在约65-75℃的温度范围下表现出最佳的核苷酸结合和掺入活性。在一些实施方案中,Candidatus altiarchaeales古细菌聚合酶是中等热稳定性聚合酶(例如,中温聚合酶)。在一些实施方案中,具有含一个或多个突变的Candidatusaltiarchaeales古细菌序列主链的工程化聚合酶可以用于在约45-75℃、或约50-65℃、或约50-60℃的温度范围下进行核苷酸结合、核苷酸掺入和/或核酸测序反应。
在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含具有来自CandidatusAltiarchaeales古细菌的DNA聚合酶的氨基酸序列主链的DNA聚合酶。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含与SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中突变型DNA聚合酶在选自Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567的一个或多个位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含(i)选自Leu416Ser、Leu416Phe和Leu416Tyr的氨基酸取代;以及(ii)Tyr417Ala、Pro418Gly、Ala493Ser、Ile529His、Arg515Leu和Asn567Asp的氨基酸取代。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:1。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:2、3、4或5中的任一者。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含SEQ ID NO:2、3、4或5中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含来自9°N的DNA聚合酶,其包含SEQ ID NO:6、7或8的氨基酸序列。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型9°N聚合酶,该聚合酶具有来自9°N的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:6、7或8),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:6、7或8中的任一者。
在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列(Vent聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Vent聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:9),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID No:9。
在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列(Deep Vent聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Deep Vent聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQID NO:10),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:10。
在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列(Pfu聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Pfu聚合酶,该聚合酶具有来自Pfu的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:11),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:11。
在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含SEQ IDNO:12的氨基酸序列(深海火球菌聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型深海火球菌聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:12),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置等同,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。在一些实施方案中,本文所述的突变位置参照SEQ ID NO:12。
在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶中的任一个可以用至少一个可检测的报告部分(例如,荧光团)标记。
在一些实施方案中,第一测序聚合酶能够结合多价分子的互补核苷酸单元和核酸双链体,以形成三元复合体。
在一些实施方案中,第二测序聚合酶结合互补核苷酸和核酸双链体,以形成三元复合体。第二聚合酶还能够催化互补核苷酸的掺入。
用于用多价分子和核苷酸测序的合适的第一和/或第二测序聚合酶的示例包括但不限于:Klenow DNA聚合酶;水生栖热菌(Thermus aquaticus)DNA聚合酶I(Taq聚合酶);KlenTaq聚合酶;Candidatus altiarchaeales古细菌;Candidatus HadarchaeumYellowstonense;Hadesarchaea古细菌;广古菌门(Euryarchaeota)古细菌;热原体纲(Thermoplasmata)古细菌;热球菌属(Thermococcus)聚合酶,诸如海岸热球菌(Thermococcus litoralis)、噬菌体T7 DNA聚合酶;人α、δ和εDNA聚合酶;噬菌体聚合酶,诸如T4、RB69和phi29噬菌体DNA聚合酶;激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶(Pfu聚合酶);枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DNA聚合酶III;大肠杆菌DNA聚合酶IIIα和ε;9°N聚合酶;逆转录酶,诸如HIV M型或O型逆转录酶;禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶;莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶;或端粒酶。DNA聚合酶的进一步非限制性示例包括来源于各种古细菌属的那些,诸如,气火菌属(Aeropyrum)、古生球菌属(Archaeglobus)、除硫球菌属(Desulfurococcus)、火棒菌属(Pyrobaculum)、火球菌属(Pyrococcus)、火叶菌属(Pyrolobus)、火网菌属(Pyrodictium)、葡萄嗜热菌属(Staphylothermus)、斯特氏菌属(Stetteria)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、热球菌属和火山鬃菌属(Vulcanisaeta)等或其变体,包括本领域已知的聚合酶,例如9°N、VENT、DEEP VENT、THERMINATOR、Pfu、KOD、Pfx、Tgo和RB69聚合酶。
试剂可以包括浓度为约1-50nM、或约50-100nM、或约100-150nM、或约150-200nM、或约200-250nM的第一或第二聚合酶。可以包括第一测序聚合酶或第二测序聚合酶的试剂包括捕获试剂、捕获后试剂和步进试剂。
在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含具有来自Candidatusaltiarchaeales古细菌的DNA聚合酶的氨基酸序列主链的重组野生型或突变型DNA聚合酶。第一和/或第二测序聚合酶包含与SEQ ID NO:221具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中突变型DNA聚合酶在选自Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567的一个或多个位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含(i)选自Leu416Ser、Leu416Phe和Leu416Tyr的氨基酸取代;以及(ii)Tyr417Ala、Pro418Gly、Ala493Ser、Ile529His、Arg515Leu和Asn567Asp的氨基酸取代。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含SEQ ID NO:221-225中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含来自9°N的DNA聚合酶,其包含与SEQ ID NO:226或227具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型9°N聚合酶,该聚合酶具有来自9°N的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:226或227),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置是位置等同的,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。
在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含与SEQ IDNO:229具有至少80%同一性的氨基酸序列(Vent聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Vent聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:229),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置是位置等同的,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。
在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含与SEQ IDNO:230具有至少80%同一性的氨基酸序列(Deep Vent聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Deep Vent聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:230),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置是位置等同的,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。
在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含与SEQ IDNO:231具有至少80%同一性的氨基酸序列(Pfu聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型Pfu聚合酶,该聚合酶具有来自Pfu的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:231),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置是位置等同的,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。
在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含DNA聚合酶,其包含与SEQ IDNO:232具有至少80%同一性的氨基酸序列(深海火球菌聚合酶)。在一些实施方案中,第一和/或第二测序聚合酶包含突变型深海火球菌聚合酶,该聚合酶具有来自Vent的聚合酶的主链氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:232),其突变位置与来自Candidatus Altiarchaeales古细菌的突变型聚合酶中的氨基酸位置是位置等同的,例如,Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567位置处的一个或多个突变。
核苷酸
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括多个核苷酸。在一些实施方案中,核苷酸包括天然核苷酸和核苷酸类似物。在一些实施方案中,核苷酸包含芳族碱基、五碳糖(例如,核糖或脱氧核糖)和至少一个磷酸基团。在一些实施方案中,多个核苷酸包含选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP的两种或更多种不同类型的核苷酸的混合物。在一些实施方案中,多个核苷酸包含选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP的三种或更多种不同类型的核苷酸的混合物。在一些实施方案中,多个核苷酸包含选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP的四种或更多种不同类型的核苷酸的混合物。
在一些实施方案中,核苷酸可以缺乏链终止部分,或者可以附接至链终止部分。在一些实施方案中,链终止部分(例如,封闭部分)可以附接至糖2’位置、糖3’位置或糖2’和3’位置。
在一些实施方案中,链终止部分选自烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苄基、叠氮基、胺基、酰胺基、酮基、异氰酸酯基、磷酸基团、硫基、二硫化物基、碳酸酯基、脲基或甲硅烷基。
在一些实施方案中,链终止部分包含3’-O-烷基羟氨基、3’-硫代磷酸酯基、3’-O-丙二酰基或3’-O-苄基。
在一些实施方案中,链终止部分选自3’-脱氧核苷酸、2’,3’-二脱氧核苷酸、3’-甲基、3’-叠氮基、3’-叠氮甲基、3’-O-叠氮烷基、3’-O-乙炔基、3’-O-氨烷基、3’-O-氟烷基、3’-氟甲基、3’-二氟甲基、3’-三氟甲基、3’-磺酰基、3’-丙二酰基、3’-氨基、3’-O-氨基、3’-巯基、3’-氨甲基、3’-乙基、3’-丁基、3’-叔丁基、3’-芴甲氧羰基、3’-叔丁氧羰基、3’-O-烷基羟氨基、3’-硫代磷酸酯和3-O-苄基或其衍生物。在一些实施方案中,链终止部分包含叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基。
在一些实施方案中,链终止部分可从核苷酸切割/去除,例如用化学化合物、光或热。在一些实施方案中,链终止部分包含烷基、烯基、炔基或烯丙基,其可用四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)、哌啶或2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)切割。在一些实施方案中,链终止部分包含芳基或苄基,其可用Pd/C切割。在一些实施方案中,链终止部分包含胺基、酰胺基、酮基、异氰酸酯基、磷酸基团、硫基或二硫化物基,其可用膦或硫醇基(包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT))切割。在一些实施方案中,链终止部分包含碳酸酯基,其可用碳酸钾(K2CO3)MeOH溶液、三乙胺吡啶溶液或Zn乙酸(AcOH)溶液切割。在一些实施方案中,链终止部分包含脲基或甲硅烷基,其可用四丁基氟化铵、吡啶-HF、氟化铵或三乙胺三氟化氢切割。在一些实施方案中,链终止部分是叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基,其可用膦化合物切割。在一些实施方案中,膦化合物包含衍生的三烷基膦部分或衍生的三芳基膦部分。在一些实施方案中,膦化合物包含三(2-羧乙基)膦(TCEP)或双磺基三苯基膦(BS-TPP)。
在一些实施方案中,核苷酸可以是未标记的,或者可以附接至可检测的报告部分。可检测的报告部分可以是荧光团。在一些实施方案中,标记的核苷酸包含可检测部分(例如,荧光团),该可检测部分经由可切割接头附接至核苷酸的碱基,该可切割接头将碱基连接至荧光团。在一些实施方案中,附接至核苷酸的荧光团对应于核苷酸的碱基,以允许区分不同荧光标记的核苷酸的核苷酸碱基。
在一些实施方案中,核苷酸上的可切割接头包含可切割部分,其选自烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苄基、叠氮基、胺基、酰胺基、酮基、异氰酸酯基、磷酸基团、硫基、二硫化物基、碳酸酯基、脲基或甲硅烷基。
在一些实施方案中,可切割接头中的可切割部分与化学试剂反应。例如,可切割部分烷基、烯基、炔基和烯丙基与四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)、哌啶或2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)反应。在一些实施方案中,可切割部分芳基和苄基与H2 Pd/C反应。在一些实施方案中,可切割部分胺、酰胺、酮、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物与膦或与硫醇基(包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT))反应。在一些实施方案中,可切割部分碳酸酯与碳酸钾(K2CO3)的MeOH溶液、三乙胺的吡啶溶液或Zn的乙酸(AcOH)溶液反应。在一些实施方案中,可切割部分脲和甲硅烷基与四丁基氟化铵、吡啶-HF、氟化铵或三乙胺三氟化氢反应。
在一些实施方案中,可切割接头中的可切割部分包含叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基。在一些实施方案中,叠氮化物、叠氮基或叠氮甲基与化学剂反应/可用化学剂切割。在一些实施方案中,化学剂包含膦化合物。在一些实施方案中,膦化合物包含衍生的三烷基膦部分或衍生的三芳基膦部分。在一些实施方案中,膦化合物包含三(2-羧乙基)膦(TCEP)或双磺基三苯基膦(BS-TPP)。
在一些实施方案中,核苷酸可以以约0.1-100uM、或约0.1-1uM、或约1-10uM、或约10-20uM、或约20-30uM、或约30-40uM、或约40-50uM的浓度包括在试剂中。
可以包括至少一个或多个核苷酸的试剂包括第一扩增试剂、第二扩增试剂和步进试剂。
用于减少光损伤的化合物
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括用于减少光损伤的一种或多种化合物。在一些实施方案中,可以减少光损伤的化合物包括抗氧化剂、三线态猝灭剂、单线态氧猝灭剂、氧清除剂、电子清除剂、防褪色制剂。这些化合物中的一些可以分类为超过一种类型的减少光损伤的化合物。在一些实施方案中,可以减少光损伤的化合物包括化学化合物或酶。
在一些实施方案中,抗氧化剂包括抗坏血酸或其衍生物、抗坏血酸棕榈酸酯、D-异抗坏血酸(异抗坏血酸)、抗坏血酸钠、丁基羟基甲苯(BTH)、丁基羟基甲苯(BHT)、多酚抗氧化剂、聚乙烯醇、丁基羟基茴香醚(BHA)、Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸)或其他维生素E类似物,包括硝化和硝基烯Trolox衍生物(参见美国专利号9,994,541,其全部内容通过引用明确地整体并入)。
在一些实施方案中,Trolox包含Trolox醌或Trolox氢醌。在一些实施方案中,成像试剂包含已经历老化过程的Trolox。
在一些实施方案中,抗氧化剂包含水溶性化合物,包括抗坏血酸、柠檬酸、香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、绿原酸、芥子酸、鞣花酸、没食子酸、龙胆酸、水杨酸、香草酸、Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸)和Trolox的硝基烯衍生物。在一些实施方案中,没食子酸包含具有1、2或3个磺酸基团的磺化形式。
抗坏血酸包括L-异构体和D-异构体以及L-和D-异构体的混合物,以及外消旋混合物。在一些实施方案中,抗坏血酸包含盐,例如L-抗坏血酸钠。在一些实施方案中,抗坏血酸包含脱氢抗坏血酸(DHA)。在一些实施方案中,包括抗坏血酸盐及其类似物和衍生物。在一些实施方案中,衍生物包括具有酯化的5-羟基和/或6-羟基的抗坏血酸盐。在一些实施方案中,衍生物包括其中5-和/或6-羟基被卤素或氨基取代的抗坏血酸盐。在一些实施方案中,衍生物包括其中5-和/或6-羟基缺乏羟基(例如氢原子取代羟基)的抗坏血酸盐。在一些实施方案中,抗坏血酸盐衍生物包括5-脱氧-L-抗坏血酸盐、6-溴-6-脱氧-L-抗坏血酸盐、6-氨基-6-脱氧-L-抗坏血酸盐、L-抗坏血酸6-羧酸盐、6-O-甲苯磺酰基-L-抗坏血酸盐和6-O-抗坏血酸链烷酸酯,诸如6-抗坏血酸棕榈酸酯(棕榈酰抗坏血酸盐)。
在一些实施方案中,三线态猝灭剂包括抗坏血酸、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)、1,3,5,7,环辛四烯(COT)、二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙胺(MEA)、β-巯基乙醇(BME)、没食子酸正丙酯、对苯二胺(PPD)、氢醌、叠氮化钠(NaN3)、TEMPO(2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基)、HTEMPO(TEMPO的4-羟基衍生物)、DTBN(二叔丁基硝基氧)或3-硝基苯甲酸(NBA)。
在一些实施方案中,单线态氧猝灭剂包括基于硫醇的猝灭剂,诸如谷胱甘肽、二硫苏糖醇、麦角硫因、甲硫氨酸、半胱氨酸、β-二甲基半胱氨酸(青霉胺)、巯基丙酰甘氨酸、MESNA、咪唑或N-乙酰半胱氨酸和卡托普利(captopril)。
在一些实施方案中,氧清除剂包括谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、肼(N2H4)、亚硫酸钠(Na2SO3)、羟胺和半胱胺。
在一些实施方案中,电子清除剂包括甲基紫精(例如,1,1’-二甲基-4,4’-联吡啶二氯化物)。
在一些实施方案中,防褪色制剂包括市售产品,包括Fluoroguard防褪色试剂(例如,来自BioRad)、SlowFade防褪色试剂盒(例如,包括DABCO,来自Molecular Probes-Invitrogen)、ProLong Gold防褪色试剂(例如,来自Invitrogen)和CitiFluor(例如,来自CitiFluor)。
试剂可以以约0.1-1mM、或约1-10mM、或约10-25mM、或约25-50mM、或约50-75mM、或约75-100mM的浓度包括用于减少光损伤的化合物中的至少一种。可以包括用于减少光损伤的至少一种化合物的试剂包括成像试剂。
切割剂和切割催化剂
在一些实施方案中,本文所述试剂中的任一种可以包括切割剂和/或切割催化剂。
在一些实施方案中,可以选择切割剂和/或切割催化剂以与荧光标记的核苷酸反应。在一些实施方案中,切割剂和/或切割催化剂可以切割/去除连接核苷酸碱基和荧光团的可切割接头,从而从核苷酸上去除荧光团标记。
在一些实施方案中,可以选择切割剂和/或切割催化剂以与链终止核苷酸反应。在一些实施方案中,切割剂和/或切割催化剂可以切割/去除附接至核苷酸的2’或3’糖位置的链终止部分。在一些实施方案中,切割剂和/或切割催化剂可以从2’或3’糖位置切割/去除链终止部分,以转化为具有可延伸的3’OH糖基团的核苷酸。
在一些实施方案中,切割剂包含哌啶、2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)或四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)与哌啶。
在一些实施方案中,切割剂包含钯催化剂,例如钯碳(Pd/C)。
在一些实施方案中,切割剂包含β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)。
在一些实施方案中,切割剂包含碳酸钾(K2CO3)的MeOH溶液、三乙胺的吡啶溶液或Zn的乙酸(AcOH)溶液。
在一些实施方案中,切割剂包含四丁基氟化铵、吡啶-HF、氟化铵或三乙胺三氟化氢。
在一些实施方案中,切割剂包含膦化合物,包括例如具有衍生的三烷基膦部分或衍生的三芳基膦部分的膦。在一些实施方案中,膦切割化合物包含三(2-羧乙基)膦(TCEP)或双磺基三苯基膦(BS-TPP)。在一些实施方案中,膦切割化合物包含三(羟丙基)膦(THPP)。在一些实施方案中,膦切割化合物包含三(羟甲基)膦(THMP)。
在一些实施方案中,切割剂包含乙醇胺(也称为2-氨基乙醇)。
在一些实施方案中,切割催化剂包含4-二甲氨基吡啶(4-DMAP)。
在一些实施方案中,试剂可以包括浓度为约1-10mM、或约10-25mM、或约25-50mM、或约50-75mM、或约75-100mM、或约100-150mM、或约150-200mM的切割剂和/或切割催化剂。试剂可以包括pH为约7-9.5或约8-9的切割剂。可以包括至少一种切割剂的试剂包括切割试剂。
在一些实施方案中,切割剂可以配制为包括盐,例如NaCl和/或MgCl2。切割剂可以包括浓度为约1-25mM、或约25-100mM、或约100-250mM、或约250-400mM、或约400-500mM的至少一种盐。
支持物上的亲水性聚合物涂层
在一些实施方案中,本文所述的亲水性聚合物涂层能够改善核酸杂交和扩增性能。在一些实施方案中,支持物可包括基质(或支持物结构)、一层或多层共价或非共价附接的低结合性化学修饰层(例如,硅烷层)、聚合物膜,和/或一种或多种共价附接或非共价附接的引物序列,其可用于将单链靶核酸拴系于支持物表面。在一些实施方案中,表面的配方(例如,一层或多层的化学组成)、用于使一层或多层与支持物表面交联和/或彼此交联的偶联化学以及层的总数可以变化,使得蛋白质、核酸分子和其他杂交和扩增反应组分与支持物表面的非特异性结合相对于可比较的单层被最小化或减少。在一些实施方案中,可改变表面的配方,使得支持物表面上的非特异性杂交相对于可比较的单层被最小化或减少。在一些实施方案中,可改变表面的配方,使得支持物表面上的非特异性扩增相对于可比较的单层被最小化或减少。在一些实施方案中,可改变表面的配方,使得支持物表面上的特异性扩增速率和/或产率最大化。在一些实施方案中,在不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30个或超过30个扩增循环中实现适于检测的扩增水平。
在一些实施方案中,包括一个或多个化学修饰层(例如,低非特异性结合聚合物层)的基质或支持物结构可以是独立的或集成至另一结构或组件中。在一些实施方案中,基质或支持物结构可包括集成或组装的微流体流动池内的一个或多个表面。在一些实施方案中,基质或支持物结构可包括微板形式内的一个或多个表面,例如,微板中的孔的底表面。在一些实施方案中,基质或支持物结构包括毛细管的内表面(例如,内腔表面)。在一些实施方案中,基质或支持物结构包括蚀刻至平面芯片中的毛细管的内表面(例如,内腔表面)。
在一些实施方案中,用于将第一化学修饰层接枝至表面上的附接化学可取决于制造表面的材料和层的化学性质。在一些实施方案中,第一层可共价附接至表面。在一些实施方案中,第一层可以非共价附接,例如,通过表面和第一层分子组分之间的非共价相互作用(诸如静电相互作用、氢键或范德华相互作用)吸附至表面。在一些实施方案中,可在附接或沉积第一层之前处理基质表面。可使用各种表面处理技术来清洁或处理表面。例如,玻璃或硅表面可使用食人鱼(Piranha)溶液(硫酸(H2SO4)和过氧化氢(H2O2)的混合物)进行酸洗,在KOH和NaOH中进行碱处理,和/或使用氧等离子体处理方法进行清洁。
在一些实施方案中,硅烷化学可以共价修饰玻璃或硅表面上的硅烷醇基团,以附接更多的反应性官能团(例如,胺或羧基),其然后可用于将接头分子(例如,各种长度的线性烃分子,诸如C6、C12、C18烃,或线性聚乙二醇(PEG)分子)或层分子(例如,支链PEG分子或其他聚合物)偶联至表面。在一些实施方案中,可用于产生低结合表面中的任一种的硅烷包括但不限于(3-氨丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)中的任一种、各种PEG-硅烷(例如,包含至少1K、至少2K、至少5K、至少10K、至少20K等的分子量)、氨基-PEG硅烷(即,包含游离氨基官能团)、马来酰亚胺-PEG硅烷、生物素-PEG硅烷等中的任一种。
包括但不限于氨基酸、肽、核苷酸、寡核苷酸、其他单体或聚合物或其组合中的任一种的各种分子可用于在表面上产生一个或多个化学修饰层。在一些实施方案中,可改变所用组分的选择,以改变表面的一种或多种性质,例如,官能团和/或拴系寡核苷酸引物的表面密度、表面的亲水性/疏水性,或表面的三维性质(例如,“厚度”)。在一些实施方案中,聚合物可用于在表面上产生一层或多层低非特异性结合材料。在一些实施方案中,聚合物可以是但不限于各种分子量和支链结构的聚乙二醇(PEG)、链霉亲和素、聚丙烯酰胺、聚酯、右旋糖酐、聚赖氨酸和聚赖氨酸共聚物中的任一种或其任何组合。在一些实施方案中,缀合化学可用于将一层或多层材料接枝至表面和/或交联层。在一些实施方案中,可使用的缀合化学包括但不限于生物素-链霉亲和素相互作用(或其变体)、His标签-Ni/NTA缀合化学、甲氧基醚缀合化学、羧酸酯缀合化学、胺缀合化学、NHS酯、马来酰亚胺、硫醇、环氧树脂、叠氮化物、酰肼、炔烃、异氰酸酯或硅烷中的任一种。
在一些实施方案中,低非特异性结合表面涂层可以均匀地施加在整个基质上。在一些实施方案中,表面涂层可被图案化,使得化学修饰层被限制在基质的一个或多个离散区域。在一些实施方案中,可使用光刻技术图案化表面,以在表面上产生化学修饰区域的有序阵列或随机图案。在一些实施方案中,可使用例如接触印刷和/或喷墨印刷技术图案化基质表面。在一些实施方案中,化学修饰区域的有序阵列或随机图案可包含至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000或更多个离散区域。
在一些实施方案中,为了获得低非特异性结合表面,可将亲水性聚合物非特异性吸附或共价接枝至表面。在一些实施方案中,利用聚(乙二醇)(PEG,也称为聚乙烯氧化物(PEO)或聚氧化乙烯)或具有不同分子量和端基的其他亲水性聚合物(其使用例如硅烷化学连接至表面)进行钝化。在一些实施方案中,远离表面的端基可以包括但不限于生物素、甲氧基醚、羧酸酯、胺、NHS酯、马来酰亚胺和双硅烷。在一些实施方案中,可在表面上沉积两层或更多层亲水性聚合物,例如,线性聚合物、支链聚合物或多支链聚合物。在一些实施方案中,两层或更多层可彼此共价偶联或内部交联,以改善所得表面的稳定性。在一些实施方案中,具有不同碱基序列和碱基修饰的寡核苷酸引物(或其他生物分子,例如,酶或抗体)可以以各种表面密度拴系于所得表面层。在一些实施方案中,例如,可改变表面官能团密度和寡核苷酸浓度,以靶向某一引物密度范围。在一些实施方案中,引物密度可以通过用携带相同官能团的其他分子稀释寡核苷酸来控制。在一些实施方案中,胺标记的寡核苷酸可以在与NHS-酯涂覆的表面反应中用胺标记的聚乙二醇稀释,以降低最终引物密度。在一些实施方案中,在杂交区域和表面附接官能团之间具有不同长度接头的引物也可以用于控制表面密度。在一些实施方案中,合适的接头包括引物5’端的聚-T和聚-A链(例如,0至20个碱基)、PEG接头(例如,3至20个单体单元)和碳链(例如,C6、C12、C18等)。在一些实施方案中,为了测量引物密度,可将荧光标记的引物拴系于表面,然后可将荧光读数与已知浓度的染料溶液的荧光读数进行比较。
在一些实施方案中,为了改变引物表面密度并增加亲水性或两性表面的额外维度,可使用包含PEG和其他亲水性聚合物的多层涂层的表面。在一些实施方案中,通过使用包括但不限于下述聚合物/共聚物材料中的任一种的亲水性和两性表面成层方法,表面上的引物负载密度可显著增加。传统的PEG涂层方法使用单层引物沉积,其通常被报告用于单分子应用,但对于核酸扩增应用不产生高拷贝数。如本文所述,“成层”可以使用与任何相容的聚合物或单体亚基的传统交联方法来实现,使得可以依次构建包含两个或更多个高度交联层的表面。在一些实施方案中,聚合物可包括但不限于链霉亲和素、聚丙烯酰胺、聚酯、右旋糖酐、聚赖氨酸或聚赖氨酸和PEG的共聚物中的任一种。在一些实施方案中,不同的层可通过多种缀合反应中的任一种彼此附接,该缀合反应包括但不限于生物素-链霉亲和素结合、叠氮化物-炔烃点击反应、胺-NHS酯反应、硫醇-马来酰亚胺反应以及带正电荷的聚合物与带负电荷的聚合物之间的离子相互作用。在一些实施方案中,高引物密度材料可在溶液中构建,随后在多个步骤中在表面上成层。
在一些实施方案中,本公开内容的低非特异性结合涂层表现出蛋白质、核酸和用于固相核酸扩增的杂交和/或扩增制剂的其他组分的非特异性结合减少。在一些实施方案中,可定性或定量评估给定支持物表面表现出的非特异性结合的程度。在一些实施方案中,在一组标准化条件下,将表面暴露于荧光染料(例如,花菁染料(诸如Cy3或Cy5等)、荧光素、香豆素、罗丹明等或本文公开的其他染料)、荧光标记的核苷酸、荧光标记的寡核苷酸和/或荧光标记的蛋白质(例如,聚合酶),随后进行指定的冲洗方案和荧光成像,可用作定性工具以比较包含不同表面配方的支持物上的非特异性结合。在一些实施方案中,在一组标准化条件下,将表面暴露于荧光染料、荧光标记的核苷酸、荧光标记的寡核苷酸和/或荧光标记的蛋白质(例如,聚合酶),随后进行指定的冲洗方案和荧光成像,可用作定量工具以比较在包括不同表面制剂的支持物上的非特异性结合,其条件是已经小心以确保荧光成像在荧光信号与支持物表面上的荧光团数量线性相关(或以可预测的方式相关)的条件下(例如,在荧光团的信号饱和和/或自猝灭不是问题的条件下)进行,并使用合适的校准标准。在一些实施方案中,可使用其他技术(例如,放射性同位素标记和计数方法)来定量评估本公开内容的不同支持物表面制剂表现出的非特异性结合的程度。
在一些实施方案中,表面表现出至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或大于100的荧光团(诸如Cy3)的特异性与非特异性结合的比率,或由本文范围涵盖的任何中间值。在一些实施方案中,表面表现出至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或大于100的荧光团(例如Cy3)的特异性与非特异性荧光的比率,或由本文范围涵盖的任何中间值。
在一些实施方案中,公开的低结合支持物表现出的非特异性结合程度可使用标准化方案来评估,该标准化方案使表面与标记的蛋白质(例如,牛血清白蛋白(BSA)、链霉亲和素、DNA聚合酶、逆转录酶、解旋酶、单链结合蛋白(SSB)等或其任何组合)、标记的核苷酸、标记的寡核苷酸等在一组标准化温育和冲洗条件下接触,随后检测保留在表面上的标记的量,并将由此产生的信号与适当的校准标准进行比较。在一些实施方案中,标记可包含荧光标记。在一些实施方案中,标记可包含放射性同位素。在一些实施方案中,标记可包含任何其他可检测的标记。在一些实施方案中,给定的支持物表面配方表现出的非特异性结合程度因此可根据每单位面积非特异性结合的蛋白质分子(或其他分子)的数量来评估。在一些实施方案中,本公开内容的低结合支持物可表现出小于0.001个分子/μm2、小于0.01个分子/μm2、小于0.1个分子/μm2、小于0.25个分子/μm2、小于0.5个分子/μm2、小于1个分子/μm2、小于10个分子/μm2、小于100个分子/μm2或小于1,000个分子/μm2的非特异性蛋白质结合(或其他指定分子(例如,花菁染料(诸如Cy3或Cy5等)、荧光素、香豆素、罗丹明等或本文公开的其他染料)的非特异性结合)。在一些实施方案中,本公开内容的支持物表面可表现出落入该范围内的任何地方的非特异性结合,例如,小于86个分子/μm2。在一些实施方案中,在与1μM Cy3标记的链霉亲和素(GE Amersham)磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液溶液接触15分钟,随后用去离子水冲洗3次后,本文公开的一些修饰表面表现出小于0.5个分子/μm2的非特异性蛋白质结合。在一些实施方案中,本文公开的修饰表面表现出小于0.25个分子/μm2的Cy3染料分子的非特异性结合。
在独立的非特异性结合测定中,将1μM标记的Cy3 SA(ThermoFisher)、1μM Cy5 SA染料(ThermoFisher)、10μM氨基烯丙基-dUTP-ATTO-647N(Jena Biosciences)、10μM氨基烯丙基-dUTP-ATTO-Rho11(Jena Biosciences)、10μM氨基烯丙基-dUTP-ATTO-Rho11(JenaBiosciences)、10μM 7-炔丙基氨基-7-脱氮-dGTP-Cy5(Jena Biosciences)和10μM 7-炔丙基氨基-7-脱氮-dGTP-Cy3(Jena Biosciences)各自在低结合基质上在37℃下以384孔板格式温育15分钟。每孔用50ul的无RNA酶/DNA酶去离子水冲洗2-3次,并用25mM ACES缓冲液(pH 7.4)冲洗2-3次。使用制造商指定的Cy3、AF555或Cy5过滤器组(根据进行的染料测试)在GE Typhoon仪器上对384孔板进行成像,其中PMT增益设置为800,分辨率为50-100μm。对于更高分辨率成像,在具有全内反射荧光(TIRF)物镜(100X,1.5NA,Olympus)、CCD相机(例如,Olympus EM-CCD单色相机、Olympus XM-10单色相机或Olympus DP80彩色和单色相机)、光照源(例如,Olympus 100W Hg灯、Olympus 75W Xe灯或Olympus U-HGLGPS荧光光源)以及532nm或635nm的激发波长的Olympus IX83显微镜(Olympus Corp.,中心谷,宾夕法尼亚州)上收集图像。二向色镜购自Semrock(IDEX Health&Science,LLC,罗契斯特市,纽约州),例如,405、488、532或633nm二向色反射器/分束器,并且带通过滤器被选择为与适当激发波长一致的532LP或645LP。在一些实施方案中,本文公开的修饰表面表现出小于0.25个分子/μm2的染料分子的非特异性结合。
在一些实施方案中,本文公开的表面表现出至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或大于100的荧光团(诸如Cy3)的特异性与非特异性结合的比率,或本文范围涵盖的任何中间值。在一些实施方案中,本文公开的表面表现出至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或大于100的荧光团(诸如Cy3)的特异性与非特异性荧光信号的比率,或本文范围涵盖的任何中间值。
在一些实施方案中,与本文公开内容一致的低背景表面可表现出至少4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、15∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1的特异性染料附接(例如,Cy3附接)与非特异性染料吸附(例如,Cy3染料吸附)比率,或每个非特异性吸附的分子附接超过50个特异性染料分子。在一些实施方案中,当经历激发能量时,与本文公开内容一致的荧光团(例如,Cy3)附接的低背景表面可表现出至少4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、15∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1或超过50∶1的特异性荧光信号(例如,由附接至表面的Cy3标记的寡核苷酸产生)与非特异性吸附染料荧光信号的比率。
在一些实施方案中,公开的支持物表面的亲水性(或与水溶液的“润湿性”)的程度可例如通过测量水接触角来评估,其中将小水滴置于表面上并使用例如光学张力计来测量其与表面的接触角。在一些实施方案中,可确定静态接触角。在一些实施方案中,可确定前进接触角或后退接触角。在一些实施方案中,本文公开的亲水性低结合支持物表面的水接触角范围可以为约0度至约30度。在一些实施方案中,本文公开的亲水性低结合支持物表面的水接触角可不超过50度、40度、30度、25度、20度、18度、16度、14度、12度、10度、8度、6度、4度、2度或1度。在很多情况下,接触角不超过40度。在一些实施方案中,本发明的给定亲水性低结合支持物表面可表现出具有该范围内任何地方的值的水接触角。
在一些实施方案中,本文公开的亲水性表面有助于减少生物测定的洗涤时间,这通常是由于生物分子与低结合表面的非特异性结合减少。在一些实施方案中,可在少于60、50、40、30、20、15、10或少于10秒内进行足够的洗涤步骤。在一些实施方案中,可在少于30秒内进行足够的洗涤步骤。
在一些实施方案中,本公开内容的低结合表面在长期暴露于溶剂和高温下,或在溶剂暴露或温度变化的重复循环中表现出稳定性或耐久性的显著改善。在一些实施方案中,公开表面的稳定性可通过荧光标记表面上的官能团或表面上拴系的生物分子(例如,寡核苷酸引物),并在长期暴露于溶剂和高温下,或在溶剂暴露或温度变化的重复循环之前、期间和之后监测荧光信号来测试。在一些实施方案中,在暴露于溶剂和/或高温下1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时或100小时的时间段内,用于评估表面质量的荧光变化程度可小于1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%或25%(或在这些时间段内测量的这些百分比的任何组合)。在一些实施方案中,在重复暴露于溶剂变化和/或温度变化的5个循环、10个循环、20个循环、30个循环、40个循环、50个循环、60个循环、70个循环、80个循环、90个循环、100个循环、200个循环、300个循环、400个循环、500个循环、600个循环、700个循环、800个循环、900个循环或1000个循环中,用于评估表面质量的荧光变化程度可小于1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%或25%(或在该循环范围内测量的这些百分比的任何组合)。
在一些实施方案中,本文公开的表面可表现出特异性信号与非特异性信号或其他背景的高比率。在一些实施方案中,当用于核酸扩增时,表面可表现出比表面的相邻未填充区域的信号大至少4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、75、100或大于100倍的扩增信号。在一些实施方案中,表面表现出比表面的相邻扩增核酸群体区域的信号大至少4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、75、100或大于100倍的扩增信号。
在一些实施方案中,当用于核酸杂交或扩增应用以产生杂交或克隆扩增的核酸分子(例如,已经用荧光团直接或间接标记的核酸分子)的簇时,公开的低背景表面的荧光图像表现出至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、210、220、230、240、250或大于250的对比噪声比(CNR)。
在一些实施方案中,一种或多种类型的引物(例如,捕获寡核苷酸和/或环化寡核苷酸)可附接或拴系于支持物表面。在一些实施方案中,一种或多种类型的衔接子或引物可包含间隔区序列、用于与衔接子连接的靶文库核酸序列杂交的衔接子序列、正向扩增引物、反向扩增引物、测序引物和/或分子条形码序列或其任何组合。在一些实施方案中,可将1个引物或衔接子序列拴系于表面的至少一层。在一些实施方案中,可将至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个不同的引物或衔接子序列拴系于表面的至少一层。
在一些实施方案中,拴系的衔接子和/或引物序列的长度范围可以为约10个核苷酸至约100个核苷酸。在一些实施方案中,拴系的衔接子和/或引物序列的长度可以为至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个核苷酸。在一些实施方案中,拴系的衔接子和/或引物序列的长度可以为至多100、至多90、至多80、至多70、至多60、至多50、至多40、至多30、至多20或至多10个核苷酸。在本段落中描述的下限和上限值中的任一个可以组合以形成包括在本发明内的范围,例如,在一些实施方案中,拴系的衔接子和/或引物序列的长度范围可以为约20个核苷酸至约80个核苷酸。拴系的衔接子和/或引物序列可具有该范围内的任何值,例如,约24个核苷酸。
在一些实施方案中,本公开内容的低结合支持物表面上的引物的所得表面密度范围可以为约100个引物分子/μm2至约100,000个引物分子/μm2。在一些实施方案中,本公开内容的低结合支持物表面上的引物的所得表面密度范围可以为约100,000个引物分子/μm2至约1015个引物分子/μm2。在一些实施方案中,引物的表面密度可以为至少1,000个引物分子/μm2、至少10,000个引物分子/μm2、至少100,000个引物分子/μm2或至少1015个引物分子/μm2。在一些实施方案中,引物的表面密度可以为至多10,000个引物分子/μm2、至多100,000个引物分子/μm2、至多1,000,000个引物分子/μm2或至多1015个引物分子/μm2。本段落中描述的下限和上限值中的任一个可以组合以形成包括在本发明内的范围,例如,在一些实施方案中,引物的表面密度范围可以为约10,000个分子/μm2至约1015个分子/μm2。引物分子的表面密度可具有该范围内的任何值,例如,约455,000个分子/μm2。在一些实施方案中,最初与支持物表面上的衔接子或引物序列杂交的靶文库核酸序列的表面密度可以小于或等于拴系的引物的表面密度。在一些实施方案中,与支持物表面上的衔接子或引物序列杂交的克隆扩增的靶文库核酸序列的表面密度可跨越与拴系的引物的表面密度相同的范围。
在一些实施方案中,如上所列的局部密度不排除整个表面上的密度变化,使得表面可包含具有例如500,000/μm2的寡聚物密度的区域,同时还包含具有基本上不同的局部密度的至少第二区域。
在一些实施方案中,低非特异性结合涂层包含一层或多层的多层表面涂层,该多层表面涂层可包含支链聚合物或可以是线性的。在一些实施方案中,合适的支链聚合物包括但不限于支链PEG、支链聚(乙烯醇)(支链PVA)、支链聚(乙烯基吡啶)、支链聚(乙烯基吡咯烷酮)(支链PVP)、支链聚(丙烯酸)(支链PAA)、支链聚丙烯酰胺、支链聚(N-异丙基丙烯酰胺)(支链PNIPAM)、支链聚(甲基丙烯酸甲酯)(支链PMA)、支链聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(支链PHEMA)、支链聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(支链POEGMA)、支链聚谷氨酸(支链PGA)、支链聚赖氨酸、支链聚葡糖苷和右旋糖酐。
在一些实施方案中,用于产生一层或多层本文公开的多层表面中的任一层的支链聚合物可包含至少4个支链、至少5个支链、至少6个支链、至少7个支链、至少8个支链、至少9个支链、至少10个支链、至少12个支链、至少14个支链、至少16个支链、至少18个支链、至少20个支链、至少22个支链、至少24个支链、至少26个支链、至少28个支链、至少30个支链、至少32个支链、至少34个支链、至少36个支链、至少38个支链或至少40个支链。
在一些实施方案中,用于产生一层或多层本文公开的多层表面中的任一层的线性、支链或多支链聚合物的分子量可以为至少500、至少1,000、至少2,000、至少3,000、至少4,000、至少5,000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000或至少50,000道尔顿。
在一些实施方案中,例如,其中多层表面的至少一层包含支链聚合物,被沉积的层的支链聚合物分子和前一层的分子之间的共价键数量范围可以为约1个共价键/分子至约32个共价键/分子。在一些实施方案中,新层的支链聚合物分子和前一层的分子之间的共价键数量可以为至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少22、至少24、至少26、至少28、至少30或至少32个共价键/分子。
在材料层偶联至表面后保留的任何反应性官能团可任选地通过使用高产率偶联化学偶联小惰性分子来封闭。在一些实施方案中,当使用胺偶联化学将新材料层附接至前一层时,任何残留的胺基团可随后通过与小氨基酸(诸如甘氨酸)偶联而乙酰化或失活。
在一些实施方案中,沉积在表面上的低非特异性结合材料(例如,亲水性聚合物材料)的层数范围可以为1至约10。在一些实施方案中,层数为至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10。在一些实施方案中,层数可以为至多10、至多9、至多8、至多7、至多6、至多5、至多4、至多3、至多2或至多1。在本段落中描述的下限和上限值中的任一个可以组合以形成包括在本发明内的范围,例如,在一些实施方案中,层数范围可以为约2至约4。在一些实施方案中,所有的层可包含相同的材料。在一些实施方案中,每层可包含不同的材料。在一些实施方案中,多个层可包含多种材料。在一些实施方案中,至少一层可包含支链聚合物。在一些实施方案中,所有的层可包含支链聚合物。
在一些实施方案中,可使用极性质子溶剂、极性或极性非质子溶剂、非极性溶剂或其任何组合将一层或多层低非特异性结合材料在一些情况下沉积在和/或缀合至基质表面上。在一些实施方案中,用于层沉积和/或偶联的溶剂可包含醇(例如,甲醇、乙醇、丙醇等)、另一种有机溶剂(例如,乙腈、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)等)、水、水性缓冲溶液(例如,磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)等)或其任何组合。在一些实施方案中,所用的溶剂混合物的有机组分可占总量的至少1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%,余量由水或水性缓冲溶液组成。在一些实施方案中,所用的溶剂混合物的水性组分可占总量的至少1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%,余量由有机溶剂组成。在一些实施方案中,所用的溶剂混合物的pH可以为小于6、约6、6.5、7、7.5、8、8.5、9或大于pH 9。
用于制备、测试和使用低非特异性结合涂层的各种组合物和方法,包括用于将任何类型的引物(例如,捕获寡核苷酸、扩增寡核苷酸和/或环化寡核苷酸)固定至涂层的方法,描述于2019年3月25日提交的美国申请号16/363,842;2020年1月10日提交的美国申请号16/740,355;2020年1月10日提交的美国申请号16/740,357;2020年4月22日提交的美国申请号16,855,877中,上述专利申请的内容通过引用明确地整体并入于此。
试剂盒
在一些实施方案中,本文公开了用于制备核酸测序文库和/或对核酸测序文库进行测序的试剂盒。在一些实施方案中,试剂盒包含本文所述的组合物,诸如用于使核酸分子环化和/或在环化后对核酸分子进行测序的试剂和底物。
试剂盒可包括酶、核酸、核苷酸、具有官能化表面的支持物、试剂或用法说明。在一些实施方案中,酶可以是连接酶、蛋白酶、转座酶、本文所述酶中的任一种及其组合。在一些实施方案中,核酸可以是寡核苷酸、夹板寡核苷酸、本文所述的任何寡核苷酸或核酸,或其任何组合。在一些实施方案中,核苷酸可包含具有封闭部分的核苷酸。在一些实施方案中,核苷酸可包含无封闭部分的核苷酸。在一些实施方案中,核苷酸可包含荧光标记的多价分子。在一些实施方案中,具有官能化表面的支持物可包含用于支持物的塑料、金属、玻璃或其任何组合。在一些实施方案中,具有官能化表面的支持物可包含用于官能化的亲水性、疏水性、聚合的、引发的或其任何组合。在一些实施方案中,试剂可包含本文所述试剂中的任一种。
在一些实施方案中,试剂盒中的每种试剂可被标记。在一些实施方案中,试剂盒中的每种试剂可用不同的数字或不同的字母标记,例如,如图22A所示。在一些实施方案中,试剂盒中的试剂可包含在不同颜色的容器中,例如,如图22B所示。在一些实施方案中,试剂盒中的试剂可包含在具有平底表面的容器中。在一些实施方案中,试剂盒中的试剂可包含在具有非平底表面的容器中。在一些实施方案中,容器可包含遮光材料。在一些实施方案中,容器可包含封闭UV光的材料。在一些实施方案中,容器可包含塑料。在一些实施方案中,容器可包含玻璃。在一些实施方案中,容器可包含标识符,例如条形码,例如,如图22A所示。在一些实施方案中,容器可包含不同颜色的盖。在一些实施方案中,容器可以是96孔板。在一些实施方案中,容器可以是384孔板。在一些实施方案中,容器可包含96孔板。在一些实施方案中,容器可包含384孔板。在一些实施方案中,容器可以是管。
在一些实施方案中,用法说明可包括对使单链核酸、单链DNA、单链RNA、双链核酸、双链DNA、双链RNA或本文所述的任何核酸及其组合环化的方法的描述。在一些实施方案中,用法说明可进一步包括对在环化之前、环化同时或环化之后附接核酸衔接子或引物的方法的描述。在一些实施方案中,用法说明可进一步包括对用于处理生物来源的遗传物质的描述。在一些实施方案中,用法说明可包括对检测核酸序列的描述。在一些实施方案中,用法说明可包括对设计多个阶段的描述,每个阶段采用本文所述方法中的一种。在一些实施方案中,这样的描述可描述使用本文所述试剂组合物中的任一种的一个或多个步骤。在一些实施方案中,这样的描述可描述使用本文所述试剂组合物中的任一种与其他试剂组合物的组合的步骤。
在一些实施方案中,用法说明可描述制备核酸文库的步骤。在一些实施方案中,用法说明可描述预处理生物样品的步骤。在一些实施方案中,用法说明可描述从生物样品中提取核酸的步骤。在一些实施方案中,用法说明可描述从其他化学品中纯化核酸的步骤。在一些实施方案中,用法说明可描述从其他种类的核酸中分离一种核酸(例如,DNA、RNA、质粒等)的步骤。在一些实施方案中,用法说明可描述向核酸添加一个或多个引物或者一个或多个衔接子的步骤。在一些实施方案中,用法说明可描述使核酸环化的步骤。
在一些实施方案中,用法说明可描述使来自核酸文库的核酸与官能化到表面上的寡核苷酸杂交的步骤。在一些实施方案中,该步骤可描述使用杂交试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述在多种组合物中使用杂交试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述将杂交试剂与适当量的溶剂混合。在一些实施方案中,该步骤可描述在预定温度范围内使用杂交试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述在预定持续时间内使用杂交试剂。
在一些实施方案中,用法说明可描述用于洗涤表面的步骤。在一些实施方案中,该步骤可描述使用通用洗涤试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述使用洗脱试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述在多种组合物中使用通用洗涤试剂或洗脱试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述将通用洗涤试剂或洗脱试剂与适当量的溶剂混合。在一些实施方案中,该步骤可描述在预定温度范围内使用通用洗涤试剂或洗脱试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述在预定持续时间内使用通用洗涤试剂或洗脱试剂。
在一些实施方案中,用法说明可描述扩增核酸的步骤。在一些实施方案中,核酸可与官能化到表面上的寡核苷酸杂交。在一些实施方案中,该步骤可描述使用扩增试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述在多种组合物中使用扩增试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述将扩增试剂与适当量的溶剂混合。在一些实施方案中,该步骤可描述在预定温度范围内使用扩增试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述在预定持续时间内使用扩增试剂。
在一些实施方案中,用法说明可描述结合荧光标记的多价分子的步骤。在一些实施方案中,该步骤可描述使用捕获试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述在各种组合物中使用捕获试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述将捕获试剂与适当量的溶剂混合。在一些实施方案中,该步骤可描述在预定温度范围内使用捕获试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述在预定持续时间内使用捕获试剂。
在一些实施方案中,用法说明可描述将荧光标记的多价分子结合至官能化到表面上的寡核苷酸上的步骤。在一些实施方案中,该步骤可描述使用捕获试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述在各种组合物中使用捕获试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述将捕获试剂与适当量的溶剂混合。在一些实施方案中,该步骤可描述在预定温度范围内使用捕获试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述在预定持续时间内使用捕获试剂。
在一些实施方案中,用法说明可描述洗涤表面同时保留与官能化到表面上的寡核苷酸结合的荧光标记的多价分子的步骤。在一些实施方案中,该步骤可描述使用捕获后试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述在多种组合物中使用捕获后试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述将捕获后试剂与适当量的溶剂混合。在一些实施方案中,该步骤可描述在预定温度范围内使用捕获后试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述在预定持续时间内使用捕获后试剂。
在一些实施方案中,用法说明可描述用于对表面进行成像的步骤。在一些实施方案中,该步骤可描述使用成像试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述在多种组合物中使用成像试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述将成像试剂与适当量的溶剂混合。在一些实施方案中,该步骤可描述在预定温度范围内使用成像试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述在预定持续时间内使用成像试剂。
在一些实施方案中,用法说明可描述使官能化到表面上的寡核苷酸延伸的步骤。在一些实施方案中,该步骤可描述使用步进试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述在多种组合物中使用步进试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述将步进试剂与适当量的溶剂混合。在一些实施方案中,该步骤可描述在预定温度范围内使用步进试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述在预定持续时间内使用步进试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述使用切割试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述在多种组合物中使用切割试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述将切割试剂与适当量的溶剂混合。在一些实施方案中,该步骤可描述在预定温度范围内使用切割试剂。在一些实施方案中,该步骤可描述在预定持续时间内使用切割试剂。
在一些实施方案中,试剂盒可包含用于每种酶的单独管。在一些实施方案中,可为每个步骤提供反应缓冲液管。在一些实施方案中,反应缓冲液可作为浓缩液提供。在一些实施方案中,寡核苷酸可与试剂盒一起提供。
实施例
提供这些实施例仅用于说明性目的,而不限制本文提供的权利要求的范围。
实施例1.用捕获试剂和成像试剂对固定化三元复合体进行光漂白测量
进行各种成像试剂的比较,以评估它们减少固定在支持物上的三元复合体的光损伤的能力。将玻璃盖玻片附接至384孔板的底部。盖玻片包括固定化表面引物。使环状DNA文库与盖玻片上的固定化表面引物杂交,并进行滚环扩增反应,以生成固定至盖玻片上的多联体模板分子(例如,聚合酶集落)。向孔中添加测序引物,以与多联体模板分子杂交并在盖玻片上形成三元复合体。向每个孔中添加20uL捕获试剂,并在42℃下温育45秒。用40uL成像试剂洗涤孔五次,以去除未结合的第一测序聚合酶和未结合的多价分子。对于成像步骤,向孔中添加40uL成像试剂。通过用激光光照3秒,随后延迟1秒,持续90秒,使固定化三元复合体经历光漂白条件。使用约90%的绿色激光功率来激发标记的多价分子dU-CF532和dG-CF570。使用约70%的红色激光功率来激发标记的多价分子dA-CF647和dC-CF680。在具有20×0.7数值孔径(NA)物镜的定制Olympus倒置显微镜上进行荧光成像。用ANDOR Zyla cMOS相机以0.5秒曝光拍摄荧光图像。使用以秒为单位的绿色或红色激光激发时间的持续时间的平均强度或P90强度来绘制表示固定化三元复合体的光漂白的曲线。代表性光漂白数据示于图17-图18、图35-图36、图38-图42和4图5中。
捕获试剂:溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂、多个核苷酸试剂(例如,多个荧光团标记的多价分子)和多个第一测序聚合酶(非标记的聚合酶)。示例性多价分子示于图2B中。
成像试剂:成像试剂包括至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂、用于增加黏度的至少一种化合物和用于减少光损伤的至少一种化合物。在一些实施方案中,用于减少光损伤的化合物包括一种化合物或两种或更多种化合物的组合,包括抗坏血酸、Trolox化合物(例如,未老化的Trolox、老化的Trolox、Trolox醌)、甲基紫精、1,3,5,7环辛四烯(COT)、半胱胺、3-硝基苯甲酸(NBA)和/或对苯二胺(PPD)。
实施例2:用包含乙二醇的成像试剂对固定化三元复合体进行强度测量
进行各种成像试剂的比较,以评估它们改善固定在支持物上的三元复合体的荧光强度的能力。处理玻璃流动池以在其上固定表面引物。使环状DNA文库与流动池上的固定化表面引物杂交,并进行滚环扩增反应,以生成固定至流动池上的多联体模板分子(例如,聚合酶集落)。使测序引物流至流动池上,以允许与多联体模板分子杂交并在流动池上形成三元复合体。使200uL捕获试剂流至流动池上,并在42℃下温育45秒。用成像试剂洗涤流动池,以去除未结合的第一测序聚合酶和未结合的多价分子。对于成像步骤,使400uL成像试剂流至流动池上。成像试剂含有不同量的乙二醇(例如,0、10%、20%、30%、35%或40%)。再次使用相同流动池来测试含有特定浓度的乙二醇的成像试剂。使用与实施例1中所述相同的倒置显微镜来获得图像。使用约30%的绿色激光功率来激发标记的多价分子dU-CF532和dG-CF570。使用约13%的红色激光功率来激发标记的多价分子dA-CF647和dC-CF680。强度数据示于图40和图41中。
捕获试剂:溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂、多个核苷酸试剂(例如,多个荧光团标记的多价分子)和多个第一测序聚合酶(非标记的聚合酶)。示例性多价分子示于图2B中。
成像试剂:成像试剂包括至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂、用于增加黏度的至少一种化合物和用于减少光损伤的至少一种化合物。在一些实施方案中,用于减少光损伤的化合物包括一种化合物或化合物的组合,包括抗坏血酸和/或Trolox化合物(例如,未老化的Trolox、老化的Trolox或Trolox醌)。
实施例3:制备老化的Trolox
Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸)可以经历UV光暴露和/或曝气,以生成表现出水溶性增加的羟基化衍生物。测试了制备羟基化Trolox衍生物(老化的Trolox)的几种方法(参见下文的方法A-E)。将老化的Trolox包括在各种成像试剂中,并在光漂白测定中进行测试。
方法A:将250mL烧杯中溶于MeOH(25mL)和水(25mL)的Trolox(1.25g,5mmol)溶液用UV光(254nm,15W)照射3小时。通过RP-HPLC(C-18柱)分析溶液,以建立其色谱图。RP-HPLC结果显示,除了起始Trolox(9.70min)外,还有三个主要的新峰(10.35min、11.33min和14.44min)以及在HPLC色谱图中观察到的几个次要峰。注意到的是,所有新形成的峰的极性小于Trolox本身,并且比Trolox在更长的迁移时间洗脱(数据未显示)。
方法B:向Trolox(1.25克,5mmol)在MeOH(5mL)中的悬浮溶液中添加NaOH溶液(1N,12mL)。涡旋2分钟后溶液变澄清,然后用水稀释(最终溶液中含10%甲醇)至总体积为50mL。测得的pH为12.5。将溶液转移至250mL烧杯中并在UV光(254nm,15W)下照射3小时。通过RP-HPLC(C-18柱)分析溶液。除了起始Trolox(9.70min)和先前观察到的两个峰(10.35min、11.33min)外,在HPLC色谱图中还观察到几个其他峰。特别地,迁移时间为8.12min和8.82min的两个主要峰是值得注意的,因为它们比Trolox极性更大,并且可能比Trolox本身更易溶于水。在环境条件下将溶液留在罩中60小时以增加老化过程,同时用RP-HPLC监测样品。Trolox的转化是缓慢的过程。在室温下温育60小时后,有大量未修饰的Trolox保留在溶液中。
方法C:测试了加速老化过程的尝试。将100mM Trolox溶液(pH12.5)用UV照射处理3小时,然后在向空气开放的烧瓶中以600rpm搅拌。溶液的RP-HPLC分析显示,在搅拌16小时后Trolox峰几乎全部消失,这表明搅拌方法有助于氧吸收并加速氧化过程。
方法D:在另一程序中,如上文方法C中所述的用搅拌但省略UV照射来制备Trolox(pH 12.5)。在将Trolox溶液搅拌过夜后,RP-HPLC分析显示出类似的结果。
方法E:为了进一步研究碱处理的氧化过程,向pH 12.5的100mM Trolox溶液中添加30%H2O2溶液(5mL)。气泡从溶液中快速释放,并且pH快速下降至9.5。RP-HPLC色谱图显示出Trolox醌的形成(11.33min)以及16小时后仍保留的未修饰Trolox的主要峰。
使用本文所述的不同老化的Trolox溶液来制备各种成像试剂,并且测试这些成像试剂减少三元复合体的光损伤(例如,减少荧光团的光损伤)的能力。按照从最好到最差排序的光损伤保护的排序顺序如下:搅拌下pH 12.5的Trolox、UV照射下pH 12.5的老化的Trolox>UV照射下Trolox的50%甲醇溶液>Trolox。显示使用含有老化的Trolox的成像试剂防止光漂白的示例性数据示于图32(制剂10)、图39(制剂33和34)和图42(制剂35和37)中。
成像试剂:成像试剂包括至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂、用于增加黏度的至少一种化合物和用于减少光损伤的至少一种化合物。在一些实施方案中,用于减少光损伤的化合物包括一种化合物或化合物的组合,包括抗坏血酸和/或Trolox化合物(例如,未老化的Trolox、老化的Trolox或Trolox醌)。
图18示出了染料标记的核苷酸的一系列图像,其中核苷酸经由可切割部分(CM)与染料连接。在暴露于高激光功率90秒后,图像显示没有残留的荧光信号。成像试剂包含Tris-HCl(pH 8.8)、EDTA、NaCl、Triton X-100、蔗糖、乙酸锶、甘油、1,3,5,7环辛四烯(COT)(2mM)、抗坏血酸钠(50mM)和Trolox(2mM)。
图19示出了显示成像试剂对来自荧光标记的多价分子的残留信号随重复循环的影响的图。成像试剂包含Tris-HCl(pH 8.8)、EDTA、NaCl(100mM)、Triton X-100、蔗糖(1M)、乙酸锶和甘油。
图20示出了显示成像试剂对来自荧光标记的多价分子的残留信号随重复循环的影响的图。成像试剂包含Tris-HCl(pH 8.8)、EDTA、NaCl(100mM)、Triton X-100、蔗糖(1M)、乙酸锶、甘油、Trolox(2mM)和抗坏血酸钠(50mM)。与图19所示的结果进行比较。
实施例4.预示性测序工作流示例
以下描述了使用本发明的一些试剂进行核酸测序的示例程序。本实施例描述了(a)在支持物上形成具有引发的寡核苷酸的亲水性涂层,(b)生成环状核酸文库,(c)进行滚环扩增以由环状核酸文库生成多联体,和(d)对多联体进行测序以确定包含环状核酸文库的核酸序列。然而,应理解,本公开内容的各种试剂可类似地用于其他核酸处理、反应或测序程序和/或步骤。
在支持物上形成亲水性聚合物涂层
用硫醇-马来酰亚胺化学制备2层聚乙二醇(PEG)表面的方法:在室温下,使用2MKOH处理30分钟以清洁玻璃载玻片。洗涤玻璃载玻片,然后使用氧等离子体活化玻璃的表面硅烷醇基团。在乙醇中以0.1%的浓度应用硅烷-PEG5K-硫醇(Creative PEGWorks,Inc.,达勒姆市,北卡罗来纳州)。2小时涂覆反应后,用乙醇和水彻底洗涤载玻片,然后与二甲基甲酰胺(DMF)中的2.5mM马来酰亚胺-PEG-琥珀酰亚胺基戊酸酯(MW=20K)反应30分钟。洗涤所得表面,并立即与5’-胺标记的寡核苷酸引物在室温下反应2小时。在引物固定后,通过与pH=9的100mM甘氨酸反应使表面上过量的琥珀酰亚胺酯失活。
用NHS酯-胺化学制备多层PEG表面的方法:在室温下,通过2M KOH处理30分钟来清洁玻璃载玻片,洗涤,然后使用氧等离子体活化表面硅烷醇基团。在乙醇溶液中以0.5%的浓度应用硅烷-PEG2K-胺(Nanocs,Inc.,纽约市,纽约州)。2小时涂覆反应后,用乙醇和水彻底洗涤载玻片。在室温下,将100uM的8臂PEG NHS(MW=10K,Creative PEGWorks,Inc.,达勒姆市,北卡罗来纳州)引入溶剂组合物中20分钟,该溶剂组合物可以包括5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%有机溶剂和5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%低离子强度缓冲液。洗涤所得表面,并与20μM多臂PEG胺(MW=10K,Creative PEGWorks,Inc.,达勒姆市,北卡罗来纳州)反应2小时。然后将所得胺-PEG表面与不同浓度的多臂PEG-NHS和胺标记的寡核苷酸引物的混合物反应。重复该过程,以在表面上生成附加的PEG层。
制备其他NSB表面的方法:对玻璃载玻片进行物理或化学处理(例如,使用等离子体处理、食人鱼清洁步骤、酸洗、碱洗、高温玻璃退火或其任何组合),以去除有机污染物并活化表面羟基用于硅烷偶联。然后将所制备的玻璃表面与硅烷反应,以共价附接第一层官能团(例如,伯胺)和/或亲水性聚合物层。在一些情况下,例如,使用标准方案将硅烷(诸如(3-氨丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)或(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、(3-丙烯酰氧基丙基)三甲氧基硅烷)与表面反应,以将伯胺官能团共价附接至表面。在其他情况下,硅烷修饰的聚合物(例如,在一端包含甲硅烷基并且在另一端包含第二官能团(例如,伯胺、羧基等)的亲水性异双官能聚合物)可直接与表面反应(例如,通过使清洁玻璃表面与浓度为0.1%-2%的硅烷修饰的聚合物在乙醇中接触约1至2小时,随后用乙醇和水冲洗)。合适的硅烷修饰的聚合物的示例包括但不限于硅烷-PEG-NH2(聚乙二醇(PEG)分子量为例如1000、2000、3400、5000或10K道尔顿)、硅烷-PEG-COOH(PEG分子量为例如1000、2000、3400、5000或10K道尔顿)、硅烷-PEG-马来酰亚胺(PEG分子量为例如1000、2000、3400、5000或10K道尔顿)、硅烷-PEG-生物素(PEG分子量为例如1000、2000、3400、5000或10K道尔顿)、硅烷-PEG-丙烯酸酯(PEG分子量为例如1000、2000、3400、5000或10K道尔顿)、硅烷-PEG-硅烷(PEG分子量为例如1000、2000、3400、5000或10K道尔顿)、包含附加官能团的各种分子量的硅烷修饰的聚丙二醇(PPG)、包含附加反应性官能团的各种分子量的硅烷修饰的聚(乙烯醇)(PVA)、包含附加反应性官能团的各种分子量的硅烷修饰的聚乙烯亚胺(PEI)、包含附加反应性官能团的各种分子量的硅烷修饰的聚(赖氨酸)等,或其任何组合。
在一些情况下,在表面与硅烷或硅烷修饰的聚合物的初始反应后,将亲水性聚合物层的至少一个附加层偶联或沉积在玻璃表面上。可使用许多亲水性聚合物中的任一种,包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(2-甲基丙烯酸羟乙基酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡糖苷、链霉亲和素、右旋糖酐或其任何组合,其中在共价偶联的情况下,选择包含合适的单官能、同双官能和/或异双官能反应性基团的聚合物,以与所选缀合化学相容。在一些情况下,使用衍生的聚合物,诸如PEG-胺、PEG-NHS或PEG-丙烯酸酯。在一些情况下,使用双官能PEG衍生物,诸如丙烯酸酯-PEG-NHS。在一些情况下,通过使表面与0.1%-2%聚合物在乙醇或乙醇/水性缓冲溶液中在室温下接触约5分钟至约1小时,随后用乙醇或乙醇/水性缓冲液冲洗,可以将这些附加的亲水性聚合物层偶联或沉积在前一层上。
在一些情况下,可以将亲水性聚合物的第二、第三、第四、第五或更多附加层偶联或沉积在支持物表面的初始层上。在一些情况下,层内的聚合物分子可使用合适的同官能或异官能交联试剂彼此交联。在一些情况下,不同层中的聚合物分子可彼此交联。在一些情况下,亲水性聚合物层中的一层或多层可包含支链聚合物,例如,支链PEG、支链聚(乙烯醇)(支链PVA)、支链聚(乙烯基吡啶)、支链聚(乙烯基吡咯烷酮)(支链PVP)、支链聚(丙烯酸)(支链PAA)、支链聚丙烯酰胺、支链聚(N-异丙基丙烯酰胺)(支链PNIPAM)、支链聚(甲基丙烯酸甲酯)(支链PMA)、支链聚(2-甲基丙烯酸羟乙基酯)(支链PHEMA)、支链聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(支链POEGMA)、支链聚谷氨酸(支链PGA)、支链聚赖氨酸、支链聚葡糖苷、支链右旋糖酐或其任何组合。
亲水性聚合物层中的一层或多层可包含多个共价附接的寡核苷酸衔接子或引物分子,其中使用多种合适的缀合化学中的任一种将寡核苷酸分子共价偶联至聚合物。在一些情况下,寡核苷酸衔接子或引物分子共价偶联至聚合物溶液,即,在将聚合物偶联或沉积在表面上之前。在一些情况下,寡核苷酸衔接子或引物分子在其已偶联或沉积在表面上之后共价偶联至聚合物。在一些情况下,至少一层亲水性聚合物包含多个共价附接的寡核苷酸衔接子或引物分子。在一些情况下,至少两层、至少三层、至少四层或至少五层亲水性聚合物包含多个共价附接的衔接子或引物分子。
所用聚合物的选择、层数、层内和层间的交联度、包含共价附接的寡核苷酸衔接子或引物分子的层数,以及寡核苷酸衔接子或引物分子的局部浓度或表面密度可单独或共同调节以“调节”表面的特性,从而实现所需的表面润湿性(如例如通过小于50度的水接触角所指示的)、在长期暴露于测序/基因分型试剂和重复热循环下所需的表面稳定性(其通常需要峰值温度为至少95℃的温度斜坡并保持至少5分钟并多次循环至少30个循环),以及寡核苷酸衔接子或引物分子的所需表面密度(例如,至少1,000个衔接子或引物分子/μm2),其进而提供染料分子或其他标记的测序/基因分型试剂的极低非特异性结合、改善的杂交效率、改善的扩增效率和特异性、克隆扩增的靶序列的最佳密度(就每单位面积的克隆集落数、每单位面积的靶序列拷贝数或每单位面积的扩增的靶分子数而言)、支持物表面的图像(例如,荧光图像)中较高的对比噪声比(CNR)(例如,CNR>20),以及基因分型和测序应用中的最终的改善的检测准确性或碱基调用准确性。
在一些情况下,寡核苷酸引物可包含与核酸文库中核酸的引物序列互补的序列。在一些情况下,寡核苷酸引物可包含与测序引物互补的序列。
核酸文库生成
将双链核酸分子机械或酶促剪切为多个双链核酸片段。多个双链核酸片段是100-5000bp的片段。
对多个双链核酸片段进行修饰。该修饰包括通过聚合酶修复和加A尾。加A尾的过程通过向多个双链核酸片段中的每一个的3’端添加腺嘌呤来进行。
将一个或多个衔接子连接至有A尾的双链核酸片段上。将一个或多个衔接子连接至有A尾的双链核酸片段的两端上。一个或多个衔接子包含与NSB表面的寡核苷酸引物序列互补的序列。一个或多个衔接子还可包含通用引物位点、表面结合位点、P5位点、P7位点或索引位点。
使用PCR扩增包含一个或多个衔接子的修饰的双链核酸分子。
为了使文库环化,使用夹板寡核苷酸与文库外部衔接子杂交。使用DNA连接酶密封由线性文库和夹板寡核苷酸形成的切口。连接后,用核酸外切酶消化非环状DNA分子,随后进行SPRI珠清洁。最终产物仅含有准备装载至流动池上并扩增/测序的环状文库。
可替代地,可使用流动池使核酸文库环化。用含有夹板寡核苷酸作为表面引物的流动池,直接装载线性文库。使用流动池上的夹板寡核苷酸与文库外部衔接子杂交,并且DNA连接酶密封由线性文库和夹板寡核苷酸形成的切口。连接后,用通用洗涤缓冲液洗去非环状DNA分子和DNA连接酶,无需核酸外切酶消化。流动池上的环状文库准备进行扩增和测序。图23中提供了表面上夹板连接的非限制性示意图。图24示出了与表面上夹板连接相比的溶液中夹板连接的非限制性示意图,并且示出了表面上夹板连接可以将反应时间减少至少75分钟,因为它不再需要消化、纯化和定量/合并。
结合并扩增模板核酸
在杂交试剂(HR,2106)的存在下,使包含引发的环状核酸(2101)的纯化的环状核酸文库与NSB表面(2107)接触。在一些情况下,HR包含溶剂、缓冲液、一价阳离子和离液剂。在一些情况下,HR包含选自制剂HR-A至HR-J中的任一种的制剂。引发的环状核酸的一个或多个衔接子(2102)与NSB表面的寡核苷酸引物杂交,该衔接子包含与NSB表面的寡核苷酸引物的引物序列(2104)互补的序列。该步骤示意性地示于图21A中。
用通用洗涤试剂(UWR)洗涤现在具有与寡核苷酸引物杂交的引发的环状核酸的NSB表面。在一些情况下,UWR包含溶剂、缓冲液、螯合剂、一价阳离子和洗涤剂。在一些情况下,UWR包含选自制剂UWR-A至UWR-BC中的任一种的制剂。结果,从NSB上洗去任何未杂交的引发的环状核酸或纯化过程中残留的污染物。
使NSB与第一扩增试剂(AR1)接触。在一些情况下,AR1包含溶剂、缓冲液、一价阳离子、铵离子、核苷酸(对于DNA为ACGT,对于RNA为ACUG)、洗涤剂、还原剂、黏度调节剂、缩合寡核苷酸、扩增聚合酶(其可以是本文公开的聚合酶中的一种)。在一些情况下,AR1包含选自制剂AR1-A至AR1-H中的任一种的制剂。设计AR1的pH,使得任何扩增反应(即,将核苷酸附加至核酸分子的3’端上)被抑制。扩增聚合酶(2108)与NSB的引发的环状核酸和引发的寡核苷酸结合以形成三元复合体。该步骤示意性地示于图21B中。
然后使NSB与第二扩增试剂(AR2,2110)接触。在一些情况下,AR2包含溶剂、缓冲液、一价阳离子、铵离子、核苷酸(对于DNA为ACGT,对于RNA为ACUG)、洗涤剂、还原剂、黏度调节剂、缩合寡核苷酸。在一些情况下,AR2包含选自制剂AR2-A至AR2-I中的任一种的制剂。在这种情况下,AR2不包含扩增聚合酶。配制AR2,使得大多数、大部分或全部扩增聚合酶保持与NSB的引发的环状核酸和引发的寡核苷酸复合。设计AR2的pH,使得扩增反应被促进。扩增聚合酶进行滚环扩增反应,产生从NSB的寡核苷酸延伸的一系列(一个或多个)多联体(2111),其中多联体各自具有与环状核酸互补的序列。该步骤示意性地示于图21C中。
然后用洗脱剂洗涤NSB,以从NSB上去除除包含多联体的引发的寡核苷酸之外的化学物质。在一些情况下,洗脱试剂(WRR)包含溶剂、缓冲液、螯合剂、洗涤剂和离液剂。在一些情况下,WRR包含选自制剂WRR-A至WRR-J中的任一种的制剂。然后用UWR洗涤NSB。
测序核酸
使NSB与捕获试剂(TR)接触。在一些情况下,TR包含溶剂、缓冲液、螯合剂、一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂、测序引物(2113)、测序聚合酶(2114)和荧光标记的多价分子(2115)。在一些情况下,TR包含选自制剂TR-A至TR-J中的任一种的制剂。回顾一下,NSB的寡核苷酸包含与测序引物序列互补的序列。因此,测序引物与NSB的寡核苷酸杂交。测序聚合酶与测序引物和NSB的寡核苷酸结合以形成三元复合体。荧光标记的多价分子可逆地结合NSB的寡核苷酸3’端的第一未配对碱基(即,荧光标记的多价分子不掺入NSB的寡核苷酸中)。该步骤示意性地示于图21D中。
用捕获后试剂(PTR)洗涤NSB。在一些情况下,PTR包含溶剂、缓冲液、螯合剂、一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂、黏度调节剂、测序引物和测序聚合酶。在一些情况下,PTR包含选自制剂PTR-A至PTR-J中的任一种的制剂。PTR不包含荧光标记的多价分子,因此从NSB上洗去任何未结合的荧光标记的多价分子。
使NSB与成像试剂(IR)接触。在一些情况下,IR包含溶剂、缓冲液、螯合剂、一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂、黏度调节剂和减少光损伤的化合物。在一些情况下,IR包含选自制剂IR-A至IR-Y中的任一种的制剂。用具有配置为将荧光标记的多价分子的荧光部分激发至较高能量水平的波长的光(2117)照射NSB,其产生可检测的荧光信号(2118)。该步骤示意性地示于图21E中。可使用荧光信号来确定荧光标记的多价分子的化学特性。
用WRR洗涤NSB,然后用UWR洗涤。在一些情况下,WRR包含选自制剂WRR-A至WRR-J中的任一种的制剂。在一些情况下,UWR包含选自制剂UWR-A至UWR-BC中的任一种的制剂。这去除了除测序引物和NSB的寡核苷酸之外的化学物质。
使NSB与步进试剂(SR,2119)接触。在一些情况下,SR包含溶剂、缓冲液、一价阳离子、催化二价阳离子、洗涤剂、测序聚合酶(2120)和多个核苷酸(2121),每个核苷酸具有附接至3’糖位置的可切割链终止部分。在一些情况下,SR包含选自制剂SR-A至SR-J中的任一种的制剂。测序聚合酶与测序引物和NSB的寡核苷酸形成三元复合体。核苷酸(具有附接至3’糖位置的可切割链终止部分)结合NSB的寡核苷酸3’端的第一未配对碱基。测序聚合酶将核苷酸附加至NSB的寡核苷酸的3’端,使NSB的寡核苷酸延伸。仅添加单个核苷酸;多个核苷酸具有可切割的链终止部分。该步骤示意性地示于图21F中。
用WRR洗涤NSB,然后用UWR洗涤。这去除了除测序引物和NSB的寡核苷酸之外的化学物质。
使NSB与切割试剂(CR,2122)接触。在一些情况下,CR包含溶剂、缓冲液、一价阳离子、洗涤剂、切割剂(2123)和切割催化剂。在一些情况下,CR包含选自制剂CR-A至CR-J中的任一种的制剂。3’端的可切割链终止部分被切割剂切割。该步骤示意性地示于图21G中。
用WRR洗涤NSB,然后用UWR洗涤。在一些情况下,WRR包含选自制剂WRR-A至WRR-J中的任一种的制剂。在一些情况下,UWR包含选自制剂UWR-A至UWR-BC中的任一种的制剂。这去除了除测序引物和NSB的寡核苷酸之外的化学物质。该步骤示意性地示于图21H中。
随后可按照上文步骤中的一些在下一个暴露的核苷酸位置处鉴定NSB的寡核苷酸。
编号的实施方案
本文考虑的实施方案包括以下编号的实施方案:
实施方案1.一种核酸杂交试剂,其包含:至少一种溶剂、pH缓冲剂和至少一种一价阳离子。
实施方案2.根据实施方案1的核酸杂交试剂,其进一步包含:洗涤剂、还原剂、离液剂、螯合剂、醇、两性离子、糖醇和/或拥挤剂中的任一种或两种或更多种的任何组合。
实施方案3.根据实施方案1的核酸杂交试剂,其进一步包含:至少一个核酸模板分子,其包含DNA或RNA,或RNA和DNA的混合物。
实施方案4.根据实施方案3的核酸杂交试剂,其中核酸模板分子包含线性或环状分子。
实施方案5.根据实施方案3的核酸杂交试剂,其中核酸模板分子可操作地连接至至少一个衔接子,其中该衔接子包括捕获引物结合序列、扩增引物结合序列和/或测序引物结合序列。
实施方案6.根据实施方案3的核酸杂交试剂,其中核酸模板分子可操作地连接至至少一个衔接子,并且其中该衔接子包括样品条形码序列或独特的分子标签序列。
实施方案7.根据实施方案3的核酸杂交试剂,其中核酸模板分子可操作地连接至至少一个衔接子,并且其中该衔接子包括与缩合寡核苷酸的一部分结合的序列。
实施方案8.根据实施方案1的核酸杂交试剂,其进一步包含:至少一个核酸扩增双链体,其包含与扩增引物杂交的核酸模板分子。
实施方案9.根据实施方案8的核酸杂交试剂,其中扩增引物包含可溶性寡核苷酸引物(例如,在溶液中),或者扩增引物固定至支持物或固定至支持物上的聚合物涂层上。
实施方案10.根据实施方案1的核酸杂交试剂,其进一步包含固定至支持物上的至少一个核酸双链体,其中该核酸双链体包含与扩增引物杂交的核酸模板分子,并且其中模板分子和/或扩增引物固定至支持物或固定至支持物上的聚合物涂层上。
实施方案11.根据实施方案10的核酸杂交试剂,其中支持物上的聚合物涂层包含水接触角不超过45-50度的亲水性聚合物涂层。
实施方案12.根据实施方案10的核酸杂交试剂,其中支持物或支持物上的聚合物涂层包含固定在其上的多个扩增引物,并且其中固定化扩增引物的密度为约100-100,000个扩增引物/mm2。
实施方案13.根据实施方案12的核酸杂交试剂,其中多个固定化扩增引物彼此流体连通,以允许核酸杂交试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化扩增引物可以以大规模平行的方式基本上同时与核酸杂交试剂反应。
实施方案14.一种第一核酸扩增试剂,其包含:至少一种溶剂、pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、铵离子、多个核苷酸和扩增聚合酶。
实施方案15.根据实施方案14的第一核酸扩增试剂,其进一步包含:洗涤剂、还原剂、黏度剂和/或多个缩合寡核苷酸中的任一种或两种或更多种的任何组合。
实施方案16.根据实施方案14的第一核酸扩增试剂,其具有降低/抑制扩增聚合酶活性的约pH 7-8的pH。
实施方案17.根据实施方案14的第一核酸扩增试剂,其中扩增聚合酶具有链置换活性。
实施方案18.根据实施方案14的第一核酸扩增试剂,其中多个核苷酸包含包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP的四种类型的核苷酸的混合物。
实施方案19.根据实施方案14的第一核酸扩增试剂,其进一步包含:至少一个核酸扩增双链体,其包含与扩增引物杂交的核酸模板分子。
实施方案20.根据实施方案19的第一核酸扩增试剂,其中扩增引物包含可溶性寡核苷酸引物(例如,在溶液中),或者扩增引物固定至支持物或固定至支持物上的聚合物涂层上。
实施方案21.根据实施方案19的第一核酸扩增试剂,其进一步包含固定至支持物上的至少一个核酸双链体,其中该核酸双链体包含与扩增引物杂交的核酸模板分子,并且其中模板分子和/或扩增引物固定至支持物或固定至支持物上的聚合物涂层上。
实施方案22.根据实施方案21的第一核酸扩增试剂,其中支持物上的聚合物涂层包含水接触角不超过45-50度的亲水性聚合物涂层。
实施方案23.根据实施方案21的第一核酸扩增试剂,其中支持物或支持物上的聚合物涂层包含固定在其上的多个扩增引物,并且其中固定化扩增引物的密度为约100-100,000个扩增引物/mm2。
实施方案24.根据实施方案23的第一核酸扩增试剂,其中多个固定化扩增引物彼此流体连通,以允许第一核酸扩增试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化扩增引物可以以大规模平行的方式基本上同时与核酸杂交试剂反应。
实施方案25.一种第二核酸扩增试剂,其包含:至少一种溶剂、pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、铵离子和多个核苷酸。
实施方案26.根据实施方案25的第二核酸扩增试剂,其缺乏扩增聚合酶。
实施方案27.根据实施方案25的第二核酸扩增试剂,其进一步包含:洗涤剂、还原剂、黏度剂和/或多个缩合寡核苷酸中的任一种或两种或更多种的任何组合。
实施方案28.根据实施方案25的第二核酸扩增试剂,其具有适于促进扩增聚合酶活性的约pH 8.5-8.8的pH。
实施方案29.根据实施方案25的第二核酸扩增试剂,其中多个核苷酸包含包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP的四种类型的核苷酸的混合物。
实施方案30.根据实施方案29的第二核酸扩增试剂,其进一步包含固定至支持物上的至少一个核酸双链体,其中该核酸双链体包含与扩增引物杂交的核酸模板分子,并且其中模板分子和/或扩增引物固定至支持物或固定至支持物上的聚合物涂层上。
实施方案31.根据实施方案30的第二核酸扩增试剂,其中支持物上的聚合物涂层包含水接触角不超过45-50度的亲水性聚合物涂层。
实施方案32.根据实施方案30的第二核酸扩增试剂,其中支持物或支持物上的聚合物涂层包含固定在其上的多个扩增引物,并且其中固定化扩增引物的密度为约100-100,000个扩增引物/mm2。
实施方案33.根据实施方案32的第二核酸扩增试剂,其中多个固定化扩增引物彼此流体连通,以允许第二核酸扩增试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化扩增引物可以以大规模平行的方式基本上同时与核酸杂交试剂反应。
实施方案34.根据实施方案23的第二核酸扩增试剂,其进一步包含含有环状模板分子的串联重复序列和存在于原始环状核酸模板分子中的任何衔接子序列的至少一个多联体,并且其中至少一个多联体固定至支持物或固定至支持物上的聚合物涂层上。
实施方案35.根据实施方案34的第二核酸扩增试剂,其中支持物涂覆有至少一个水接触角不超过45-50度的亲水性聚合物涂层。
实施方案36.根据实施方案35的第二核酸扩增试剂,其中支持物或支持物上的聚合物涂层包含固定在其上的多个多联体,并且其中固定化多联体的密度为约100-100,000个扩增引物/mm2。
实施方案37.根据实施方案36的第二核酸扩增试剂,其中多个固定化多联体彼此流体连通,以允许第二核酸扩增试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化多联体可以以大规模平行的方式基本上同时与核酸杂交试剂反应。
实施方案38.一种洗脱试剂,其包含:至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、洗涤剂和离液剂。
实施方案39.一种捕获试剂,其包含:至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂、多个多价分子和第一测序聚合酶。
实施方案40.根据实施方案39的捕获试剂,其进一步包含多个测序引物,每个测序引物包含3’可延伸末端或3’不可延伸末端。
实施方案41.根据实施方案39的捕获试剂,其进一步包含:至少一种黏度剂。
实施方案42.根据实施方案39的捕获试剂,其中多个多价分子中的单个多价分子包含:(1)核心,和(2)多个核苷酸臂,其包含(i)核心附接部分、(ii)包含PEG部分的间隔区、(iii)接头和(iv)核苷酸单元。
实施方案43.根据实施方案42的捕获试剂,其中多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心。
实施方案44.根据实施方案42的捕获试剂,其中在核苷酸臂中,间隔区附接至接头,并且接头附接至核苷酸单元。
实施方案45.根据实施方案42的捕获试剂,其中接头包含具有2-6个亚基的脂族链或具有2-6个亚基的低聚乙二醇链。
实施方案46.根据实施方案42的捕获试剂,其中多个多价分子中的单个多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心,其中多个核苷酸臂具有相同类型的核苷酸单元,其选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。
实施方案47.根据实施方案42的捕获试剂,其中多个多价分子包含具有两种或更多种不同类型的核苷酸的多价分子的混合物,该核苷酸选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。
实施方案48.根据实施方案42的捕获试剂,其中多个多价分子中的至少一个是荧光标记的,其中荧光团附接至核心或附接至核苷酸单元上的至少一个碱基。
实施方案49.根据实施方案42的捕获试剂,其中多价分子中的至少一个包含至少一个具有可切割部分的核苷酸臂,其中核苷酸臂中的可切割部分可以用可切割剂切割,以将核苷酸臂与核心分离。
实施方案50.根据实施方案42的捕获试剂,其中多个多价分子中的至少一个包括附接至至少一个核苷酸单元的2’或3’糖位置的链终止部分,其中通过使多价分子与切割/去除链终止部分的化合物接触,可以从核苷酸单元去除链终止部分。
实施方案51.根据实施方案39的捕获试剂,其中第一测序聚合酶包含来自Candidatus altiarchaeales古细菌的重组突变型聚合酶,该重组突变型聚合酶具有与SEQID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中第一测序聚合酶在选自Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567的一个或多个位置处包含氨基酸取代。
实施方案52.根据实施方案39的捕获试剂,其中第一测序聚合酶包含(i)选自Leu416Ser、Leu416Phe和Leu416Tyr的氨基酸取代;以及(ii)Tyr417Ala、Pro418Gly、Ala493Ser、Ile529His、Arg515Leu和Asn567Asp的氨基酸取代。
实施方案53.根据实施方案39的捕获试剂,其中第一测序聚合酶包含SEQ ID NO:2、3、4或5中任一者的氨基酸序列。
实施方案54.根据实施方案39的捕获试剂,其进一步包含:至少一个核酸模板分子,其包含多联体模板分子。
实施方案55.根据实施方案54的捕获试剂,其中多联体模板分子包含扩增的分子(例如,克隆扩增的分子)。
实施方案56.根据实施方案54的捕获试剂,其中多联体模板分子包括至少一个衔接子,其中该衔接子包括捕获引物结合序列、扩增引物结合序列和/或测序引物结合序列。
实施方案57.根据实施方案54的捕获试剂,其中多联体模板分子包括至少一个衔接子,并且其中该衔接子包括样品条形码序列或独特的分子标签序列。
实施方案58.根据实施方案39的捕获试剂,其进一步包含多个三元复合体,每个三元复合体包含与核酸双链体结合的第一测序聚合酶和多价分子的互补核苷酸单元,该核酸双链体包括与测序引物杂交的核酸模板分子(例如,多联体)。
实施方案59.根据实施方案58的捕获试剂,其中多个三元复合体固定至支持物上,其中三元复合体内的模板分子(例如,多联体)固定至支持物或固定至支持物上的涂层(例如,聚合物涂层)上。
实施方案60.根据实施方案59的捕获试剂,其中支持物涂覆有至少一个水接触角不超过45-50度的亲水性聚合物涂层。
实施方案61.根据实施方案59的捕获试剂,其中多个三元复合体固定至支持物上的一层或多层涂层上,并且其中固定化三元复合体的密度为约100-100,000/mm2。
实施方案62.根据实施方案59的捕获试剂,其中多个固定化三元复合体彼此流体连通,以允许捕获试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化三元复合体可以以大规模平行的方式基本上同时与捕获试剂反应。
实施方案63.一种捕获后试剂,其包含:至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂和第一测序聚合酶。
实施方案64.根据实施方案63的捕获后试剂,其进一步包含至少一种黏度剂。
实施方案65.根据实施方案63的捕获后试剂,其缺乏多个多价分子。
实施方案66.根据实施方案63的捕获后试剂,其中第一测序聚合酶包含来自Candidatus altiarchaeales古细菌的重组突变型聚合酶,该重组突变型聚合酶具有与SEQID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中第一测序聚合酶在选自Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567的一个或多个位置处包含氨基酸取代。
实施方案67.根据实施方案63的捕获后试剂,其中第一测序聚合酶包含(i)选自Leu416Ser、Leu416Phe和Leu416Tyr的氨基酸取代;以及(ii)Tyr417Ala、Pro418Gly、Ala493Ser、Ile529His、Arg515Leu和Asn567Asp的氨基酸取代。
实施方案68.根据实施方案63的捕获后试剂,其中第一测序聚合酶包含SEQ IDNO:2、3、4或5中任一者的氨基酸序列。
实施方案69.根据实施方案63的捕获后试剂,其进一步包含多个测序引物,每个测序引物包含3’可延伸末端或3’不可延伸末端。
实施方案70.根据实施方案63的捕获后试剂,其进一步包含多个三元复合体,每个三元复合体包含与核酸双链体结合的第一测序聚合酶和多价分子的互补核苷酸单元,该核酸双链体包括与测序引物杂交的核酸模板分子(例如,多联体)。
实施方案71.根据实施方案70的捕获后试剂,其中多个三元复合体固定至支持物上,其中三元复合体内的模板分子(例如,多联体)固定至支持物或固定至支持物上的涂层(例如,聚合物涂层)上。
实施方案72.根据实施方案71的捕获后试剂,其中支持物涂覆有至少一个水接触角不超过45-50度的亲水性聚合物涂层。
实施方案73.根据实施方案71的捕获后试剂,其中多个三元复合体固定至支持物上的一层或多层涂层上,并且其中固定化三元复合体的密度为约100-100,000/mm2。
实施方案74.根据实施方案71的捕获后试剂,其中多个固定化三元复合体彼此流体连通,以允许捕获后试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化三元复合体可以以大规模平行的方式基本上同时与捕获后试剂反应。
实施方案75.一种成像试剂,其包含:至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂和用于减少光损伤的至少一种化合物。
实施方案76.根据实施方案75的成像试剂,其包含2-5种减少光损伤的化合物。
实施方案77.根据实施方案75的成像试剂,其进一步包含至少一种黏度剂,或者成像试剂缺乏黏度剂。
实施方案78.根据实施方案75的成像试剂,其中一价盐包含NaCl、KCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾。
实施方案79.根据实施方案75的成像试剂,其中非催化二价阳离子包含锶离子和/或钡离子。
实施方案80.根据实施方案75的成像试剂,其缺乏包含镁和/或锰的催化二价阳离子。
实施方案81.根据实施方案75的成像试剂,其进一步包含多个三元复合体,每个三元复合体包含与核酸双链体结合的第一测序聚合酶和多价分子的互补核苷酸单元,该核酸双链体包括与测序引物杂交的核酸模板分子(例如,多联体),其中多价分子用荧光团标记,并且多价分子的核苷酸单元在与模板链中的互补核苷酸相对的位置处与测序引物的3’端结合。
实施方案82.根据实施方案81的成像试剂,其中成像试剂包含用于减少光损伤的至少一种化合物,其中该化合物(i)减少附接至多价分子的荧光团的激发三线态的形成,(ii)抵消活性氧物质的损伤效应,从而改善附接至多价分子的荧光团的光稳定性,(iii)减少附接至多价分子的荧光团的光漂白,(iv)保持附接至多价分子的荧光团的荧光强度,和/或(v)减少荧光团(其附接至多价分子)与其他生物分子(例如,聚合酶、核酸模板分子和/或测序引物寡核苷酸)的非特异性结合。
实施方案83.根据实施方案81的成像试剂,其中成像试剂包含用于减少光损伤的至少一种化合物,其中该化合物在后续测序循环中的成像步骤期间减轻来自荧光标记的多价分子的残留信号。
实施方案84.根据实施方案81的成像试剂,其中多价分子包含:(1)核心,和(2)多个核苷酸臂,其包含(i)核心附接部分、(ii)包含PEG部分的间隔区、(iii)接头和(iv)核苷酸单元。
实施方案85.根据实施方案84的成像试剂,其中多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心。
实施方案86.根据实施方案84的成像试剂,其中在核苷酸臂中,间隔区附接至接头,并且接头附接至核苷酸单元。
实施方案87.根据实施方案84的成像试剂,其中接头包含具有2-6个亚基的脂族链或具有2-6个亚基的低聚乙二醇链。
实施方案88.根据实施方案84的成像试剂,其中多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核心,其中多个核苷酸臂具有相同类型的核苷酸单元,其选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。
实施方案89.根据实施方案84的成像试剂,其中多价分子包含具有两种或更多种不同类型的核苷酸的多价分子的混合物,该核苷酸选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。
实施方案90.根据实施方案84的成像试剂,其中多价分子是荧光标记的,其中荧光团附接至核心或附接至核苷酸单元上的至少一个碱基。
实施方案91.根据实施方案84的成像试剂,其中多价分子包含至少一个具有可切割部分的核苷酸臂,其中核苷酸臂中的可切割部分可以用可切割剂切割,以将核苷酸臂与核心分离。
实施方案92.根据实施方案84的成像试剂,其中多价分子包含附接至至少一个核苷酸单元的2’或3’糖位置的链终止部分,其中通过使多价分子与切割/去除链终止部分的化合物接触,可以从核苷酸单元去除链终止部分。
实施方案93.根据实施方案81的成像试剂,其中第一测序聚合酶包含来自Candidatus altiarchaeales古细菌的重组突变型聚合酶,该重组突变型聚合酶具有与SEQID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中第一测序聚合酶在选自Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567的一个或多个位置处包含氨基酸取代。
实施方案94.根据实施方案81的成像试剂,其中第一测序聚合酶包含(i)选自Leu416Ser、Leu416Phe和Leu416Tyr的氨基酸取代;以及(ii)Tyr417Ala、Pro418Gly、Ala493Ser、Ile529His、Arg515Leu和Asn567Asp的氨基酸取代。
实施方案95.根据实施方案81的成像试剂,其中第一测序聚合酶包含SEQ ID NO:2、3、4或5中任一者的氨基酸序列。
实施方案96.根据实施方案81的成像试剂,其中核酸模板分子包含多联体模板分子。
实施方案97.根据实施方案96的成像试剂,其中多联体模板分子包含扩增的分子(例如,克隆扩增的分子)。
实施方案98.根据实施方案96的成像试剂,其中多联体模板分子包括至少一个衔接子序列,该衔接子序列包含至少一个表面捕获引物结合序列、扩增引物结合序列和/或测序引物结合序列。
实施方案99.根据实施方案96的成像试剂,其中多联体模板分子包括至少一个衔接子序列,该衔接子序列包含至少一个样品条形码序列或独特的分子标签序列。
实施方案100.根据实施方案96的成像试剂,其中多联体模板分子包括结合缩合寡核苷酸的至少一部分的衔接子序列。
实施方案101.根据实施方案81的成像试剂,其中多个三元复合体固定至支持物上,或者多个三元复合体固定至支持物上的涂层(例如,亲水性聚合物涂层)上。
实施方案102.根据实施方案101的成像试剂,其中亲水性聚合物涂层的水接触角不超过45-50度。
实施方案103.根据实施方案101的成像试剂,其中多个三元复合体固定至支持物上的一层或多层聚合物涂层上,并且其中固定化三元复合体的密度为约100-100,000/mm2。
实施方案104.根据实施方案101的成像试剂,其中多个固定化三元复合体彼此流体连通,以允许成像试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化三元复合体可以以大规模平行的方式基本上同时与成像试剂反应。
实施方案105.一种步进试剂,其包含:至少一种溶剂、至少一种pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、催化二价阳离子、洗涤剂、第二测序聚合酶和多个核苷酸(例如,游离核苷酸)。
实施方案106.根据实施方案105的步进试剂,其中催化二价阳离子包含镁和/或锰。
实施方案107.根据实施方案105的步进试剂,其缺乏包含锶和/或钡的非催化二价阳离子。
实施方案108.根据实施方案105的步进试剂,其中一价盐包含NaCl、KCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾。
实施方案109.根据实施方案105的步进试剂,其进一步包含至少一种黏度剂。
实施方案110.根据实施方案105的步进试剂,其任选地包括与核酸模板分子的至少一部分杂交的多个测序引物,其中多个测序引物包含3’可延伸末端或3’不可延伸末端。
实施方案111.根据实施方案105的步进试剂,其中多个核苷酸包含选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP的至少一种类型的核苷酸。
实施方案112.根据实施方案105的步进试剂,其中多个核苷酸包含选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP的核苷酸的任何组合中的两种或更多种的混合物。
实施方案113.根据实施方案105的步进试剂,其中多个核苷酸中的至少一个是荧光标记的。
实施方案114.根据实施方案113的步进试剂,其中多个荧光标记的核苷酸各自包含附接至核苷酸碱基的荧光团,其中附接的荧光团对应于核苷酸的碱基,以允许区分不同荧光标记的核苷酸的核苷酸碱基。
实施方案115.根据实施方案114的步进试剂,其中多个荧光标记的核苷酸各自包含荧光团,该荧光团经由可切割接头附接至核苷酸的碱基,可切割接头可用切割可切割接头的化合物切割,以从核苷酸上去除荧光团。
实施方案116.根据实施方案105的步进试剂,其中多个核苷酸中的至少一个核苷酸包括附接至核苷酸的2’或3’糖位置的链终止部分。
实施方案117.根据实施方案116的步进试剂,其中至少一个链终止核苷酸包含附接至核苷酸单元的2’或3’糖位置的链终止部分,并且其中通过使链终止核苷酸与切割/去除链终止部分的化合物接触,可以从核苷酸上去除链终止部分。
实施方案118.根据实施方案105的步进试剂,其中第二测序聚合酶包含来自Candidatus altiarchaeales古细菌的重组突变型聚合酶,该重组突变型聚合酶具有与SEQID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列,其中第二测序聚合酶在选自Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567的一个或多个位置处包含氨基酸取代。
实施方案119.根据实施方案105的步进试剂,其中第二测序聚合酶包含(i)选自Leu416Ser、Leu416Phe和Leu416Tyr的氨基酸取代;以及(ii)Tyr417Ala、Pro418Gly、Ala493Ser、Ile529His、Arg515Leu和Asn567Asp的氨基酸取代。
实施方案120.根据实施方案105的步进试剂,其中第二测序聚合酶包含SEQ IDNO:2、3、4或5中任一者的氨基酸序列。
实施方案121.根据实施方案105的步进试剂,其进一步包含多个三元复合体,每个三元复合体包含与核酸双链体结合的第二测序聚合酶和互补核苷酸,该核酸双链体包括与测序引物杂交的核酸模板分子(例如,多联体),其中核苷酸用荧光团标记,并且核苷酸在与模板链中的互补核苷酸相对的位置处与测序引物的3’端结合。
实施方案122.根据实施方案121的步进试剂,其中多个三元复合体固定至支持物上,或者多个三元复合体固定至支持物上的涂层(例如,亲水性聚合物涂层)上。
实施方案123.根据实施方案122的步进试剂,其中亲水性聚合物涂层的水接触角不超过45-50度。
实施方案124.根据实施方案122的步进试剂,其中多个三元复合体固定至支持物上的一层或多层聚合物涂层上,并且其中固定化三元复合体的密度为约100-100,000/mm2。
实施方案125.根据实施方案122的步进试剂,其中多个固定化三元复合体彼此流体连通,以允许步进试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化三元复合体可以以大规模平行的方式基本上同时与步进试剂反应。
实施方案126.一种切割试剂,其包含:至少一种溶剂、pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、洗涤剂、切割剂和切割催化剂。
实施方案127.根据实施方案126的切割试剂,其中切割试剂可以通过切割/去除连接核苷酸碱基和荧光团的可切割接头而与荧光标记的核苷酸反应,从而从荧光标记的核苷酸上去除荧光团标记。
实施方案128.根据实施方案126的切割试剂,其中切割试剂可以通过切割/去除附接至核苷酸的2’或3’糖位置的链终止部分而与链终止核苷酸反应,以将链终止核苷酸转化为具有可延伸的3’OH糖基团的核苷酸。
实施方案129.根据实施方案126的切割试剂,其进一步包含固定至支持物上的多个核酸双链体,其中核酸双链体内的模板分子(例如,多联体)固定至支持物或固定至支持物上的涂层(例如,聚合物涂层)上。
实施方案130.根据实施方案129的切割试剂,其中亲水性聚合物涂层的水接触角不超过45-50度。
实施方案131.根据实施方案129的切割试剂,其中多个核酸双链体固定至支持物上的一层或多层涂层上,并且其中固定化核酸双链体的密度为约100-100,000/mm2。
实施方案132.根据实施方案129的切割试剂,其中多个固定化核酸双链体彼此流体连通,以允许切割试剂的溶液流至支持物上,使得支持物上的多个固定化核酸双链体可以以大规模平行的方式基本上同时与切割试剂反应。
实施方案133.一种用于进行核酸测序工作流的方法,其包括:(a)在核酸杂交试剂的存在下,使多个核酸模板分子与多个扩增引物在适于形成多个核酸双链体的条件下接触,每个双链体包含与扩增引物杂交的模板分子,其中扩增引物固定至支持物上,并且其中核酸杂交试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、至少一种一价阳离子和离液剂,其中核酸杂交试剂任选地包括洗涤剂、还原剂、螯合剂、醇、两性离子、糖醇和/或拥挤剂中的任一种或两种或更多种的任何组合;(b)任选地用通用洗涤试剂在适于保留步骤(a)中形成的核酸双链体的条件下洗涤步骤(a)中形成的多个固定化核酸双链体,其中通用洗涤试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子和洗涤剂;(c)使多个核酸双链体与第一扩增试剂接触,该第一扩增试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、铵离子、多个核苷酸和扩增聚合酶,并且其中第一扩增试剂任选地进一步包含洗涤剂、还原剂、黏度剂和/或多个缩合寡核苷酸中的任一种或两种或更多种的任何组合,其中第一扩增试剂的pH抑制扩增聚合酶的活性,其中步骤(c)的接触在适于形成多个复合的扩增聚合酶的条件下进行,每种复合的扩增聚合酶包含扩增聚合酶和与核酸双链体结合的核苷酸;(d)使来自步骤(c)的多个多联体与第二扩增试剂在适于保留多种复合的扩增聚合酶的条件下接触,并且该条件适于进行多个核酸扩增反应以形成固定至支持物上的多个多联体,其中第二扩增试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、铵离子和多个核苷酸,其中第二扩增试剂任选地包括洗涤剂、还原剂、黏度剂和/或多个缩合寡核苷酸中的任一种或两种或更多种的任何组合,其中第二扩增试剂的pH适于促进扩增聚合酶的活性,并且其中第二扩增试剂缺乏扩增聚合酶;(e)使步骤(d)中形成的多个固定化多联体与洗脱试剂在适于保留固定化多联体并且适于去除(例如,洗去)来自步骤(c)和(d)的扩增聚合酶和核苷酸的条件下接触,其中洗脱试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、洗涤剂和离液剂;(f)任选地用通用洗涤试剂在适于保留多个固定化多联体的条件下洗涤步骤(d)中形成的多个固定化多联体,其中通用洗涤试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子和洗涤剂;(g)使多个固定化多联体与捕获试剂接触,该捕获试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂、多个荧光标记的多价分子、多个测序引物和第一测序聚合酶,并且捕获试剂任选地包括至少一种黏度剂,其中非催化二价阳离子包含锶和/或钡,其中多个多价分子中的单个多价分子包含(1)核心,和(2)多个核苷酸臂,其中每个臂包含(i)核心附接部分、(ii)包含PEG部分的间隔区、(iii)接头和(iv)荧光标记的核苷酸单元,并且其中步骤(g)的接触在适于通过将固定化多联体与测序引物、第一测序聚合酶和多个荧光标记的多价分子结合而形成多个固定化荧光标记的三元复合体的条件下进行,并且其中在固定化荧光标记的三元复合体中核苷酸单元不掺入测序引物中;(h)使多个固定化多联体与捕获后试剂在适于保存多个固定化荧光标记的三元复合体而不聚合酶催化掺入荧光标记的核苷酸单元的条件下接触,其中捕获后试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂和第一测序聚合酶,其中非催化二价阳离子包含锶和/或钡,其中捕获后试剂缺乏多个多价分子,并且其中捕获后试剂任选地包含至少一种黏度剂;(i)使多个固定化荧光标记的三元复合体与成像试剂接触,并通过将多个三元复合体暴露于激发光照并检测响应于激发光照由固定化荧光标记的三元复合体发射的荧光信号来检测多个固定化荧光标记的三元复合体中至少一个的存在,其中成像试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂和用于减少光损伤的至少一种化合物,并且成像试剂任选地包括至少一种黏度剂;(j)鉴定与测序引物结合的多价分子的荧光标记的核苷酸单元,作为步骤(i)中检测的荧光标记的三元复合体的一部分;(k)使多个固定化荧光标记的三元复合体与洗脱试剂在适于通过从固定化核酸双链体中去除荧光标记的多价分子和第一测序聚合酶而解离荧光标记的三元复合体的条件下和在适于保留固定化核酸双链体的条件下接触,其中洗脱试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、洗涤剂和离液剂;(l)任选地在适于保留多个固定化核酸双链体的条件下,用通用洗涤试剂洗涤多个固定化核酸双链体,其中通用洗涤试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子和洗涤剂;(m)使多个固定化核酸双链体与步进试剂接触,该步进试剂包含至少一种溶剂、至少一种pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、催化二价阳离子、洗涤剂、第二测序聚合酶和各自具有附接至3’糖位置的可切割链终止部分的多个核苷酸,其中催化二价阳离子包含镁和/或锰,其中步进试剂任选地包括至少一种黏度剂,其中步骤(m)的接触在适于通过将单个固定化双链体与第二测序聚合酶和互补核苷酸结合而形成多个固定化三元复合体的条件下进行,并且该条件适于促进聚合酶催化的核苷酸掺入,从而生成多个固定化延伸的核酸双链体,每个固定化延伸的核酸双链体包含与延伸的测序引物杂交的固定化模板多联体;(n)使多个固定化延伸的核酸双链体与洗脱试剂在适于去除第二测序聚合酶和链终止核苷酸的条件下以及在保留多个固定化延伸的核酸双链体的条件下接触,其中洗脱试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、洗涤剂和离液剂;(o)任选地在适于保留多个固定化延伸的核酸双链体的条件下洗涤多个固定化延伸的核酸双链体,其中通用洗涤试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子和洗涤剂;(p)使多个固定化延伸的核酸双链体与切割试剂在适于从掺入在延伸的测序引物上的核苷酸上切割链终止部分的条件下接触,从而生成多个固定化延伸的核酸双链体,每个固定化延伸的核酸双链体具有含3’可延伸末端的延伸的测序引物,其中切割试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、洗涤剂、从掺入的核苷酸上切割链终止部分的切割试剂和切割催化剂;(q)任选地在适于保留多个固定化延伸的核酸双链体的条件下洗涤多个固定化延伸的核酸双链体,其中通用洗涤试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子和洗涤剂;以及(r)重复步骤(g)-(q),区别在于在重复的步骤(g)中,在不存在测序引物的情况下,使多个固定化多联体与捕获试剂接触。
实施方案134.根据实施方案133的方法,其中第一测序聚合酶包含来自Candidatus altiarchaeales古细菌的重组野生型或突变型聚合酶,其包含与SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列。
实施方案135.根据实施方案134的方法,其中突变型DNA聚合酶在选自Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567的一个或多个位置处包含氨基酸取代。
实施方案136.根据实施方案133的方法,其中第二测序聚合酶包含来自Candidatus altiarchaeales古细菌的重组野生型或突变型聚合酶,其包含与SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列。
实施方案137.根据实施方案136的方法,其中突变型DNA聚合酶在选自Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567的一个或多个位置处包含氨基酸取代。
Claims (60)
1.一种分析核酸的方法,所述方法包括:
(a)使引发的核酸序列与荧光标记的核苷酸缀合物在足以形成结合复合体的条件下接触,所述结合复合体包含与所述荧光标记的核苷酸缀合物的第二核苷酸结合的所述引发的核酸分子的第一核苷酸;
(b)使所述结合复合体与成像试剂接触;以及
(c)在所述成像试剂的存在下获得所述结合复合体的图像,从而与在不存在所述成像试剂的类似条件下的光漂白风险相比,降低所述荧光标记的核苷酸缀合物的光漂白风险。
2.根据权利要求1所述的方法,其进一步包括通过分析(c)中获得的所述图像来鉴定所述第一核苷酸。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述成像试剂包含抗坏血酸。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述抗坏血酸包含抗坏血酸钠。
5.根据权利要求3所述的方法,其中所述抗坏血酸的浓度为至少20mM。
6.根据权利要求3所述的方法,其中所述抗坏血酸的浓度为约10mM至约100mM。
7.根据权利要求3所述的方法,其中所述抗坏血酸的浓度为约50mM。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述荧光标记的核苷酸缀合物包含:(i)核心、(ii)与其偶联的多个所述第二核苷酸,和(iii)直接与所述核心偶联的一个或多个荧光团。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述荧光标记的核苷酸缀合物进一步包含将所述多个所述第二核苷酸连接至所述核心的核心附接部分。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述第二核苷酸包含约3至约10个磷酸基团。
11.根据权利要求1所述的方法,其中所述第二核苷酸是包含可去除的链终止部分的核苷三磷酸。
12.根据权利要求1所述的方法,其进一步包括使所述引发的核酸序列与聚合酶在足以形成所述结合复合体的条件下接触,其中所述结合复合体进一步包含所述聚合酶。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述聚合酶缺乏可检测标记。
14.根据权利要求12所述的方法,其中所述聚合酶包含可检测标记。
15.根据权利要求1所述的方法,其中所述结合复合体固定至支持物上。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述支持物包含表面,并且其中所述表面包含与其偶联的亲水性涂层。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述亲水性涂层包含小于50度的水接触角。
18.根据权利要求1所述的方法,其进一步包括使所述引发的核酸序列与第二荧光标记的核苷酸缀合物在足以形成第二结合复合体的条件下接触,所述第二结合复合体包含与所述荧光标记的核苷酸缀合物的第三核苷酸结合的所述引发的核酸分子的下一个核苷酸,其中所述第三核苷酸不同于所述第二核苷酸。
19.根据权利要求1所述的方法,其中所述引发的核酸序列包含在多联体核酸分子中,所述多联体核酸分子包含所述引发的核酸序列的串联重复序列。
20.根据权利要求1所述的方法,其中所述成像试剂包含抑制所述第二核苷酸掺入的非催化二价阳离子,其中所述非催化二价阳离子包含锶、钡、钪、钛、钙、钒、铬、铁、钴、镍、铜、锌、镓、锗、砷、硒、铑、铕、锡或铽离子。
21.一种用于在成像期间减少生物实体的光漂白的制剂,所述制剂包含:至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂和抗坏血酸。
22.根据权利要求21所述的制剂,其中所述pH缓冲剂包含Tris-HCl。
23.根据权利要求22所述的制剂,其中所述Tris-HCl的pH为约8.8。
24.根据权利要求21所述的制剂,其中所述螯合剂包含EDTA。
25.根据权利要求21所述的制剂,其中所述一价阳离子包含NaCl、KCl、(NH4)2SO4或谷氨酸钾。
26.根据权利要求21所述的制剂,其中所述非催化二价阳离子包含锶、钡、钪、钛、钙、钒、铬、铁、钴、镍、铜、锌、镓、锗、砷、硒、铑、铕、锡或铽离子,或其组合。
27.根据权利要求21所述的制剂,其中所述制剂缺乏包含镁或锰或其组合的催化二价阳离子。
28.根据权利要求21所述的制剂,其中所述洗涤剂包含Triton X-100。
29.根据权利要求21所述的制剂,其中所述制剂进一步包含糖。
30.根据权利要求21所述的制剂,其中所述制剂进一步包含黏度剂,所述黏度剂包含甘油。
31.根据权利要求21所述的制剂,其中所述制剂进一步包含1,3,5,7环辛四烯(COT)。
32.根据权利要求31所述的制剂,其中所述COT的浓度为约2毫摩尔(mM)。
33.根据权利要求21所述的制剂,其中所述抗坏血酸包含抗坏血酸钠。
34.根据权利要求21-33中任一项所述的制剂,其中所述抗坏血酸的浓度为至少10mM。
35.根据权利要求21-33中任一项所述的制剂,其中所述抗坏血酸的浓度为至少20mM。
36.根据权利要求21-33中任一项所述的制剂,其中所述抗坏血酸的浓度为约10mM至约100mM。
37.根据权利要求21-33中任一项所述的制剂,其中所述抗坏血酸的浓度为约50mM。
38.根据权利要求21所述的制剂,其中所述制剂进一步包含Trolox。
39.根据权利要求37所述的制剂,其中所述Trolox的浓度为约2mM。
40.根据权利要求21所述的制剂,其中所述制剂进一步包含3-硝基苯甲酸(NBA)。
41.根据权利要求21所述的制剂,其中所述制剂进一步包含半胱胺。
42.一种制剂,其包含(i)至少一种溶剂、(ii)pH缓冲剂、(iii)螯合剂、(iv)至少一种一价阳离子、(v)非催化二价阳离子、(vi)洗涤剂、(vii)多个多价分子和(viii)测序聚合酶,其中所述多个多价分子中的每一个包含(1)核心,和(2)与所述核心偶联的多个核苷酸和多个可检测部分,并且其中所述测序聚合酶包含与SEQ ID NO:2-5中的任一者具有至少80%同一性的氨基酸序列。
43.根据权利要求42所述的制剂,其中所述多个多价分子中的每一个进一步包含将所述多个核苷酸偶联至所述核心的接头,并且其中所述接头包含具有2-6个亚基的脂族链或具有2-6个亚基的低聚乙二醇链。
44.根据权利要求42所述的制剂,其中所述核心是球形的。
45.根据权利要求41所述的制剂,其中所述多个核苷酸是选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP的相同类型的核苷酸。
46.根据权利要求41所述的制剂,其中所述多个多价分子包含两种或更多种不同类型的多价分子,其中所述两种或更多种不同类型的所述多价分子中的每一种包含不同的多个核苷酸。
47.根据权利要求41所述的制剂,其中所述测序聚合酶在氨基酸序列中包含突变,所述氨基酸序列相对于包含Leu416、Tyr417、Pro418、Ala493、Arg515、Ile529和Asn567的SEQ IDNO:1在一个或多个位置处包含取代。
48.根据权利要求41所述的制剂,其中所述测序聚合酶包含SEQID NO:2-5中任一者的氨基酸序列。
49.一种试剂盒,其包含一个或多个容器,所述一个或多个容器含有根据权利要求21-48中任一项所述的制剂。
50.根据权利要求42所述的试剂盒,其中所述试剂盒进一步包含在所述制剂存在下在生化反应期间在对所述生物实体进行成像的同时减少对所述生物实体的光损伤的用法说明。
51.根据权利要求43所述的试剂盒,其中所述生化反应包括测序反应。
52.根据权利要求43所述的试剂盒,其中所述用法说明包括在对所述生物实体进行成像之前在所述生化反应期间将所述生物实体浸没在所述制剂中。
53.一种试剂盒,其包含:
捕获试剂,所述捕获试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂、多个荧光标记的核苷酸缀合物和第一测序聚合酶;
捕获后试剂,所述捕获后试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂和第一测序聚合酶;
成像试剂,所述成像试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、至少一种一价阳离子、非催化二价阳离子、洗涤剂和抗坏血酸;以及
步进试剂,所述步进试剂包含至少一种溶剂、至少一种pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、催化二价阳离子、洗涤剂、第二测序聚合酶和多个核苷酸,其中所述多个核苷酸中的每个核苷酸包含附接至3’糖位置的可切割终止子部分。
54.根据权利要求53所述的试剂盒,其进一步包含使用所述捕获试剂的用法说明,其中所述用法说明包括使多个固定化模板核酸分子与(i)所述捕获试剂和(ii)多个测序引物在足以形成多个固定化荧光标记的三元复合体而不将所述多个荧光标记的核苷酸缀合物掺入所述测序引物中的条件下接触。
55.根据权利要求54所述的试剂盒,其进一步包含使用所述捕获后试剂的用法说明,其中所述用法说明包括使所述多个固定化荧光标记的三元复合体与捕获后试剂在足以保存所述多个固定化荧光标记的三元复合体而不将所述多个固定化荧光标记的三元复合体掺入所述测序引物中的条件下接触。
56.根据权利要求55所述的试剂盒,其进一步包含使用所述步进试剂的用法说明,其中所述用法说明包括使所述多个固定化模板核酸分子与所述步进试剂在足以使所述固定化模板核酸分子延伸的条件下接触。
57.根据权利要求53所述的试剂盒,其进一步包含:
第一扩增试剂,所述第一扩增试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、铵离子、多个核苷酸和扩增聚合酶;以及
第二扩增试剂,所述第二扩增试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、至少一种一价阳离子、铵离子和多个核苷酸。
58.根据权利要求57所述的试剂盒,其进一步包含使用所述第一扩增试剂和所述第二扩增试剂的用法说明,其中所述用法说明包括:
使所述固定化模板核酸分子与第一扩增试剂在抑制所述扩增聚合酶活性的条件下接触;以及
使所述固定化模板核酸分子与第二扩增试剂在适于恢复所述扩增聚合酶活性的条件下接触以进行多个核酸扩增反应。
59.根据权利要求53至58中任一项所述的试剂盒,其进一步包含:
洗脱试剂,所述洗脱试剂包含至少一种溶剂、pH缓冲剂、螯合剂、洗涤剂和离液剂。
60.根据权利要求53至59中任一项所述的试剂盒,其进一步包含核酸杂交试剂,所述核酸杂交试剂包含:
至少一种溶剂、pH缓冲剂和至少一种一价阳离子;以及
洗涤剂、还原剂、离液剂、螯合剂、醇、两性离子、糖醇或拥挤剂,或其组合。
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