WO2015019548A1 - Ｄｎａ分解反応抑制方法及びｄｎａ分解反応抑制剤 - Google Patents

Ｄｎａ分解反応抑制方法及びｄｎａ分解反応抑制剤 Download PDF

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degradation reaction
solution
degrading enzyme
λdna
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夜久　英信
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パナソニック株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for inhibiting a DNA degradation reaction and a DNA degradation reaction inhibitor.
  • Patent Document 1 a method of adding a chelating reagent such as ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter referred to as “EDTA”) or citric acid to a sample solution is known (Patent Document 1, Non-Patent Document 1). ).
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 2
  • the present disclosure aims to provide a method for suppressing a DNA degradation reaction by a DNA degrading enzyme by an easy operation.
  • a method for inhibiting a DNA degradation reaction is a method for inhibiting a DNA degradation reaction that inhibits a DNA degradation reaction by a DNA degrading enzyme, comprising a step (a) of preparing a solution containing the DNA degrading enzyme, , DNA serving as a substrate for the degradation reaction by the DNA degrading enzyme, and 5,10,15,20-Tetrakis (N-methylpyridinium-4-yl) porphyrin or 5,10,15,20-Tetrakis (4-trimethylamylophenyl) porphyrin A step (b) of mixing at least one of the DNA decomposition reaction suppression method.
  • a DNA degradation reaction by a DNA degrading enzyme can be suppressed by an easy operation.
  • the method for inhibiting a DNA degradation reaction is a method for inhibiting a DNA degradation reaction that inhibits a DNA degradation reaction by a DNA degrading enzyme, comprising preparing a solution containing the DNA degrading enzyme (a), , The solution, DNA serving as a substrate for the degradation reaction by the DNA degrading enzyme, 5,10,15,20-Tetrakis (N-methylpyridinium-4-yl) porphyrin or 5,10,15,20-Tetrakis (4 (Trimethylammoniophenyl) porphyrin mixing step (b).
  • the DNA degradation reaction by the DNA degrading enzyme can be suppressed by an easy operation.
  • the method for inhibiting a DNA degradation reaction according to the second aspect of the present disclosure may be that in the first aspect, the nucleolytic enzyme is DNase.
  • the DNA degradation reaction by DNase can be suppressed.
  • the 5,10,15,20-Tetrakis (N-methylpyridinium-4-yl) porphyrin or the 5, 10,15,20-Tetrakis (4-trimethylamylophenyl) porphyrin may be added at 10 ⁇ M or more.
  • a sufficient amount of TMPyP4 or TMAPP that suppresses the DNA degradation reaction by the DNA enzyme can be added.
  • the DNA degradation reaction inhibitor according to the fourth aspect of the present disclosure is a DNA degradation reaction inhibitor that inhibits a DNA degradation reaction by a DNA degrading enzyme, and is 5, 10, 15, 20-Tetrakis (N-methylpyridinium-4- yl) containing porphyrin or 5,10,15,20-Tetrakis (4-trimethylamylophenyl) porphyrin.
  • the fourth aspect it is possible to suppress a DNA degradation reaction by a DNA degrading enzyme.
  • the DNA degradation reaction inhibitor according to the fifth aspect of the present disclosure may be that in the fourth aspect, the DNA degrading enzyme is DNase.
  • the DNA degradation reaction by DNase can be suppressed.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a procedure of a method for inhibiting a DNA degradation reaction according to the present disclosure.
  • a reaction container 1 such as a tube having a sample solution 2 containing a DNA degrading enzyme is prepared.
  • the DNA degrading enzyme is an enzyme having an action of degrading DNA such as DNase.
  • TMPyP4 5,10,15,20-Tetrakis (N-methylpyridinium-4-yl) porphyrin (hereinafter referred to as “TMPyP4”) (Formula 1) or 5,10,15,20-Tetrakis (4- Trimethylaminophenyl) porphyrin (hereinafter referred to as “TMPyP4”) (Chemical Formula 2) is added to the reaction vessel 1.
  • the amount of TMPyP4 or TMAPP to be added is determined by the concentration of TMPyP4 or TMAPP, the concentration of the DNA degrading enzyme contained in the sample solution 2, the concentration of DNA, the volume of the sample solution 2, and the like.
  • the concentration of TMPyP4 or TMAPP to be added varies depending on various conditions, but is preferably 1 ⁇ M or more, and more preferably 10 ⁇ M or more.
  • timing of adding TMPyP4 or TMAPP to the sample solution 2 may be the same as when adding DNA to the sample solution 2 or after adding DNA to the sample solution 2. However, in order to further enhance the effect of suppressing the DNA degradation reaction, it is desirable that the timing of adding TMPyP4 or TMAPP is before the DNA is added to the sample solution 2.
  • sample solution 2 contains a DNA degrading enzyme and DNA
  • TMPyP4 or TMAPP may be added to the sample solution 2.
  • Example 1 ⁇ DNA (obtained from Takara Bio Inc.) was used as the DNA that is the target of the DNA degradation reaction.
  • a cell extract was used as a sample solution containing a DNA degrading enzyme.
  • the cell extract was obtained by dissolving normal human dermal fibroblasts (obtained from Kurashiki Boseki Co., Ltd.) using CHAPS Lysis Buffer (obtained from Millipore Corporation).
  • the cell concentration of the obtained cell extract was 10 6 cells / 200 ⁇ L.
  • the obtained cell extract contained DNase, which is a DNA degrading enzyme. Such DNase has an action of degrading ⁇ DNA.
  • Example 1 The experimental procedure of Example 1 was described below.
  • Solutions A to D shown in Table 1 were prepared.
  • Solution A did not contain ⁇ DNA and TMPyP4.
  • Solution B contained ⁇ DNA but no TMPyP4.
  • Solution C contained ⁇ DNA and TMPyP4 (final concentration 10 ⁇ M).
  • Solution D contained ⁇ DNA and TMPyP4 (final concentration 20 ⁇ M).
  • solutions A to D were incubated at 37 ° C. for 1 hour or 24 hours, respectively.
  • the gel used was a 10% polyacrylamide gel containing 3.5M Urea.
  • the buffer used for electrophoresis was a Tris-Brate-EDTA buffer (hereinafter referred to as “TBE buffer”).
  • the voltage applied in electrophoresis was 300V.
  • the gel after electrophoresis is SYBR Gold Nucleic Acid Gel. Stained and analyzed using Stain (available from Life Technologies Corporation).
  • Fig. 2 shows the result of electrophoresis.
  • (1) is the result of electrophoresis when incubated for 1 hour
  • (2) is the result of electrophoresis when incubated for 24 hours.
  • lanes A to D correspond to the electrophoresis results of the solutions A to D, respectively.
  • a single band was confirmed from lane A in FIG. Such a band is considered to be a cell-derived nucleic acid band.
  • a slightly smeared band was confirmed in addition to the band considered to be derived from cells.
  • Such a smear band is considered to be a band derived from ⁇ DNA.
  • the smear band was a band with a broader molecular weight.
  • TMPyP4 suppresses the degradation reaction of ⁇ DNA by DNase.
  • Example 2 An experiment similar to that of Example 1 was performed except that TMPyP4 was changed to TMAPP.
  • Example 2 The experimental procedure of Example 2 was described below.
  • solutions B shown in Table 1 and solutions E to G shown in Table 2 were prepared.
  • Solution E contained ⁇ DNA and TMAPP (final concentration 10 ⁇ M).
  • Solution F contained ⁇ DNA and TMAPP (final concentration 20 ⁇ M).
  • Solution G contained ⁇ DNA and TMAPP (final concentration 50 ⁇ M).
  • Solution B and Solutions E to G were incubated at 37 ° C. for 12 hours, respectively.
  • Fig. 3 shows the result of electrophoresis.
  • lane B and lanes E to G correspond to the electrophoresis results of the solution B and the solutions E to G, respectively.
  • the smear band derived from ⁇ DNA was smaller in the solutions E to G than in the solution B. That is, ⁇ DNA in the solutions E to G containing TMAPP was hardly degraded by DNase, which is a DNA degrading enzyme contained in the cell lysate.
  • TMAPP suppresses the degradation reaction of ⁇ DNA by DNase.
  • Solution B shown in Table 1 and solutions H to J shown in Table 3 were prepared.
  • Solution H contained ⁇ DNA and Alcian blue (final concentration 10 ⁇ M).
  • Solution I contained ⁇ DNA and Alcian blue (final concentration 20 ⁇ M).
  • Solution J contained ⁇ DNA and Alcian blue (final concentration 50 ⁇ M).
  • Solution B and Solutions H to J were incubated at 37 ° C. for 12 hours, respectively.
  • Fig. 4 shows the result of electrophoresis.
  • Lane B and Lanes H to J correspond to the electrophoresis results of Solution B and Solutions H to J, respectively.
  • Comparative Example 2 Except for changing the concentrations of TMPyP4 and TMAPP, experiments similar to those in Example 1 and Example 2 were performed. In Comparative Example 2, the final concentrations of TMPyP4 and TMAPP were 1 nM, 10 nM, and 100 nM.
  • solution B shown in Table 1 and K to P shown in Tables 4 and 5 were prepared.
  • Solution K contained ⁇ DNA and TMPyP4 (final concentration 1 nM).
  • Solution L contained ⁇ DNA and TMPyP4 (final concentration 10 nM).
  • Solution M contained ⁇ DNA and TMPyP4 (final concentration 100 nM).
  • Solution N contained ⁇ DNA and TMAPP (final concentration 1 nM).
  • Solution O contained ⁇ DNA and TMAPP (final concentration 10 nM).
  • Solution P contained ⁇ DNA and TMAPP (final concentration 100 nM).
  • Solution B and Solutions K to P were incubated at 37 ° C. for 12 hours, respectively.
  • FIG. 5 shows the result of electrophoresis.
  • lane B and lanes K to P correspond to the electrophoresis results of solution B and solutions K to P, respectively.
  • Example 3 An experiment similar to that of Example 1 was performed except that TMPyP4 was changed to EDTA.
  • Solution Q contained ⁇ DNA and EDTA (final concentration 50 mM).
  • Solution B and Solution Q were each incubated at 37 ° C. for 12 hours.
  • FIG. 6 shows the result of electrophoresis.
  • lanes B and Q correspond to the electrophoresis results of the solution B and the solution Q, respectively.
  • the smear band derived from ⁇ DNA was smaller in the solution Q than in the solution B. That is, ⁇ DNA in the solution Q containing EDTA is hardly decomposed by DNase contained in the cell lysate.
  • TMPyP4 and TMAPP suppress the DNA degradation reaction by DNase.
  • the method for inhibiting DNA degradation reaction according to the present disclosure is useful as a method for inhibiting the degradation of necessary DNA in a sample solution because the DNA degradation reaction can be inhibited by an easy operation.

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Abstract

　従来のＤＮＡ分解抑制技術は、操作が煩雑であるという課題があった。本発明は、ＤＮＡ分解酵素によるＤＮＡ分解反応を抑制するＤＮＡ分解反応抑制方法であって、前記ＤＮＡ分解酵素を含有する溶液を準備する工程（ａ）と、前記溶液と、前記ＤＮＡ分解酵素による分解反応の基質となるＤＮＡと、５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ－４－ｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎまたは５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（４－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎとを混合する工程（ｂ）と、を有する。

Description

ＤＮＡ分解反応抑制方法及びＤＮＡ分解反応抑制剤
　本開示は、ＤＮＡ分解反応抑制方法及びＤＮＡ分解反応抑制剤に関する。
　ＤＮＡの分解反応の抑制方法として、試料溶液中にエチレンジアミン四酢酸（以下、「ＥＤＴＡ」と呼ぶ）又はクエン酸などのキレート試薬を添加する方法が知られている（特許文献１、非特許文献１）。
　他のＤＮＡの分解反応の抑制方法として、フェノール／クロロホルム溶液によって、試料溶液中のＤＮＡ分解酵素を含むタンパク質をすべて変性して除去する方法、及び、ＤＮＡ分解酵素におけるジスルフィド結合を解裂してスルホヒドリル基を形成し、このスルホヒドリル基を選択的に修飾することによって、不可逆的にＤＮＡ分解酵素を変性する方法が知られている（非特許文献１、特許文献２）。
特開２０１１－１５７０１号公報 特開２００４－５７０６４号公報
田村隆明編「改定遺伝子工学実験ノート　上」株式会社羊土社出版、１９９７年３月１日（Ｐ２９－Ｐ３１）
　上記のとおり、ＤＮＡ分解酵素によるＤＮＡ分解反応を抑制する従来技術は、複数報告されているが、操作が煩雑であるという課題があった。
　本開示は、容易な操作によりＤＮＡ分解酵素によるＤＮＡ分解反応を抑制する方法を提供することを目的とする。
　本開示に係るＤＮＡ分解反応抑制方法は、ＤＮＡ分解酵素によるＤＮＡ分解反応を抑制するＤＮＡ分解反応抑制方法であって、前記ＤＮＡ分解酵素を含有する溶液を準備する工程（ａ）と、前記溶液と、前記ＤＮＡ分解酵素による分解反応の基質となるＤＮＡと、５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ－４－ｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎまたは５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（４－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎのうち少なくとも一方とを、混合する工程（ｂ）と、を有するＤＮＡ分解反応抑制方法。
　本開示のＤＮＡ分解反応の抑制方法によれば、容易な操作によりＤＮＡ分解酵素によるＤＮＡ分解反応を抑制することができる。
本開示に係るＤＮＡ分解反応抑制方法の手順を示す図 実施例１の電気泳動結果を示す図 実施例２の電気泳動結果を示す図 比較例１の電気泳動結果を示す図 比較例２の電気泳動結果を示す図 比較例３の電気泳動結果を示す図
　本開示の第１態様に係るＤＮＡ分解反応抑制方法は、ＤＮＡ分解酵素によるＤＮＡ分解反応を抑制するＤＮＡ分解反応抑制方法であって、前記ＤＮＡ分解酵素を含有する溶液を準備する工程（ａ）と、前記溶液と、前記ＤＮＡ分解酵素による分解反応の基質となるＤＮＡと、５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ－４－ｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎまたは５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（４－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎとを混合する工程（ｂ）と、を有する。
　上記第１態様によれば、容易な操作によりＤＮＡ分解酵素によるＤＮＡ分解反応を抑制することができる。
　本開示の第２態様に係るＤＮＡ分解反応抑制方法は、上記第１態様において、前記核酸分解酵素がＤＮａｓｅである、としてもよい。
　上記第２態様によれば、ＤＮａｓｅによるＤＮＡ分解反応を抑制することができる。
　本開示の第３態様に係るＤＮＡ分解反応抑制方法は、上記第１態様の工程（ｂ）において、前記５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ－４－ｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎまたは前記５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（４－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎを、１０μＭ以上添加してもよい。
　上記第３態様によれば、ＤＮＡ酵素によるＤＮＡ分解反応を抑制する十分な量のＴＭＰｙＰ４又はＴＭＡＰＰを添加することができる。
　本開示の第４態様に係るＤＮＡ分解反応抑制剤は、ＤＮＡ分解酵素によるＤＮＡ分解反応を抑制するＤＮＡ分解反応抑制剤であって、５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ－４－ｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎまたは５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（４－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎを含有する。
　上記第４態様によれば、ＤＮＡ分解酵素によるＤＮＡ分解反応を抑制することができる。
　本開示の第５態様に係るＤＮＡ分解反応抑制剤は、上記第４態様において、前記ＤＮＡ分解酵素がＤＮａｓｅである、としてもよい。
　上記第５態様によれば、ＤＮａｓｅによるＤＮＡ分解反応を抑制することができる。
　（実施の形態）
　以下、本開示の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
　図１は、本開示に係るＤＮＡ分解反応抑制方法の手順を示す図である。
　まず、ＤＮＡ分解酵素を含む試料溶液２を有するチューブ等の反応容器１を準備する。ここで、ＤＮＡ分解酵素とは、ＤＮａｓｅなどのＤＮＡを分解する作用を有する酵素である。
　次に、５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ－４－ｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ（以下、「ＴＭＰｙＰ４」と呼ぶ）（化１）、又は、５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（４－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ（以下、「ＴＭＰｙＰ４」と呼ぶ）（化２）を、反応容器１に添加する。添加するＴＭＰｙＰ４又はＴＭＡＰＰの量は、ＴＭＰｙＰ４又はＴＭＡＰＰの濃度、試料溶液２に含有されるＤＮＡ分解酵素の濃度、ＤＮＡの濃度、及び試料溶液２の容量などによって決定される。なお、添加するＴＭＰｙＰ４又はＴＭＡＰＰの濃度は、種々の条件によって変わるが、望ましくは１μＭ以上であり、より望ましくは１０μＭ以上である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　次に、ＤＮＡを含有する溶液を試料溶液２に添加する。
　以上が、本開示に係るＤＮＡ分解反応の抑制方法の手順である。
　なお、ＴＭＰｙＰ４又はＴＭＡＰＰを試料溶液２に添加するタイミングは、ＤＮＡを試料溶液２に添加するときと同時でも良く、ＤＮＡを試料溶液２に添加した後でも良い。ただし、ＤＮＡ分解反応の抑制効果をより高めるためには、ＴＭＰｙＰ４又はＴＭＡＰＰの添加するタイミングは、ＤＮＡを試料溶液２に添加する前であることが望ましい。
　なお、試料溶液２がＤＮＡ分解酵素及びＤＮＡを含有している場合、かかる試料溶液２にＴＭＰｙＰ４又はＴＭＡＰＰを添加してもよい。
　なお、ＴＭＰｙＰ４又はＴＭＡＰＰとＤＮＡとを混合した溶液を、ＤＮＡ分解酵素を含有する試料溶液２に添加してもよい。
　（実施例）
　以下、実施例を参照して、本開示の実施の形態に係るＤＮＡ分解反応の抑制方法について詳細に説明する。
　（実施例１）
　ＤＮＡ分解反応の標的であるＤＮＡには、λＤＮＡ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いた。
　ＤＮＡ分解酵素を含有する試料溶液には、細胞抽出液を用いた。細胞抽出液は、正常ヒト皮膚繊維芽細胞（倉敷紡績株式会社より入手）を、ＣＨＡＰＳ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより入手）を用いて溶解することにより得られた。得られた細胞抽出液の細胞濃度は１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬであった。得られた細胞抽出液には、ＤＮＡの分解酵素であるＤＮａｓｅが含有されていた。かかるＤＮａｓｅは、λＤＮＡを分解する作用を有する。
　以下に、実施例１の実験手順を記した。
　始めに、表１に示された溶液Ａ～Ｄをそれぞれ調製した。溶液Ａは、λＤＮＡ及びＴＭＰｙＰ４を含有していなかった。溶液Ｂは、λＤＮＡを含有するが、ＴＭＰｙＰ４を含有していなかった。溶液Ｃは、λＤＮＡ及びＴＭＰｙＰ４（終濃度１０μＭ）を含有していた。溶液Ｄは、λＤＮＡ及びＴＭＰｙＰ４（終濃度２０μＭ）を含有していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　次に、溶液Ａ～Ｄを３７℃にて１時間又は２４時間それぞれインキュベートした。
　次に、インキュベート後の溶液Ａ～Ｄから６μＬ採取した。採取したそれぞれ溶液Ａ～Ｄについて、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により解析した。用いたゲルは、３．５ＭのＵｒｅａを含む１０％ポリアクリルアミドゲルであった。電気泳動に用いられたバッファーは、Ｔｒｉｓ－Ｂｒａｔｅ－ＥＤＴＡバッファー（以下、「ＴＢＥバッファー
」と呼ぶ）であった。電気泳動において印加された電圧は、３００Ｖであった。
　次に、電気泳動後のゲルは、ＳＹＢＲ　Ｇｏｌｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｇｅｌ
　Ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより入手）を用いて染色され、解析された。
　図２に電気泳動結果を示した。図２において、（１）は１時間インキュベートした際の電気泳動結果であり、（２）は２４時間インキュベートした際の電気泳動結果の結果である。また、図２において、レーンＡ～Ｄは、溶液Ａ～Ｄの電気泳動結果にそれぞれ対応している。
　図２（１）のレーンＡより、一本のバンドが確認された。かかるバンドは、細胞由来の核酸のバンドと考えられる。
　また、図２（１）のレーンＢより、細胞由来と考えられるバンドの他に、ややスメアなバンドが確認された。かかるスメアなバンドは、λＤＮＡ由来のバンドと考えられる。溶液Ｂを２４時間インキュベートした場合である図２（２）のレーンＢに示されるように、スメアなバンドは、より広範囲な分子量のバンドになっていた。かかる結果は、λＤＮＡが、細胞溶解液中のＤＮＡ分解酵素であるＤＮａｓｅによって分解されたことを示している。
　一方、図２（１）のレーンＣ及びＤは、図２（１）のレーンＢと同様なバンドが確認された。しかし、図２（２）のレーンＣ及びＤに示すように、溶液Ｃ及び溶液Ｄを２４時間インキュベートした後の電気泳動結果は、１時間インキュベート後の電気泳動結果とほぼ同様であった。つまり、ＴＭＰｙＰ４を含有する溶液Ｃ及び溶液Ｄ中のλＤＮＡは、細胞溶解液中に含有される核酸分解酵素であるＤＮａｓｅによってほとんど分解されなかったことが確認された。
　以上の結果より、ＴＭＰｙＰ４がＤＮａｓｅによるλＤＮＡの分解反応を抑制することが確認された。
　（実施例２）
　ＴＭＰｙＰ４をＴＭＡＰＰに変更した以外は、実施例１とほぼ同様の実験を行なった。
　以下に、実施例２の実験手順を記した。
　始めに、表１に示された溶液Ｂ及び表２に示された溶液Ｅ～Ｇをそれぞれ調製した。溶液Ｅは、λＤＮＡ及びＴＭＡＰＰ（終濃度１０μＭ）を含有していた。溶液Ｆは、λＤＮＡ及びＴＭＡＰＰ（終濃度２０μＭ）を含有していた。溶液Ｇは、λＤＮＡ及びＴＭＡＰＰ（終濃度５０μＭ）を含有していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　次に、溶液Ｂ、及び溶液Ｅ～Ｇを３７℃にて１２時間それぞれインキュベートした。
　次に、インキュベート後の溶液Ｂ及び溶液Ｅ～Ｇより６μＬを採取した。採取した溶液Ｂ及び溶液Ｅ～Ｇについて、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により解析した。用いたゲル及び電気泳動条件は、実施例１と同じであった。
　次に、電気泳動後のゲルは、実施例１と同じ条件で染色され、解析された。
　図３に電気泳動結果を示した。図３において、レーンＢ及びレーンＥ～Ｇは、溶液Ｂ及び溶液Ｅ～Ｇの電気泳動結果にそれぞれ対応している。
　図３のレーンＢより、溶液Ｂにおいては、実施例１の結果と同様、λＤＮＡ由来のスメアのバンドが確認された。
　一方、図３のレーンＥ～Ｇより、溶液Ｅ～Ｇにおいては、溶液Ｂと比較して、λＤＮＡ由来のスメアなバンドが小さかった。つまり、ＴＭＡＰＰを含有する溶液Ｅ～Ｇ中のλＤＮＡは、細胞溶解液中に含有されるＤＮＡ分解酵素であるＤＮａｓｅによってほとんど分解されなかったことを示している。
　以上の結果より、ＴＭＡＰＰがＤＮａｓｅによるλＤＮＡの分解反応を抑制することが確認された。
　（比較例１）
　ＴＭＰｙＰ４をＡｌｃｉａｎ　ｂｌｕｅ（化３）に変更した以外は、実施例１とほぼ同様の実験を行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　以下に、比較例１の実験手順を記した。
　始めに、表１に示された溶液Ｂ及び表３に示された溶液Ｈ～Ｊをそれぞれ調製した。溶液Ｈは、λＤＮＡ及びＡｌｃｉａｎ　ｂｌｕｅ（終濃度１０μＭ）を含有していた。溶液Ｉは、λＤＮＡ及びＡｌｃｉａｎ　ｂｌｕｅ（終濃度２０μＭ）を含有していた。溶液Ｊは、λＤＮＡ及びＡｌｃｉａｎ　ｂｌｕｅ（終濃度５０μＭ）を含有していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　次に、溶液Ｂ及び溶液Ｈ～Ｊを３７℃にて１２時間それぞれインキュベートした。
　次に、インキュベート後の溶液Ｂ及び溶液Ｈ～Ｊより６μＬを採取した。採取した溶液Ｂ及び溶液Ｈ～Ｊについて、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により解析した。用いたゲル及び電気泳動条件は、実施例１と同じであった。
　次に、電気泳動後のゲルは、実施例１と同じ条件で染色され、解析された。
　図４に電気泳動結果を示した。図４において、レーンＢ及びレーンＨ～Ｊは、溶液Ｂ及び溶液Ｈ～Ｊの電気泳動結果にそれぞれ対応している。
　図４のレーンＢより、溶液Ｂにおいては、実施例１の結果と同様、λＤＮＡ由来のスメアのバンドが確認された。また、図４のレーンＨ～Ｊより、溶液Ｈ～Ｊにおいても、λＤ
ＮＡ由来のスメアのバンドが確認された。ここで、Ａｌｃｉａｎ　ｂｌｕｅは、ＴＭＰｙＰ４及びＴＭＡＰＰと同じカチオン性ポルフィリンである。つまり、Ａｌｃｉａｎ　ｂｌｕｅは、同じカチオン性ポルフィリンであるＴＭＰｙＰ４又はＴＭＡＰＰとは異なり、ＤＮａｓｅによるλＤＮＡの分解反応を抑制できなかったことを示している。
　以上の結果より、Ａｌｃｉａｎ　ｂｌｕｅがＤＮａｓｅによるλＤＮＡの分解反応を抑制しないことが確認された。
　（比較例２）
　ＴＭＰｙＰ４及びＴＭＡＰＰの濃度を変更した以外は、実施例１及び実施例２とほぼ同様の実験を行なった。比較例２において、ＴＭＰｙＰ４及びＴＭＡＰＰの終濃度は、１ｎＭ、１０ｎＭ及び１００ｎＭとした。
　以下に、比較例２の実験手順を記した。
　始めに、表１に示された溶液Ｂ、表４及び５に示されたＫ～Ｐをそれぞれ調製した。溶液Ｋは、λＤＮＡ及びＴＭＰｙＰ４（終濃度１ｎＭ）を含有していた。溶液Ｌは、λＤＮＡ及びＴＭＰｙＰ４（終濃度１０ｎＭ）を含有していた。溶液Ｍは、λＤＮＡ及びＴＭＰｙＰ４（終濃度１００ｎＭ）を含有していた。溶液Ｎは、λＤＮＡ及びＴＭＡＰＰ（終濃度１ｎＭ）を含有していた。溶液Ｏは、λＤＮＡ及びＴＭＡＰＰ（終濃度１０ｎＭ）を含有していた。溶液Ｐは、λＤＮＡ及びＴＭＡＰＰ（終濃度１００ｎＭ）を含有していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　次に、溶液Ｂ及び溶液Ｋ～Ｐを３７℃にて１２時間それぞれインキュベートした。
　次に、インキュベート後の溶液Ｂ及び溶液Ｋ～Ｐより６μＬを採取した。採取した溶液Ｂ及び溶液Ｋ～Ｐについて、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により解析した。用いたゲル及び電気泳動条件は、実施例１と同じであった。
　次に、電気泳動後のゲルは、実施例１と同じ条件で染色され、解析された。
　図５に、電気泳動結果を示した。図５において、レーンＢ及びレーンＫ～Ｐは、溶液Ｂ及び溶液Ｋ～Ｐの電気泳動結果にそれぞれ対応している。
　図５のレーンＢより、溶液Ｂにおいては、実施例１の結果と同様、λＤＮＡ由来のスメアのバンドが確認された。また、図５のレーンＫ～Ｐより、溶液Ｋ～Ｐにおいても、λＤＮＡ由来のスメアのバンドが確認された。つまり、ｎＭオーダーの低濃度のＴＭＰｙＰ４及びＴＭＡＰＰは、ＤＮａｓｅによるλＤＮＡの分解反応を抑制できなかったことを示している。
　以上の結果より、ＴＭＰｙＰ４及びＴＭＡＰＰの終濃度が１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭである場合、ＤＮａｓｅによるλＤＮＡの分解反応を抑制しないことが確認された。
　（比較例３）
　ＴＭＰｙＰ４をＥＤＴＡに変更した以外は、実施例１とほぼ同様の実験を行なった。
　以下に、比較例３の実験手順を記した。
　始めに、表１に示された溶液Ｂ及び表６に示された溶液Ｑをそれぞれ調製した。溶液Ｑは、λＤＮＡ及びＥＤＴＡ（終濃度５０ｍＭ）を含有していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　次に、溶液Ｂ及び溶液Ｑを３７℃にて１２時間それぞれインキュベートした。
　次に、インキュベート後の溶液Ｂ及び溶液Ｑより６μＬを採取した。採取した溶液Ｂ及び溶液Ｑについて、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により解析した。用いたゲル及び電気泳動条件は、実施例１と同じであった。
　次に、電気泳動後のゲルは、実施例１と同じ条件で染色され、解析された。
　図６に電気泳動結果を示した。図６において、レーンＢ及びＱは、溶液Ｂ及び溶液Ｑの電気泳動結果にそれぞれ対応している。
　図６のレーンＢより、溶液Ｂにおいては、実施例１の結果と同様、λＤＮＡ由来のスメアのバンドが確認された。
　一方、図６のレーンＱより、溶液Ｑにおいては、溶液Ｂと比較して、λＤＮＡ由来のスメアなバンドが小さかった。つまり、ＥＤＴＡを含有する溶液Ｑ中のλＤＮＡは、細胞溶解液中に含有されるＤＮａｓｅによってほとんど分解されなかったことを示している。
　ここで、ＥＤＴＡは、ＤＮＡ分解酵素の活性化因子であるＭｇイオンをキレートすることにより、ＤＮＡ分解酵素によるＤＮＡ分解反応を抑制することが知られている。したがって、比較例３の結果は、実施例１～３及び比較例１～３の溶液ＢにおけるλＤＮＡの分解は、細胞溶解液中のＤＮＡ分解酵素によるものであることを示している。
　以上の結果より、ＴＭＰｙＰ４及びＴＭＡＰＰがＤＮａｓｅによるＤＮＡの分解反応を抑制することが確認された。
　本開示に係るＤＮＡ分解反応抑制方法は、容易な操作によりＤＮＡ分解反応を抑制することができるため、試料溶液中の必要なＤＮＡの分解抑制方法として有用である。
　１　　反応容器
　２　　試料溶液

Claims (5)

  1. 　ＤＮＡ分解酵素によるＤＮＡ分解反応を抑制するＤＮＡ分解反応抑制方法であって、
    　前記ＤＮＡ分解酵素を含有する溶液を準備する工程（ａ）と、
    　前記溶液と、前記ＤＮＡ分解酵素による分解反応の基質となるＤＮＡと、５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ－４－ｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎまたは５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（４－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎとを混合する工程（ｂ）と、
    　を有するＤＮＡ分解反応抑制方法。
  2. 　前記ＤＮＡ分解酵素がＤＮａｓｅである、請求項１に記載のＤＮＡ分解反応抑制方法。
  3. 　前記工程（ｂ）において、前記５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ－４－ｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎまたは前記５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（４－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎを、１０μＭ以上添加する、
    　請求項１に記載のＤＮＡ分解反応抑制方法。
  4. 　ＤＮＡ分解酵素によるＤＮＡ分解反応を抑制するＤＮＡ分解反応抑制剤であって、
    　５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ－４－ｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎまたは５，１０，１５，２０－Ｔｅｔｒａｋｉｓ（４－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎを含有する、
    　ＤＮＡ分解反応抑制剤。
  5. 　前記ＤＮＡ分解酵素がＤＮａｓｅである、請求項４に記載のＤＮＡ分解反応抑制剤。
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