JP2005296013A

JP2005296013A - 試料中の生体分子の安定化

Info

Publication number: JP2005296013A
Application number: JP2005109707A
Authority: JP
Inventors: Mark D Krevolin; ディー．クレボリンマーク
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2004-04-07
Filing date: 2005-04-06
Publication date: 2005-10-27
Also published as: EP1584923A2; CA2504041A1; EP1584923A3; US20050227225A1

Abstract

【課題】一般に、その中で非血液基材試料中の微生物生体分子が高温において安定である、安定化された非血液基材試料の提供。
【解決手段】安定化された非血液基材試料は、試料中の微生物生体分子を安定化するために有効量の安定化成分を含む。典型的には、安定化成分はこれらの安定化された非血液基材試料中に低いレベルで有効である。これにより、安定化された非血液基材試料に関して試薬の費用が最小になるという利点が提供される。また、非血液基材試料中の微生物生体分子を安定化する方法および関係するキットを提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、一般に、試料中の生体分子および生体分子の分析に関する。

広いスペクトルの微生物は、種々の細菌、ウイルス、真菌、および原生動物を包含し、多数の異なる感染症の原因となる因子である。1つの細菌の例として、淋菌 (Neisseria gonorrhoeae) はヒトにおける淋病を引き起こすグラム陰性好気的細菌である。淋菌 (N. gonorrhoeae) の感染は、高い罹患率および低い死亡率を有し、一般に性的接触により獲得され、典型的には男性の尿道の粘膜および女性の子宮頸内膜に影響を与える。しかしながら、感染はまた他の組織に拡がる。淋菌 (N. gonorrhoeae) の病因機構は、毛を介する非繊毛上皮細胞への細菌の付着を含む。

また、この機構はエンドトキシンおよびIgAプロテアーゼの産生を含む。さらに、淋菌 (N. gonorrhoeae) およびトラコーマクラミジア (Chlamydia trachomatis) の共同感染がしばしば観測される。両方の感染は子宮外妊娠の2つの既知原因であり、そして未治療の場合、不妊症にも導くことがある。また、それらは粘液膿性子宮頸炎および骨盤炎症性疾患の急性臨床的症候群の既知原因である。したがって、特に女性において、無症候性であることがある、淋菌 (N. gonorrhoeae) およびトラコーマクラミジア (C. trachomatis) の感染の検出は、治療を必要とする個体、および感染を獲得し、さらに伝播する危険がある、より広い集団にとって重要である。

例えば、細菌感染の検出および同定は、検体源、増殖必要条件、可視増殖特徴、微視的形態、染色反応、および生化学的特性の知識を使用する、純粋な培養単離および決定手法により、伝統的に達成されてきている。例示すると、淋菌 (Neisseria gonorrhoeae) を検出し、同定する、これらの方法のいくつかは、グラム染色法、選択寒天培地上の培養、およびシトクロムオキシダーゼおよび炭水化物を使用する試験を包含する。また、共同凝集および蛍光抗体染色を包含する、血清学的アッセイは、淋菌 (N. gonorrhoeae) の検出について記載されてきている。培養に基づく方法は、比較的高感度であるが、一般に、実行が遅く、しばしば一夜のインキュベーションを含み、労力を必要とする。典型的には、グラム染色法および抗体に基づく試験は1時間より短い結果を提供するが、一般に、培養に基づく方法よりも感度が低い。

感染因子を認識するプローブとして特定のポリヌクレオチド配列を使用することは、問題となる免疫学的同定アッセイおよび他の方法の1つの代替法である。例えば、標的核酸配列に対して相補的である核酸プローブは、標的核酸配列を検出するために、ハイブリダイゼーション手法、例えば、サザンブロットおよびドットブロットにおいて使用されてきている。これらのハイブリダイゼーション手法の多数は生物の培養および/または濃縮に依存し、こうして、急速診断に不適当である。特定した核酸配列の急速な増幅技術、例えば、数ある中でポリメラーゼ連鎖反応の出現は、臨床的検体上で配列特異的プローブを直接使用し、これによりハイブリダイゼーションアッセイの実行前に病原体の濃縮およびin vitro 培養を排除する機構を提供した。こうして、核酸の増幅試験は、臨床的試料中の病原体を検出する簡単な、急速な診断技術を提供することができる。

例えば、核酸の増幅に基づくハイブリダイゼーションアッセイを使用して、患者に由来する試料または検体を感染因子の存在について直ちに試験することは常に可能であるというわけではない。例えば、診断研究所は医療点に位置しないことがあり、したがって、これらの地点間で試料を輸送しなくてはならない。これは試料採取点と試料を実際に分析する点との間でタイムラグを生ずる。その上、試料の分析を医療点で実行した場合でさえ、試料の手持ちは試験遅延を引き起こすことがある。検体中の生体分子は一般に経時的に分解するので、これらのような遅延は特定のアッセイの正確度を弱体化することがある。

例示すると、ヒトの尿は多数の化学物質、代謝物質、酵素、および生物の診断試験に普通に使用される。典型的には、尿は生体分子、例えば、核酸およびタンパク質の破壊に関係する種々の成分、例えば、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼを含む。尿または他の試料の不適切な取扱いで、被検体の分解、例えば、患者について偽陰性の結果を得るという潜在的に危険な状況のために、診断結果は偏ることがある。

試料の分解を最小するために、生体分子を一般に引き続く分析のために保存または安定化する。例えば、尿検体のような試料はしばしば低温、例えば、8℃以下に維持され、および/または安定化成分を使用して化学的に保存される。このような安定化成分は、使用すべき特定の診断試験の標的生体分子の完全性を維持する目的で、しばしば、例えば、プロテアーゼおよびヌクレアーゼの活性を減少するキレート化剤を包含する。さらに、化学的安定化の先存アプローチは高いレベルの他の試薬、例えば、カオトロピック試薬の使用をしばしば包含する。生体分子の安定化に対する先存するこれらの特別のアプローチが有する欠点は、低温を維持するとき消費される費用および時間、および、例えば、キレート化剤および高いレベルのカオトロピック試薬を使用するとき発生する原価を包含する。

本発明は、生体分子を安定化する、多数のこれらの先存アプローチの欠点を回避する、試料中の微生物生体分子を安定化する方法を提供する。本発明のこれらおよび他の特徴は、下記の開示を完全に概観すると明らかであろう。

本発明は、一般に、試料中の生体分子の安定化に関する。本発明の生体分子の安定化に対するアプローチは、一般に、多数の先存技術おけるある種の特別の取扱い必要条件を回避する。例えば、生体分子は、典型的には、試料中の生体分子の分解を最小するために、ある種の先存技術を使用するよりも高温において (例えば、温室およびその他において) 安定化される。典型的には、本明細書に記載する高温技術は、これらの先存アプローチに関して、生体分子の安定化に関連する全体の費用を減少し、そうでなければ生体分子の安定化を促進する。一般に、本発明の安定化技術は、多数の先存方法において使用するよりも少量のカオトロピック試薬の使用を含む。

したがって、典型的には、これは生体分子を安定化するとき、これらの先存アプローチに関して発生する全体の費用をさらに減少する。さらに、より少ない量のカオトロピック試薬を使用する間の高温における生体分子の安定化は、本発明の1つの驚くべき結果である。その上、本発明のある態様においてキレート化剤を使用しないことによって、試料中の生体分子を安定化する原価は他のアプローチに関してまた典型的には最小化される。試料中の生体分子を安定化する方法に加えて、本発明は、また、安定化された非血液基材試料および非血液基材試料中の微生物生体分子を安定化するキットに関する。

1つの面において、本発明は、微生物生体分子を含んでなる少なくとも1種の非血液基材試料と、少なくとも1種のカオトロピック試薬を含んでなる有効量の少なくとも1種の安定化成分とを含み、安定化された非血液基材試料中の微生物生体分子が約20℃以上の温度において安定である、安定化された非血液基材試料を提供する。ある態様において、例えば、安定化された非血液基材試料の温度が約30℃または約8℃と約2℃との間に維持されるかどうかにしたがい、安定化された非血液基材試料中の微生物生体分子のレベル (例えば、活性レベルまたはその他) は少なくとも約7日間にわたって約15%より少なく互いから変動する。

必要に応じて、安定化成分は、カオトロピック試薬に加えて、1種または2種以上の物質を含み、このような物質は、例えば、有機溶媒、還元剤、緩衝剤、洗浄剤、および/またはその他を包含する。典型的には、安定化成分はキレート化剤を実質的に含まない (例えば、キレート化剤、およびその他を欠如する) 。ある態様において、安定化された非血液基材試料は少なくとも1種の輸送媒質をさらに含む。多くの異なる種類の非血液基材試料を安定化された非血液基材試料において必要に応じて使用するが、非血液基材試料は本発明のある態様において尿を含んでなる。これらの態様において、カオトロピック試薬は典型的には約0.5 M以下の濃度で安定化された非血液基材試料中に存在する。

他の面において、本発明は、安定化された非血液基材試料と、少なくとも1種の核酸増幅試薬とを含む反応混合物を提供する。安定化された非血液基材試料は、1種または2種以上の微生物核酸を含んでなる少なくとも1種の非血液基材試料と、少なくとも1種のカオトロピック試薬を含む有効量の少なくとも1種の安定化成分とを含む。安定化成分は、微生物核酸を約20℃以上の温度において安定化する。核酸増幅試薬は、1種または2種以上の、例えば、プライマー核酸、プローブ核酸、ヌクレオチド組込み生物触媒、拡張可能なヌクレオチドまたはその他を包含する。

典型的な微生物核酸は、淋菌 (Neisseria gonorrhoeae) の核酸、髄膜炎菌 (Neisseria meningitides) の核酸、パピローマウイルスの核酸、熱帯熱マラリア原虫 (Plasmodium falciparum) の核酸、クラミジア・ムリダルム (Chlamydia muridarum) の核酸、トラコーマクラミジア (Chlamydia trachomatis) の核酸、および/またはその他を包含する。一般に、安定化成分の有効量は安定化された非血液基材試料の全重量の約45%以下を構成する。ある態様において、安定化成分は、例えば、有機溶媒、還元剤、緩衝剤、洗浄剤、および/またはその他をさらに含む。典型的には、安定化成分はキレート化剤を実質的に含まない。

他の面において、本発明は、非血液基材試料中の微生物生体分子を安定化する方法に関する。この方法は微生物生体分子 (例えば、核酸、DNA、RNA、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、プリオン、および/またはその他) を含んでなる少なくとも1種の非血液基材試料を準備する工程を含む。また、この方法は、少なくとも1種のカオトロピック試薬を含んでなる有効量の少なくとも1種の安定化成分と非血液基材試料を接触させて安定化された非血液基材試料を生成する工程を含み、ここで安定化成分は約20℃以上の温度において微生物生体分子を安定化する。安定化成分の有効量は、一般に、安定化された非血液基材試料の全重量の約45%以下を構成する。

ある態様において、例えば、非血液基材試料は尿を含んでなり、そして安定化成分の有効量は安定化された非血液基材試料の全重量の約15%以下を構成する。一般に、安定化成分はキレート化剤を実質的に含まない (例えば、キレート化剤、およびその他を欠如する) 。ある態様において、安定化された非血液基材試料の温度が約30℃または約8℃と約2℃との間に維持されるかどうかにしたがい、安定化された非血液基材試料中の微生物生体分子のレベルは少なくとも約7日間にわたって約15%より少なく互いから変動する。ある態様において、この方法は非血液基材試料を少なくとも1種の輸送媒質と接触させる工程をさらに含む。

ある態様において、この方法は、接触工程後、1種または2種以上の微生物生体分子を単離する工程を含む。典型的には、この方法は、接触工程後に1種または2種以上の微生物生体分子を単離しない場合でさえ、1種または2種以上の生物学的分子を検出する工程をさらに含む。例示すると、検出工程は、微生物生体分子により生成された、または少なくとも1種の微生物生体分子に検出可能に結合する微生物生体分子検出試薬により生成された、検出可能なシグナルを増幅して、増幅されたシグナルを生成し、そして増幅されたシグナルを検出する工程を必要に応じてさらに含む。さらに例示すると、微生物生体分子は核酸を必要に応じて含んでなり、そして検出工程は1種または2種以上の核酸の少なくともセグメントを増幅して増幅された核酸を生成し、そして増幅工程の間または後に1種または2種以上の核酸を検出する工程を必要に応じて含んでなる。

なお他の面において、本発明は、少なくとも1種のカオトロピック試薬を含んでなる少なくとも1種の安定化成分を含むキットを提供する。また、このキットは、微生物生体分子を含んでなる少なくとも1種の非血液基材試料を有効量の安定化成分と接触させて、微生物生体分子が約20℃以上の温度において安定である、安定化された非血液基材試料を生成するのための使用説明書を含む。一般に、安定化成分はキレート化剤を実質的に含まない (例えば、キレート化剤、およびその他を欠如する) 。ある態様において、安定化成分は安定化溶液を含んでなる。必要に応じて、安定化成分は1種または2種以上の固体物質を含んでなる。ある態様において、キットは安定化成分を含んでなる少なくとも1つの容器をさらに含む。ある態様において、キットは少なくとも1種の輸送媒質をさらに含む。必要に応じて、キットは非血液基材試料中の微生物生体分子を検出するための使用説明書をさらに含む。

I. 定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の態様に限定されないことを理解すべきである。また、本発明において使用する述語は特定の態様を説明することのみを目的し、限定を意図しないことを理解すべきである。特記しない限り、単位、接頭語、および記号は、国際単位系 (SI) により示唆される形を意味する。数字の範囲はその範囲を規定する数を含む。明細書および添付された特許請求の範囲おいて使用するとき、特記しない限り、単数形は複数の意味をも含む。こうして、例えば、「生体分子」に対する意味は2種またはそれ以上の生体分子、およびその他をまた包含する。さらに、特記しない限り、本発明において使用するすべてが技術用語および科学用語は、本発明が関係する当業者が普通に理解するのと同一の意味を有する。以下において定義する用語、およびそれらの文法的変異形は、明細書全体を参照することによって、いっそう完全に定義される。

「5’‐ヌクレアーゼプローブ」は、少なくとも2つ標識を含んでなり、そして2つの標識がプローブから切断されるか、あるいは他の方法で分離された後、強度が増加した放射線を放射するオリゴヌクレオチドプローブを意味する。ある態様において、例えば、5’‐ヌクレアーゼプローブは2つの異なる蛍光色素、例えば、5’ 末端のリポーター色素および3’ 末端のクエンチングング色素または部分で標識化される。プローブが無傷であるとき、典型的にはエネルギー移動はリポーター色素からの蛍光放射がクエンチングされるように2つの発蛍光団間で起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程間に、例えば、鋳型核酸に結合した5’‐ヌクレアーゼプローブは、例えば、Taqポリメラーゼの5’ヌクレアーゼ活性により切断され、こうしてリポーター色素の蛍光放射はもはやクエンチングされない。

典型的な5’‐ヌクレアーゼプローブは、例えば、下記の文献に記載されている：米国特許第5,210,015号、発明の名称”HOMOGENEOUS ASSAY SYSTEM USING THE NUCLEASE ACTIVITY OF A NUCLEIC ACID POLYMERASE”、1993年5月11日発行 (Gelfand 他) 、米国特許第5,994,056号、発明の名称”HOMOGENEOUS METHODS FOR NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND DETECTION”、1999年11月30日発行 (Higuchi) 、および米国特許第6,171,785号、発明の名称”METHODS AND DEVICES FOR HOMOGENEOUS NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND DETECTOR”、2001年1月9日発行 (Higuchi) 、これらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる。

用語「生体分子」は、生物または粒子 (例えば、ウイルス粒子)から構成された、誘導された、またはそれらに由来する有機分子を意味する。これらは、例えば、下記のものを包含する：ヌクレオチド、アミノ酸、糖、脂肪酸、ステロイド、核酸、ポリペプチド、ペプチド、ペプチドフラグメント、炭水化物、およびこれらの組み合わせ (例えば、糖タンパク質、リボヌクレオチドタンパク質、リポタンパク質、またはその他) 。
用語「血液」は、生物の心臓血管系から、例えば、静脈穿刺を介して、直接得られた物質を意味する。

用語「緩衝剤」は、pH変化に対して抵抗性である物質または混合物を意味する。緩衝剤の例は、トリス‐ (ヒドロキシメチル) アミノエタン (TRIS) 、トリス‐ (ヒドロキシメチル) アミノメタンリン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、およびその他である。
用語「カオトロピック試薬」は、疎水性相互作用を崩壊させることができる試薬を意味する。例えば、カオトロピック試薬はタンパク質を変性または可溶化することができる。典型的なカオトロピック試薬は、グアニジンイソチオシアネートまたはその塩、グアニジン塩酸塩またはその塩、およびその他である。

用語「キレート化剤」は、金属イオンに結合する物質を意味する。典型的なキレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 、 [エチレンビス (オキシエチレンニトリロ) ] 四酢酸 (EGTA) 、1,2‐ビス (2‐アミノフェノキシ) エタン‐N,N,N’,N’‐四酢酸 (BAPTA) 、およびその他である。
用語「直接結合する」は、1種または2種以上の検出法を使用してバックグラウンドのシグナル (例えば、雑音) より上で検出可能である、少なくとも2つ分子種 (例えば、プローブ核酸および標的核酸、抗体および標的生体分子、およびその他) 間の結合 (例えば、共有結合または非共有結合) を意味する。

用語「洗浄剤」は、親水性部分および疎水性部分の両方を含んでなる物質を意味する。典型的には、洗浄剤は非イオン性、イオン性、または双生イオン性である。典型的な洗浄剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート (TWEEN(商標) 20) 、ドデシル硫酸ナトリウム、およびその他を包含する。
成分の用語「有効量」は、必要な効果、例えば、試料中の生体分子の安定化を引き起こすために十分な成分の量を意味する。本発明のある態様において、例えば、所定の安定化された非血液基材試料の全重量の約45%以下である安定化成分は、混合物中の生体分子を安定化するために十分な量である。

用語「拡張可能なヌクレオチド」は、いったん拡張可能なヌクレオチドがヌクレオチドポリマーの中に組込まれると、例えば、ヌクレオチド組込み生物触媒により触媒化される反応において、少なくとも1つの他のヌクレオチドを付加または共有結合することができるヌクレオチドを意味する。拡張可能なヌクレオチドの例は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含する。典型的には、拡張可能なヌクレオチドは、他のヌクレオチドを拡張可能なヌクレオチドの糖部分の3’ ‐位置に付加することによって拡張される。

用語「高温」は、約20℃以上である温度を意味する。例示すると、本発明の安定化された非血液基材試料は典型的には約20℃〜約40℃の温度に維持され、より典型的には約21℃〜約35℃の温度に維持され、なおより典型的には約22℃〜約30℃の温度 (例えば、温室) に維持される。
「溶菌試薬」は、混合物中の細胞の溶菌を行うまたは促進する試薬を意味する。
用語「微生物」は、任意の微視的または超顕微鏡的生物または粒子を意味する。微生物は、例えば、細菌、ウイルス、原生動物、およびある種の真菌を包含する。

用語「微生物生体分子」は、微生物から生ずる生体分子を意味する。微生物生体分子は、例えば、細菌の生体分子、ウイルスの生体分子、真菌の生体分子、原生動物の生体分子、またはその他を包含する。
用語「微生物生体分子検出試薬」は、標的生体分子に検出可能に結合 (例えば、核酸ハイブリダイゼーション、抗体‐抗原認識、または他の種類の結合相互作用における水素結合) する試薬を意味する。典型的な微生物生体分子検出試は、例えば、オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブ、抗体、およびその他を包含する。
用語「微生物核酸」は、微生物から生ずる核酸を意味する。微生物核酸は、例えば、細菌の核酸、ウイルスの核酸、真菌の核酸，原生動物の核酸、およびその他を包含する。
「混合物」は、2またはそれ以上の異なる成分の組み合わせを意味する。

「非血液基材試料」は、血液以外の1種または2種以上の物質を含む被検体 (例えば、哺乳動物の被検体、特にヒトの被検体) から得られた試料を意味する。典型的な非血液基材試料は、尿、精液、精漿、前立腺液、膣液、膣切屑、頸部液、子宮液、頸部切屑、羊水、肛門切屑、糞便、消化液、乳首分泌物、リンパ液、肺/気管支洗液、粘膜、痰、涙、バックル (buckle) 細胞、唾液、組織試料、脊髄液、汗、およびその他を包含する。ある態様において、異なる被検体から得られた非血液基材試料を一緒にプールし、本明細書に記載するように安定化した後、1種または2種以上のプロトコルに付す。

用語「核酸」は、ヌクレオチドのひもに対応させることができるモノマー単位の任意の物理的ひもを包含し、ヌクレオチドポリマー (例えば、典型的なDNAまたはRNAのポリマー) 、PNA、変性されたオリゴヌクレオチド (例えば、溶液中の生物学的RNAまたはDNAに対して典型的ではないヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド、例えば、2’‐O‐メチル化オリゴヌクレオチド) 、および/またはその他を含む。核酸は、例えば、一本鎖または二本鎖であることができる。特記しない限り、本発明の特定の核酸配列は、明瞭に示した配列に加えて、相補的配列を包含する。また、核酸は修飾、例えば、標識、クエンチャー、またはその他を含むことができる。用語「核酸」は、例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、遺伝子、cDNA、および遺伝子によりコードされるmRNAと互換的に使用される。

「核酸増幅試薬」は、核酸増幅反応および/または核酸反応生成物の検出に参加しおよび/またはそれを促進することができる試薬を意味する。典型的な核酸増幅試薬は、プライマー核酸、プローブ核酸、ヌクレオチド組込み生物触媒、拡張可能なヌクレオチド、およびその他を包含する。

「ヌクレオチド組込み生物触媒」は、核酸の中へのヌクレオチドの組込みを触媒する触媒を意味する。典型的には、ヌクレオチド組込み生物触媒は酵素である。「酵素」は、他の化合物または「基質」を包含する化学反応の活性化エネルギーを減少する作用をするタンパク質および/または核酸に基づく触媒である。「ヌクレオチド組込み酵素」は、核酸の中へのヌクレオチドの組込みを触媒する酵素を意味する。典型的なヌクレオチド組込み酵素は、例えば、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、末端トランスフェラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、およびその他を包含する。「熱安定性酵素」は、熱に対して安定性 (例えば、破壊または変性に対して抵抗性) であり、そして選択した時間の間高温に暴露したとき、十分な活性を保持する酵素を意味する。

例えば、熱安定性ポリメラーゼは、二本鎖核酸を変性するために必要な時間の間高温に暴露したとき、引き続くプライマーエクステンション反応を実施するために十分な活性を保持する。核酸の変性に必要な加熱条件はこの分野においてよく知られており、そして米国特許第4,683,202号および米国特許第4,683,195号 (これらの両方は引用することによって本明細書の一部とされる) において例示されている。本明細書において使用するとき、熱安定性ポリメラーゼは典型的には温度サイクリング反応、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 、およびその他に適当である。熱安定性ヌクレオチド組込み酵素について、酵素活性は、鋳型核酸に対して相補的なプライマー核酸エクステンション生成物を形成する適切な方法における、ヌクレオチドの組み合わせの触媒反応を意味する。本明細書において言及する他の熱安定性酵素は熱安定性ピロホスファターゼを包含し、これは、例えばピロホスホロリシスを最小とするために、高温に暴露したとき、十分な活性を同様に保持する。

用語「ポリペプチド」は、2またはそれ以上のアミノ酸残基 (例えば、ペプチドまたはタンパク質) を含んでなるポリマーを意味する。このポリマーは非アミノ酸要素、例えば、標識、クエンチャー、ブロッキング基、またはその他をさらに含んでなり、そして必要に応じて修飾、例えば、グリコシル化またはその他を含んでなることができる。ポリペプチドのアミノ酸残基は天然または非天然であることができ、そして非置換、非修飾であるか、あるいは置換または修飾されていることができる。

「プライマー核酸」または「プライマー」は、典型的には鋳型核酸または標的核酸に対してハイブリダイゼーションすることができ、そして適当な反応条件下に、例えば、ヌクレオチド組込み生物触媒、例えば熱安定性ポリメラーゼを使用して連鎖のエクステンションまたは伸長を行うことができる核酸である。典型的には、プライマー核酸は天然または合成のオリゴヌクレオチド (例えば、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド、およびその他) である。他のプライマー核酸長さが必要に応じて使用されるが、それらは典型的には15〜35ヌクレオチドの範囲である。一般に、短いプライマー核酸は、鋳型核酸と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度を使用する。典型的には、鋳型核酸のサブ配列に対して少なくとも部分的に相補的であるプライマー核酸は、鋳型核酸とハイブリダイゼーションしてエクステンションを引き起こすために十分である。

必要に応じて、プライマー核酸は、例えば、スペクトロスコピー、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的技術により、標識を検出可能に組込むことによって標識化することができる。例示すると、有効な標識は、放射性同位体、蛍光色素、電子密な試薬、酵素 (ELISAにおいて普通に使用されているような) 、ビオチン、またはハプテンおよびタンパク質 (それに対する抗血清またはモノクローナル抗体が入手可能である) を包含する。これらの標識の多数および他の標識は本明細書にさらに記載され、および/またはそうでなければこの分野において知られている。

用語「プローブ核酸」または「プローブ」は、適当な条件下に標的核酸に選択的にハイブリダイゼーションすることができる標識化または非標識化オリゴヌクレオチドを意味する。典型的には、プローブは核酸試料中に含有される特異的標的配列 (例えば、細菌の核酸、ウイルスの核酸、真菌の核酸、原生動物の核酸、およびその他) に対して十分に相補的であって、選択したハイブリダイゼーション条件 (例えば、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件であるが、これに限定されない) 下に標的配列と安定なハイブリダイゼーションデュプレックスを形成する。十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にプローブを使用して実施されたハイブリダイゼーションアッセイは、特定の標的配列の選択的検出を可能とする。

用語「ハイブリダイゼーション領域」は、標的配列に対して正確にまたは実質的に相補的である核酸の領域を意味する。配列中の単一のヌクレオチド差を識別するハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用するために、ハイブリダイゼーション領域は典型的には約8〜約100ヌクレオチド長さである。ハイブリダイゼーション領域は一般に全体のオリゴヌクレオチドを意味するが、プローブは、例えば、プローブ配列を固体支持体またはその他に結合させる部位を提供するリンカー結合部位として機能する、追加のヌクレオチド配列を含むことができる。ある態様において、プローブ核酸は1または2以上の標識 (例えば、リポーター色素、クエンチャー部分、およびその他) 、例えば、5’‐ヌクレアーゼプローブ、FRETプローブ、分子ビーコン、またはその他を含んでなり、これらは試料中のプローブ核酸および標的核酸の間のハイブリダイゼーションを検出するために使用することもできる。

ある態様において、プローブ核酸のハイブリダイゼーション領域は標的配列に対して完全に相補的である。しかしながら、一般に、完全な相補性は不必要である；安定なデュプレックスはミスマッチ塩基または非対合塩基を含有することができる。ストリンジェント条件の変更は、1または2以上の塩基対のミスマッチまたは非対合塩基との安定なハイブリダイゼーションデュプレックスを可能とするために必要である。

Sambrook 他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N. Y. (2001) (これは引用することによって本明細書の一部とされる) には、適当な変更のための手引きが記載されている。標的/プローブデュプレックスの適当性は、オリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成およびオリゴヌクレオチドの配列、温度およびイオンの条件を含む多くの変数に依存する。当業者は、一般に、所定のプローブの正確な相補性がプローブとして同様に有効であることを認識するであろう。また、当業者は、ある態様において、プローブ核酸をプライマー核酸として使用することもできることを認識するであろう。

用語「有機溶媒」は、他の有機物質を溶解するか、あるいは他の有機物質中に溶解して溶液を形成する有機化学物質または有機化学物質の混合物を意味する。有機溶媒の例は、アルコール、ポリエチレングリコール、およびその他である。

「反応混合物」は、所定の反応に参加し、および/またはそれを促進することができる分子を含んでなる混合物を意味する。例えば、核酸増幅反応混合物は核酸増幅反応に必要な成分を含む。こうして、核酸増幅反応混合物は標的核酸を増幅する核酸増幅法において使用するために適当であるが、核酸増幅反応の開始をユーザーがコントロールできるように、反応混合物は最初に不完全であることができる。この方法において、いったん最終成分、例えば、ヌクレオチド組込み生物触媒 (例えば、ポリメラーゼ、リガーゼ、および/またはその他) を添加して、完全な核酸増幅反応混合物を形成すると、反応を開始することができる。典型的には、核酸増幅反応混合物は、重合活性に適当な緩衝剤、拡張可能なヌクレオチド、およびプライマー核酸を含有するであろう。ある態様において、プローブ核酸 (例えば、5’‐ヌクレアーゼプローブ、およびその他) をまた添加して核酸増幅反応を監視する。

用語「還元剤」は、典型的には電子を供与することによって化学組成物を還元する物質を意味する。ある態様において、還元剤はタンパク質中のジサルファイド結合を切断する。典型的な還元剤は、ジチオスレイトール (DTT) 、ジチオエリトリトール、およびその他を包含する。

混合物の温度が約30℃または約8℃と約2℃との間に維持されるかどうかにしたがい、混合物中の微生物生体分子 (例えば、微生物生体分子またはその他) のレベル (例えば、活性レベル (例えば、光学密度 [OD] またはその他により測定した) またはその他) が少なくとも約7日間にわたって約20% (例えば、約15%、約10%、約5%、およびその他) より少なく互いから変動するとき、生体分子は非血液基材試料中で「安定化」または「保存」される。

用語「安定化成分」は、混合物中の生体分子を安定化または保存する、例えば、それらの生体分子が混合物中で分解するのを防止するか、あるいはこのような分解を少なくとも最小にする物質または物質の混合物を意味する。本発明のある態様において、安定化成分は溶菌試薬を含んでなる。

「安定化された非血液基材試料」は、1種または2種以上の微生物生体分子を含むことが推測される少なくとも1種の非血液基材試料と、少なくとも1種のカオトロピック試薬を含む有効量の少なくとも1種の安定化成分とを含んでなり、ここで微生物生体分子が約20℃以上の温度において安定である、混合物を意味する。ある態様において、例えば、微生物核酸は、例えば核酸増幅反応を介して、検出される前に、安定化された非血液基材試料中で保存される。

用語「輸送媒質」は、試料の収集、輸送、および/または貯蔵のために使用される媒質である。典型的には、輸送媒質は液相または固相で準備され、一般に、特定の生物に対して特異的または非特異的である。典型的な輸送媒質は、例えば、M4、JEMBEC(商標) 媒質、トランスグロウ (Transgrow) 媒質、およびその他を包含する。

II.序論
本発明は、一般に、試料中の生体分子の安定化に関する。ある態様において、例えば、微生物生体分子は、それらの生体分子を分析して患者を診断するまで、患者に由来する試料中で保存または安定化される。ある種の先存技術において、それらの生体分子を含んでなる試料を低温、例えば、約8℃と約2℃との間に温度において貯蔵することによって、生体分子の分解を最小にすることが試みられる。対照的に、本明細書に記載するように保存される生体分子は、より高い温度、例えば、温室においてさえ安定である。こうして、本発明の生体分子の安定化に対するアプローチは、これらの先存技術における特別の取扱いの必要条件により制限されない。

その上、典型的には、本発明により提供される生体分子の安定化に対するアプローチは、使用するとしても、他の生体分子の保存技術において普通に使用されるよりも少ない量の種々の安定化成分 (例えば、カオトロピック試薬、キレート化剤、およびその他) を使用する。したがって、本明細書に記載するように、生体分子の安定化に関連する費用は、典型的には、生体分子の安定化に対する多数のこれらの先存アプローチに関連する費用より少なく、本発明の利点のいくつかを例示する。これらの利点のあるものを例示する実施例は後述される。

ある態様において、本発明は、安定化された非血液基材試料および非血液基材試料中の微生物生体分子を安定化するキットを提供する。さらに、本発明は、また、このような試料中の微生物生体分子を安定化する方法を提供する。

III. 安定化された非血液基材試料および反応混合物
本発明は、その中で微生物生体分子が高温 (例えば、約20℃以上) において安定である、安定化された非血液基材試料を提供する。一般に、本発明の安定化された非血液基材試料中の微生物生体分子の活性レベル (例えば、ODにより測定した) は、安定化された非血液基材試料の温度が約30℃または約8℃と約2℃との間に維持されるかどうかにしたがい、少なくとも約7日間にわたって約20%より少なく互いから変動する。安定化された非血液基材試料は、微生物生体分子と、カオトロピック試薬を含む有効量の安定化成分とを含んでなる非血液基材試料を包含する。典型的には、本発明の安定化された非血液基材試料は、種々の分子の分析、多数のアッセイの中で、例えば、核酸増幅に基づく診断試験において使用される。本発明の反応混合物は、安定化された非血液基材試料と核酸増幅試薬とを含む。

A. 非血液基材試料
尿は例示の明確さのために本明細書において強調されるが、特に患者から得られた任意の非血液基材試料が安定化された非血液基材試料および本発明の他の面において必要に応じて使用されることが理解されるであろう。他の典型的な非血液基材試料は、例えば、精液、精漿、前立腺液、膣液、膣切屑、頸部液、子宮液、頸部切屑、羊水、肛門切屑、糞便、消化液、乳首分泌物、リンパ液、肺/気管支洗液、粘膜、痰、涙、バックル (buckle) 細胞、唾液、組織試料、脊髄液、汗、およびその他を包含する。さらに、多数の異なる種類の微生物生体分子、例えば、核酸、DNA、RNA、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、プリオン、および/またはその他は、本発明の安定化された非血液基材試料中で安定化される。

これらの微生物生体分子源は広く変化するが、典型的には哺乳動物、特にヒトにおける感染因子であるものを包含する。これらの微生物源の例は、例えば、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、およびその他を包含する。さらに例示すると、典型的な細菌源は、例えば、淋菌 (Neisseria gonorrhoeae) 、髄膜炎菌 (Neisseria meningitides) 、クラミジア・ムリダルム (Chlamydia muridarum) 、トラコーマクラミジア (Chlamydia trachomatis) 、およびその他を包含する。典型的なウイルス源はパピローマウイルスであるが、真菌源の例はヒストプラズマ・カプスラツス (Histoplasma capsulatus) 、ブラストマイセス・デマチチヂス (Blastomyces dematitidis) 、およびその他を包含する。1つの典型的な原生動物源は熱帯熱マラリア原虫 (Plasmodium falciparum) であり、これはヒトにおいてマラリアを引き起こす。多数の他の微生物源はこの分野においてよく知られている。

本質的に任意の収集技術を使用して、非血液基材試料は得られる。ある態様において、例えば、尿を患者から収集するが、他の態様において、スワブ、ブラシ、またはループを使用して、例えば、特定の患者の子宮頸内膜、尿道、直腸、膣、中咽頭、眼、およびその他から試料を採取する。多数のスワブのタイプ、例えば、レーヨン繊維を先端とするスワブ、綿のスワブ、DACRON(商標) スワブ、またはその他は、これらの非血液基材試料の収集に適する。必要に応じて、スワブは被覆される (例えば、血清またはウシアルブミン‐被覆スワブ、アルギン酸カルシウムスワブ、およびその他) 。典型的には、尿またはスワブ採取検体は試料容器、例えば、ポリプロピレン管、ねじ蓋付き管、およびその他の中に入れられる。一般に、本発明の安定化成分は、試料処理プロトコルの一部分として特定の非血液基材試料を容器に添加する前または後に、これらの試料容器に添加される。

安定化成分は詳しく後述される。ある態様において、尿試料を洗浄緩衝剤と接触させ、遠心し、そして上澄みを除去した後、安定化成分を残留する試料と接触させる。また、検体を収集し、取扱う技術は下記の文献に記載されている：例えば、Forrest 他 (編者) 、Manual of Clinical Microbiology、第8版、ASM Press (2003) 、Murray 他 (編者) 、Manual of Clinical Microbiology、第7版、ASM Press (1999) 、およびForbes 他、Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology、第11版、Elsevier Science (2002) 、これらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる。一般に、これらの源からの検体を貯蔵し、細胞を培養し、生体分子 (例えば、核酸、タンパク質、およびその他) を単離し、調製する方法はこの分野におこれらの源からのいて知られており、そして本明細書中に提供される参考文献および/または実施例にさらに説明されている。

ある態様において、また、試料容器は1種または2種以上の追加の成分、例えば、検体の希釈剤、標的微生物に適する輸送媒質、および/またはその他を含む。例えば、淋菌 (N. gonorrhoeae) に適する輸送媒質は、非栄養輸送媒質、例えば、スチュアートまたはアミーズ媒質、または選択増殖および輸送媒質、例えば、M4、JEMBEC(商標)、またはトランスグロウ媒質を包含する。他の典型的な輸送媒質は本明細書において説明されている。多数の異なる種類の輸送媒質は、種々の供給会社、例えば、Quelabs Laboratories, Inc. (カナダ国モントリオール) から商業的に入手可能である。

また、輸送媒質および媒質系は、例えば、下記の文献に記載されている：米国特許第5,096,062号、発明の名称“TRANSPORT SYSTEM FOR SHIPPING MICROBIOLOGICAL SAMPLES”、1992年3月17日発行 (Burkardt 他) 、米国特許第5,545,555号、発明の名称“MICROBIAL TRANSPORT MEDIA”、1996年8月13日発行 (Racioppi他) 、および米国特許第5,702,944、発明の名称“MICROBIAL TRANSPORT MEDIA”、1997年12月30日発行 (Racioppi 他) 、これらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる。

B. 安定化成分
本発明の安定化された非血液基材試料において使用する安定化成分はカオトロピック試薬を含み、これらの試薬は酵素、例えば、ヌクレアーゼ (例えば、DNアーゼ、RNアーゼ、およびその他) およびプロテアーゼ (例えば、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびその他) を変性することによって不活性化する。本発明の安定化された非血液基材試料において、これらの酵素は阻害されるか、あるいは高い温度においてさえ混合物中の生体分子を分解するのを防止されるので、この不活性化は微生物生体分子を安定化する。典型的には、本明細書に記載する安定化成分は試料収集時に試料に添加される。

カオトロピック試薬に加えて、本明細書に記載するように使用される安定化成分は、追加の化合物、例えば、ある態様において有機溶媒、還元剤、緩衝剤、または洗浄剤を含む。これらの追加の化合物の典型的な量を例示の目的で本明細書において示したが、当業者は理解するように、これらの態様において他の量を安定化成分に添加することもできる。また、典型的な安定化成分は下に提供される実施例に記載されている。一般に、これらの安定化成分において使用されるカオトロピック試薬および他の化合物は、種々の商業的供給会社、例えば、Sigma‐Aldrich, Inc (米国ミゾリー州セントルイス) から容易に入手可能である。

生体分子の安定化に対するある種の先存アプローチと異なり、本発明の安定化成分は典型的にはキレート化剤、例えば、EDTA、EGTA、BAPTA、およびその他を欠如する。これにより、他の利点の中でも、これらの他のアプローチに関して費用が節約される。安定化成分の有効量は典型的には安定化された非血液基材試料の全重量の約45%以下、より典型的には安定化された非血液基材試料の全重量の約35%以下、なおより典型的には安定化された非血液基材試料の全重量の約25%以下を構成する。例えば、非血液基材試料が尿であるとき、安定化成分の有効量は典型的には安定化された非血液基材試料の全重量の約15%以下 (例えば、約12%、約10%、約8%、およびその他) を構成する。

カオトロピック試薬
本発明の安定化された非血液基材試料および他の面の驚くべき結果の1つは、安定化された非血液基材試料が高温に維持される間、微生物生体分子が少量のカオトロピック試薬を使用して安定化されることである。ある態様において、例えば、カオトロピック試薬は安定化された非血液基材試料中に約5.0 M以下 (例えば、約4.5 M、約4.0 M、約3.5 M、およびその他) の濃度で存在する。さらに例示すると、非血液基材試料が尿であるとき、カオトロピック試薬は典型的には安定化された非血液基材試料中に約0.5 M以下 (例えば、約0.45 M、約0.40 M、約0.35 M、およびその他) の濃度で存在する。

カオトロピック試薬は疎水性相互作用を崩壊させることができ、例えば、タンパク質の変性または可溶化を引き起こす。本明細書に記載する安定化成分中のカオトロピック試薬は、例えば、試料中のヌクレアーゼ、プロテアーゼ、およびその他を変性することによって、生体分子を安定化し、これにより本発明の安定化された非血液基材試料中の標的生体分子 (例えば、核酸、タンパク質、およびその他) をそれらの酵素が分解するのを実質的に防止する。必要に応じて使用する典型的なカオトロピック試薬は、1種または2種以上の、例えば、グアニジンイソチオシアネートまたはその塩、グアニジン塩酸塩またはその塩、尿素、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、塩化カリウム、アンモニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、トリフルオロエタノール、または過塩素酸ナトリウム、またはその他を包含する。

有機溶媒
ある態様において、安定化成分は少なくとも1種の有機溶媒をさらに含む。これらの態様において、有機溶媒は典型的には安定化された非血液基材試料の全重量の約0.1%〜約10% (例えば、約0.5%、約1%、約3%、約5%、約7%、約9%、およびその他) を構成する。例えば、非血液基材試料が尿を含んでなるとき、有機溶媒は必要に応じて安定化された非血液基材試料の全重量の約0.1%〜約1% (例えば、約0.3%、約0.5%、約0.7%、約0.9%、およびその他) を構成する。本発明の安定化成分中に必要に応じて使用するある種の典型的な有機溶媒は、1種または2種以上の、例えば、ポリエチレングリコール、アセトン、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド、またはその他を包含する。典型的には、ポリエチレングリコールの分子量は約5000ダルトン〜15000ダルトンである。

還元剤
ある態様において、安定化成分は少なくとも1種の還元剤をさらに含んでなる。典型的には、還元剤は約10 mM〜約200 mM (例えば、約50 mM、約75 mM、約100 mM、約125 mM、約150 mM、約175 mM、およびその他) の濃度で安定化された非血液基材試料中に存在する。さらに例示すると、非血液基材試料が尿を含んでなるとき、還元剤は必要に応じて約10 mM〜約20 mM (例えば、約12 mM、約14 mM、約16 mM、約18 mM、およびその他) の濃度で安定化された非血液基材試料中に存在する。本明細書に記載するように使用する典型的な還元剤は必要に応じて1種または2種以上の、例えば、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、2‐アミノエタンチオール、2‐メルカプトエタノール、およびその他を含んでなる。

緩衝剤
安定化成分は必要に応じて少なくとも1種の緩衝剤をさらに含んでなる。典型的には、緩衝剤は安定化された非血液基材試料のpHを約6以上に維持するために十分な量で存在する。典型的には、緩衝剤は約0.1 mM〜約100 mM (例えば、約5 mM、約10 mM、約25 mM、約50 mM、約75 mM、およびその他) の濃度で安定化された非血液基材試料中に存在する。例えば、非血液基材試料が尿を含んでなるとき、緩衝剤は必要に応じて約0.1 mM〜約10 mM (例えば、約0.5 mM、約1 mM、約3 mM、約5 mM、約7 mM、約9 mM、およびその他) の濃度で安定化された非血液基材試料中に存在する。

さらに例示すると、緩衝剤は必要に応じて1種または2種以上の、例えば、下記のものを包含する：トリス‐ (ヒドロキシメチル) アミノエタン (TRIS) 、トリス‐ (ヒドロキシメチル) アミノメタンリン酸ナトリウム、ビス (2‐ヒドロキシエチル) イミノ‐トリス (ヒドロキシメチル) メタン (BIS‐TRIS) 、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、グリシン‐水酸化ナトリウム、N‐2‐ヒドロキシエチルピペラジン‐N’‐2‐エタンスルホン酸 (HEPES) 、3‐[(1,1−ジメチル‐ヒドロキシエチル) アミノ]‐2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸 (AMPSO) 、3‐(シクロヘキシルアミノ)‐2‐ヒドロキシ‐1‐プロパンスルホン酸 (CAPSO) 、3‐[N,N‐ビス (ヒドロキシエチル) アミノ]‐2-ヒドロキシプロパンスルホン酸 (DIPSO) 、N‐(2‐ヒドロキシエチル) ピペラジン‐N’‐2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸 (HEPPSO) 、3‐(N‐モルホリノ)‐2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸 (MOPSO) 、ピペラジン‐N,N’‐ビス (2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸) (POPSO) 、3‐[N‐トリス‐(ヒドロキシメチル) メチルアミノ]‐2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸 (TAPSO) 、2‐(N‐モルホリノ) エタンスルホン酸 (MES) 、3‐(N‐モルホリノ) プロパンスルホン酸 (MOPS) 、ピペラジン‐N,N’‐ビス (エタンスルホン酸) (PIPES) 、酢酸塩、クエン酸塩、塩酸、塩化カリウム、グリシン、フタル酸水素カリウム、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、フタル酸水素二ナトリウム、オルトリン酸二水素ナトリウム、フタル酸水素二カリウム、オルトリン酸二水素カリウム、バルピトンナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、またはその他。

洗浄剤
ある態様において、安定化成分は少なくとも1種の洗浄剤を含む。これらの態様において、洗浄剤は典型的には安定化された非血液基材試料の全重量の約0.001%〜約1% (例えば、約0.01%、約0.1%、約0.5%、およびその他) を構成する。さらに例示すると、非血液基材試料が尿を含んでなるとき、洗浄剤は必要に応じて安定化された非血液基材試料の全重量の約0.001%〜約0.01% (例えば、約0.003%、約0.005%、約0.007%、約0.009%、およびその他) を構成する。必要に応じて、洗浄剤は1種または2種以上の、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート (TWEEN(商標) 20) 、サルコシン、ドデシル硫酸ナトリウム、ノナエチレングリコールオクチルフェノールエーテル (TRITON(商標) X‐100) 、またはその他を含んでなる。

C. 核酸増幅試薬
典型的には、本発明の反応混合物は、本明細書に記載するように、その中で微生物核酸が安定化される、安定化された非血液基材試料を包含する。さらに、反応混合物は核酸増幅試薬をも含む。典型的な核酸増幅試薬は、核酸増幅反応を実施するとき有効であるもの、例えば、プライマー核酸、プローブ核酸、ヌクレオチド組込み生物触媒、拡張可能なヌクレオチド、およびその他を包含する。ある態様において、例えば、核酸増幅反応は、例えば疾患の診断および/または予後を促進するために、これらの反応混合物を使用して試料中の標的微生物核酸を検出することによって実施される。また、核酸の増幅は下記においてさらに説明される。

一般に、反応混合物は、安定化された非血液基材試料またはそのアリコートを、選択した特定の核酸増幅法を実施するために十分な量の核酸増幅試薬と組み合わせることによって調製される。所定の反応混合物に添加すべき核酸増幅試薬の量は、選択した核酸増幅法にかんがみて、当業者によく知られている。しかしながら、例示すると、プライマー核酸および拡張可能なヌクレオチド (例えば、4つのdNTP (dGTP、dCTP、dATP、dTTP)) の各々は、ある態様において反応混合物の中に大モル過剰量で存在する。本発明の反応混合物において使用することができるプローブ核酸およびプライマー核酸は、下記においてさらに説明される。適当な拡張可能なヌクレオチドは下記の多数の異なる商業的供給会社から容易に入手可能である：Riche Diagnostics Corporation (米国インジアナ州インジアナポリス) 、Amersham Biosciences Corp. (米国ニュージャージー州ピスカタウェイ) 、Applied Biosystems (米国カリフォルニア州フォスターシティー) 、およびその他。

ある態様において、安定化された非血液基材試料を他の処理工程において1または2回以上精製した(例えば、試料中の標的微生物核酸を濃縮するため、およびその他のために) 後、核酸増幅試薬と組み合わせて本発明の反応混合物を形成する。精製は技術、例えば、塩、クロロホルムまたはフェノールを使用する化学的抽出、沈降、遠心、クロマトグラフィーまたは当業者に知られている他の技術を包含することができる。他の態様において、例えば、試料処理を含むアプローチに関して全体のプロセスの処理量を改良するために、前の試料処理を実施しないで、反応混合物を調製する。

典型的には、本発明の反応混合物および他の面において使用するヌクレオチド組込み生物触媒は、酵素、例えば、ポリメラーゼ、末端トランスフェラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、およびその他を包含する。ある態様において、例えば、酵素は5’ → 3’ ヌクレアーゼ活性、5’ → 3’エキソヌクレアーゼ活性を包含し、および/または熱安定性酵素である。

酵素は必要に応じて下記の生物に由来する：例えば、テルムス・アントラニキアニイ (Thermus antranikianii) 、テルムス・アクアティカス (Thermus aquaticus) 、テルムス・カルドフィルス (Thermus caldophilus) 、テルムス・チリアロフィルス (Thermus chliarophilus) 、テルムス・フィリフォルミス (Thermus filiformis) 、テルムス・フラブス (Thermus flavus) 、テルムス・イグニテラエ (Thermus igniterrae) 、テルムス・ラクテウス (Thermus lacteus) 、テルムス・オシマイ (Thermus oshimai) 、テルムス・ルベル (Thermus ruber) 、テルムス・ルベンス (Thermus rubens) 、テルムス・スコトヅクツス (Thermus scotoductus) 、テルムス・シルヴァヌス (Thermus silvanus) 、テルムス・スペシーズ (Thermus species) Z05、テルムス・スペシーズ (Thermus species) sps 17、テルムス・サーモフィルス (Thermus thermophilus) 、サーモトガ・マリチマ (Thermotoga maritima) 、サーモトガ・ネアポリタナ (Thermotoga neapolitana) 、サーモシフォ・アフリカヌス (Thermosipho africanus) 、アネロセルム・ファーモフィルム (Anaerocellum thermophilum) 、バシラス・カルドテナクス (Bacillus caldotenax) 、バシラス・ステアロサーモフィルス (Bacillus stearothermophilus) 、またはその他。

ある態様において、酵素を修飾する。典型的な修飾された酵素は下記のものを包含する：例えば、G46E E678G CS5 DNAポリメラーゼ、G46E E678G CS6 DNAポリメラーゼ、△ ZO5Rポリメラーゼ、G46E L329A E678G CS5 DNAポリメラーゼ、およびその他。また、ヌクレオチド組込み生物触媒に関する詳細は下記の文献に記載されている：例えば、米国特許第5,939,292号、発明の名称”THERMOSTABLE DNA POLYMERASE HAVING REDUCED DISCRIMINATION AGAINST RIBO‐NTPS”、1999年8月17日発行 (Gelfand 他) 、および米国願公開第US 2002/0012970号、発明の名称”HIGH TEMPERATURE REVERSE TRANSCRIPTION USING MUTANT DNA POLYMERASE ”、2002年1月31日公開 (Smith 他) および米国特許出願第10/401,403号、2003年3月26日提出、これらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる。

ある態様において、また、追加の試薬を本発明の反応混合物に添加する。例示すると、反応混合物はまた必要に応じて、例えば、ピロホスホロリシスを最小にするとき使用するために、ピロホスファターゼ (例えば、熱安定性ピロホスファターゼ) 、例えば、キャリーオーバー汚染に対して保護するために、ウラシルN‐グリコシラーゼ (UNG) (例えば、熱安定性UNG) 、およびその他を含む。

D. 調製された安定化された非血液基材試料および反応混合物
本発明の好ましい非血液基材試料は下記成分を含んでなる：
‐ 微生物生体分子を含んでなる少なくとも1種の非血液基材試料；および
‐ 少なくとも1種のカオトロピック試薬を含んでなる有効量の少なくとも1種の安定化成分；
ここで安定化された非血液基材試料中の微生物生体分子は約20℃以上の温度において安定である。
好ましくは、この非血液基材試料は、1種または2種以上の尿、精液、精漿、前立腺液、膣液、膣切屑、頸部液、子宮液、頸部切屑、羊水、肛門切屑、糞便、消化液、乳首分泌物、リンパ液、肺/気管支洗液、粘膜、痰、涙、バックル細胞、唾液、組織試料、脊髄液、または汗を含んでなる。

好ましくは、この安定化された非血液基材試料の微生物生体分子は、1種または2種以上の核酸、DNA、RNA、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、またはプリオンを含んでなる。
また、この安定化された非血液基材試料の微生物生体分子は、好ましくは細菌の生体分子、ウイルスの生体分子、真菌の生体分子、または原生動物の生体分子の1種または2種以上を含んでなり、なおより好ましくは淋菌 (Neisseria gonorrhoeae) の生体分子、髄膜炎菌 (Neisseria meningitides) の生体分子、ポリオーマウイルスの生体分子、熱帯熱マラリア原虫 (Plasmodium falciparum) の生体分子、クラミジア・ムリダルム (Chlamydia muridarum) の生体分子、またはトラコーマクラミジア (Chlamydia trachomatis) の生体分子の1種または2種以上を含んでなる。

好ましくは、この安定化された非血液基材試料の安定化成分の有効量は、安定化された非血液基材試料の全重量の約45%以下を構成する。なおより好ましくは、この安定化された非血液基材試料は尿を含んでなり、そして安定化成分の有効量は安定化された非血液基材試料の全重量の約15%以下を構成する。
好ましくは、この安定化された非血液基材試料の安定化成分はキレート化剤を実質的に含まない。

好ましくは、この安定化された非血液基材試料のカオトロピック試薬は、グアニジンイソチオシアネートまたはその塩、グアニジン塩酸塩またはその塩、尿素、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、塩化カリウム、アンモニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、トリフルオロエタノール、または過塩素酸ナトリウムの1種または2種以上を含んでなる。
好ましくは、また、この安定化された非血液基材試料は少なくとも1種の輸送媒質を含んでなる。

好ましくは、この安定化された非血液基材試料のカオトロピック試薬は、安定化された非血液基材試料中に約5.0 M以下の濃度で存在する。より好ましくは、この安定化された非血液基材試料は尿を含んでなり、そしてカオトロピック試薬は安定化された非血液基材試料中に約0.5 M以下の濃度で存在する。
好ましくは、安定化された非血液基材試料の温度が約30℃または約8℃と約2℃との間に維持されるかどうかにしたがい、この安定化された非血液基材試料中の微生物生体分子のレベルは少なくとも約7日間にわたって約15%より少なく互いから変動する。
好ましくは、この安定化された非血液基材試料の安定化成分は、後述するように、有機溶媒、還元剤、緩衝剤、または洗浄剤の1種または2種以上をさらに含んでなる。

好ましくは、この安定化された非血液基材試料の安定化成分は少なくとも1種の有機溶媒をさらに含んでなり、この有機溶媒はより好ましくは安定化された非血液基材試料の全重量の約0.1%〜約10%を構成する。なおより好ましくは、安定化された非血液基材試料は尿を含んでなり、そして有機溶媒は安定化された非血液基材試料の全重量の約0.1%〜約1%を構成する。好ましくは、有機溶媒はポリエチレングリコール、アセトン、メタノール、エタノール、またはジメチルスルホキシドの1種または2種以上を含んでなる。この安定化された非血液基材試料がポリエチレングリコールを含んでなる場合、好ましくはポリエチレングリコールの分子量は約5000ダルトン〜15000ダルトンである。

好ましくは、この安定化された非血液基材試料の安定化成分は少なくとも1種の還元剤をさらに含んでなり、なおより好ましくはこの還元剤はジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、2‐アミノエタンチオール、または2‐メルカプトエタノールの1種または2種以上を含んでなる。好ましくは、還元剤は約10 mM〜約200 mMの濃度で安定化された非血液基材試料中に存在する。なおいっそう好ましくは、非血液基材試料は尿を含んでなり、そして還元剤は約10 mM〜約20 mMの濃度で安定化された非血液基材試料中に存在する。

さらに好ましくは、この安定化された非血液基材試料中に存在する安定化成分は少なくとも1種の緩衝剤を含んでなり、この緩衝剤は下記の緩衝剤の1種または2種以上を包含する：トリス‐ (ヒドロキシメチル) アミノエタン、トリス‐ (ヒドロキシメチル) アミノメタンリン酸ナトリウム、ビス (2‐ヒドロキシエチル) イミノ‐トリス (ヒドロキシメチル) メタン、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、グリシン‐水酸化ナトリウム、N‐2‐ヒドロキシエチルピペラジン‐N’‐2‐エタンスルホン酸、3‐[(1,1−ジメチル‐ヒドロキシエチル) アミノ]‐2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸、3‐(シクロヘキシルアミノ)‐2‐ヒドロキシ‐1‐プロパンスルホン酸、3‐[N,N‐ビス (ヒドロキシエチル) アミノ]‐2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、N‐(2‐ヒドロキシエチル) ピペラジン‐N’‐2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸、3‐(N‐モルホリノ)‐2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸、ピペラジン‐N,N’‐ビス (2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸) 、3‐[N‐トリス‐(ヒドロキシメチル) メチルアミノ]‐2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸、2‐(N‐モルホリノ) エタンスルホン酸、3‐(N‐モルホリノ) プロパンスルホン酸、ピペラジン‐N,N’‐ビス (エタンスルホン酸) 、酢酸塩、クエン酸塩、塩酸、塩化カリウム、グリシン、フタル酸水素カリウム、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、フタル酸水素二ナトリウム、オルトリン酸二水素ナトリウム、フタル酸水素二カリウム、オルトリン酸二水素カリウム、バルピトンナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、または炭酸水素ナトリウム。好ましくは、緩衝剤は安定化された非血液基材試料のpHを約6以上に維持するために十分な量で存在する。より好ましくは、緩衝剤は約0.1 mM〜約100 mMの濃度で、なおいっそう好ましくは約0.1 mM〜約10 mMの濃度で安定化された非血液基材試料中に存在する。

さらに、この安定化された非血液基材試料の安定化成分は少なくとも1種の洗浄剤を含んでなり、この洗浄剤は好ましくはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、サルコシン、ドデシル硫酸ナトリウム、またはノナエチレングリコールオクチルフェノールエーテルの1種または2種以上を含んでなる。好ましくは、洗浄剤は安定化された非血液基材試料の全重量の約0.001%〜約1%を構成する。
なおいっそう好ましくは、非血液基材試料は尿を含んでなり、そして洗浄剤は安定化された非血液基材試料の全重量の約0.001%〜約0.01%を構成する。

本発明は、また、反応混合物に関する。好ましくは、本発明の反応混合物は下記成分を含んでなる：
‐ 1種または2種以上の微生物核酸を含んでなる少なくとも1種の非血液基材試料と、少なくとも1種のカオトロピック試薬を含んでなる有効量の少なくとも1種の安定化成分とを含んでなる安定化された非血液基材試料、ここで安定化成分は約20℃以上の温度において微生物生体分子を安定化する；および
‐ プライマー核酸、プローブ核酸、ヌクレオチド組込み生物触媒、および拡張可能なヌクレオチドから成る群から選択される少なくとも1種の核酸増幅試薬。

好ましくは、この反応混合物の非血液基材試料は、尿、精液、精漿、前立腺液、膣液、膣切屑、頸部液、子宮液、頸部切屑、羊水、肛門切屑、糞便、消化液、乳首分泌物、リンパ液、肺/気管支洗液、粘膜、痰、涙、バックル細胞、唾液、組織試料、脊髄液、または汗の1種または2種以上を含んでなる。
好ましくは、この反応混合物中に存在する微生物核酸は、淋菌 (Neisseria gonorrhoeae) の核酸、髄膜炎菌 (Neisseria meningitides) の核酸、パピローマウイルスの核酸、熱帯熱マラリア原虫 (Plasmodium falciparum) の核酸、クラミジア・ムリダルム (Chlamydia muridarum) の核酸、またはトラコーマクラミジア (Chlamydia trachomatis) の核酸の1種または2種以上を含んでなる。

好ましくは、この反応混合物中に存在する安定化成分の有効量は、安定化された非血液基材試料の全重量の約45%以下を構成する。
好ましくは、この反応混合物の安定化成分は、有機溶媒、還元剤、緩衝剤、または洗浄剤の1種または2種以上をさらに含んでなる。
また、好ましくは、この反応混合物の安定化成分は、キレート化剤を実質的に含まない。

IV.生体分子を安定化し、分析する方法
本発明は、また、非血液基材試料中の微生物生体分子を安定化する方法、およびそれらの微生物生体分子を分析する方法を提供する。これらの方法は、非血液基材試料を有効量の安定化成分と接触させて、安定化された非血液基材試料を生成する工程を含む。安定化された非血液基材試料、ならびに試料の種類および源、試料収集技術、安定化された試料の貯蔵はいっそう詳細に前述され、かつ下記の実施例において説明される。本明細書に記載するように、これらの試料の輸送および/または貯蔵 (例えば、引き続く分析のための) は、特に試料を積極的に冷却して (例えば、冷蔵またはその他により) 生体分子の安定化する必要がないので、これらの安定化法により促進される。

典型的には、安定化された微生物生体分子を1種または2種以上の分子の分析に付して、例えば、非血液基材試料を採取した患者についての診断情報を得る。一般に、これらの分析は、試料中の微生物生体分子 (例えば、タンパク質、核酸、およびその他) を検出する工程を含む。ある態様において、微生物生体分子を、例えば検出前に、安定化された非血液基材試料の他の成分から単離する (例えば、クロマトグラフィー、電気泳動、およびその他による) 。ある態様において、生体分子の検出は、微生物生体分子が生成する検出可能なシグナルを増幅し、そしてそれらの増幅されたシグナルを検出する工程を含む。さらに例示すると、標的微生物生体分子が核酸であるとき、検出は必要に応じてそれらの核酸のセグメントを増幅し、そして増幅 (例えば、実時間PCR技術を使用する) と同時にまたはその後に、それらの増幅された核酸を検出する工程を含む。種々の例示的自動化およびマニュアル核酸試験技術は、下記においてさらに説明される。

本発明の方法を実施するとき、分子生物学における多数の慣用技術を必要に応じて使用する。これらの技術はよく知られており、そして、例えば、下記の文献に説明されている：Ausubel他 (編者) 、Current Protocols in Molecular Biology、Vol. I、II、およびIII、 (1997) (Ausubel 1) 、Ausubel他 (編者) 、Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology、第5版、John Wiley & Sons, Inc. (2002) (Ausubel 2) 、Sambrook 他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000) (Sambrook)、Innis 他 (編者) 、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、Elsevier Science & Technology Books (1990) (Innis) 、BergerおよびKimmel、Guide to Molecular Cloning Techniques: Methods in Enzymology、Vol. 152、Academic Press Inc. (Berger) 、Vorbruggen 他、Handbook of Nucleoside Synthesis、Organic Reactions Series、#60、John Wiley & Sons, Inc. (2001) 、Gait (編者) 、Oligonucleotide Synthesis、Oxford University Press (1984) 、HamesおよびHiggins、Nucleic Acid Hybridization、Practical Approach Series、Oxford University Press (1997) 、およびHamesおよびHiggins (編者) 、Transcription And Translation、Practical Approach Series、Oxford University Press (1984) 、これらのすべては引用することによって本明細書の一部とされる。

A. 核酸分析技術
本発明の反応混合物中の微生物核酸または反応混合物からの微生物核酸の分析において使用できるか、あるいはそれに適合する核酸分析技術の一般的種類の例は、核酸プローブをベースとする技術、シグナル増幅アッセイ、および核酸増幅試験である。典型的には、核酸プローブをベースとするアッセイは、試料中の標的核酸に対してハイブリダイゼーションする標識化オリゴヌクレオチドプローブの使用を含む。ある種のシグナル増幅アッセイは、本質的にアッセイのシグナルの増幅に複数の標識を使用する核酸プローブをベースとする試験である。

これらの種類の試験の例は、bDNAアッセイ (Bayer Diagnostics, Inc.、米国カリフォルニア州エメリーヴィレ) およびハイブリッド捕捉アッセイ (Digene Corp.、米国マリーランド州ガイサーバーグ) である。典型的には、核酸増幅試験の共通の特性は、検出すべき生物に対して特異的である核酸配列を増幅するように設計されていることである。一般に、核酸増幅試験は核酸分析に対する他のアプローチよりも高い感度を有する。典型的には、この改良された感度は、標的核酸の単一コピー程度に少ないものから陽性シグナルを生成できる能力に帰する。本発明の安定化された非血液基材試料および方法において使用するために、必要に応じて適合する、種々の商業的核酸増幅試験は、一般に、増幅方法および標的核酸配列が異なる。

これらの商業的試験の例は次の通りである：AMPLICOR(商標) およびCOBAS AMPLICOR(商標) アッセイ (Riche Diagnostics Corporation 、米国インジアナ州インジアナポリス) 、これはポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を使用する；LCx(商標) 試験 (Abbott Laboratories、米国イリノイ州アボットパーク) 、これはリガーゼ連鎖反応 (LCR) を使用する；BDProbeTec(商標) ET 試験 (Becton, Dickinson and Company、米国ニュージャージー州フランクリンレークス) 、これは鎖置換増幅 (SDA) を使用する；およびAPTIMA^TM アッセイ (Gen‐Probe, Inc.、米国カリフォルニア州サンディエゴ) 、これは転写仲介増幅 (TMA) を使用する。核酸増幅は下記においてさらに説明される。

本発明の安定化された非血液基材試料および方法において使用するために適合する他の核酸分析技術は、遺伝的形質転換試験 (GTT) を包含する。また、この技術は、例えば、下記の文献に記載されている：Jaffe 他、“Diagnosis of gonorrhea using a genetic transformation test on mailed clinical specimens”、J. Infect. Dis. 146(2): 275‐279 (1982) 、これは引用することによって本明細書の一部とされる。

本発明の安定化された非血液基材試料中の微生物生体分子を検出するか、あるいは安定化された非血液基材試料から微生物生体分子を検出するために、微生物生体分子検出試薬として使用できるオリゴヌクレオチドのプローブおよび/またはプライマーは、必要に応じて本質的に任意のこの分野において知られている技術を使用して調製される。ある態様において、例えば、オリゴヌクレオチドのプローブおよび/またはプライマーは、下記を包含する方法を使用して化学的に合成される：種々の核酸合成法、例えば、BeaucageおよびCaruthers、Tetrahedron Letts. 22(20): 1859‐1862 (1981) (これは引用することによって本明細書の一部とされる) に記載されている固相ホスホアミダイトトリエステル法、またはこの分野において知られている他の合成技術、例えば、Needham‐VanDevanter 他、Nucleic Acids Res. 12: 6159‐6168 (1984) (これは引用することによって本明細書の一部とされる) に記載されている自動化合成装置を使用する方法。

自動化オリゴヌクレオチド合成のために、広範な種類の装置が商業的に入手可能である。また、マルチ‐ヌクレオチド合成アプローチ (例えば、トリ‐ヌクレオチド合成、およびその他) を必要に応じて使用する。その上、必要に応じて種々の修飾を使用して、オリゴヌクレオチドを製造する。ある態様において、例えば、引き続くアンプリコンのクローニングまたはその他を促進するために、例えば、プライマーは制限部位リンカーを含む。さらに例示すると、また、下記の文献に記載されているように、プライマーを必要に応じて修飾して増幅反応の特異性を改良する：例えば、米国特許第6,001,611号、発明の名称“MODIFIED NUCLEIC ACID AMPLIFICATION PRIMERS”、1999年12月14日発行 (Will) 、これは引用することによって本明細書の一部とされる。また、この分野において知られている種々の他の修飾を使用して、プライマーおよびプローブを合成することができる。

本発明の方法において使用するプローブおよび/またはプライマーを必要に応じて標識化して、プローブ‐標的ハイブリダイゼーションデュプレックスを検出できるようにする。一般に、標識は核酸または他の微生物生体分子検出試薬に結合し、検出可能なシグナル (例えば、定量可能なシグナル) を生成できる任意の部分であることができる。この分野において知られている種々の技術により、標識を微生物生体分子検出試薬に直接的または間接的に結合することができる。

例示すると、使用する標識の種類に依存して、標識を末端のヌクレオチド (オリゴヌクレオチドのプライマーおよび/またはプローブの5’または3’末端) または非末端のヌクレオチドに結合することができ、そして種々の大きさおよび組成のリンカーまたはスペーサーアームを通して間接的に結合することができる。商業的に入手可能なホスホアミダイト試薬を使用して、適当に保護されたホスホアミダイトを介して5’ 末端または3’ 末端に官能基を含有するオリゴマー (例えば、チオールまたは第一級アミン) を製造することができ、そして、例えば、Innis、前掲、に記載されているプロトコルを使用して、このようなオリゴヌクレオチドを標識化することができる。

必要に応じて、本質的に任意の標識を使用して、本明細書に記載する微生物生体分子検出試薬 (例えば、オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブ、抗体、およびその他) を標識化する。ある態様において、例えば、標識は下記のものを含む：蛍光色素 (例えば、ローダミン色素 (例えば、R6G、R110、TAMRA、ROX、およびその他) 、蛍光色素 (例えば、JOE、VIC、TET、HEX、FAM、およびその他) 、ハロ蛍光色素、シアニン色素 (例えば、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、およびその他) 、BODIPY(商標) 色素 (例えば、FL、530/550、TR、TMR、およびその他) 、ALEXA FLUOR(商標) 色素 (例えば、488、532、546、558、594、555、653、647、660、680、およびその他) 、ジクロロローダミン色素、エネルギー移動色素 (例えば、BIGDYE^TM v 1 色素、BIGDYE^TM v 2 色素、BIGDYE^TM v 3 色素、およびその他) 、Lucifer色素 (例えば、Luciferイエロー、およびその他) 、CASCADE GLUE(商標) 、オレゴン・グリーン、およびその他。

蛍光色素の追加の例は、例えば、下記の文献に記載されている：Haugland、Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Products、第9版、(2003) およびそれに対する最新情報、これらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる。一般に、蛍光色素は下記のものを包含する種々の商業的供給会社から容易に入手可能である：例えば、Molecular Probes, Inc. (オレゴン州エウゲン) 、Amersham Biosciences Corp. (ニュージャージー州ピスカタウェイ) 、Applied Biosystems (カリフォルニア州フォスターシティー) 、およびその他。

他の標識は下記のものを包含する：例えば、ビオチン、弱く蛍光性の標識 (Yin 他 (2003) Applied Environ. Microbiol. 69(7): 3938、Babendure 他 (2003) Anal. Biochem. 317(1): 1、およびJankowiak 他 (2003) Chem. Res. Toxicol. 16(3): 304) 、非蛍光性標識、比色標識、化学発光性標識 (Wilson 他 (2003) Analyst. 128(5):480およびRoda 他 (2003) Luminescence 18(2): 72) 、ラマン標識、電気化学的標識、生物発光性標識 (Kitayama 他 (2003) Photochem. Photobiol. 77(3): 333、Arakawa 他 (2003) Anal. Biochem. 314(2): 206、およびMaeda (2003) J. Pharm. Biomed. Anal. 30(6): 1725) 、および下記の文献に記載されているようなα‐メチル‐PEG標識化試薬：例えば、米国仮特許出願第60/428,484号2002年11月22日提出、これらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる。

さらに、本質的に任意の核酸 (および標準的または非標準的であるかどうかにかかわらず、事実上任意の標識化核酸) は、下記の種々の商業的源から入手可能な特注または標準的核酸であることができる： The Midland Certified Reagent Company、The Great American Gene Company、ExpressGen Inc.、Operon Technologies Inc.、Proligo LLCおよび多数の他の会社。

淋菌 (N. gonorrhoeae) およびトラコーマクラミジア (C. trachomatis) の核酸を検出するために使用するプローブおよびプライマーは、本発明の方法のある態様を実施するために必要に応じて使用し、例えば、下記の文献に記載されている：米国特許第5,550,040号 (Purohit 他) 、および米国特許第6,090,557号 (Weiss) 、これらの両方は引用することによって本明細書の一部とされる。他の標的微生物に検出可能に結合する他のプローブおよび/またはプライマーはこの分野において知られているか、あるいは当業者はそれらを容易に設計することができる。

ある態様において、標的微生物生体分子に対してハイブリダイゼーションするように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを固体支持体に共有結合または非共有結合させる。これらの実施例において、本発明の安定化された非血液基材試料中の微生物核酸に由来する標識化アンプリコンを典型的には固体支持体に結合したプローブと接触させて、ハイブリダイゼーションおよび検出を実施する。他の態様において、アンプリコンを固体支持体に結合させ、標識化プローブと接触させる。なお他の態様において、核酸を遊離状態で溶液中で検出する。

必要に応じて、本質的に任意の支持体が固体支持体として使用するために適合する。ある態様において、例えば、支持体はケイ素、ガラス、またはポリマーの材料 (例えば、ガラスまたはプライマーの顕微鏡用スライド、シリコンウェーハ、マイクロウェルプレートのウェル、およびその他) から製作される。顕微鏡用スライドを含む、適当なガラスまたはポリマーの支持体は、種々の商業的供給会社、例えば、Fisher Scientific (ペンシルベニア州ピッツバーグ) またはその他から入手可能である。ある態様において、本発明において使用する固体支持体は膜である。適当な膜材料は必要に応じて下記から選択される：例えば、ポリアラミド膜、ポリカーボネート膜、多孔質プラスチックマトリックス膜 (例えば、POREX(商標) Porous Plastic、およびその他) 膜、ナイロン膜、セラミック膜、ポリエステル膜、ポリテトラフルオロエチレン (TEFLON(商標)) 膜、ニトロセルロース膜、またはその他。

これらの膜材料の多数は下記を包含する種々の商業的供給会社から広く入手可能である：例えば、P. J. Cobert Associates, Inc. (米国ミゾリー州セントルイス) 、Millipore Corporation (米国マサチューセッツ州ベッドフォード) 、またはその他。必要に応じて使用する他の典型的な固体支持体は、例えば、セラミック、金属、樹脂、ゲル、プレート、ビーズ (例えば、磁気ミクロビーズ、およびその他) 、ホイスカー、繊維、コーム、単結晶、自己集合単層、およびその他を包含する。

核酸は、例えば、任意の利用可能な化学的または物理的方法により、支持体に直接的または間接的に (例えば、リンカー、例えば、ウシ血清アルブミン (BSA) またはその他を介して) 結合することができる。分子を広範な種類の固体支持体に結合させるために、広範な種類の結合化学を利用できる。さらに詳しくは、共有結合、例えば、カップリング剤との接合、または非共有結合、例えば、静電相互作用、水素結合または抗体‐抗原のカップリング、またはそれらの組み合わせにより、核酸を固体支持体に結合させることができる。

典型的なカップリング剤は下記のものを包含する：ビオチン/アビジン、ビオチン/ストレプトアビジン、黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus) のプロテインA/IgG抗体Fcフラグメント、およびストレプトアビジン/プロテインAキメラ (Sano 他 (1991) Bio/Technology 9: 1378、これは引用することによって本明細書の一部とされる) 、またはこれらの因子の誘導体または組み合わせ。核酸は光切断可能な結合、静電的結合、ジサルファイド結合、ペプチド結合、ジエステル結合またはこれらの結合の組み合わせにより固体支持体に結合させることができる。また、核酸は必要に応じて選択的に解放可能な結合、例えば、4,4’‐ジメトキシトリチルまたはその誘導体により固体支持体に結合する。

切断可能な結合は、プローブと固体支持体との間の切断可能な化学的部分、例えば、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴポリアミド、オリゴアクリルアミド、オリゴエチレングリコール、約6〜約20個の炭素原子のアルキル鎖、およびそれらの組み合わせによりつくることができる。これらの部分は、例えば、添加した化学的因子、電磁放射、または酵素により切断することができる。酵素により切断可能な典型的な結合は、ペプチド結合 (これはプロテアーゼで切断可能である) 、およびホスホジエステル結合 (これはヌクレアーゼで切断可能なである) を包含する。

化学的因子、例えば、β‐メルカプトエタノール、ジチオスレイトール (DTT) および他の還元剤はジサルファイド結合を切断する。有効である他の因子は、酸化剤、水和因子および他の選択的に活性な化合物を包含する。電磁放射、例えば、紫外線、赤外線および可視光線は、光切断可能な結合を切断する。また、結合は、例えば、熱処理または酵素処理を使用して、可逆的であるか、あるいは可逆的化学的結合または磁気的結合であることができる。解放および再結合は、例えば、磁場または電場を使用して、実施することができる。

多数の配列系は記載されてきており、そして標的微生物核酸の検出において使用するために適合可能である。また、配列の構成および使用の面は下記の文献に記載されている：例えば、Sapolsky 他 (1999) “High‐throughput polymorphism screening and genotyping with high‐density oligonucleotide arrays” Genetic Analysis: Biomolecular Engineering 14: 187‐192、Lockhart (1998) “Mutant yeast on Drugs” Nature Medicine 4: 1235‐1236、Fodor (1997) “Genes, Chips and the Human Genome” FASEB Journal 11: A879、Fodor (1997) “Massively Parallel Genomics” Science 277: 393‐395、およびChee 他 (1996) “Accessing Genetic Information with High‐Density DNA Array” Science 274: 610‐614、これらのすべては引用することによって本明細書の一部とされる。

本発明の安定化された非血液基材試料中の微生物生体分子の検出、または安定化された非血液基材試料からの微生物生体分子の検出に、必要に応じて使用できる増幅法は、例えば、種々のポリメラーゼ、リガーゼ、逆転写酵素を仲介する増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 、リガーゼ連鎖反応 (LCR) 、逆転写PCR (RT‐PCR) 、および/またはその他を包含する。これらおよび他の増幅法の使用に関する詳細は、種々の標準的テキスト、例えば、Berger、Sambrook、Ausubel 1および2、およびInnis (これらは上に言及した) に記載されている。また、多数の入手可能な生物学のテキストにおいて、PCRおよび関係する増幅法に関して広く論じられている。

また、核酸の増幅は、例えば、下記の文献に記載されている：Mullis 他 (1987) 米国特許第4,683,202号およびSooknananおよびMalek (1995) Biotechnology 13: 563、これらの両方は引用することによって本明細書の一部とされる。大きい核酸をPCRにより増幅する改良された方法は下記の文献に要約されている：Cheng 他 (1994) Nature 369: 684、これは引用することによって本明細書の一部とされる。ある態様において、デュプレックスPCRを使用して標的核酸を増幅する。

デュプレックスPCR増幅は下記の文献にさらに記載されている：例えば、Gabriel 他 (2003) “Identification of human remains by immobilized sequence‐specific oligonucleotide probe analysis of mtDNA hypervariable regions I and II” Croat. Med. J. 44(6) 293およびLa 他 (2003) “Development of a duplex PCR assay for detection of Brachyspira hyodysenteriae and Brachyspira pilosicoli in pig feces” J. Clin. Microbiol. 41(7): 3372、これらの両方は引用することによって本明細書の一部とされる。必要に応じて、標識化プライマー (例えば、ビオチニル化プライマー、およびその他) を使用して試料中の核酸を増幅する、例えば、アンプリコンと本発明のオリゴヌクレオチドプローブとの間のハイブリダイゼーションの検出を促進する。

この分野においてよく知られている多数の方法、例えば、電気泳動、クロマトグラフィー、沈殿、透析、濾過、および/または遠心により、アンプリコンを必要に応じて他の反応成分から回収し、精製する。核酸を精製する面は下記の文献に記載されている：例えば、Douglas 他、DNA Chromatography、Wiley, John & Sons, Inc. (2002) 、およびSchott、Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins、Chromatographic Science Series、#27、Marcel Dekker (1984) 、それらの両方は引用することによって本明細書の一部とされる。ある態様において、検出前に、例えば、アンプリコンを増幅と同時に検出するとき、アンプリコンを精製しない。アンプリコンの検出は下記においてさらに説明される。

標的微生物核酸、例えば、淋菌 (N. gonorrhoeae) および/またはトラコーマクラミジア (C. trachomatis) の核酸に対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、適当なハイブリダイゼーション条件を選択することによって達成することができる。典型的には、プローブと標的微生物核酸との間でのみ安定な検出可能なハイブリッドが形成するように、プローブ：標的核酸ハイブリッドの安定性をアッセイおよび洗浄条件に適合させて選択する。1または2以上の異なるアッセイパラメーターを操作して、特定のハイブリダイゼーションアッセイの正確な感度および特異性を決定する。

さらに詳しくは、温度、塩濃度、静電強度、緩衝液組成、およびその他が変化する広範な種類の条件下に、DNA、RNA、PNA、またはDNA、RNAおよびPNAの組み合わせの相補的塩基間のハイブリダイゼーションは起こる。これらの条件およびそれらを適用する方法の例は下記の文献に記載されている：例えば、Tijssen、Hybridization with Nucleic Acid Probes、Vol. 24、Elsevier Science (1993) 、およびHamesおよびHiggins、前掲、これらの両方は引用することによって本明細書の一部とされる。一般に、ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションすべき配列の特質およびその長さに依存して、約0℃〜約70℃において、約1分〜約1時間の間に起こる。

しかしながら、ハイブリダイゼーションは反応条件に依存して、数秒〜数時間のうちに起こることことが認識されている。例示すると、2×20マーの混合物についての典型的なハイブリダイゼーション条件は、この混合物を68℃にし、次いで温室 (22℃) に5分間冷却するか、あるいは2 μlにおいて非常に低い温度、例えば、2℃に冷却することである。緩衝液、例えば、Tris‐EDTA (TE) 、Tris‐HClおよびHEPES、塩溶液 (例えば、NaCl、KCl、CuCl₂) 、または他の水溶液、試薬および化学物質を使用して、核酸間のハイブリダイゼーションを促進することができる。これらの試薬の例は、一本鎖結合性タンパク質、例えば、Rec Aタンパク質、T4遺伝子32タンパク質、大腸菌 (E. coli) の一本鎖結合性タンパク質、および主要なまたは少量の核酸溝結合性タンパク質を包含する。

このような試薬および化学物質の他のの例は、2価のイオン、多価のイオンおよびインターカレーター物質、例えば、臭化エチジウム、アクチノマイシンD、プソラレン、およびアンゲリシンを包含する。本発明において使用する典型的なハイブリダイゼーション条件は、COBAS AMPLICOR(商標) トラコーマクラミジア (Chlamydia trachomatis) (CT)/淋菌 (Neisseria gonorrhoeae) (NG) の試験プロトコル (Riche Diagnostics Corporation、インジアナ州インジアナポリス) において特定されているのと同様な条件に従う。

標的微生物生体分子および/またはそれらのアンプリコンを検出する任意の入手可能な方法を、本発明において使用することができる。普通のアプローチは、5’‐ヌクレアーゼプローブまたは分子ビーコンを使用する実時間増幅の検出、インターカレート色素の検出、増幅プローブの中に組込まれた標識または増幅された核酸それら自体の検出、例えば、組込まれなかった標識からの増幅生成物の電気泳動的分離、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイ (例えば、配列に基づくアッセイ) 後の検出、および/または核酸に結合する二次試薬の検出を包含する。

例えば、5’‐ヌクレアーゼプローブまたは分子ビーコンを必要に応じて特定の微生物核酸 (例えば、淋菌 (Neisseria gonorrhoeae) 、髄膜炎菌 (Neisseria meningitides) 、ポリオーマウイルス、熱帯熱マラリア原虫 (Plasmodium falciparum) 、クラミジア・ムリダルム (Chlamydia muridarum) 、トラコーマクラミジア (Chlamydia trachomatis) 、およびその他からの核酸) をターゲッティングするオリゴヌクレオチド配列を含むように設計する。分子ビーコンまたは5’‐ヌクレアーゼプローブは下記においてさらに説明される。また、これらの一般的アプローチは、例えば、Sambrook、Ausubel 1および2に記載されている。

ある態様において、1種または2種以上の5’‐ヌクレアーゼプローブを含む実時間PCRアッセイ系を、増幅された標的微生物核酸の検出に使用する。ある種のポリメラーゼの内因的エンドヌクレアーゼ活性を使用して、クエンチャーおよび標識を含んでなるオリゴヌクレオチドからクエンチャーまたは標識を切断し、標識をアンクエンチングすることによって、それらの系は働く。ポリメラーゼは、複製の開始時に、すなわち、オリゴヌクレオチドが鋳型に結合し、そしてポリメラーゼがプライマーを拡張するとき、クエンチャーおよび標識を切断するだけである。こうして、適当に標識化されたプローブ核酸と、適当なヌクレアーゼ活性を含んでなるポリメラーゼとを使用して、問題の標的微生物核酸を検出することができる。

例えば、FRETまたはその他(および関係する実時間逆転写PCR) による、実時間PCR生成物の分析は、種々の情況において使用された実時間PCRモニターのよく知られている技術を提供し、これは本明細書に記載する方法と使用するように適合させることができる (下記の文献を参照のこと、Laurendeau 他 (1999) “TaqMan PCR‐based gene dosage assay for predictive testing in individuals from a cancer family with INK4 locus haploinsufficiency” Clin. Chem. 45(7): 982‐6; Laurendeau 他 (1999) “Quantitation of MYC gene expression in sporadic breast tumors a real‐time reverse transcription‐PCR assay” Clin. Chem. 59(12): 2759‐65; およびKreuzr 他 (1999) “LightCycler Technology for the quantitation of bcr/abl fusion transcripts” Cancer Research 59(13): 3171‐4、これらのすべては引用することによって本明細書の一部とされる) 。

本明細書に記載する核酸検出試薬を使用する標的微生物生体分子の検出に必要に応じて利用する、典型的な商業的に入手可能なシステムは、例えば、COBAS AMPLICOR(商標) Analyzer、これはRiche Diagnostics Corporation (米国インジアナ州インジアナポリス) から入手可能である、LUMINEX 100^TM 系、これはLUMINEX Corporation (米国テキサス州オースチン) から入手可能である、を包含する。

分子ビーコンは、標的核酸の実時間検出および定量化のために設計されたオリゴヌクレオチドである。分子ビーコンの5’および3’ 末端は集合的に1対の部分を含んでなり、これは分子ビーコンの検出可能な性質を与える。末端の一方は発蛍光団に結合されており、そして他方は発蛍光団の蛍光放射をクエンチングすることができるクエンチャー分子に結合されている。例示すると、蛍光体‐クエンチャーの対の1つの例は、例えば5’末端に、発蛍光団、例えばEDANSまたはフルオレセイン、および、例えば3’末端に、クエンチャー、例えば、Dabcylを使用ことができる。分子ビーコンは溶液中で遊離して存在するとき、すなわち、第2核酸に対してハイブリダイゼーションしないとき、分子ビーコンのステムは相補的塩基対により安定化されている。

この自己相補的対合は分子ビーコンの「ヘアピン」構造を生じ、ここで発蛍光団およびクエンチング部分は互いに対して近接して存在する。この立体配置において、蛍光性部分はクエンチング部分によりクエンチングされる。分子ビーコンのループは典型的にはオリゴヌクレオチドプローブを含んでなり、したがって標的微生物核酸中で検出すべき配列に対して相補的であり、こうして標的中のループのその相補的配列に対するハイブリダイゼーションはステムの解離を強制し、これにより発蛍光団およびクエンチャーを互いから遠のける。これにより、発蛍光団はアンクエンチングされ、分子ビーコンの蛍光は増加する。

分子ビーコンを作り、使用する標準的方法に関する詳細は文献において十分に確立されており、そして分子ビーコンは多数の商業的試薬源から入手可能である。分子ビーコンを製造し、使用する方法に関するそれ以上の詳細は、例えば、下記の文献に記載されている：Leone 他 (1995) “Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous real‐time detection of RNA”、Nucleic Acids Res. 26: 2150‐2155; Kostrikis 他 (1998) “Molecular beacons: spectral genotyping of human alleles” Science 279: 1228‐1229; Fang 他 (1999) “Designing a novel molecular beacon for surface‐immobilized DNA hybridization studies” J. Am. Chem. Soc. 121: 2921‐2922；およびMarras 他 (1999) “Multiplex detection of single‐nucleotide variation using molecular beacons” Genet. Anal. Biomol. Eng. 14: 151‐156、これらのすべては引用することによって本明細書の一部とされる。

下記の会社を包含する種々の商業的供給会社は標準的および特注の分子ビーコンを製造している：Oswel Research Products Lid. (英国) 、Research Genetics (Invitrogen のディビジョン、米国アラバマ州ハンツヴィレ) 、Midland Certified Reagent Company (米国テキサス州ミドランド) 、およびGorilla Genomics, LLC (米国カリフォルニア州アラメダ) 。また、下記のものを包含する分子ビーコンを使用する種々のキットが商業的に入手可能である：Sentinel^TM Molecular Beacon Allelic Discrimination Kits from Stratagene (米国カリフォルニア州ラジョラ) およびEurogentec SA (ベルギー) およびIsogen Bioscience BV (オランダ) から入手可能である種々のキット。

典型的には、検出器は、例えば、所定のアッセイ系の他の構成部分の中またはそれに近接して (例えば、容器中で、固体支持体上で、およびその他) 生成された検出可能なシグナルを検出するように構成されている。ここにおいて必要に応じて使用し、または適合する、適当なシグナル検出器は、例えば、蛍光、蛍リン光、放射能、吸収、屈折率、ルミネセンス、質量、またはその他を検出する。検出器は必要に応じて、例えば、所定のアッセイ工程の動作の上流および/または下流からの1つまたは複数のシグナルをモニターする。例えば、検出器は、位置が「実時間」の結果に対応する、複数のシグナルを必要に応じてモニターする。

検出器またはセンサーの例は、光電子増倍管、CCD配列、光学的センサー、温度センサー、圧力センサー、pHセンサー、伝導性センサー、走査検出器、またはその他を包含する。本発明の方法の実施において必要に応じて使用する、いっそう特定の典型的な検出器は、例えば、共鳴光散乱検出器、発光分光器、蛍光分光器、リン光分光器、ルミネセンス分光器、分光光度計、測光計、およびその他を包含する。また、検出器は下記の文献に記載されている：例えば、Skoog 他、Principles of Instrumental Analysis、第5版、Harcourt Brace College Publishers (1998) およびCurrell、Analytical Instrumentation: Performance Characteristics and Quality、John Wiley & Sons, Inc. (2000) 、それらの両方は引用することによって本明細書の一部とされる。

B. タンパク質分析技術
また、例えば、患者の診断を促進するために、本発明の安定化された非血液基材試料中に保存された微生物タンパク質を検出することができる。タンパク質を検出する本質的に任意の入手可能な技術を、必要に応じて本発明の方法において使用する。典型的なタンパク質分析技術は下記のものを包含する：例えば、一次元および二次元のSD‐PAGEに基づく分離および検出、イムノアッセイ (例えば、ウェスタンブロッティング、およびその他) 、アプタマー (aptamer) に基づく検出、質量分析的検出、およびその他。一般に、これらおよび他の技術はこの分野においてよく知られている。

例示すると、イムノアッセイにおいて使用するために適当な抗体は、慣用法および/または遺伝子操作により製造することができる。抗体フラグメントは、例えば、超可変領域を含む軽鎖および/または重鎖の可変領域 (V_HおよびV_L) から、またはV_HおよびV_L領域の両方から遺伝子操作することができる。例えば、「抗体」は、本明細書において使用するとき、下記のものを包含する：ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体および生物学的に活性なそれらのフラグメント、なかでも、「一価」抗体 (Glennie 他 (1982) Nature 295: 712)；Fabタンパク質、共有結合または非共有結合的に凝集しているどうかにかかわらず、Fab’およびF（ab’）₂フラグメントを含む；軽鎖または重鎖単独、典型的には可変重鎖および軽鎖領域 (V_HおよびV_L領域) 、およびより典型的には超可変領域を含む (そうでなければV_HおよびV_L領域の相補性決定領域 (CDR)として知られている)；Fcタンパク質；2以上の抗原と結合できる「ハイブリッド」抗体；定常‐可変領域キメラ;由来が異なる重鎖および軽鎖をもつ「複合」免疫グロブリン；標準的組換え技術により、突然変異誘発技術により、またはこの分野において知られている他の有向 (directed) 進化技術により製造された、改良された特異性および他の特性をもつ「変更された」抗体。

本発明の方法において使用する抗体は標識抗体または非標識抗体であることができる。適当な標識は下記のものを包含する：例えば、ラジオヌクレオチド、酵素、補酵素、蛍光色素、化学発光色素、色素源、酵素基質またはコファクター、酵素インヒビター、フリーラジカル、およびその他。このような標識化された試薬は、種々のよく知られているアッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、例えば、ELISA、蛍光イムノアッセイ、およびその他において使用することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：米国特許第3,766,162号；米国特許第3,791,932号；米国特許第3,817,837号;および米国特許第4,233,402号、これらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる。

また、微生物タンパク質は、フォトアプタマー (photoaptamer) を包含する装置を使用して検出することができる。一般に、アプタマーは一本鎖オリゴヌクレオチド (例えば、典型的には診断適用のためのDNA) であり、これらは特異的配列依存的形状を取り、2つの分子間の「ロック・アンド・キー」勘合に基づいて標的タンパク質に結合する。アプタマーは下記を使用して同定できる：SELEXプロセス (Gold (1996)“The SELEX process: a surprising source of therapeutic and diagnostic compounds”、Harvey Lect. 91: 47‐57、これは引用することによって本明細書の一部とされる) 。アプタマー配列は下記を包含する種々の供給会社から商業的に入手可能である：例えば、SomaLogic, Inc. (米国コロラド州ボールダー) 。

質量を介するタンパク質の検出は、本発明の方法において使用するために適合できる種々のフォーマットを包含する。典型的なフォーマットは下記のものを包含する：マトリックス補助レーザー脱着/イオン化に基づく (MALDI) および表面増強レーザー脱着/イオン化に基づく (SELDI) 検出。また、MALDIおよびSELDIに基づく検出は下記の文献に記載されている：例えば、Weinberger 他 (2000) “Recent trends in protein biochip technology” Pharmacogenomics 1(4): 395‐416、Forde 他 (2000) “Characterization of transcription factors by mass spectrometry and the role of SELDI‐MS” Mass Spectrom. Rev. 21(6): 419‐439、およびLeushner (20001) “MALDI TOF mass spectrometry: an emerging platform for genomics and diagnostics” Expert. Rev. Mol. Diagn. 1(1): 11‐18、これらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる。タンパク質チップおよび関係するインストルメンテーションは商業的供給会社、例えば、Ciphergen Biosystems, Inc. (米国カリフォルニア州フレモント) から入手可能である。

C. 生体分子の安定化および分析の好ましい方法
本発明は、また、生体分子の安定化および分析の方法に関する。本発明の好ましい方法は非血液基材試料中の微生物生体分子を安定化する方法であり、この方法は下記の工程を含んでなる：
‐ 微生物生体分子を含んでなる少なくとも1種の非血液基材試料を準備し、そして
‐ 少なくとも1種のカオトロピック試薬を含んでなる有効量の少なくとも1種の安定化成分と前記非血液基材試料を接触させて安定化された非血液基材試料を生成し、ここで安定化成分は約20℃以上の温度において微生物生体分子を安定化する。

好ましくは、この方法における微生物生体分子は、核酸、DNA、RNA、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、またはプリオンの1種または2種以上を含んでなる。
また好ましくは、この方法において使用する安定化成分はキレート化剤を実質的に含まない。
好ましくは、この方法において使用する安定化成分の有効量は、安定化された非血液基材試料の全重量の約45%以下を構成する。より好ましくは、非血液基材試料は尿を含んでなり、そして安定化成分の有効量は安定化された非血液基材試料の全重量の約15%以下を構成する。

好ましくは、本発明の方法において使用するカオトロピック試薬は、グアニジンイソチオシアネートまたはその塩、グアニジン塩酸塩またはその塩、尿素、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、塩化カリウム、アンモニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、トリフルオロエタノール、または過塩素酸ナトリウムの1種または2種以上を含んでなる。
好ましくは、この方法は、非血液基材試料を少なくとも1種の輸送媒質と接触させる工程をさらに含んでなる。

好ましくは、安定化された非血液基材試料の温度が約30℃または約8℃と約2℃との間に維持されるかどうかにしたがい、安定化された非血液基材試料中の微生物生体分子のレベルは少なくとも約7日間にわたって約15%より少なく互いから変動する。
好ましくは、この方法は下記の工程をさらに含んでなる：
‐ 接触工程後、1種または2種以上の微生物生体分子を単離する。
より好ましくは、この方法は下記の工程をさらに含んでなる：

‐ 1種または2種以上の生物学的分子を検出する。
好ましくは、この検出工程は下記の工程をさらに含んでなる：
‐ 微生物生体分子により生成された、または1種または2種以上の微生物生体分子に検出可能に結合する微生物生体分子検出試薬により生成された、検出可能なシグナルを増幅して、増幅されたシグナルを生成し、そして
‐ 増幅されたシグナルを検出する。

より好ましくは、生物学的分子は核酸を含んでなり、そしてこの方法の検出工程は下記の工程をさらに含んでなる：
‐ 1種または2種以上の核酸の少なくともセグメントを増幅して増幅された核酸を生成し、そして
‐ 増幅工程の間または後に1種または2種以上の核酸を検出する。
好ましくは、この方法において使用する安定化成分は、後述するように有機溶媒、還元剤、緩衝剤、または洗浄剤の1種または2種以上をさらに含んでなる。

好ましくは、この方法において使用する安定化成分は少なくとも1種の有機溶媒をさらに含んでなり、これは好ましくはポリエチレングリコール、アセトン、またはジメチルスルホキシドを含んでなる。
また、好ましくは、本発明の方法において使用する安定化成分は少なくとも1種の還元剤をさらに含んでなり、これは好ましくはジチオスレイトール、2‐アミノエタンチオール、または2‐メルカプタトエタノールの少なくとも1種をさらに含んでなる。

この方法において使用する安定化成分は少なくとも1種の緩衝剤をさらに含んでなり、これは好ましくは下記の緩衝剤の1種または2種以上を包含する：トリス‐ (ヒドロキシメチル) アミノエタン、トリス‐ (ヒドロキシメチル) アミノメタンリン酸ナトリウム、ビス (2‐ヒドロキシエチル) イミノ‐トリス (ヒドロキシメチル) メタン、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、グリシン‐水酸化ナトリウム、N‐2‐ヒドロキシエチルピペラジン‐N’‐2‐エタンスルホン酸、3‐[(1,1−ジメチル‐ヒドロキシエチル) アミノ]‐2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸、3‐(シクロヘキシルアミノ)‐2‐ヒドロキシ‐1‐プロパンスルホン酸、3‐[N,N‐ビス (ヒドロキシエチル) アミノ]‐2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、N‐(2‐ヒドロキシエチル) ピペラジン‐N’‐2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸、3‐(N‐モルホリノ)‐2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸、ピペラジン‐N,N’‐ビス (2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸) 、3‐[N‐トリス‐(ヒドロキシメチル) メチルアミノ]‐2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸、2‐(N‐モルホリノ) エタンスルホン酸、3‐(N‐モルホリノ) プロパンスルホン酸、ピペラジン‐N,N’‐ビス (エタンスルホン酸) 、酢酸塩、クエン酸塩、塩酸、塩化カリウム、グリシン、フタル酸水素カリウム、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、フタル酸水素二ナトリウム、オルトリン酸二水素ナトリウム、フタル酸水素二カリウム、オルトリン酸二水素カリウム、バルピトンナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、または炭酸水素ナトリウム。

さらに、この方法において使用する安定化成分は少なくとも1種の洗浄剤をさらに含んでなり、これは好ましくはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、サルコシン、ドデシル硫酸ナトリウム、またはα‐[4‐(1,1,3,3‐テトラメチルブチル) フェニル]‐オメガ‐ヒドロキシポリ (オキシ‐1,2‐エタンジイル) の1種または2種以上を含んでなる。
最後に、本発明のそれ以上の主題は、前述の方法により製造された安定化された非血液基材試料である。

V. キット
本発明は、また、非血液基材試料中の微生物生体分子を安定化するキットを提供する。典型的には、これらのキットは、少なくとも1種の本明細書に記載する安定化成分と、非血液基材試料を安定化成分と接触させて、微生物生体分子が約20℃以上の温度において安定である、安定化された非血液基材試料を生成するのための使用説明書とを含んでなる。ある態様において、安定化成分は安定化溶液を含んでなるが、他の態様において、安定化成分は 1種または2種以上の固体物質 (例えば、凍結乾燥されたまたは粉末状カオトロピック試薬または他の成分) を含む。

一般に、カオトロピック試薬は安定化成分 (例えば、安定化溶液) 中に約5.0 M以下 (例えば、約4.5 M以下、約4.0 M以下、約3.5 M以下、およびその他) の濃度で存在する。典型的には、有機溶媒は特定の安定化成分の全重量の約50％以下 (例えば、約40％、約30%、約20%、約10%、およびその他) を構成する。必要に応じて、安定化成分は還元剤をさらに含んでなる。これらの態様において、還元剤は一般に安定化成分中に約200 mM以下 (例えば、約150 mM、100 mM、50 mM、およびその他) の濃度で存在する。

ある態様において、安定化成分は緩衝剤をさらに含んでなり、これは典型的には安定化成分中に約100 mM以下 (例えば、約75 mM、約50 mM、約25 mM、およびその他) の濃度で存在する。ある態様において、安定化成分は洗浄剤をさらに含む。これらの態様のいくつかにおいて、洗浄剤は安定化された非血液基材試料の全重量の約1%以下 (例えば、約0.8%、約0.6%、約0.4%、約0.2%、およびその他) を構成する。安定化成分、またはそれらの成分は一般に1または2以上の容器の中に包装される。これらの態様のいくつかにおいて、キットは少なくとも1種の輸送媒質、例えば、容器 (例えば、検体容器、およびその他) の中に配置された輸送媒質をさらに含む。

必要に応じて、キットは非血液基材試料中の微生物生体分子を検出するための使用説明書をさらに含む。これらの態様において、例えば、キットはまた適当に包装された試薬 (例えば、オリゴヌクレオチドのプローブおよび/またはプライマー、または他の微生物生体分子検出試薬) および必要な物質、例えば、核酸の固定化、ハイブリダイゼーション、および検出に必要な物質、例えば、固体支持体、緩衝剤、酵素、および核酸の標準を含むことができる。必要に応じて、本発明の微生物生体分子検出試薬 (例えば、オリゴヌクレオチドプローブ、抗体、およびその他) は固体支持体上に既に固体支持体に結合されているか、あるいは他の方法で固体支持体上に固定化された状態で提供される。

他のオプションとして、微生物生体分子検出試薬は、例えば、溶液相中で本発明の検出方法を実施するために、容器中の溶液中において遊離状態で提供される。これらの態様のいくつかにおいて、キットの微生物生体分子検出試薬は、例えば、それが分子ビーコン、5’‐ヌクレアーゼプローブ、またはその他の形態であるとき、標識および/またはクエンチャー部分を含んでなる。ある態様において、キットは標的微生物核酸を増幅するための標識化されたプライマーをさらに含む。

また、キットは必要に応じて微生物生体分子検出試薬を試料からの核酸またはそのアンプリコンと接触させ、そして微生物生体分子検出試薬と標的微生物生体分子 (例えば、淋菌 (N. gonorrhoeae) および/またはトラコーマクラミジア (C. trachomatis) の核酸、または他の標的微生物からの核酸) との間の結合を検出するための１組の使用説明書、および微生物生体分子検出試薬および前記組の使用説明書を包装するための少なくとも1つの容器の1または2以上を含む。本発明のキット中に含まれる典型的な固体支持体は、必要に応じて、例えば、プレート、ビーズ、ミクロビーズ、繊維、ホイスカー、コーム、ハイブリダイゼーションチップ、膜、単結晶、セラミック層、自己集合単層、およびその他から選択される。

プライマーを含む態様において、キットは典型的にはヌクレオチド組込み生物触媒 (例えば、ポリメラーゼ、リガーゼ、およびその他) 、1種または2種以上のヌクレオチド (例えば、標識化ヌクレオチド、およびその他) 、および標的微生物核酸の1または2以上の下位配列をプライマー、生物触媒、およびヌクレオチドで増幅するための使用説明書をさらに含む。ある態様において、プライマーは少なくとも1種の標識 (例えば、蛍光色素、放射性同位体、およびその他) を含んでなる。適当な標識は本明細書においてさらに説明される。例えば、プライマーは必要に応じてビオチンまたはビオチン誘導体と複合化される。

これらの態様において、典型的には、キットは、例えば、本発明の微生物生体分子検出試薬 (例えば、オリゴヌクレオチドプローブ) と標的核酸またはそのアンプリコンとの間の結合を検出するために、アビジンまたはアビジン誘導体、またはストレプトアビジンまたはストレプトアビジン誘導体と複合化された酵素をさらに含む。これらの態様のいくつかにおいて、キットは、例えば、ピロホスホロリシスを最小するとき使用するために、少なくとも1種のピロホスファターゼ (例えば、熱安定性ピロホスファターゼ) 、例えば、キャリーオーバー汚染に対する保護を望む用途において使用するために、ウラシルN‐グリコシダーゼ (UNG) (例えば、熱安定性UNG) をさらに含む。

A. 好ましいキット
本発明による好ましいキットは下記の構成部分を含んでなる：
‐ 少なくとも1種のカオトロピック試薬を含んでなる少なくとも1種の安定化成分；および
‐ 微生物生体分子を含んでなる少なくとも1種の非血液基材試料を有効量の安定化成分と接触させて、その中で微生物生体分子が約20℃以上の温度において安定である、安定化された非血液基材試料を生成するのための使用説明書。
好ましくは、このキットの安定化成分はキレート化剤を実質的に含まない。

好ましくは、このキットの安定化成分は、安定化溶液を含んでなるか、あるいは1種または2種以上の固体物質を含んでなる。
好ましくは、このキットのカオトロピック試薬は、グアニジンイソチオシアネートまたはその塩、グアニジン塩酸塩またはその塩、尿素、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、塩化カリウム、アンモニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、トリフルオロエタノール、または過塩素酸ナトリウムの1種または2種以上を含んでなる。好ましくは、カオトロピック試薬は約5.0 M以下の濃度で安定化成分中に存在する。好ましくは、このキットは、安定化成分を含んでなる少なくとも1つの容器を含んでなる。

好ましくは、このキットは少なくとも1種の輸送媒質を含んでなる。
好ましくは、このキットは、安定化された非血液基材試料中の微生物生体分子を検出するための使用説明書をさらに含む。
好ましくは、このキットの安定化成分は、後述するように有機溶媒、還元剤、緩衝剤、または洗浄剤の1種または2種以上をさらに含んでなる。
好ましくは、このキットの安定化成分は少なくとも1種の有機溶媒をさらに含んでなり、これはより好ましくは安定化成分の全重量の約50%以下を構成する。

好ましくは、このキットの有機溶媒は、ポリエチレングリコール、アセトン、メタノール、エタノール、またはジメチルスルホキシドの1種または2種以上を含んでなる。このキットがポリエチレングリコールを含んでなる場合、それは約5000ダルトン〜約15000ダルトンの分子量を有する。
好ましくは、このキットの安定化成分は少なくとも1種の還元剤をさらに含んでなり、これはより好ましくはジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、2‐アミノエタンチオール、または2‐メルカプタトエタノールの少なくとも1種を含んでなる。なおいっそう好ましくは、還元剤は安定化成分中に約200 mM以下の濃度で存在する。

好ましくは、このキットの安定化成分は少なくとも1種の緩衝剤をさらに含んでなり、これは好ましくは下記の緩衝剤の1種または2種以上を包含する：トリス‐ (ヒドロキシメチル) アミノエタン、トリス‐ (ヒドロキシメチル) アミノメタンリン酸ナトリウム、ビス (2‐ヒドロキシエチル) イミノ‐トリス (ヒドロキシメチル) メタン、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、グリシン‐水酸化ナトリウム、N‐2‐ヒドロキシエチルピペラジン‐N’‐2‐エタンスルホン酸、3‐[(1,1−ジメチル‐ヒドロキシエチル) アミノ]‐2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸、3‐(シクロヘキシルアミノ)‐2‐ヒドロキシ‐1‐プロパンスルホン酸、3‐[N,N‐ビス (ヒドロキシエチル) アミノ]‐2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、N‐(2‐ヒドロキシエチル) ピペラジン‐N’‐2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸、3‐(N‐モルホリノ)‐2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸、ピペラジン‐N,N’‐ビス (2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸) 、3‐[N‐トリス‐(ヒドロキシメチル) メチルアミノ]‐2‐ヒドロキシプロパンスルホン酸、2‐(N‐モルホリノ) エタンスルホン酸、3‐(N‐モルホリノ) プロパンスルホン酸、ピペラジン‐N,N’‐ビス (エタンスルホン酸) 、酢酸塩、クエン酸塩、塩酸、塩化カリウム、グリシン、フタル酸水素カリウム、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、フタル酸水素二ナトリウム、オルトリン酸二水素ナトリウム、フタル酸水素二カリウム、オルトリン酸二水素カリウム、バルピトンナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、または炭酸水素ナトリウム。好ましくは、緩衝剤はこのキットの安定化成分中に約100 mM以下の濃度で存在する。

好ましくは、このキットの安定化成分は少なくとも1種の洗浄剤をさらに含んでなり、これはより好ましくはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、サルコシン、ドデシル硫酸ナトリウム、またはα‐[4‐(1,1,3,3‐テトラメチルブチル) フェニル]‐オメガ‐ヒドロキシポリ (オキシ‐1,2‐エタンジイル) の1種または2種以上を含んでなる。好ましくは、この洗浄剤は安定化成分の全重量の約1%以下を構成する。

VI.実施例
本明細書に記載する実施例および態様は例示のみを目的とし、そしてにそれらに照らして見ると、種々の変更または変化が当業者に示唆され、そしてそれらはこの出願の精神および範囲および添付された特許請求の範囲の範囲内に包含されることが理解される。

実施例１．経時的に変化した条件下における尿試料中の淋菌 (Neisseria gonorrhoeae) の安定性
この実施例は、経時的に異なる条件下の尿試料中の淋菌 (Neisseria gonorrhoeae) の安定性の分析に関する。さらに詳しくは、患者の尿検体中の淋菌 (N. gonorrhoeae) の活性レベルを、2〜8℃および30℃において7日間モニターした。尿試料のいくつかを未処理のままにした、すなわち、安定化成分を試料に添加しなかった。各試料の全重量が10%が溶解試薬であるように、本発明の溶菌試薬または安定化成分を他の試料に添加した。

溶菌試薬は下記の成分を含有した；
4.2 Mのグアニジンイソチオシアネート；
3.5%のポリエチレングリコール (分子量 10,000)；
160 mMのジチオスレイトール；
50 mMのTris (pH 7.5)；および
0.1%のTWEEN(商標) 20

また、DNA/RNA PROTECT^TM (Sierra Diagnostics, Inc.、米国カリフォルニア州ソノラ) を10重量%および40重量%の最終尿濃度で使用して、2つの追加の条件を検査した。前述したように、試料が約30℃または約8℃と約2℃との間に維持されるかどうかにしたがい、試料中の安定下の成分の活性レベルが約20％より少なく変動する時、試料は安定化される。

第1図は、前述の条件下に尿試料中で検出された淋菌 (N. gonorrhoeae) 活性レベルを示すグラフである。特に、第1図に示すグラフの横座標は残留する初期淋菌 (N. gonorrhoeae) 活性レベルを表すが、縦座標は時点 (日数) を表す。第1図に示すように：
(1) 尿が未処理である場合、内因的淋菌 (N. gonorrhoeae) DNAは30℃において急速に分解し、第７日にゼロ時点の活性のほぼ5％が残る (尿30℃)；
(2) 尿が未処理である場合、内因的淋菌 (N. gonorrhoeae) DNAは2〜8℃において分解し、第７日にゼロ時点の活性のほぼ48％が残る (尿2〜8℃)；
(3) 尿を10%の溶菌試薬で処理した場合、内因的淋菌 (N. gonorrhoeae) DNAは30℃において第７日にゼロ時点の活性のほぼ82％を保持する (10%の溶菌試薬30℃)；

(4) 尿を10%の溶菌試薬で処理した場合、内因的淋菌 (N. gonorrhoeae) DNAは2〜8℃において第７日にゼロ時点の活性のほぼ86％を保持する (10%の溶菌試薬2〜8℃)；
(5) 尿を10%のDNA/RNA PROTECT^TMで処理した場合、内因的淋菌 (N. gonorrhoeae) DNAは30℃において急速に分解し、第７日にゼロ時点の活性のほぼ16％が残る (10%のPROTECT^TM 30℃)；
(6) 尿を10%のDNA/RNA PROTECT^TM で処理した場合、内因的淋菌 (N. gonorrhoeae) DNAは2〜8℃において第７日にゼロ時点の活性のほぼ84％を保持する (10%のPROTECT^TM 2〜8℃)；

(7) 尿を40%のDNA/RNA PROTECT^TMで処理した場合、内因的淋菌 (N. gonorrhoeae) DNAは30℃において分解し、第７日にゼロ時点の活性のほぼ44％が残る (40%のPROTECT^TM 30℃)；そして
(8) 尿を40%のDNA/RNA PROTECT^TM で処理した場合、内因的淋菌 (N. gonorrhoeae) DNAは2〜8℃において第７日にゼロ時点の活性のほぼ85％を保持する (40%のPROTECT^TM 2〜8℃)。

したがって、第1図に描写する結果は、10%の溶菌試薬で安定化した尿を除外して、すべての条件について本明細書において定義した安定性の減少を示し、ここで10%の溶菌試薬で安定化した尿は試料が約30℃または約8℃と約2℃との間に維持されるかどうか無関係に約7日間にわたって約20%より少なく互いから変動した活性レベルを有した。
さらに例示すると、第2図は実際の全光学密度 [OD] の読みを示す第1図に表すデータのグラフである。さらに詳しくは、第2図のグラフの横座標は試料中の全淋菌 (N. gonorrhoeae) ODを表すが、縦座標は試料の希釈を表す。

実施例２．臨床試料中の淋菌 (N. gonorrhoeae) /トラコーマクラミジア (C. trachomatis) の検出
この予言的実施例により、臨床試料中の淋菌 (N. gonorrhoeae) /トラコーマクラミジア (C. trachomatis) を検出するプロトコルを説明する。

臨床試料
この分野において知られている標準手法により、女性から子宮頸内膜のスワブ検体および男性から尿道のスワブ検体を収集する。スワブを適当な培養輸送媒質 (例えば、2SP、M‐4 (Microtest, Inc.、ジョージア州アトランタ) 、Bartel’s chlamydial (Intracel Corp.、ワシントン州イッサクア) 、およびその他) 中に接種し、次いでこれをPCR分析に使用した (また、下記の文献を参照のこと：Van der Pol 他 (2000) J. Clin. Microbiol. 38: 1105‐1112、これは引用することによって本明細書の一部とされる) 。典型的には、細胞培養物をも接種する。検体中の生体分子を安定化するために、各試料の全重量の10%が溶菌試薬であるように、溶菌試薬 (実施例1に記載されている) を添加する。典型的には、検体をまだ管中にあるスワブで渦形成し、次いでこれを一般に収集後7日まで室温において貯蔵し、次いでPCR分析のために処理する。

必要に応じて、最初の採取の尿の50 mlのアリコートをまた男性および女性の両方から収集する。スワブの収集前後に、女性の尿の検体を収集する。尿道スワブ検体が得られた後、男性の尿検体を収集する。前述したように、検体中の生体分子を安定化するために、各尿試料の全重量の10%が溶菌試薬であるように、溶菌試薬を添加する。次いで、尿検体を典型的には収集時間から7日まで室温において貯蔵し、次いでPCR分析のために処理する。

PCR分析
典型的には、各検体をさらに処理し、製造業者の包装挿入物に記載されているように、AMPLICOR(商標) およびCOBAS AMPLICOR(商標) 試験に付す。各処理した検体について、少なくとも1つがトラコーマクラミジア (C. trachomatis) に対して特異的でありかつ少なくとも1つが淋菌 (N. gonorrhoeae) に対して特異的である、少なくとも2つのプライマー対を含有する単一の安定化された非血液基材試料中でトラコーマクラミジア (C. trachomatis) 、淋菌 (N. gonorrhoeae) 、および内部対照 (IC) の標的DNAを同時に増幅する。

一般に、生ずる増幅生成物を別々に捕捉し、マイクロウェルプレート (AMPLICOR(商標) フォーマット) (Crotchfelt 他 (1997) “Detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis in genitourinary specimens from men and women by a coamplification PCR assay, “J. Clin. Microbiol. 35: 1536‐1540、これは引用することによって本明細書の一部とされる) に対して、または淋菌 (N. gonorrhoeae) 特異的、トラコーマクラミジア (C. trachomatis) 特異的、およびIC特異的オリゴヌクレオチドプローブで被覆された磁気微小粒子に対してハイブリダイゼーションさせることによって比色的に検出する。

COBAS AMPLICOR(商標) 分析装置は増幅、ハイブリダイゼーション、および検出工程のすべてを自動的に実施する (DiDomenico 他 (1996) “COBAS AMPLICOR^TM : a fully automated RNA and DNA amplification and detection system for routine diagnostic PCR” Clin. Chem. 42: 1915‐1923、Jungkind 他 (1996) “Evolution of automated COBAS AMPLICOR PCR system for detection of several infectious agents and its impact on laboratory management” J. Clin. Microbiol. 34: 2778‐2783、これらの両方は引用することによって本明細書の一部とされる) 。

AMPLICOR(商標) フォーマットにおいて、増幅は、例えば、GeneAmp(商標) PCR System 9700 サーマルサイクラー (Perkin‐Elmer、コネチカット州ノーウォーク) を使用して実施し、そしてハイブリダイゼーションおよび検出をマニュアルで実施する (Loeffelholz 他 (1992) “Detection of Chlamydia trachomatis in endocervical specimen by polymerase chain reaction” J. Clin. Microbiol. 30: 2847‐2851、これは引用することによって本明細書の一部とされる) 。

データ分析
IC結果に無関係に、典型的には、陽性カットオフ(光学密度(OD)：トラコーマクラミジア (C. trachomatis) について2.0 (A₆₆₀) および淋菌 (N. gonorrhoeae) について3.5 (A₆₆₀)) より上にシグナルを生ずる検体は、特定の生物について陽性として解釈する。典型的には、陰性カットオフ (例えば、0.2のOD) より下に淋菌 (N. gonorrhoeae) またはトラコーマクラミジア (C. trachomatis) のシグナルを生ずる検体は、特定の生物について陰性として解釈し、ただしICシグナルは割り当てたカットオフ (0.2のOD) より上に存在し、試験は有効であると考える。

淋菌 (N. gonorrhoeae) またはトラコーマクラミジア (C. trachomatis) およびICの両方についてのカットオフ値より下に淋菌 (N. gonorrhoeae) またはトラコーマクラミジア (C. trachomatis) のシグナルを生ずる検体は、一般に抑制として解釈する。典型的には、もとの検体のアリコートを処理することによって、抑制検体を再試験する。上の基準を使用して、反復試験の結果を分類する。

典型的には、陰性カットオフと陽性カットオフとの間の結果(淋菌 (N. gonorrhoeae) について≧0.2、＜3.5およびトラコーマクラミジア (C. trachomatis) について≧0.2、＜0.2) を生ずる検体は、ICシグナルを無視して、特定の生物について同等であると考慮する。一般に、同等の結果はもとの検体のアリコートを処理し、二重反復実験で再試験し、結果を最初の試験と比較することによって解明する。少なくとも2回の有効な試験が特定の生物について≧0.2の淋菌 (N. gonorrhoeae) またはトラコーマクラミジア (C. trachomatis) のODを生ずる場合、これらの検体は典型的には陽性であると解釈する。

2回の反復試験が特定の生物について＜0.2 ODの淋菌 (N. gonorrhoeae) またはトラコーマクラミジア (C. trachomatis) のシグナルを生ずる場合、これらの検体は特定の生物について一般に陰性であると解釈し、ただしICシグナルは割り当てたカットオフより上に存在する。2回の反復試験が特定の生物について＜0.2の淋菌 (N. gonorrhoeae) またはトラコーマクラミジア (C. trachomatis) のODを生じ、そしてICシグナルが二重反復実験再試験のいずれについても割り当てたカットオフより下に存在する場合、これらの検体は抑制として一般に解釈する。

前述の発明を明瞭さおよび理解を目的として多少詳細に説明したが、この開示を読むと、本発明の真の範囲から逸脱しないで、形態および詳細における種々の変更が可能であることは当業者にとって明らかであろう。例えば、前述のすべての技術および装置を種々の組み合わせで使用することができる。この出願における引用したすべての刊行物、特許、特許出願、および/または他の文献は、各個々の刊行物、特許、特許出願、および/または他の文献がすべての目的で引用することによって個々に示されるのと同程度に、すべての目的でそれらの全体において引用することによって本明細書の一部とされる。

第1図は、異なる時点において種々の条件下に尿試料中で検出された淋菌 (N. gonorrhoeae) の活性レベルを示すグラフである。第2図は、試料について実際の全光学密度の読みを示す、第1図に表すデータのグラフである。

Claims

微生物生体分子を含んでなる少なくとも1種の非血液基材試料と、少なくとも1種のカオトロピック試薬を含んでなる有効量の少なくとも1種の安定化成分とを含んでなり、安定化された非血液基材試料中の微生物生体分子が約20℃以上の温度において安定である、安定化された非血液基材試料。
前記安定化成分の有効量が安定化された非血液基材試料の全重量の約45%以下を構成する、請求項1に記載の安定化された非血液基材試料。
前記非血液基材試料が尿を含んでなり、そして前記安定化成分の有効量が安定化された非血液基材試料の全重量の約15%以下を構成する、請求項1に記載の安定化された非血液基材試料。
前記安定化成分がキレート化剤を実質的に含まない、請求項1に記載の安定化された非血液基材試料。
前記カオトロピック試薬がグアニジンイソチオシアネートまたはその塩、グアニジン塩酸塩またはその塩、尿素、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、塩化カリウム、アンモニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、トリフルオロエタノール、または過塩素酸ナトリウムの1種または2種以上を含んでなる、請求項1に記載の安定化された非血液基材試料。
前記カオトロピック試薬が安定化された非血液基材試料中に約5.0 M以下の濃度で存在する、請求項1に記載の安定化された非血液基材試料。
前記非血液基材試料が尿を含んでなり、そしてカオトロピック試薬が安定化された非血液基材試料中に約0.5 M以下の濃度で存在する、請求項1に記載の安定化された非血液基材試料。
前記安定化された非血液基材試料の温度が約30℃または約8℃と約2℃との間に維持されるかどうかにしたがい、安定化された非血液基材試料中の微生物生体分子のレベルが少なくとも約7日間にわたって約15%より少なく互いから変動する、請求項1に記載の安定化された非血液基材試料。
1種または2種以上の微生物核酸を含んでなる少なくとも1種の非血液基材試料と、少なくとも1種のカオトロピック試薬を含んでなる有効量の少なくとも1種の安定化成分とを含んでなる安定化された非血液基材試料と、
プライマー核酸、プローブ核酸、ヌクレオチド組込み生物触媒、および拡張可能なヌクレオチドから成る群から選択される少なくとも1種の核酸増幅試薬と、
を含んでなる反応混合物。
前記安定化成分の有効量が安定化された非血液基材試料の全重量の約45%以下を構成する、請求項9に記載の反応混合物。
前記安定化成分が有機溶媒、還元剤、緩衝剤、または洗浄剤の1種または2種以上をさらに含んでなる、請求項9に記載の反応混合物。
前記安定化成分がキレート化剤を実質的に含まない、請求項9に記載の反応混合物。
微生物生体分子を含んでなる少なくとも1種の非血液基材試料を準備し、そして
少なくとも1種のカオトロピック試薬を含んでなる有効量の少なくとも1種の安定化成分と前記非血液基材試料を接触させて安定化された非血液基材試料を生成する工程を含んでなり、
ここで安定化成分は約20℃以上の温度において微生物生体分子を安定化する、
非血液基材試料中の微生物生体分子を安定化する方法。
前記安定化成分がキレート化剤を実質的に含まない、請求項13に記載の方法。
前記安定化成分の有効量が安定化された非血液基材試料の全重量の約45%以下を構成する、請求項13に記載の方法。
前記非血液基材試料が尿を含んでなり、そして安定化成分の有効量が安定化された非血液基材試料の全重量の約15%以下を構成する、請求項13に記載の方法。
前記カオトロピック試薬がグアニジンイソチオシアネートまたはその塩、グアニジン塩酸塩またはその塩、尿素、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、塩化カリウム、アンモニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、トリフルオロエタノール、または過塩素酸ナトリウムの1種または2種以上を含んでなる、請求項13に記載の方法。
前記安定化された非血液基材試料の温度が約30℃または約8℃と約2℃との間に維持されるかどうかにしたがい、安定化された非血液基材試料中の微生物生体分子のレベルが少なくとも約7日間にわたって約15%より少なく互いから変動する、請求項13に記載の方法。
接触工程後、1種または2種以上の微生物生体分子を単離する工程をさらに含んでなる、請求項13に記載の方法。
1種または2種以上の生物学的分子を検出する工程をさらに含んでなる、請求項13又は19に記載の方法。
前記検出工程が下記工程をさらに含んでなる、請求項20に記載の方法：
微生物生体分子により生成された、または少なくとも1種の微生物生体分子に検出可能に結合する微生物生体分子検出試薬により生成された、検出可能なシグナルを増幅して、増幅されたシグナルを生成し、そして増幅されたシグナルを検出する。
前記生物学的分子が核酸を含んでなり、そして検出工程が1種または2種以上の核酸の少なくともセグメントを増幅して増幅された核酸を生成し、そして増幅工程の間または後に1種または2種以上の核酸を検出する工程を含んでなる、請求項20に記載の方法。
請求項13〜22のいずれか1項に記載の方法により製造された安定化された非血液基材試料。
前記少なくとも1種のカオトロピック試薬を含んでなる少なくとも1種の安定化成分と、微生物生体分子を含んでなる少なくとも1種の非血液基材試料を有効量の安定化成分と接触させて、その中で微生物生体分子が約20℃以上の温度において安定である、安定化された非血液基材試料を生成するのための使用説明書とを含んでなるキット。
前記安定化成分がキレート化剤を実質的に含まない、請求項24に記載のキット。
前記カオトロピック試薬がグアニジンイソチオシアネートまたはその塩、グアニジン塩酸塩またはその塩、尿素、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、塩化カリウム、アンモニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、トリフルオロエタノール、または過塩素酸ナトリウムの1種または2種以上を含んでなる、請求項24に記載のキット。
前記カオトロピック試薬が約5.0 M以下の濃度で安定化成分中に存在する、請求項24に記載のキット。