JP2009261405A - 重亜硫酸塩処理の改良された方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】核酸を含む溶液中で核酸を1.5〜3.5時間の間、70〜90℃の間の温度でインキュベートし、ここで溶液中の重亜硫酸塩の濃度が3 M〜6.25 Mの間であり、溶液のpH値が5.0〜6.0の間であり、核酸、すなわち核酸中のシトシン塩基が脱アミノ化される。脱アミノ化された核酸を含む溶液は、次いで脱スルホン酸化される。さらに、特定のpHを有し、重亜硫酸塩を伴う溶液を含むキット。
【選択図】なし
Description
本願は、重亜硫酸塩反応を行って核酸中のメチル化位置、すなわちメチル化および非メチル化シトシンを決定する方法であって、ここで核酸を含む溶液中で核酸を1.5〜3.5時間の間、70〜90℃の間の温度でインキュベートし、ここで溶液中の重亜硫酸塩の濃度が3 M〜6.25 Mの間であり、溶液のpH値が5.0〜6.0の間であり、核酸、すなわち核酸中のシトシン塩基が脱アミノ化される方法に関する。脱アミノ化された核酸を含む溶液は、次いで脱スルホン酸化され、好ましくは脱塩される。本願はさらに、特定のpHを有し、重亜硫酸塩を伴う溶液を含むキットおよびその使用ならびに溶液を含むキットに関する。
遺伝子は、全哺乳類ゲノムのうちごく一部だけを構成し、非コードデオキシリボ核酸(DNA)の圧倒的なバックグラウンド存在下におけるその発現の正確な制御は、その調節に関する本質的な問題をもたらす。イントロン、反復要素、および潜在的に活性のある転移因子等の非コードDNAは、その長期のサイレンシングに効果的な機構を要する。哺乳動物は、シトシンのメチル化によって提供される、DNA−タンパク質相互作用を改変してかかるサイレンシングを支援する遺伝性の機構を供給する可能性を利用してきたようである。DNAのメチル化は哺乳類の発生に必須であり、老化および癌の間に潜在的な役割を果たす。遺伝子発現の調節におけるメチル化の関与およびインプリント遺伝子を特徴付ける後生の修飾としての関与は、充分確立されている。哺乳動物において、メチル化はシトシン残基においてのみ起こり、より具体的にはグアノシン残基に隣接するシトシン残基、すなわち配列CGにおいてのみ起こる。DNAメチル化部位の検出およびマッピングは、所定の配列がメチル化されているかどうかを示す分子標識を理解するのに必須の工程である。
〔1〕5.25〜5.75の間のpH値を有し、3 M〜6.25 Mの間の濃度で重亜硫酸塩を含み、任意にヒドロキノンを含む溶液を含むキット、
〔2〕5.4〜5.6の間のpH値を有し、3.5 M〜6.25 Mの間の濃度で重亜硫酸塩を含み、任意にヒドロキノンを含む溶液、
〔3〕重亜硫酸塩の濃度が3.75 M〜6 Mの間である、〔2〕記載の溶液、
〔4〕溶液のpH値が5.5であり、重亜硫酸塩の濃度が5 Mである、〔2〕または〔3〕記載の溶液
に関する。
本発明は、核酸中のシトシン塩基、好ましくは複数のシトシン塩基のウラシル塩基、好ましくは複数のシトシン塩基への変換のための方法であって、好ましくは、5-メチル-シトシン塩基、好ましくは複数の5-メチル-シトシン塩基は実質的に変換されず、
a)核酸を含む溶液を1.5〜3.5時間、70〜90℃の間の温度でインキュベートする工程であって、溶液中の重亜硫酸塩の濃度が3 M〜6.25 Mの間であり、溶液のpH値が5.0〜6.0の間であって、核酸が脱アミノ化される工程、および
b)脱アミノ化された核酸を含む溶液をアルカリ性条件下でインキュベートする工程であって、脱アミノ化された核酸が脱スルホン化される工程
を含む方法を提供する。
本発明は、核酸中のシトシン塩基、好ましくは複数のシトシン塩基の、ウラシル塩基、好ましくは複数のウラシル塩基への変換のための方法であって、好ましくは、5-メチル-シトシン塩基、好ましくは複数の5-メチル-シトシン塩基は実質的に変換されず、
a)核酸を含む溶液を、1.5〜3.5時間の間、70〜90℃の間の温度でインキュベートする工程であって、溶液中の重亜硫酸塩の濃度が3 M〜6.25 Mの間であり、溶液のpH値が5.0〜6.0の間であり、核酸が脱アミノ化される工程、および
b)脱アミノ化された核酸を含む溶液をアルカリ性条件下でインキュベートする工程であって、脱アミノ化された核酸が脱スルホン化される工程
を含む方法に関する。
1.1 モデル系(オリゴヌクレオチド)を用いた至適条件と標準条件との比較およびHPLCによる解析
1.1.1 方法:
1.1.1.1 試薬の組成
重亜硫酸塩試薬 pH = 5.0/50℃:1.9g Na2S2O5
(「標準」) 2ml Millipore水
0.7ml 2M NaOH
0.5ml 1Mヒドロキノン(任意)
Millipore水を4mlの容量まで添加
重亜硫酸塩試薬 pH = 5.5/80℃:1.9g Na2S2O5
lml Millipore水
2ml 2M NaOH
0.5ml 1Mヒドロキノン(任意)
Millipore水を4mlの容量まで添加
オリゴヌクレオチドを、ホスホルアミダイト化学を利用する標準的な自動固相合成手順を用いて合成する。
配列番号:1:5'-d(GAGGGGCGCCCTGGAGTCCC)-3'(センス鎖)
配列番号:2:5'-d(GGGACTCCAGGGCGCCCCTC)-3'(アンチセンス鎖)
配列番号:3:5'-d(GAGGGGUGUUUTGGAGTUUU)-3'(センス鎖のCがUに変換(生成物))
配列番号:4:5'-d(GGGAUTUUAGGGUGUUUUTU)-3'(アンチセンス鎖のCがUに変換(生成物))
配列番号:5:5'-d(T5CT5)-3'
配列番号:6:5'-d(T5CMeT5)-3'
配列番号:7:5'-d(T5UT5)-3'
配列番号:8:5'-d(T11)-3'
一本鎖オリゴヌクレオチド約5ナノモルまたは二本鎖オリゴヌクレオチドの各鎖5ナノモルを、20μ1のMillipore水に溶解し、次いで、200μlの重亜硫酸塩試薬を添加する。その後、反応チューブをサーモミキサー内に入れる(50℃または80℃;600rpm)。t = x時間後、反応を、500μlの2.5M NaOHの添加により停止させる(脱スルホン化)。室温で30分後、反応混合物を、Sephadex G25カラムにて脱塩する。オリゴヌクレオチド含有画分をエバポレートし、HPLCにより解析するために200μ1のMillipore水に溶解する。
解析的HPLC: カラム: Dionex DNA Pac PA-100 SEL
バッファーA: 0.01M NaOH、0.2M NaCl
バッファーB: 0.01M NaOH、1M NaCl
勾配: 25分で50〜100%B
データ評価: HPLCクロマトグラムを、HPLCのt = xにおける生成物ピークの面積%により比較し、図2〜12に示す。
1.1.2.1 GSTP1 dsのT = 80℃、pH = 5.5における反応速度論
GSTP1配列である配列番号:1(これはセンス鎖である)および配列番号:2(これはアンチセンス鎖である)を用い、上記の標準的プロトコルに従って二重測定を行なった。その平均値を計算する。
GSTP1配列である配列番号:1(これはセンス鎖である)および配列番号:2(これはアンチセンス鎖である)を用い、上記の標準的プロトコルに従って二重測定を行なった。その平均値を計算する。
重亜硫酸塩反応の特異性を評価するため、オリゴヌクレオチド5'- T5CMeT5-3'(配列番号:6)を、表示した条件下のもとで評価した。結果は以下の通りであった:
本発明の条件によって、2時間の反応時間後に、標準条件で8〜16時間後と同様の生成物収率がもたらされる。重亜硫酸塩反応の特異性は、「標準条件」で16時間後と比べ、本発明の条件で2時間後でかなり良好である。
1.2.1 概要
重亜硫酸塩反応が作用し、非メチル化シトシンをウラシルに変換させたとういう事実はまた、非メチル化シトシンがウラシルに変換された核酸配列領域に特異的なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により実証され得る(すなわち、プライマー中の塩基アデニンが、非メチル化シトシン由来の重亜硫酸塩反応生成物であるウラシルと向かい合う)。変換が不完全な場合、プライマー中のアデニン塩基にマッチしないシトシンが存在し得るため、プライマーはこの領域にハイブリダイズし得ない。このことは、PCR産物が得られないという影響をもたらし得る。
1.2.2.1 DNAの変性
100μ1のメチル化DNA(Intergen, Serologicals Corporation, Norcross, GA, USAにより販売;Cat S 7821)希釈物(100ng/アッセイを1000ngヒトDNAバックグラウンド, Roche Cat. 1691112にスパイクする;1方法につき4連)および12μlの2M NaOHを混合し、15分間37℃でインキュベートする。
112μlの変性DNAを200μlの重亜硫酸塩試薬(2.5M重亜硫酸ナトリウム、125mMヒドロキノン、pH 5.1)と混合し、20時間50℃でインキュベートする(「標準法」)
または
112μlの変性DNAを200μlの重亜硫酸塩試薬(2.5M重亜硫酸ナトリウム、125 mMヒドロキノン、pH 5.5)と混合し、2時間80℃でインキュベートする。(「BIS法」)。
312μlの脱アミノ化DNA(両方法のそれぞれに由来)を、番号がEP02019097.1またはEP02028114.3の欧州特許出願に記載の方法に従って、核酸をMGPSに結合させるために、600μlの結合バッファー(MagNAPure DNA Isolation Kit I, Rocheカタログ番号3 003 990)および75μ1の磁性体ガラス粒子溶液(MagNAPure DNA Isolation Kit I)と混合し、連続的に混合しながら15分間/室温でインキュベートする。その後、磁性体ガラス粒子(MGP)を、1mlの70%エタノールで3回洗浄する。結合型と非結合型の分離を、磁気セパレーター(Roche Cat. 1641794)において行なう。その後、250μlの38% EtOH/100mM NaCl/200mM NaOHを、MGPに結合したDNAに添加することにより、脱スルホン化を起こす。混合物を、混合しながら5分間、室温でインキュベートする。その後、MGPを、90%エタノールで2回洗浄する。エタノール残物を除くため、蓋を開けたままのサーモミキサー内でMGPを15分間/60℃で加熱した。その後、DNAを、50μlの1OmM Tris/O.1mM EDTA pH 7.5(15分間/60℃)で溶出する。10μ1の溶出DNAを、その後のPCR解析に使用する。
1.2.2.4.1 マスターミックスの組成
LightCycler(登録商標) FastStart DNA Master HybridizationProbe 1×(Roche 2239272)、2mM MgCl2、フォワードプライマー 0.5μM、リバースプライマー0.5μM、ドナープローブ250 nM、アクセプタープローブ250 nM、鋳型10μl、全PCR容量20μl。
変性 10分間/95℃
55サイクル 95℃/10秒
65℃/10秒−シグナル取得
72℃/10秒 ランプ時間20℃/秒
以下の実験は、1.2.1の実施例の実験装置を用いて行ない、それによって、温度およびインキュベーション時間を変化させ、示されるct値を測定した。
[1]核酸中のシトシン塩基をウラシル塩基に変換する方法であって、
a)核酸を含む溶液を、1.5〜3.5時間の間、70〜90℃の間の温度でインキュベートする工程であって、ここで溶液中の重亜硫酸塩の濃度が3 M〜6.25 Mの間であり、溶液のpH値が5.0〜6.0の間であり、核酸が脱アミノ化される工程、および
b)脱アミノ化された核酸を含む溶液をアルカリ性条件下でインキュベートする工程であって、脱アミノ化された核酸が脱スルホン化される工程
を含む方法。
[2]工程a)において、温度が75〜85℃の間であることを特徴とする、[1]記載の方法。
[3]重亜硫酸塩の濃度が3.2 M〜6 Mの間であることを特徴とする、[1]または[2]記載の方法。
[4]溶液のpH値が5.25〜5.75の間であることを特徴とする、[1]〜[3]いずれか記載の方法。
[5]時間が1.75〜3時間の間であることを特徴とする、[1]〜[4]いずれか記載の方法。
[6]時間が2〜3時間の間であることを特徴とする、[1]〜[5]いずれか記載の方法。
[7]工程a)において温度が80℃であり、重亜硫酸塩の濃度が5 Mであり、溶液のpH値が5.5であり、時間が2〜3時間の間であることを特徴とする、[1]〜[6]いずれか記載の方法。
[8]核酸中のシトシン塩基が、重亜硫酸イオンの存在下でウラシル塩基に変換される反応における、5.0〜6.0の間のpH値を有し、3 M〜6.25 Mの間の濃度で重亜硫酸塩を含み、任意にヒドロキノンを含む溶液の70〜90℃の間の反応温度での使用。
[9]溶液のpH値が5.25〜5.75の間であり重亜硫酸塩の濃度が3.2 M〜6 Mの間である、[8]記載の使用。
[10]溶液のpH値が5.5であり、重亜硫酸塩の濃度が5 Mである、[8]または[9]記載の使用。
[11]5.0〜6.0の間のpH値を有し、3 M〜6.25 Mの間の濃度で重亜硫酸塩を含み、任意にヒドロキノンを含む溶液を含むキット。
[12]5.4〜5.6の間のpH値を有し、3.5 M〜6.25 Mの間の濃度で重亜硫酸塩を含み、任意にヒドロキノンを含む溶液。
[13]重亜硫酸塩の濃度が3.75 M〜6 Mの間である、[12]記載の溶液。
[14]溶液のpH値が5.5であり、重亜硫酸塩の濃度が5 Mである、[12]または[13]記載の溶液。
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- 5.25〜5.75の間のpH値を有し、3 M〜6.25 Mの間の濃度で重亜硫酸塩を含み、任意にヒドロキノンを含む溶液を含むキット。
- 5.4〜5.6の間のpH値を有し、3.5 M〜6.25 Mの間の濃度で重亜硫酸塩を含み、任意にヒドロキノンを含む溶液。
- 重亜硫酸塩の濃度が3.75 M〜6 Mの間である、請求項2記載の溶液。
- 溶液のpH値が5.5であり、重亜硫酸塩の濃度が5 Mである、請求項2または3記載の溶液。
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