JP2016505262A - 固体基材上での核酸安定化のための配合物 - Google Patents
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Abstract
Description
培養したヒトリンパ球細胞株(すなわち、Jurkat細胞)を、全細胞RNA源として利用した。細胞は、表示の試薬を含浸させた7mmのセルロースディスク上で乾燥し、デシケーターキャビネットに室温で10日間保存し、標準プロトコールに従って細胞核酸を電気溶出した。簡潔に言えば、2mg/mLのプロテイナーゼKを含むヌクレアーゼフリー水(15μL)でディスクを再水和して余分なタンパク質を除去し、約30分間乾燥した。パンチ片を、1%Trisホウ酸−EDTA(TBE)アガロースゲルの各ウェルに入れ、ホルムアミド(Ambion)を含む1×Gel Loading Buffer IIに懸濁させた。細胞核酸を110ボルトで1〜2時間電気泳動にかけ、RNA及びDNAをSYBR Gold(Invitrogen)で後染色し、Typhoon Imager(GE Healthcare)を用いて検出した。セルロースからの電気溶出中及びその後の細胞RNAの完全性を保存するために、全て装置及び表面をRNAZap(Ambion)で処理した。RNA 6000 Nano Ladder(Agilent Technologies)及び筋肉由来の精製ヒト全RNA(Origene)などの内標準をアガロースゲルに含有させて、RNアーゼの混入を観察し、コントロールrRNAバンドを特定する。
本実施例の主な目的は、セルロース紙でのRNAの保存に対する各単一要素の効果及び試験要素(例えば、キレート剤、緩衝液、pH、タンパク質変性剤、還元剤及びペプチドRNアーゼ阻害剤)の組み合わせの効果を評価することであった。本実施例のさらなる態様は、タンパク質変性剤の効果を高める可能性のある還元剤(DTT)の存在を評価することであった。
RNAを保存するための重要な成分を実施例2で特定した後、実施例3は、RNA保存能力に対するDTT及びSDSの単一の効果又は組み合わせの効果及び実施例2で好適なRNA安定性を示したGITC/DTTの組み合わせの性能に対するラジカル捕捉剤及びキレート剤の効果を研究するよう設計した。
RNAを保存するための他の重要な成分を実施例3で特定した後、実施例4は、安定性に優れ、臭いの少ない代替の還元剤(TCEP)がDTTの代わりに使用できるかどうかを調べるよう設計した。本実施例に導入した別の要素は、低分子のRNアーゼ阻害剤であるバナジルリボヌクレオシド錯体(VRC)であった。これらの代用を、rRNAを安定化する能力について比較し、評価した。
実施例5は、選択組成物を室温で30日間保存した後の選択組成物の長期性能を評価するよう設計した。Jurkat細胞をセルロース紙試料に直接適用し、風乾し、典型的なエンドユーザアプリケーションを模倣した。全細胞RNAは、実施例1で上述したプロトコールに従い、1%のアガロースゲルへの電気溶出により回収し、既知の基準に基づいて、28s:18s rRNAの量を分析した。セルロース試料は、分析前にデシケーターキャビネット内に室温で30日間保管した。各棒の上の数字は18s rRNAに対する28s rRNAの比率に対応する。1より大きい28s:18s比率は一般にインタクトなRNAを示す。実施例5の結果を図5に示す。
実施例6は、様々な緩衝液条件で新鮮な全血により選択RNA安定化紙組成物(GITC/TCEP/MEHQ)の性能を評価するように設計した。約50μLのラット全血を被験体の尾静脈から採取し、表示の緩衝液成分で調製したFTA紙又はRNA安定化紙にスポットした。カードを乾燥し、周囲温度であるが、調整した湿度(相対湿度約20%)で5〜22日間保存した。RNAは、7mmの中央パンチ片から溶解緩衝液に抽出し、当該技術分野において公知のプロトコールに従い、シリカ膜スピンカラムを通して精製した。精製及び溶出の後、RNA 6000 Pico LabChipを用いて、Agilent2100バイオアナライザでRNA Integrity Number(RIN)を測定した。従来、RT−PCR又はマイクロアレイの応用などの下流の定量分析には、RIN>5が好適であるが、RIN>6が最も好適である。実施例6の結果を図6に示す。全ての試験緩衝液組成物のうちこの選択紙組成物(GITC/TCEP/MEHQ)からの全体的なRNAの品質がFTA紙の性能を超えていた。
実施例7は、選択乾燥マトリックス(GITC/TCEP/Tris)に存在するUV阻害剤及びラジカル捕捉剤によるmRNA保護を調べるよう設計した。DNAフリー全Jurkat RNA(1μg)を、表示の成分を含有するRNA安定化紙に二反復でスポットした。各カードを分割し、半分を35℃で20時間暗所で保存し、残りは、日光の全エネルギースペクトル(全エネルギー21.7kJ/m2)を再現するためのQ−SUN Xe−1Xenon試験機で20時間(35℃、0.3W/cm2、340nm)処理した。各試料から1.2mmのパンチ片を採取し、逆転写酵素反応に直接供し、cDNAライブラリーを作製した。その後、cDNAライブラリーは、qPCRにより、HPRT1及びクラスリンmRNAに特異的なプライマーに対するプローブとした。UVに暴露した試料のサイクル閾値(CT)を、暗所で保存した未処理のメイトペアのCTから差し引いた。実施例7の結果を図7に示す。ビタミンCは、図ではアスコルビン酸の同義語として使用する。
Whatman(商標)製の31ETFセルロースベース紙を、Tris緩衝液(pH7.4)中のGITCの存在下で、高濃度のTCEP又はDTTに浸した。セルロースベース紙は、湿度を調節せずに室温で保存した。5日目、19日目及び105日目、5,5’−ジチオ−ビス(2−ニトロ安息香酸)(「DTNB」)を各紙試料に置いた。活性還元剤の存在下で、黄色への急な変色が確認された。周囲条件下で保存してから105日目までは、あらゆる濃度のTCEP溶液でコーティングされたセルロース紙はまだ活性があり、白から黄色まで紙の色の明らかな変化によって示されるようにDTNBを還元できた。DTTに浸した紙試料はDTNBを還元でなかったため、紙の色は白のままであった。これらの図は白黒では意味を成さないため、本明細書に含まれていないが、検査官の要請で提供可能である。DTNBの還元に関する化学反応は、Cline et al.(2004)Biochemistry 43:15195−15203に提供されている。
31−ETFセルロース紙試料は、異なる濃度の還元剤TCEP又はDTTと共に、Tris緩衝液(pH7.4)中のGITCを含有していた。紙試料を、次の異なる条件下で保存した:1)21℃、相対湿度10%;2)21℃、相対湿度80%;及び3)41℃、相対湿度10%。
異なる緩衝液(Tris、pH7.4;MES、pH6.2;及びMOPS、pH7.0)中のGITC及びMEHQをさらに含むTCEP組成物及び緩衝液を含まないコントロール試料を調製した。その後、セルロースベース紙をそれぞれ別の上記溶液でコーティングし、エアブローによりオーブン内で50℃で迅速に乾燥し、湿度を低く維持するためにアルミホイル袋に乾燥剤で密閉し、その後、4℃、室温又は41℃で保存した。
培養ヒトリンパ球細胞株、より詳細には、Jurkat細胞株を利用し、全細胞RNAの試料を得た。下記の表に示す試薬を所定濃度で含浸させた7mmのセルロースディスクに細胞をスポットした。下記試薬を含有するディスクは、表1に列挙した量の試薬を含有する浸漬溶液のペトリ皿にWhatman(商標)31−ETF紙を置くことにより、複数(in2中約4枚)のセルロース紙(Whatman(商標)31−ETF紙)を飽和させる「浸漬」プロトコールによって調製した。浸漬溶液は、浸漬溶液においてこれらの各試薬が所望の濃度となるように、表示のチオシアン酸塩(例えば、NaSCN、KSCN、NH4SCN、Ca(SCN)2、Mg(SCN)2、Ba(SCN)2、Co(SCN)2、Zn(SCN)2又はNaClO4)MOPS、TCEP−HCl及びMEHQ又はTHQに脱イオン水を加えることにより調製した。浸漬溶液をボルテックスで撹拌して固体試薬を完全に溶解し、各最終浸漬溶液のpHを当該技術分野において公知の方法に従って測定した。
実施例12は、全血由来の全細胞RNAを安定化するために3種の異なる無機塩の性能を評価するように設計した。約50μLのラット全血を被験体の尾静脈から採取し、乾燥形態で還元剤(例えば、TCEP)、緩衝液(例えば、Tris)及び酸化防止剤(例えば、THQ)と組み合わせて等モル濃度で表示の塩を含む化学的処理紙にスポットした。化学的に処理した乾燥セルロース紙を本質的に実施例11に上述するように調製した。化学的に含浸したセルロース紙の血斑を乾燥し、相対湿度約20%の調整湿度かつ周囲温度で19日間保存した。7mmの中央パンチ片から溶解緩衝液にRNAを抽出し、当該技術分野において公知のプロトコールに従い、シリカ膜スピンカラムを通して精製した。精製及び溶出の後、RNA 6000 Pico LabChipを用いて、Agilent2100バイオアナライザで、各試料のRNA Integrity Number(RIN)を測定した。また、RT−PCR又はマイクロアレイの応用などの下流の定量分析には、RIN>5が好適であると考えられ、RIN>6が最も好適であると考えられる。
Claims (32)
- 試料から核酸を抽出及び保存するための乾燥固体マトリックスであって、チオシアン酸グアニジン(GuSCN)以外の1種以上のチオシアン酸塩、還元剤及び緩衝液を含む組成物を乾燥固体マトリックスに導入し、次いでマトリックスを乾燥させた、乾燥固体マトリックス。
- 1種以上のチオシアン酸塩が金属チオシアン酸塩である、請求項1記載の乾燥固体マトリックス。
- 金属チオシアン酸塩が第1族又は第2族の金属カチオンを含む、請求項2記載の乾燥固体マトリックス。
- 第1族又は第2族の金属カチオンが、Na+、K+、Li+、Mg2+、Ca2+及びBa2+からなる群から選択される、請求項3記載の乾燥固体マトリックス。
- 試料が生体試料である、請求項1記載の乾燥固体マトリックス。
- 固体マトリックスに存在する組成物が、UV阻害剤、ラジカル捕捉剤、キレート剤又はそれらの組合せをさらに含む、請求項1記載の乾燥固体マトリックス。
- 乾燥固体マトリックスに導入された組成物がさらにRNアーゼ阻害剤を含む、請求項1記載の乾燥固体マトリックス。
- 乾燥固体マトリックスにより、周囲条件下で乾燥形態の核酸の長期保存が可能となる、請求項1記載の乾燥固体マトリックス。
- 核酸が、RNA、DNA又はその組み合わせである、請求項8記載の乾燥固体マトリックス。
- 核酸がRNAである、請求項9記載の乾燥固体マトリックス。
- 固体マトリックスが、セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維又はそれらの組合せを含む多孔質マトリックスである、請求項1記載の乾燥固体マトリックス。
- 多孔質マトリックスがセルロース紙である、請求項11記載の乾燥固体マトリックス。
- チオシアン酸塩が、金属カチオンから構成され、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸リチウム、チオシアン酸マグネシウム、チオシアン酸カルシウム、チオシアン酸バリウム、チオシアン酸亜鉛及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項1記載の乾燥固体マトリックス。
- 還元剤が、ジチオトレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール(2−ME)、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項1記載の乾燥固体マトリックス。
- 緩衝液が、2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−プロパン−1,3−ジオール(Tris)、2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)、3−(N−モルフォリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、クエン酸緩衝液及びリン酸緩衝液からなる群から選択される、請求項1記載の乾燥固体マトリックス。
- pH域が3〜8である、請求項15記載の乾燥固体マトリックス。
- UV保護剤又はラジカル捕捉剤が、ヒドロキノンモノメチルエーテル(MEHQ)、ヒドロキノン(HQ)、トルヒドロキノン(THQ)及びアスコルビン酸からなる群から選択される、請求項6記載の乾燥固体マトリックス。
- RNアーゼ阻害剤が、バナジルリボヌクレオシド錯体(VRC)、ヌクレオチドアナログ又は市販のRNアーゼ阻害剤である、請求項7記載の乾燥固体マトリックス。
- 固体マトリックスが多孔質セルロースベースマトリックスであり、
a)金属チオシアン酸塩が第1族又は第2族の金属カチオンで構成され、
b)還元剤がTCEPであり、
c)緩衝液がMOPSである、
請求項2記載の乾燥固体マトリックス。 - ラジカル捕捉剤をさらに含む、請求項18記載の固体マトリックスであって、ラジカル捕捉剤がMEHQ又はTHQを含む、固体マトリックス。
- 試料から核酸を抽出し、保存する方法であって、
a)組成物をチオシアン酸グアニジン以外のチオシアン酸塩、還元剤及び緩衝液を含む乾燥固体マトリックスに導入し、試料から核酸を抽出及び保存するための乾燥固体マトリックスを供給すること、
b)乾燥固体マトリックスに組成物に導入した後に固体マトリックスを乾燥すること、
c)核酸を収集するために乾燥固体マトリックスに試料を適用すること、
d)核酸を含む固体マトリックスを乾燥すること、及び
e)周囲条件下で乾燥状態の固体マトリックスで核酸を保存すること
を含む、方法。 - チオシアン酸塩が金属カチオンを含む、請求項21記載の方法。
- 金属カチオンが第1族又は第2族の金属カチオンである、請求項22記載の方法。
- 金属カチオンが、Na+、K+、Li+、Mg2+、Ca2+及びBa2+からなる群から選択される、請求項23記載の方法。
- 固体マトリックスから核酸を回収することをさらに含む、請求項21記載の方法。
- 試料が生体試料である、請求項21記載の方法。
- 生体試料が、血液、血清、組織、唾液、鼻の粘液又は細胞である、請求項26記載の方法。
- 試料が、精製核酸試料又は組織培養細胞調製物である、請求項21記載の方法。
- 試料からの核酸の精製は、核酸を抽出及び保存するための乾燥固体マトリックスに試料を適用する前に不必要である、請求項21記載の方法。
- 方法により、周囲条件下で乾燥形態のRNAの長期保存が可能となる、請求項21記載の方法。
- 水溶液、緩衝液又は有機溶液でマトリックスを再水和することにより、乾燥固体マトリックスから核酸を回収し、核酸をさらなる分析に供する、請求項25記載の方法。
- 電気溶出により乾燥固体マトリックスから核酸を回収する、請求項25記載の方法。
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