WO2010116423A1 - テロメラーゼ反応阻害方法 - Google Patents

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WO2010116423A1
WO2010116423A1 PCT/JP2009/003232 JP2009003232W WO2010116423A1 WO 2010116423 A1 WO2010116423 A1 WO 2010116423A1 JP 2009003232 W JP2009003232 W JP 2009003232W WO 2010116423 A1 WO2010116423 A1 WO 2010116423A1
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telomerase
reaction
dna
stranded dna
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PCT/JP2009/003232
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夜久英信
三好大輔
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パナソニック株式会社
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    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
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    • A61K31/409—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having four such rings, e.g. porphine derivatives, bilirubin, biliverdine
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Definitions

  • the present invention relates to a method for inhibiting a DNA elongation reaction by telomerase.
  • telomere is a structure consisting of DNA and various proteins located at both ends of eukaryotic chromosomes.
  • the DNA in the telomere part (hereinafter simply referred to as “telomere DNA”) is a 6-base repetitive sequence of 5′-TTAGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 1), and is present at about 10,000 base pairs. At the 3 ′ end, it protrudes (overhangs) by about 100 bases and becomes a single strand.
  • telomeric DNA in normal somatic cells is shortened each time cell division occurs, reaches the limit of division life when it reaches about 5000 base pairs, and cells that are unable to divide eventually become apoptotic. It is known that
  • telomerase reaction this telomerase DNA elongation reaction (hereinafter simply referred to as “telomerase reaction”) is considered to be an important target in cancer treatment. It has been studied.
  • the G-quadruplex structure is a quadruplex DNA structure formed from a DNA sequence rich in guanine bases, including a single-stranded portion of a telomeric DNA sequence (5′-TTAGGG-3 ′, SEQ ID NO: 1). This is a sequence capable of forming a G-quadruplex structure.
  • telomerase cannot bind to the G-quadruplex structure, the telomerase reaction can be inhibited if the G-quadruplex structure can be stably present in the telomeric DNA. Therefore, a method for inhibiting telomerase reaction through G-quadruplex structure stabilization has been proposed by various compounds so far.
  • Patent Document 1 reports a telomerase reaction inhibitory effect by a pyrazolone derivative.
  • Patent Document 2 a general formula: a nitrogen-containing aromatic ring having a quaternary nitrogen atom- (NR3) p-CO-partitioning agent- (CO) m- (NR'3) qX-aromatic ring or non-aromatic ring, The telomerase reaction inhibitory effect by the compound which becomes is reported.
  • Patent Document 3 reports a telomerase reaction inhibitory effect by a compound having the following structure (Chemical Formula 1).
  • Non-patent document 1 Non-patent document 2 and Non-patent document 3 report the effects of telomerase, Phen-DC3, 360A on telomerase reaction inhibition, respectively.
  • Non-Patent Document 4 reports the effect of inhibiting telomerase reaction by TMPyP4.
  • perylene derivatives, quinolines and quinoline-related substances have been reported to have similar inhibitory effects.
  • genomic DNA has a double helix structure
  • non-specific interaction of these compounds with genomic DNA leads to cytotoxicity. More specifically, when these compounds bind nonspecifically to double-helix structure DNA, the DNA elongation reaction by a polymerase necessary for DNA replication is also inhibited.
  • anionic phthalocyanine specifically interacts with the G-quadruplex structure and has a high inhibitory effect on telomerase reaction.
  • the invention has been achieved.
  • the present invention for solving the above problems
  • the present invention relates to a method for inhibiting a DNA elongation reaction by telomerase, which comprises reacting anionic phthalocyanine as a telomerase inhibitor with DNA serving as a substrate for telomerase.
  • anionic phthalocyanine is added to a solution (in many cases, a buffer solution) containing telomerase, DNA serving as a substrate for telomerase reaction, and dNTP.
  • the anionic phthalocyanine preferably has at least one functional group obtained from the group consisting of a carboxyl group, a metal salt of a carboxyl group, a sulfo group, and a metal salt of a sulfo group.
  • the anionic phthalocyanine is either an anionic phthalocyanine coordinated with at least one metal obtained from the group consisting of copper, zinc, cobalt and nickel, or an anionic phthalocyanine in which no metal is coordinated It is desirable.
  • a method capable of inhibiting a telomerase reaction by specifically interacting with a G-quadruplex structure without a non-specific binding to a double-helix structure DNA by a compound capable of inhibiting a telomerase reaction by specifically interacting with a G-quadruplex structure without a non-specific binding to a double-helix structure DNA by a compound.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining an embodiment (in vitro) of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining an embodiment of the present invention (in vivo (in a human cell)).
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of an anionic phthalocyanine used in the embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of electrophoresis in Comparative Example 1.
  • FIG. 5 shows the relationship between the DNA concentration of the PCR control peak and the concentration of TMPyP or each anionic phthalocyanine in the reaction solution based on the results of electrophoresis analysis of Comparative Examples 1-2 and Examples 1-3. It is a graph.
  • FIG. 5 shows the relationship between the DNA concentration of the PCR control peak and the concentration of TMPyP or each anionic phthalocyanine in the reaction solution based on the results of electrophoresis analysis of Comparative Examples 1-2 and Examples 1-3. It is a graph.
  • FIG. 5 shows the relationship between the DNA concentration of the
  • FIG. 6 shows the total DNA concentration in the reaction product corresponding to the ladder-like peak and the reaction solution of TMPyP or each anionic phthalocyanine based on the results of electrophoresis analysis of Comparative Examples 1-2 and Examples 1-3. It is the graph which showed the relationship with the density
  • FIG. 7 is a graph showing a CD measurement result indicating that an anti-parallel G-quadruplex structure is formed.
  • FIG. 8 is a graph showing an absorption spectrum at 480 nm to 800 nm when CuPC and a G-quadruplex structure are mixed in Example 4.
  • FIG. 9 is a graph showing an absorption spectrum at 480 nm to 800 nm when CuPC and single-stranded DNA (A) or CuPC and double-stranded DNA (B) are mixed in Example 4.
  • FIG. 10 is a graph showing an absorption spectrum at 480 nm to 800 nm when NiPC and a G-quadruplex structure are mixed in Example 5.
  • FIG. 11 is a graph showing an absorption spectrum at 480 nm to 800 nm when NiPC and single-stranded DNA (A) or CuPC and double-stranded DNA (B) are mixed in Example 5.
  • FIG. 12 is a graph showing an absorption spectrum at 480 nm to 800 nm when PC and a G-quadruplex structure are mixed in Example 6.
  • FIG. 13 is a graph showing an absorption spectrum at 480 nm to 800 nm when PC and single-stranded DNA (A) or CuPC and double-stranded DNA (B) are mixed in Example 6.
  • FIG. 14 is a graph showing an absorption spectrum at 480 nm to 800 nm when CoPC and a G-quadruplex structure are mixed in Example 7.
  • FIG. 15 is a graph showing an absorption spectrum at 480 nm to 800 nm when CoPC and single-stranded DNA (A) or CuPC and double-stranded DNA (B) are mixed in Example 7.
  • FIG. 16 is a gel electrophoresis result showing the telomerase inhibitory effect of TMPyP in the absence of ⁇ DNA in Comparative Example 3.
  • FIG. 17 is a gel electrophoresis result showing the telomerase inhibitory effect of TMPyP in the presence of ⁇ DNA in Comparative Example 3.
  • FIG. 18 shows the results of gel electrophoresis showing the telomerase inhibitory effect of CuPC in the absence of ⁇ DNA in Example 4.
  • FIG. 19 is a gel electrophoresis result showing the telomerase inhibitory effect of CuPC in the presence of ⁇ DNA in Example 4.
  • FIG. 20 is the result of gel electrophoresis showing the telomerase inhibitory effect of NiPC in the absence of ⁇ DNA in Example 5.
  • FIG. 21 is a gel electrophoresis result showing the telomerase inhibitory effect of NiPC in the presence of ⁇ DNA in Example 6.
  • telomerase reaction occurs in a solution containing telomerase, DNA serving as a substrate of telomerase, and dNTP.
  • DNA serving as a substrate for telomerase extends in the 3 'direction while repeating telomeric DNA.
  • examples of “DNA serving as a substrate for telomerase” include TSprimer and telomeric DNA (SEQ ID NO: 1).
  • dNTP means a mixture of four types of deoxyribonucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP). However, since telomeric DNA (SEQ ID NO: 1) does not have C (cytosine), “dNTP” may not contain dCTP. DATP is deoxyadenosine triphosphate, dCTP is deoxycytidine triphosphate, dGTP is deoxyguanosine triphosphate, and dTTP is deoxythymidine triphosphate.
  • telomere reaction by an anionic phthalocyanine in vivo (in a human cell)
  • a method for inhibiting a telomerase reaction by an anionic phthalocyanine in vivo in a human cell
  • the telomeric portion at the end of the double-stranded DNA contained in the cell is derived from the repetitive sequence of telomeric DNA: 5′-TTAGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 1). Become. If such a telomere moiety, telomerase and dNTP are present, a telomerase reaction occurs.
  • the anionic phthalocyanine in the embodiment of the present invention is an anionic phthalocyanine coordinated with at least one metal obtained from the group consisting of copper, zinc, cobalt and nickel, or the metal is coordinated. It is preferably any of the anionic phthalocyanines that are not coordinated. Further, as shown in FIG. 3, the anionic phthalocyanine in the embodiment of the present invention includes at least one kind obtained from the group consisting of a carboxyl group, a metal salt of a carboxyl group, a sulfo group, and a metal salt of a sulfo group as a functional group. It is preferable to have.
  • Copper (II) phthalocyanine-3,4 ′, 4 ′′, 4 ′ ′′-tetrasulfonic acid tetrasodium salt (hereinafter simply referred to as CuPC) and Nickel (II) phthalocyanine tetrasulfulonic Acid tetrasodium salt (hereinafter simply referred to as NiPC) was purchased from Sigma-Aldrich.
  • Phthalocyanine tetrasulphonic acid (hereinafter simply referred to as PC) and Zinc (II) phthalocyanine tetrasulphonic acid (hereinafter simply referred to as ZnPC) were purchased from Funakoshi Co., Ltd.
  • TMPyP was purchased from Dojin Chemical Laboratory.
  • Cobalt (II) phthalocyanine tetracarboxylic acid (hereinafter simply referred to as CoPC) was synthesized by the inventors. The synthesis method is as follows.
  • trimellitic acid 20 g of urea, 4.75 g of cobalt chloride hexahydrate and 0.82 g of ammonium molybdate tetrahydrate were heated in an oil bath at 170 to 180 ° C. in 100 mL of nitrobenzene for 4.5 hours. After cooling, the nitrobenzene layer was removed by decantation. The residue was washed with methanol and water and then vacuum dried to obtain 8.66 g of a solid. After stirring 1.0 g of this solid in 30 g of 50% aqueous potassium hydroxide solution at 70 to 75 ° C. for 2 hours, 90 mL of water was added and stirred, followed by filtration.
  • the filtrate obtained here was made strongly acidic with 35-37% hydrochloric acid to precipitate a precipitate, which was collected by filtration. This precipitate was dissolved in 100 mL of 1N aqueous sodium hydroxide and filtered again. The filtrate obtained here was made strongly acidic again with hydrochloric acid, and the deposited precipitate was collected by filtration. This was washed with a large amount of water and then vacuum-dried to obtain CoPC as a powder of 0.1 g. CoPC used in the following examples was obtained by this synthesis.
  • telomerase activity measurement kit (TRAPEZE Telomerase Detection Kit S7700) manufactured by Millipore Corporation is used for the telomerase inhibitory effect of a typical known telomerase inhibitory effect material cationic porphyrin (TMPyP) and anionic phthalocyanine.
  • TMPyP cationic porphyrin
  • TRAPEZE Telomerase Detection Kit S7700 (hereinafter simply referred to as S7700 kit) is a kit including 10 ⁇ TRAP Reaction buffer, 50 ⁇ dNTP Mix, TS primer, Primer Mix, and control cell pellet.
  • TRAP Reaction buffer is a buffer solution for performing a reaction using the S7700 kit.
  • DNTP Mix is a mixed solution of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP.
  • the control cell pellet is a cell pellet containing telomerase, from which a solution containing telomerase can be prepared.
  • TS primer is an oligo DNA consisting of 5'AATCCGTCGAGCAGAGTT3 'and, like a human telomeric DNA sequence, is bound by telomerase and becomes the initiation sequence for the telomerase reaction.
  • the amount of reaction product of the telomerase reaction started from this TS primer may be directly quantified. However, since the amount of this product is very small, it cannot be detected by electrophoresis or the like, and it is necessary to amplify the obtained telomerase reaction product by PCR.
  • the RP primer is included in the Primer Mix of the S7700 kit.
  • This primer is an oligo DNA having a sequence complementary to the sequence extended by the telomerase reaction. Therefore, by performing PCR with the TS primer and the RP primer, the primer can be detected to an amount that can be detected by electrophoresis or the like.
  • the telomerase reaction product can be amplified.
  • thermostable polymerase but is not included in the S7700 kit, so this time, TITANIUM Taq polymerase (Clontech Laboratories) was used.
  • telomerase reaction and PCR are sequentially performed.
  • a material expected to inhibit the telomerase reaction in this case, TMPyP and anionic phthalocyanine is also mixed first. Then, it is only necessary to confirm whether or not a telomerase reaction product is detected from the result of electrophoresis performed last.
  • telomerase reaction product is not detected as a result of electrophoresis, it can be said that the material expected to inhibit the telomerase reaction actually inhibited the telomerase reaction. There is no point.
  • telomerase reaction is not inhibited, but the subsequent PCR may be inhibited.
  • telomerase reaction and PCR are performed as in the S7700 kit reaction, it is necessary to confirm that a material expected to inhibit the telomerase reaction does not inhibit normal PCR.
  • a set of template DNA and primers for confirming it is included in Primer Mix, and when PCR is performed, a 36 bp PCR amplification product is obtained from this set.
  • the telomerase reaction product was not detected and the 36 bp PCR product was normally amplified. It is necessary to confirm that.
  • Comparative Example 1 In Comparative Example 1, as described above, the activity of telomerase attached to the kit was measured using the S7700 kit. The measurement procedure was as follows.
  • a telomerase solution was prepared from the attached control cell pellet.
  • 2 ⁇ L of 10 ⁇ TRAP reaction buffer, 0.4 ⁇ L of 50 ⁇ dNTP Mix, 0.4 ⁇ L of TS primer, 0.4 ⁇ L of Primer Mix, 0.4 ⁇ L of TITANIUM Taq polymerase, 14 milliQ water (purified water) .8 ⁇ L and 1.6 ⁇ L of the prepared telomerase solution were mixed to prepare a reaction solution with a total volume of 20 ⁇ L.
  • telomerase reaction was performed by placing this reaction solution at 30 ° C. for 30 minutes, PCR was performed by repeating a temperature cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 59 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute 33 times. went.
  • the reaction solution after PCR was subjected to electrophoresis analysis with Bioanalyzer 2100 (manufactured by Agilent).
  • Fig. 4 shows the result of electrophoresis analysis.
  • the peak indicated by the lower marker indicated by the reference symbol “1” and the upper marker indicated by the reference symbol “2” indicate the length and concentration of the electrophoresed sample DNA. Internal control for electrophoretic analysis. Therefore, it has nothing to do with the above telomerase reaction and PCR reaction results.
  • the peak indicated as PCR control is a 36-bp PCR amplification product obtained from the template DNA and primer set contained in the above-mentioned Primer Mix.
  • the DNA concentration in the reaction product corresponding to the PCR control peak was 1.23 ng / ⁇ L
  • the total DNA concentration in the reaction product corresponding to the ladder-shaped peak was 2.95 ng / ⁇ L. there were.
  • Comparative Example 2 In Comparative Example 2, as in Comparative Example 1, the activity of telomerase attached to the kit was measured using the S7700 kit. However, at that time, TMPyP was added to the reaction solution. Specifically, it was as follows.
  • the reaction solution was placed under 30 ° C. for 30 minutes, and then a temperature cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 59 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute was repeated 33 times.
  • the electrophoresis analysis by Bioanalyzer2100 was performed.
  • Example 1 In Example 1, as in Comparative Example 1, the activity of telomerase attached to the kit was measured using the S7700 kit. However, at that time, CuPC was added to the reaction solution. Specifically, it was as follows.
  • the reaction solution was placed under 30 ° C. for 30 minutes, and then a temperature cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 59 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute was repeated 33 times.
  • the electrophoresis analysis by Bioanalyzer2100 was performed.
  • Example 2 In Example 2, as in Comparative Example 1, the activity of telomerase attached to the kit was measured using the S7700 kit. However, at that time, NiPC was added to the reaction solution. Specifically, it was as follows.
  • the reaction solution was placed under 30 ° C. for 30 minutes, and then a temperature cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 59 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute was repeated 33 times.
  • the electrophoresis analysis by Bioanalyzer2100 was performed.
  • Example 3 In Example 3, as in Comparative Example 1, the activity of telomerase attached to the kit was measured using the S7700 kit. However, at that time, PC was added to the reaction solution. Specifically, it was as follows.
  • the reaction solution was placed under 30 ° C. for 30 minutes, and then a temperature cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 59 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute was repeated 33 times.
  • the electrophoresis analysis by Bioanalyzer2100 was performed.
  • FIG. 5 shows that the DNA concentration is remarkably reduced depending on the concentration of TMPyP, and the DNA concentration when the TMPyP concentration is 3 ⁇ M or more is below the detection limit of Bioanalyzer 2100.
  • TMPyP inhibits the normal PCR reaction, which is considered to be because TMPyP is non-specifically bound to the double-stranded DNA as a template.
  • anionic phthalocyanine has a remarkable inhibitory effect on telomerase reaction compared to TMPyP which is a cationic substance known as a conventional telomerase reaction inhibitor candidate. was found to be large and the inhibition to the polymerase reaction was small.
  • telomerase inhibitory effects of TMPyP and anionic phthalocyanine will be compared using Comparative Example 3 and Examples 4 to 5 below.
  • the S7700 kit is used as in Comparative Examples 1 and 2 and Examples 1 to 3.
  • all the reagents necessary for the telomerase reaction and PCR were mixed first, and the telomerase reaction and PCR were sequentially performed by controlling the reaction temperature.
  • Comparative Example 3 and Examples 4 to 5 below only a reagent necessary for the telomerase reaction was mixed to perform the telomerase reaction, and then a part of the reaction solution and a reagent necessary for PCR were mixed. PCR was performed.
  • Comparative Example 3 In Comparative Example 3, the effect of inhibiting telomerase activity by TMPyP was examined using the S7700 kit. Specifically, it was as follows.
  • telomerase reaction solution having a total volume of 10 ⁇ L was prepared (prepared with final concentrations of TMPyP of 0 M, 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, and 10 ⁇ M, respectively). And the telomerase reaction was performed by putting this reaction liquid on 30 degreeC conditions for 60 minutes.
  • the solution after PCR was electrophoresed on a 10% polyacrylamide gel and stained with GelStar Nucleic Acid Stain (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the result of the gel obtained from the above is shown in FIG.
  • the final concentrations of TMPyP are 0 M, 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, and 10 ⁇ M. From this, it can be seen that as the final concentration of TMPyP increases, the band indicating the telomerase reaction product becomes thinner, and TMPyP inhibits the telomerase reaction. However, under the condition of 10 ⁇ M TMPyP, the band indicating the PCR control is also thin, indicating that the polymerase reaction is also inhibited.
  • telomerase reaction solution 2.6 ⁇ L of ⁇ DNA solution (manufactured by Takara Bio Inc.) was mixed instead of 2.6 ⁇ L of milliQ water.
  • ⁇ DNA solution manufactured by Takara Bio Inc.
  • Other telomerase reaction temperature / time conditions, PCR solution preparation conditions, PCR temperature / time conditions, and electrophoresis conditions are exactly the same. The result is shown in FIG.
  • the telomerase reaction is not inhibited at all even when the concentration of TMPyP is increased. That is, it can be seen that the telomerase inhibitory effect of TMPyP is significantly reduced under conditions where double-stranded DNA is present in a large amount such as genomic DNA.
  • Example 4 In Example 4, the same experiment as Comparative Example 3 was performed using CuPC instead of TMPyP. Experimental results are shown in FIGS. First, FIG. 18 shows the results under the condition where ⁇ DNA is not added. From the leftmost lane, the final concentrations of CuPC are 0 M, 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, and 10 ⁇ M. is there. This shows that the telomerase reaction is inhibited as the concentration of CuPC increases under these conditions. Unlike TMPyP (FIG. 16), PCR control amplification is not inhibited even in the case of 10 ⁇ M CuPC.
  • FIG. 19 shows the results in the presence of ⁇ DNA.
  • CuPC can efficiently inhibit the telomerase reaction even in the presence of ⁇ DNA, unlike the case of TMPyP. That is, it can be seen that CuPC can exert its telomerase inhibitory effect even under conditions where a large amount of double-stranded DNA is present, such as genomic DNA.
  • Example 5 In Example 5, the same experiment as Comparative Example 3 was performed using NiPC instead of TMPyP. The experimental results are shown in FIGS. First, FIG. 20 shows the results under the condition where ⁇ DNA is not added, and in the order from the leftmost lane, the final concentrations of NiPC are 0 M, 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, and 10 ⁇ M. . This shows that the telomerase reaction is inhibited as the concentration of NiPC increases under these conditions. Unlike TMPyP (FIG. 16), PCR control amplification was not inhibited even in the case of 10 ⁇ M NiPC.
  • FIG. 21 shows the results in the presence of ⁇ DNA. This shows that NiPC can efficiently inhibit the telomerase reaction even in the presence of ⁇ DNA, unlike the case of TMPyP. That is, it can be seen that NiPC can exert its telomerase reaction inhibitory effect even under conditions where a large amount of double-stranded DNA is present, such as genomic DNA.
  • CuPC and NiPC which are anionic phthalocyanines, differ from the cationic substance TMPyP known as a candidate telomerase reaction inhibitor candidate, as in genomic DNA. It was found that the telomerase reaction can be efficiently inhibited even under conditions where a large amount of double-stranded DNA is present.
  • telomeric oligo DNA Single-stranded DNA consisting of the sequence of 5′-gggttagggtgtgggtttaggg-3 ′ (SEQ ID NO: 2) (this sequence is similar to the sequence of the human telomeric portion, and hence this DNA is hereinafter referred to as human telomeric oligo DNA)
  • SEQ ID NO: 2 this sequence is similar to the sequence of the human telomeric portion, and hence this DNA is hereinafter referred to as human telomeric oligo DNA
  • the concentration of human telomere oligo DNA contained in the solution was 0, 0.5, 2, 5, 10, 25, 50, 100 ⁇ M.
  • a positive peak near 295 nm, a negative peak near 265 nm was recognized. This indicates that an anti-parallel G-quadruplex is formed.
  • the absolute values of the positive and negative peaks in the solution having a human telomere oligo DNA concentration of 100 ⁇ M are the largest, and the others are decreasing in the order of 50, 25, 10, 5, 2, 0.5 ⁇ M. This indicates that the concentration of the anti-parallel G-quadruplex-forming DNA obtained is higher when the concentration of the initially contained human telomere oligo DNA is higher.
  • G-quadruplex solutions prepared from solutions having human telomere oligo DNA concentrations of 100, 50, 25, 10, 5, 2, 0.5 ⁇ M were respectively prepared as G-quadruplex solutions A, B, C, D, Called E, F, G.
  • a solution that does not contain human telomere oligo DNA is called an NC solution.
  • Example 6 In Example 6, the interaction between CuPC and various DNAs was examined.
  • both the single-stranded DNA solution and the double-stranded DNA solution both have the case of the NC solution even though 50 ⁇ M of high-concentration DNA is contained. It turns out that it becomes almost the same result. Therefore, it can be seen that there is no interaction between CuPC and single-stranded DNA and between CuPC and double-stranded DNA.
  • Example 7 In Example 7, the interaction between NiPC and various DNAs was examined.
  • FIG. 11 (A) and FIG. 11 (B) Each measurement result in the case of a single-stranded DNA solution and a double-stranded DNA solution is shown in FIG. 11 (A) and FIG. 11 (B).
  • the results using the NC solution are also shown.
  • 11 (A) and 11 (B) both the single-stranded DNA solution and the double-stranded DNA solution both have the case of the NC solution, despite containing a high concentration of 50 ⁇ M DNA. It turns out that it becomes almost the same result. Therefore, it can be seen that there is no interaction between NiPC and single-stranded DNA and between CuPC and double-stranded DNA.
  • Example 8 In Example 8, the interaction between PC and various DNAs was examined.
  • Example 9 In Example 9, the interaction between CoPC and various DNAs was examined.
  • FIG. 14 shows that two peaks appear in the range of 660 to 740 nm except for the NC solution not containing DNA, and these peaks are larger in the order of G-quadruplex solution B> C> D> G. From the above results, it can be seen that there is an interaction between the CoPC and the G-quadruplex structure.
  • the peak increase in the range of 640 to 720 nm observed when CoPC is used is smaller than the result when CuPC, NiPC, or PC is used. This is probably because the synthesized CoPC was not sufficiently purified.
  • any anionic phthalocyanine is extremely specific although it interacts with the G-quadruplex structure and does not interact with single-stranded DNA or double-stranded DNA. I understood that. Therefore, anionic phthalocyanine is very suitable as a telomerase inhibitor, and it can be said that the telomerase inhibition method in the present invention is more effective than conventional methods.
  • the present invention provides a method for inhibiting telomerase. Since the telomerase reaction is known to cause canceration, the method of the present invention can be used for cancer treatment.

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Abstract

　本発明は、テロメラーゼによるＤＮＡ伸張反応を阻害する方法を提供することを目的とする。 具体的に本発明は、テロメラーゼによるＤＮＡ伸張反応を阻害する方法であって、テロメラーゼ、テロメラーゼ反応の基質となるＤＮＡ、およびｄＮＴＰを含有する溶液に、アニオン性フタロシアニンを添加する工程を有する、ことを特徴とする方法に関する。

Description

テロメラーゼ反応阻害方法
　本発明はテロメラーゼによるＤＮＡ伸長反応を阻害する方法に関する。
　テロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）は真核生物の染色体の両末端部分に位置するＤＮＡとさまざまなタンパク質からなる構造である。ヒトの場合、このテロメア部分におけるＤＮＡ（以下、単に「テロメアＤＮＡ」と呼ぶ）は５’－ＴＴＡＧＧＧ－３’（配列番号：１）という６塩基の繰り返し配列でおよそ1万塩基対存在しており、３’末端では１００塩基ほど突出（オーバーハング）して一本鎖になっている。
　これまでの研究により、通常の体細胞におけるテロメアＤＮＡは、細胞分裂が行われるたびに短くなり、５０００塩基対程度になると分裂寿命の限界に達し、分裂できなくなった細胞は最終的にはアポトーシスへと至ることが知られている。
　しかしながらその一方で、癌細胞の７０～８０％においては、短くなったテロメアＤＮＡを再び伸長させるテロメラーゼの活性が非常に高いため、その細胞が分裂寿命に至らず分裂をし続けてしまうことが明らかになってきている。したがって、近年このテロメラーゼによるテロメアＤＮＡの伸長反応（以下、単に「テロメラーゼ反応」と呼ぶ）は、癌治療における重要な標的であると考えられており、この反応の阻害剤や阻害方法が精力的に研究されている。
　テロメラーゼ反応の阻害方法は、種々提案されているが、その中にＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造の安定化による阻害方法がある。Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造とはグアニン塩基に富んだＤＮＡ配列から形成される四重鎖ＤＮＡ構造のことであり、テロメアＤＮＡ配列（５’－ＴＴＡＧＧＧ－３’、配列番号：１）の一本鎖部分もＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を形成できる配列である。
　テロメラーゼはＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造には結合できないため、テロメアＤＮＡ中おいてＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を安定に存在させることができればテロメラーゼ反応は阻害できる。従って、これまで様々な化合物によりＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造安定化を介したテロメラーゼ反応阻害方法が提案されてきた。
　特許文献１ではピラゾロン誘導体によるテロメラーゼ反応阻害効果が報告されている。特許文献２では一般式：四級窒素原子を有する窒素含有芳香環－（ＮＲ３）ｐ－ＣＯ－分配剤－（ＣＯ）ｍ－（ＮＲ’３）ｑ－Ｘ－芳香環または非芳香環、からなる化合物によるテロメラーゼ反応阻害効果が報告されている。また特許文献３では下記（化１）の構造からなる化合物によるテロメラーゼ反応阻害効果が報告されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３ではそれぞれ、テロメスタチン、Ｐｈｅｎ－ＤＣ３、３６０Ａによるテロメラーゼ反応阻害効果が報告されている。またさらに非特許文献４ではＴＭＰｙＰ４によるテロメラーゼ反応阻害効果が報告されている。これら以外にも例えばペリレン誘導体やキノリンおよびキノリン関連物質が同様の阻害効果があることが報告されている。
特開２００５－２８９８７４号公報 特表２００６－５１８７２６号公報 特表２００４－５０５０８２号公報
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００２）１２４，２０９８－２０９９ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００７）１２９，１８５６－１８５７ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００５）２４，２９１７－２９２８ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０，３２６１－３２６２
　上述したテロメラーゼ反応阻害に関わる化合物において最も重要な点は、二重らせん構造ＤＮＡとは相互作用せず、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造に対して特異的に結合しなければいけない点である。
　何故ならゲノムＤＮＡの大半は二重らせん構造であり、これら化合物が非特異的にゲノムＤＮＡと相互作用することは細胞毒性へとつながるためである。より具体的には、これら化合物が二重らせん構造ＤＮＡに対しても非特異的に結合してしまうと、ＤＮＡの複製に必要なポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応までも阻害してしまう。
　これまでＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造安定によるテロメラーゼ反応阻害を目的として開発されてきた化合物はいずれも電気的に中性かカチオン性である。これはＤＮＡ自身がアニオン性であるため、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへ結合させるという観点から考えた場合、アニオン性の化合物は静電的な反発が起こり、結合反応において不利と考えられるためである。従って、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造安定によるテロメラーゼ反応阻害を目的とした場合、アニオン性の化合物を用いるという考え方はなかった。
　以上のような背景の下、本発明者は鋭意検討した結果、アニオン性のフタロシアニンがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造と特異的に相互作用し、かつ高いテロメラーゼ反応阻害効果を有していることを見出し、本発明を達成するに至った。
　上記課題を解決する本発明は、
　テロメラーゼによるＤＮＡ伸張反応を阻害する方法であって、アニオン性フタロシアニンをテロメラーゼ阻害剤としてテロメラーゼの基質となるＤＮＡと反応させることを特徴とするテロメラーゼ反応阻害方法に関する。
　具体的には、本発明に係るテロメラーゼ反応阻害方法は、テロメラーゼ、テロメラーゼ反応の基質となるＤＮＡ、およびｄＮＴＰを含有する溶液（多くの場合、緩衝液）に、アニオン性フタロシアニンを添加する。
　前記アニオン性フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有していることが望ましい。
　前記アニオン性フタロシアニンは、銅、亜鉛、コバルトおよびニッケルからなる群より得られる少なくとも一種の金属が配位したアニオン性フタロシアニンであるか、または金属が配位していないアニオン性フタロシアニンのいずれかであることが望ましい。
　本発明の上記目的、他の目的、特徴および利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
　本発明により、化合物による二重らせん構造ＤＮＡへの非特異的結合がなく、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造に対して特異的に相互作用しテロメラーゼ反応を阻害できる方法が提供される。
図１は、本発明の実施形態（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）を説明するための図である。 図２は、本発明の実施形態（ｉｎ　ｖｉｖｏ（ヒト細胞内））を説明するための図である。 図３は、本発明の実施形態で用いられるアニオン性フタロシアニンの例を示す図である。 図４は、比較例１における電気泳動結果を示すグラフである。 図５は、比較例１～２および実施例１～３の各電気泳動解析結果に基づき、ＰＣＲ　ｃｏｎｔｒｏｌのピークのＤＮＡ濃度と、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの反応液中における濃度との関係を示したグラフである。 図６は、比較例１～２および実施例１～３の各電気泳動解析結果に基づき、ラダー状のピークに相当する反応産物中の合計ＤＮＡ濃度と、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの反応液中における濃度との関係を示したグラフである。 図７は、アンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造が形成されていることを示すＣＤ測定結果を示すグラフである。 図８は、実施例４において、ＣｕＰＣとＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を混合した際の４８０ｎｍ～８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。 図９は、実施例４において、ＣｕＰＣと一本鎖ＤＮＡ（Ａ）、あるいはＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ（Ｂ）を混合した際の４８０ｎｍ～８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。 図１０は、実施例５において、ＮｉＰＣとＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を混合した際の４８０ｎｍ～８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。 図１１は、実施例５において、ＮｉＰＣと一本鎖ＤＮＡ（Ａ）、あるいはＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ（Ｂ）を混合した際の４８０ｎｍ～８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。 図１２は、実施例６において、ＰＣとＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を混合した際の４８０ｎｍ～８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。 図１３は、実施例６において、ＰＣと一本鎖ＤＮＡ（Ａ）、あるいはＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ（Ｂ）を混合した際の４８０ｎｍ～８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。 図１４は、実施例７において、ＣｏＰＣとＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を混合した際の４８０ｎｍ～８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。 図１５は、実施例７において、ＣｏＰＣと一本鎖ＤＮＡ（Ａ）、あるいはＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ（Ｂ）を混合した際の４８０ｎｍ～８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。 図１６は、比較例３における、λＤＮＡ非存在下でのＴＭＰｙＰによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。 図１７は、比較例３における、λＤＮＡ存在下でのＴＭＰｙＰによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。 図１８は、実施例４における、λＤＮＡ非存在下でのＣｕＰＣによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。 図１９は、実施例４における、λＤＮＡ存在下でのＣｕＰＣによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。 図２０は、実施例５における、λＤＮＡ非存在下でのＮｉＰＣによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。 図２１は、実施例６における、λＤＮＡ存在下でのＮｉＰＣによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
　以下本発明の実施の形態について、適宜図面を参酌しながら説明する。
　まず、本発明の実施形態の一例として、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるアニオン性フタロシアニンによるテロメラーゼ反応阻害方法について、図１を用いて説明する。
　まず、図１（ａ）に示すように、テロメラーゼ、テロメラーゼの基質となるＤＮＡ、およびｄＮＴＰを含有する溶液においては、テロメラーゼ反応が生じる。これにより、テロメラーゼの基質となるＤＮＡは、テロメアＤＮＡを繰り返しながら３’方向に伸長する。
　一方、後述する実施例から裏付けられるように、図１（ｂ）に示すように、テロメラーゼ、テロメラーゼの基質となるＤＮＡ、およびｄＮＴＰを含有する溶液に、アニオン性フタロシアニンがさらに含有されている場合には、テロメラーゼ反応が抑制される。これが本発明の趣旨である。
　ここで、「テロメラーゼの基質となるＤＮＡ」としては、例えば、ＴＳｐｒｉｍｅｒ、テロメアＤＮＡ（配列番号：１）を挙げることができる。
　本明細書において用いられる用語「ｄＮＴＰ」とは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）の混合物を意味する。ただし、テロメアＤＮＡ（配列番号：１）は、Ｃ（シトシン）を有しないので、「ｄＮＴＰ」にはｄＣＴＰが含まれなくても良い。なお、ｄＡＴＰとはデオキシアデノシントリホスフェート、ｄＣＴＰとはデオキシシチジントリホスフェート、ｄＧＴＰとはデオキシグアノシントリホスフェート、ｄＴＴＰとはデオキシチミジントリホスフェートである。
　次に、本発明の実施形態の一例として、ｉｎ　ｖｉｖｏ（ヒト細胞内）におけるアニオン性フタロシアニンによるテロメラーゼ反応阻害方法について、図２を用いて説明する。図２（ａ）に示すように、ｉｎ　ｖｉｖｏでは、細胞に含まれる二重鎖ＤＮＡの末端が有するテロメア部分は、テロメアＤＮＡ：５’－ＴＴＡＧＧＧ－３’（配列番号：１）の繰り返し配列からなる。そして、このようなテロメア部分、テロメラーゼおよびｄＮＴＰが存在すれば、テロメラーゼ反応が生じる。
　しかし、図２（ｂ）に示すように、アニオン性フタロシアニンが存在すれば、細胞内テロメラーゼ反応は抑制される。
　本発明の実施形態におけるアニオン性フタロシアニンは、図３に示すように、銅、亜鉛、コバルトおよびニッケルからなる群より得られる少なくとも一種の金属が配位したアニオン性フタロシアニンであるか、または金属が配位していないアニオン性フタロシアニンのいずれかであることが好ましい。また、本発明の実施形態におけるアニオン性フタロシアニンは、図３に示すように、官能基として、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種を有していることが好ましい。
　以下の実施例で用いられるフタロシアニンのうち、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ－３，４’，４’’，４’’’－ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ（以下、単にＣｕＰＣと呼ぶ）およびＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ（以下、単にＮｉＰＣと呼ぶ）はシグマ・アルドリッチ（株）より購入した。Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（以下、単にＰＣと呼ぶ）およびＺｉｎｃ（ＩＩ）　ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（以下、単にＺｎＰＣと呼ぶ）は（株）フナコシより購入した。ＴＭＰｙＰは同仁化学研究所（株）より購入した。Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ　ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ（以下、単にＣｏＰＣと呼ぶ）は発明者が合成した。合成方法は下記のとおりである。
　トリメリット酸６．４ｇ、尿素２０ｇ、塩化コバルト六水和物４．７５ｇおよびモリブデン酸アンモニウム四水和物０．８２ｇを１００ｍＬのニトロベンゼン中１７０～１８０℃の油浴中で４．５時間加熱し、放冷後、デカンテーションでニトロベンゼン層を除いた。残留物をメタノールおよび水で洗浄後、真空乾燥して８．６６ｇの固形物を得た。この固形物１．０ｇを５０％水酸化カリウム水溶液３０ｇ中、７０～７５℃で２時間攪拌後、９０ｍＬの水を添加、攪拌し、これをろ過した。ここで得られたろ液を３５～３７％塩酸で強酸性にすることで沈殿物を析出させ、これをろ取した。この沈殿物を１００ｍＬの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶かして再度ろ過した。ここで得られたろ液を再び塩酸によって強酸性にし、析出した沈殿物をろ取した。これを大量の水で洗浄した後、真空乾燥することでＣｏＰＣを０．１ｇの粉末として得た。以下の実施例で用いられるＣｏＰＣはこの合成により得られた。
　－アニオン性フタロシアニンによるテロメラーゼ活性阻害効果の検討－
　以下、比較例１、２および実施例１、２、３について説明する。ここでは、従来知られている代表的なテロメラーゼ阻害効果材料のカチオン性ポルフィリン（ＴＭＰｙＰ）と、アニオン性フタロシアニンによるテロメラーゼ阻害効果について、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のテロメラーゼ活性測定用キット（ＴＲＡＰＥＺＥ　Ｔｅｌｏｍｅｒａｚｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｓ７７００）を用いて比較検討を行った。
　ＴＲＡＰＥＺＥ　Ｔｅｌｏｍｅｒａｚｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｓ７７００（以下、単にＳ７７００キットと呼ぶ）は、１０×ＴＲＡＰ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ、５０×ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ、ＴＳ　ｐｒｉｍｅｒ、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘ、ｃｏｎｔｒｏｌ　ｃｅｌｌ　ｐｅｌｌｅｔを含むキットである。
　ここで、ＴＲＡＰ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒはＳ７７００キットを用いて反応を行うための緩衝液である。
　ｄＮＴＰ　ＭｉｘはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合液である。
　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｃｅｌｌ　ｐｅｌｌｅｔは、テロメラーゼを含む細胞のペレットであり、これよりテロメラーゼを含む溶液を調製することができる。
　ＴＳ　ｐｒｉｍｅｒは、５’ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ３’からなるオリゴＤＮＡで、ヒトのテロメアＤＮＡ配列と同様に、テロメラーゼによる結合を受け、テロメラーゼ反応の開始配列となる。
　本来であれば、このＴＳ　ｐｒｉｍｅｒから開始したテロメラーゼ反応の反応産物量を直接定量できればよい。しかし、この産物量は非常に少ないため、電気泳動などでは検出できず、得られたテロメラーゼ反応産物をＰＣＲで増幅する必要がある。
　そのためＳ７７００キットのＰｒｉｍｅｒ　ＭｉｘにはＲＰ　ｐｒｉｍｅｒが含まれている。このプライマーは、テロメラーゼ反応により伸長された配列に相補的な配列を有するオリゴＤＮＡであり、したがって、上記ＴＳ　ｐｒｉｍｅｒと、このＲＰ　ｐｒｉｍｅｒとでＰＣＲを行うことにより、電気泳動などで検出可能な量までテロメラーゼ反応産物を増幅させることができる。
　ＰＣＲには耐熱性のポリメラーゼが必要であるが、Ｓ７７００キットには含まれていないので、今回はＴＩＴＡＮＩＵＭ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いた。
　以上のように、Ｓ７７００キットを用いたテロメラーゼ活性測定では、テロメラーゼ反応とＰＣＲを順に行わせる。
　実際には、比較例１～２および実施例１～３で詳細に説明するように、必要な試薬は全て最初に混合し、この反応液の温度制御をすることで、テロメラーゼ反応とＰＣＲを順に行わせる。
　このとき、テロメラーゼ反応を阻害すると期待される材料（今回の場合は、ＴＭＰｙＰとアニオン性フタロシアニン）も最初に混合しておく。そして最後に行う電気泳動結果で、テロメラーゼ反応産物が検出されるか否かを確認すればよい。
　しかし、ここで気をつけなければいけないのは、電気泳動の結果、テロメラーゼ反応産物が検出されなかったとしても、テロメラーゼ反応を阻害すると期待される材料が、実際にテロメラーゼ反応を阻害したとは言えない点である。
　すなわち、テロメラーゼ反応は阻害していないが、その後のＰＣＲを阻害している可能性がある。
　例えば、二本鎖ＤＮＡに非特異的に結合する材料などはＰＣＲを阻害する可能性が高い。したがって、Ｓ７７００キットの反応のように、テロメラーゼ反応とＰＣＲを行う場合は、テロメラーゼ反応を阻害すると期待される材料が、通常のＰＣＲは阻害しないことを確認しておく必要がある。
　Ｓ７７００キットには、それを確認するための鋳型ＤＮＡとプライマーのセットがＰｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘ中に含まれており、ＰＣＲを行うと、このセットから３６ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られる。
　従って、Ｓ７７００キットを用いてテロメラーゼ反応を阻害すると期待される材料の効果を検証する場合、最後の電気泳動結果において、テロメラーゼ反応産物が検出されないことと、この３６ｂｐのＰＣＲ産物が正常に増幅されていることを確認する必要がある。
　（比較例１）
　比較例１では、上述のとおり、Ｓ７７００キットを用いて、キットに添付されたテロメラーゼの活性について測定した。測定手順は以下のとおりであった。
　まずキットのプロトコルに従い、添付されたｃｏｎｔｒｏｌ　ｃｅｌｌ　ｐｅｌｌｅｔよりテロメラーゼ溶液を調製した。次に、１０×ＴＲＡＰ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、５０×ｄＮＴＰ　Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＳ　ｐｒｉｍｅｒを０．４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＩＴＡＮＩＵＭ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．４μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水（精製水）を１４．８μＬ、上記調製済みテロメラーゼ溶液を１．６μＬ混合し、全容量２０μＬの反応液を調製した。
　そしてこの反応液を３０℃条件下に３０分間置くことでテロメラーゼ反応を行った後、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で１分間の温度サイクルを３３回繰り返すことでＰＣＲを行った。ＰＣＲ後の反応溶液については、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）による電気泳動解析を行った。
　電気泳動解析結果を図４に示す。
　ここで、図４において参照符号「１」で示されるＬｏｗｅｒ　Ｍａｒｋｅｒおよび参照符号「２」で示されるＵｐｐｅｒ　Ｍａｒｋｅｒと示されたピークは、電気泳動されたサンプルＤＮＡの長さや濃度を解析するための電気泳動解析用内部コントロールである。したがって上記のテロメラーゼ反応およびＰＣＲ反応結果とは関係ない。
　一方、ＰＣＲ　ｃｏｎｔｒｏｌと示されたピークは、上述のＰｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘに含まれる鋳型ＤＮＡとプライマーのセットから得られる３６ｂｐのＰＣＲ増幅産物である。
　したがって、上記テロメラーゼ反応の有無に関係なく得られるものであり、ＰＣＲ反応が良好に行われたか否かを示すピークである。そして残りのラダー状のピークは、テロメラーゼ反応によって得られた様々な長さのＤＮＡ断片がその後のＰＣＲ反応によって増幅されたものである。したがって、本比較例１ではテロメラーゼ反応およびＰＣＲ反応の両方が行われたことが分かる。
　Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００による解析の結果、ＰＣＲ　ｃｏｎｔｒｏｌのピークに相当する反応産物中のＤＮＡ濃度は１．２３ｎｇ／μＬであり、またラダー状のピークに相当する反応産物中の合計ＤＮＡ濃度は２．９５ｎｇ／μＬであった。
　（比較例２）
　比較例２では、比較例１と同様に、Ｓ７７００キットを用いて、キットに添付されたテロメラーゼの活性について測定した。ただしその際、反応液中にＴＭＰｙＰを添加した。具体的には以下のとおりであった。
　１０×ＴＲＡＰ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、５０×ｄＮＴＰ　Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＳ　ｐｒｉｍｅｒを０．４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＩＴＡＮＩＵＭ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．４μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水を１２．８μＬ、比較例１での調製済みテロメラーゼ溶液を１．６μＬ、ＴＭＰｙＰ水溶液２μＬを混合し、全容量２０μＬの反応液を調製した（ＴＭＰｙＰの終濃度が０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭのものをそれぞれ調製した）。
　その後、比較例１と同様にこの反応液を３０℃条件下に３０分間置き、さらにその後、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で１分間の温度サイクルを３３回繰り返した。ＰＣＲ後の反応溶液については、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００による電気泳動解析を行った。
　（実施例１）
　実施例１では、比較例１と同様に、Ｓ７７００キットを用いて、キットに添付されたテロメラーゼの活性について測定した。ただしその際、反応液中にＣｕＰＣを添加した。具体的には以下のとおりであった。
　１０×ＴＲＡＰ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、５０×ｄＮＴＰ　Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＳ　ｐｒｉｍｅｒを０．４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＩＴＡＮＩＵＭ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．４μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水を１２．８μＬ、比較例１での調製済みテロメラーゼ溶液を１．６μＬ、ＣｕＰＣ水溶液２μＬを混合し、全容量２０μＬの反応液を調製（ＣｕＰＣの終濃度が０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭのものをそれぞれ調製した）。
　その後、比較例１と同様にこの反応液を３０℃条件下に３０分間置き、さらにその後、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で１分間の温度サイクルを３３回繰り返した。ＰＣＲ後の反応溶液については、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００による電気泳動解析を行った。
　（実施例２）
　実施例２では、比較例１と同様に、Ｓ７７００キットを用いて、キットに添付されたテロメラーゼの活性について測定した。ただしその際、反応液中にＮｉＰＣを添加した。具体的には以下のとおりであった。
　１０×ＴＲＡＰ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、５０×ｄＮＴＰ　Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＳ　ｐｒｉｍｅｒを０．４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＩＴＡＮＩＵＭ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．４μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水を１２．８μＬ、比較例１での調製済みテロメラーゼ溶液を１．６μＬ、ＮｉＰＣ水溶液２μＬを混合し、全容量２０μＬの反応液を調製（ＮｉＰＣの終濃度が０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭのものをそれぞれ調製した）。
　その後、比較例１と同様にこの反応液を３０℃条件下に３０分間置き、さらにその後、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で１分間の温度サイクルを３３回繰り返した。ＰＣＲ後の反応溶液については、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００による電気泳動解析を行った。
　（実施例３）
　実施例３では、比較例１と同様に、Ｓ７７００キットを用いて、キットに添付されたテロメラーゼの活性について測定した。ただしその際、反応液中にＰＣを添加した。具体的には以下のとおりであった。
　１０×ＴＲＡＰ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、５０×ｄＮＴＰ　Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＳ　ｐｒｉｍｅｒを０．４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＩＴＡＮＩＵＭ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．４μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水を１２．８μＬ、比較例１での調製済みテロメラーゼ溶液を１．６μＬ、ＰＣ水溶液２μＬを混合し、全容量２０μＬの反応液を調製（ＰＣの終濃度が０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭのものをそれぞれ調製した）。
　その後、比較例１と同様にこの反応液を３０℃条件下に３０分間置き、さらにその後、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で１分間の温度サイクルを３３回繰り返した。ＰＣＲ後の反応溶液については、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００による電気泳動解析を行った。
　以上、比較例１～２および実施例１～３の各電気泳動解析結果に基づき、ＰＣＲ　ｃｏｎｔｒｏｌのピークのＤＮＡ濃度と、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの反応液中における濃度の関係を、図５に示した。すなわち、ＰＣＲ　ｃｏｎｔｒｏｌのピークのＤＮＡ濃度を縦軸にとり、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの反応液中における濃度を横軸にとり、これらの関係についてプロットした（横軸で０は、各アニオン性フタロシアニンあるいはＴＭＰｙＰの何れも含まれていない比較例１の結果である）。
　図５から、ＴＭＰｙＰの濃度に依存して顕著にＤＮＡ濃度が減少しており、ＴＭＰｙＰ濃度が３μＭ以上におけるＤＮＡ濃度はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００の検出限界以下となったことが分かる。
　すなわちこの結果は、ＴＭＰｙＰが通常のＰＣＲ反応を阻害しているためであり、これはＴＭＰｙＰが鋳型である二本鎖ＤＮＡに非特異的に結合しているためと考えられる。
　一方、各アニオン性フタロシアニンの場合、ＤＮＡ濃度の減少はＴＭＰｙＰと比較して穏やかであり、これらアニオン性フタロシアニンの濃度が３μＭである場合でも１．１ｎｇ／μＬ以上のＤＮＡが検出された。すなわち、これらアニオン性フタロシアニンによる二本鎖ＤＮＡへの非特異的結合がＴＭＰｙＰと比べ非常に少ないことが分かる。
　次に、図６において、ラダー状のピークに相当する反応産物中の合計ＤＮＡ濃度を縦軸にとり、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの反応液中における濃度を横軸にとり、これらの関係についてプロットした（横軸で０は、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの何れも含まれていない比較例１の結果である）。
　図６に示すように、各アニオン性フタロシアニンの場合、その濃度に依存してＤＮＡ濃度が減少しており、各アニオン性フタロシアニンが０．１μＭ以上の場合、１．０ｎｇ／μＬ以下となった。一方、ＴＭＰｙＰの場合、１．１μＭ添加された場合であっても、ラダー状のピークに相当する反応産物中の合計ＤＮＡ濃度は２．７ｎｇ／μＬであった。
　すなわち、これらの結果より、テロメラーゼ反応への阻害効果は、従来阻害物質候補として知られていたカチオン性物質のＴＭＰｙＰよりも、今回用いたアニオン性フタロシアニンのほうが明らかに大きいことが示された。
　以上まとめると、比較例１～２および実施例１～３の結果から、アニオン性フタロシアニンは、従来のテロメラーゼ反応阻害物質候補として知られているカチオン性物質のＴＭＰｙＰと比べ、顕著にテロメラーゼ反応阻害効果が大きく、またポリメラーゼ反応への阻害が小さいことがわかった。
　さらに、以下比較例３および実施例４～５を用いてＴＭＰｙＰとアニオン性フタロシアニンによるテロメラーゼ阻害効果について比較する。これらの実験では、上記比較例１～２および実施例１～３と同じくＳ７７００キットが用いられている。しかし、上記比較例１～２および実施例１～３では、テロメラーゼ反応とＰＣＲに必要な試薬は全て最初に混合し、反応温度を制御することでテロメラーゼ反応とＰＣＲを順に行わせたのに対し、以下の比較例３および実施例４～５では、まずテロメラーゼ反応に必要な試薬のみを混合してテロメラーゼ反応を行わせた後、その反応液の一部とＰＣＲに必要な試薬を混合し、ＰＣＲを行わせた。
　また、以下比較例３および実施例４～５のそれぞれにおいて、テロメラーゼ反応時に、λＤＮＡを添加した場合としていない場合の実験を行っている。λＤＮＡの添加の意図は、λＤＮＡを添加することで、細胞のゲノムＤＮＡのように大量の二本鎖ＤＮＡが存在する条件を擬似的に再現し、このよりｉｎ　ｖｉｖｏに近い条件でもＴＭＰｙＰやアニオン性フタロシアニンがテロメラーゼ阻害効果を発揮し得るか否かを検討するものである。
　（比較例３）
　比較例３では、Ｓ７７００キットを用いて、ＴＭＰｙＰによるテロメラーゼ活性阻害効果について検討した。具体的には以下のとおりであった。
　１０×ＴＲＡＰ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒを１μＬ、５０×ｄＮＴＰ　Ｍｉｘを０．２μＬ、ＴＳ　ｐｒｉｍｅｒを０．２μＬ、比較例１での調製済みテロメラーゼ溶液を４μＬ、ＴＭＰｙＰ水溶液を２μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水を２．６μＬ混合し、全容量１０μＬのテロメラーゼ反応液を調製した（ＴＭＰｙＰの終濃度が０Ｍ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭのものをそれぞれ調製した）。そして、この反応液を３０℃条件下に６０分間置くことでテロメラーゼ反応を行った。
　次に、このテロメラーゼ反応後の溶液をｍｉｌｌｉＱ水で２０倍に希釈したものを４μＬ、５０×ｄＮＴＰ　Ｍｉｘを０．２μＬ、ＴＳ　ｐｒｉｍｅｒを０．２μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘを０．２μＬ、ＴａＫａＬａ　ＬＡ　Ｔａｑ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ株式会社製）を０．１μＬ、１０×ＬＡ　ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　ＩＩ（Ｍｇ２＋　ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＬａ　ＬＡ　Ｔａｑ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎの付属緩衝液）を１μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水を４．３μＬ混合し、全容量１０μＬのＰＣＲ溶液を調製した。そしてこのＰＣＲ溶液を、９５℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の温度サイクルを３０回繰り返す温度条件下に置き、ＰＣＲを行った。
　最後に、ＰＣＲ後の溶液を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＧｅｌＳｔａｒ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｓｔａｉｎ（タカラバイオ株式会社製）により染色した。以上より得られたゲルの結果を図１６に示す。一番左のレーンより順に、ＴＭＰｙＰの終濃度が０Ｍ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭの結果である。これよりＴＭＰｙＰの終濃度が大きくなるにつれ、テロメラーゼ反応産物を示すバンドが薄くなっており、ＴＭＰｙＰがテロメラーゼ反応を阻害していることが分かる。ただし、１０μＭのＴＭＰｙＰの条件ではＰＣＲ　ｃｏｎｔｒｏｌを示すバンドも薄くなっており、ポリメラーゼ反応も阻害していることが分かる。
　一方で、テロメラーゼ反応液にλＤＮＡを添加した実験も行った。すなわち、上記テロメラーゼ反応液調製の際に、ｍｉｌｌｉＱ水を２．６μＬ混合する代わりに、λＤＮＡ溶液（タカラバイオ株式会社製）を２．６μＬ混合した。その他のテロメラーゼ反応温度／時間条件、ＰＣＲ溶液調製条件、ＰＣＲ温度／時間条件、電気泳動条件は全く同じである。この結果を図１７に示す。
　これより、図１６と大きく異なり、λＤＮＡ存在下では、ＴＭＰｙＰの濃度が大きくなっても全くテロメラーゼ反応が阻害されていないことが分かる。すなわちゲノムＤＮＡのように大量に二本鎖ＤＮＡが存在する条件下では、ＴＭＰｙＰによるテロメラーゼ阻害効果は著しく小さくなることが分かる。
　（実施例４）
　実施例４では、比較例３と同じ実験を、ＴＭＰｙＰの代わりにＣｕＰＣを用いて行った。実験結果を図１８および図１９に示す。まず、図１８はλＤＮＡを添加していない条件下での結果であり、一番左のレーンより順に、ＣｕＰＣの終濃度が０Ｍ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭの結果である。これより、この条件下でＣｕＰＣの濃度が大きくなるに従いテロメラーゼ反応が阻害されていることが分かる。またＴＭＰｙＰの場合（図１６）と異なり、１０μＭＣｕＰＣの場合であっても、ＰＣＲ　ｃｏｎｔｒｏｌの増幅は阻害されていない。
　一方、図１９はλＤＮＡ存在下での結果を示すものである。これより、ＴＭＰｙＰの場合と異なりλＤＮＡ存在下であってもＣｕＰＣはテロメラーゼ反応を効率よく阻害できることが分かる。すなわち、ゲノムＤＮＡのように大量に二本鎖ＤＮＡが存在する条件下であってもＣｕＰＣはそのテロメラーゼ阻害効果を発揮できることが分かる。
　（実施例５）
　実施例５では、比較例３と同じ実験を、ＴＭＰｙＰの代わりにＮｉＰＣを用いて行った。実験結果を図２０および図２１に示す。まず図２０はλＤＮＡを添加していない条件下での結果であり、一番左のレーンより順に、ＮｉＰＣの終濃度が０Ｍ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭの結果である。これより、この条件下でＮｉＰＣの濃度が大きくなるに従いテロメラーゼ反応が阻害されていることが分かる。またＴＭＰｙＰの場合（図１６）と異なり、１０μＭＮｉＰＣの場合であっても、ＰＣＲ　ｃｏｎｔｒｏｌの増幅は阻害されていない。
　一方、図２１はλＤＮＡ存在下での結果を示すものである。これより、ＴＭＰｙＰの場合と異なりλＤＮＡ存在下であってもＮｉＰＣはテロメラーゼ反応を効率よく阻害できることが分かる。すなわち、ゲノムＤＮＡのように大量に二本鎖ＤＮＡが存在する条件下であってもＮｉＰＣはそのテロメラーゼ反応阻害効果を発揮できることが分かる。
　以上、比較例３および実施例４～５の結果から、アニオン性フタロシアニンであるＣｕＰＣおよびＮｉＰＣは、従来のテロメラーゼ反応阻害物質候補として知られているカチオン性物質のＴＭＰｙＰと異なり、ゲノムＤＮＡのように大量に二本鎖ＤＮＡが存在している条件下であっても、効率よくテロメラーゼ反応を阻害できることが分かった。
 
　－アニオン性フタロシアニンと各種ＤＮＡ間の相互作用についての検討－
　以下、実施例６、７、８、９において、アニオン性フタロシアニンと各種ＤＮＡ間の相互作用について検討した。そのためまず、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を含む溶液、一本鎖ＤＮＡを含む溶液、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を以下の手順で調製した。
　＜Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液の調製＞
　５’－ｇｇｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇ－３’の配列（配列番号：２）からなる一本鎖ＤＮＡ（この配列はヒトのテロメア部分の配列と同様のものであり、そのため以降このＤＮＡをヒトテロメアオリゴＤＮＡと呼ぶ）を含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μＬ）を９０℃で５分間インキュベートした後、２℃／分の降温速度で０℃まで冷やし、最後に０℃で２時間インキュベートした。
　溶液中に含まれるヒトテロメアオリゴＤＮＡの濃度は、０、０．５、２、５、１０、２５、５０、１００μＭであった。調製後の各溶液についてＣＤ解析を行った結果、図７に示すように、ヒトテロメアオリゴＤＮＡが０μＭであった溶液を除き、いずれの場合も２９５ｎｍ付近に正のピーク、２６５ｎｍ付近に負のピークが認められた。これはアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが形成されていることを示すものである。
　ヒトテロメアオリゴＤＮＡ濃度が１００μＭであった溶液における上記正および負のピークの絶対値は最も大きく、その他については５０、２５、１０、５、２、０．５μＭの順で小さくなっている。このことは最初に含まれていたヒトテロメアオリゴＤＮＡ濃度が大きければ、得られるアンチパラレル型Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ濃度も大きいということを示している。以降、ヒトテロメアオリゴＤＮＡ濃度が１００、５０、２５、１０、５、２、０．５μＭであった溶液から調製されたＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液を、それぞれＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇと呼ぶ。一方、ヒトテロメアオリゴＤＮＡが含まれていなかった溶液についてはＮＣ溶液と呼ぶ。
　＜一本鎖ＤＮＡ溶液の調製＞
　５’－ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ－３’の配列（配列番号：３）からなる一本鎖ＤＮＡが５０μＭの濃度で含まれる５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μＬ）を調製し、これを９０℃で５分間インキュベートした後、２℃／分の降温速度で０℃まで冷やし、最後に０℃で２時間インキュベートした。この結果得られる溶液中のＤＮＡはインキュベート後も一本鎖ＤＮＡである（以降、この溶液を一本鎖ＤＮＡ溶液と呼ぶ）。
　＜二本鎖ＤＮＡ溶液の調製＞
　５’－ＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡ－３’の配列（配列番号：４）からなる一本鎖ＤＮＡと５’－ＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴ－３’の配列（配列番号：５）からなる一本鎖ＤＮＡがそれぞれ５０μＭの濃度で含まれる５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μＬ）を調製し、これを９０℃で５分間インキュベートした後、２℃／分の降温速度で０℃まで冷やし、最後に０℃で２時間インキュベートした。上記二種類のＤＮＡは相補的な関係にあるため、このインキュベートの結果、溶液中において両ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡを形成している（以降、この溶液を二本鎖ＤＮＡ溶液と呼ぶ）。
　（実施例６）
　本実施例６ではＣｕＰＣと各種ＤＮＡ間の相互作用について検討した。
　まず、１５μＭのＣｕＰＣを含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μＬ）を調製した。そして、このＣｕＰＣ溶液とＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。
　測定結果を図８に示す。図８より、ＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、おおよそ６４０～７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｃ＞Ｄ＞Ｅ＞Ｆの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、ＣｕＰＣとＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造間で相互作用があることが分かる。
　次に、同様に上記ＣｕＰＣ溶液と一本鎖ＤＮＡ溶液、および上記ＣｕＰＣ溶液と二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図９（Ａ）及び図９（Ｂ）に示す。
　それぞれの図において、ＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。図９（Ａ）および図９（Ｂ）より、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがってＣｕＰＣと一本鎖ＤＮＡ間、およびＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ間に相互作用はないことが分かる。
　（実施例７）
　本実施例７ではＮｉＰＣと各種ＤＮＡ間の相互作用について検討した。
　まず、１５μＭのＮｉＰＣを含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μＬ）を調製した。そして、このＮｉＰＣ溶液とＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。
　測定結果を図１０に示す。図１０より、ＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、おおよそ６４０～７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ＞Ｅ＞Ｆ＞Ｇの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、ＮｉＰＣとＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造間で相互作用があることが分かる。
　次に、同様に上記ＮｉＰＣ溶液と一本鎖ＤＮＡ溶液、および上記ＮｉＰＣ溶液と二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）に示す。それぞれの図において、ＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）より、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがってＮｉＰＣと一本鎖ＤＮＡ間、およびＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ間に相互作用はないことが分かる。
　（実施例８）
　本実施例８ではＰＣと各種ＤＮＡ間の相互作用について検討した。
　まず、１５μＭのＰＣを含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μＬ）を調製した。そして、このＰＣ溶液とＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。
　測定結果を図１２に示す。図１２より、ＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、６６０～７４０ｎｍの範囲で二つのピークが現れ、またこのピークはＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ＞Ｅ＞Ｆ＞Ｇの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、ＰＣとＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造間で相互作用があることが分かる。
　次に、同様に上記ＰＣ溶液と一本鎖ＤＮＡ溶液、および上記ＰＣ溶液と二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図１３（Ａ）および図１３（Ｂ）に示す。それぞれの図において、ＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。図１３（Ａ）および図１３（Ｂ）より、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがってＰＣと一本鎖ＤＮＡ間、およびＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ間に相互作用はないことが分かる。
　（実施例９）
　本実施例９ではＣｏＰＣと各種ＤＮＡ間の相互作用について検討した。
　まず、１５μＭのＣｏＰＣを含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μＬ）を調製した。そして、このＣｏＰＣ溶液とＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。
　測定結果を図１４に示す。図１４より、ＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、６６０～７４０ｎｍの範囲で二つのピークが現れ、またこのピークはＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｇの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、ＣｏＰＣとＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造間で相互作用があることが分かる。
　ところでＣｏＰＣを用いた場合に見られた６４０～７２０ｎｍの範囲のピーク上昇は、ＣｕＰＣやＮｉＰＣやＰＣを用いた場合の結果より小さい。これは合成したＣｏＰＣが十分に精製されていなかったためと考えられる。
　次に、同様に上記ＣｏＰＣ溶液と一本鎖ＤＮＡ溶液、および上記ＣｏＰＣ溶液と二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０～８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図１５（Ａ）および図１５（Ｂ）に示す。それぞれの図において、ＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。図１５（Ａ）および図１５（Ｂ）より、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがってＣｏＰＣと一本鎖ＤＮＡ間、およびＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ間に相互作用はないことが分かる。
　以上のアニオン性フタロシアニンの他、ＺｎＰＣを用いて、同様の実験を行った結果、ＺｎＰＣについてもＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造と特異的に相互作用することが示された。
　以上、実施例６～９についてまとめると、いずれのアニオン性フタロシアニンもＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造とは相互作用を起こすものの極めて特異的であり、一本鎖ＤＮＡや二本鎖ＤＮＡとは相互作用を起こさないことが分かった。したがって、アニオン性フタロシアニンはテロメラーゼ阻害物質として非常に適しており、本発明におけるテロメラーゼ阻害方法は従来の方法と比べ効果的であると言える。
　上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施の形態が明らかである。したがって、上記説明は例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造および／または機能の詳細を実質的に変更できる。
　本発明により、テロメラーゼ阻害方法が提供される。テロメラーゼ反応は癌化の原因であることが知られていることから、本発明の方法は癌治療に用いることができる。
　　１　Ｌｏｗｅｒ　Ｍａｒｋｅｒ
　　２　Ｕｐｐｅｒ　Ｍａｒｋｅｒ 
　　３　ＰＣＲ　ｃｏｎｔｒｏｌのピーク
　　４　ラダー状ピーク

Claims (4)

  1. 　テロメラーゼによるＤＮＡ伸張反応を阻害する方法であって、
    　テロメラーゼ、テロメラーゼ反応の基質となるＤＮＡ、およびｄＮＴＰを含有する溶液に、アニオン性フタロシアニンを添加する工程を有する、方法。
  2. 　前記溶液が緩衝液である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記アニオン性フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有している、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記アニオン性フタロシアニンは、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性フタロシアニンのいずれかである、請求項１に記載の方法。
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