DE602004009038T2 - Verbessertes verfahren zur behandlung durch bisulfit - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Anmeldung betrifft ein Verfahren zum Durchführen einer Bisulfitreaktion, mit der man Methylierungpositionen in einer Nukleinsäure feststellt, d.h. methylierte und nicht methylierte Cytosine, wobei die Nukleinsäure in einer Lösung, welche die Nukleinsäure umfasst, für einen Zeitraum von 1,5 bis 3,5 Stunden bei einer Temperatur zwischen 70 und 90°C inkubiert wird, wobei die Konzentration an Bisulfit in der Lösung zwischen 3 M und 6,25 M beträgt, und wobei der pH-Wert der Lösung zwischen 5,0 und 6,0 liegt, wobei die Nukleinsäure, d.h. die Cytosin-Basen in der Nukleinsäure, desaminiert ist. Dann wird die Lösung, welche die desaminierte Nukleinsäure umfasst, desulfoniert und vorzugsweise entsalzt. Die Anmeldung betrifft zudem einen Kit mit einer Lösung, die Bisulfit mit einem bestimmten pH-Wert umfasst, und Verwendungen davon sowie einen Kit, der die Lösung umfasst.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Gene machen nur einen kleinen Anteil des gesamten Säugetiergenoms aus, und die genaue Steuerung ihrer Expression in Anwesenheit eines äußerst starken Hintergrundes von nicht-codierender Desoxyribonukleinsäure (DNA) stellt ein erhebliches Problem für ihre Regulation dar. Nicht-codierende DNA, die Introns, repetitive Elemente und möglicherweise aktive transposable Elemente enthält, erfordert effektive Mechanismen für ihr langfristiges Silencing. Säugetiere haben anscheinend die von der Cytosinmethylierung ausgehenden Möglichkeiten genutzt, um einen erblichen Mechanismus zum Verändern der DNA-Protein-Interaktionen zu schaffen, die dieses Silencing unterstützen. DNA-Methylierung ist für die Entwicklung von Säugetieren wesentlich und spielt eine mögliche Rolle beim Altern und bei Krebs. Die Beteiligung der Methylierung an der Regulation der Genexpression und als epigenetische Modifizierung, die Prägungsgene markiert, ist bestens bekannt. In Säugetieren tritt Methylierung nur an Cytosin-Resten und insbesondere nur auf Cytosin-Resten neben einem Guanosin-Rest auf, d.h. an der Sequenz CG. Der Nachweis und die Kartierung von DNA-Methylierungsstellen sind für das Verständnis der molekularen Signale, die anzeigen, ob eine bestimmte Sequenz methyliert ist, wesentliche Schritte.
  • Dieses erfolgt derzeit durch das so genannte Bisulfitverfahren, das von Frommer, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 1827-1831, beschrieben ist, zum Nachweis von 5-Methylcytosinen. Das Bisulfitverfahren zur Kartierung von 5-Methylcytosin nutzt den Effekt, dass Natriumhydrogensulfit mit Cytosin reagiert, aber nicht oder nur schwach mit 5-Methylcytosin. Cytosin reagiert mit Bisulfit unter Bildung eines sulfonierten Cytosinreaktionszwischenprodukts, das zur Desaminierung neigt, was zu einem sulfonierten Uracil führt, das unter alkalischen Bedingungen zu Uracil desulfoniert werden kann (siehe 1). Uracil hat bekanntlich im Gegensatz zu dem Edukt Cytosin das Basenpaarungsverhalten von Thymin, wohingegen 5-Methylcytosin das Basenpaarungsverhalten von Cytosin hat. Dies ermöglicht die Unterscheidung von methylierten oder nicht-methylierten Cytosinen beispielsweise durch genomische Bisulfitsequenzierung (Grigg, G. und Clark, S., Bioessays 16 (1994) 431-436; Grigg, G.W., DNA Seq. 6 (1996) 189-198) oder methylierungsspezifische PCR (MSP), die in US 5 786 146 offenbart ist. Grundlegende Untersuchungen über die Reaktion von Uracil- und Cytosinderivaten mit Bisulfit wurden von Shapiro et al., JACS 92 (1970) 422-424 durchgeführt.
  • Es gibt verschiedene Dokumente, die spezifische Aspekte der Bisulfitreaktion behandeln.
  • Hayatsu, H., et al., Biochemistry 9 (1970) 2858-2865 setzten Uracil, Cytosin oder ihre Derivate mit 1 M Bisulfit bei einem pH-Wert von ca. 6, bei 37°C 24 Std. lang um. Hayatsu, H., et al., J. Am. Chem. Soc. 92 (1970) 724-726 beschreiben die Reaktion von Cytosin mit 3 M Bisulfit bei einem pH-Wert von ca. 6 und einer Temperatur von 80°C für 30 Min. Slae und Shapiro, J. Org. Chem. 43 (1978) 4197-4200 beschreiben die Desaminierung von Cytidin mit 1 M Bisulfit bei etwa neutralem pH-Wert und bei verschiedenen Temperaturen, wobei die Reaktionszeit nicht beschrieben wird. Die Desaminierung von Cytosin oder Methylcytosin in Nukleinsäuren wurde in diesen Dokumenten nicht untersucht.
  • Paulin, R., et al., Nucl. Acids Res. 26 (1998) 5009-5010 untersuchen die Effekte von Harnstoff auf die Leistungsfähigkeit der Bisulfit-vermittelten Sequenzierung von 5-Methylcytosin in DNA. Die DNA wird mit 3,44 M Bisulfit in Anwesenheit von 5,36 M Harnstoff und 0,5 mM Hydrochinon bei einem pH-Wert von 5,0 und einer Temperatur von 55°C 15 Std. umgesetzt.
  • Raizis, A. M., et al., Anal. Biochem. 226 (1995) 161-166 offenbaren ein Bisulfitverfahren für die 5-Methylcytosin-Kartierung, die den Abbau des Templates minimiert. Sie untersuchen ein Verfahren zum Minimieren eines Template-Abbaus mit 5 M Bisulfitlösungen in Anwesenheit von 100 mM Hydrochinon bei einem pH-Wert von 5 und bei 50°C. Eine maximale Ausbeute an PCR-Produkt wurde nach 4 Stunden beobachtet. Andere Bedingungen, wie erhöhter pH-Wert und niedrigere Temperaturen wurden ebenfalls untersucht.
  • Grunau, C., et al., Nucleic Acids Res. 29 (2001) e65-5, S. 1 bis 7, führen eine systematische Untersuchung der kritischen experimentellen Parameter der Bisulfitreaktion durch. Sie untersuchen 3,87 bis 4,26 und 5,2 bis 5,69 M Bisulfitlösungen bei einem pH-Wert von 5. Die Tests fanden bei Temperaturen von 15, 35, 55, 80, 85 und 95°C für 1, 4 und 18 Std. statt. In diesen Untersuchungen ist der DNA-Abbau ein Problem.
  • Wang, R.Y., et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980) 4777-4790 offenbaren die Verwendung einer 3 M Bisulfitlösung bei einem pH-Wert von 5,5 und einer Temperatur von 37°C für verschiedene Zeiträume bei der Bisulfitbehandlung von DNA. Feil, R., et al., Nucleic Acids Res. 22 (1994) 695-696 offenbaren die Verwendung einer 3,5 M Bisulfitlösung bei einem pH-Wert von 5 und einer Temperatur von 0°C für 24 Std. bei der Bisulfitbehandlung von DNA. Clark, S.J., et al., Nucleic Acids Res. 22 (1994) 2990-2997, offenbaren die Verwendung einer 3 bis 4 M Bisulfitlösung bei einem pH-Wert von 4,8 bis 5,8 und einer Temperatur von 37 bis 72°C für 8 bis 16 Std. bei der Bisulfitbehandlung von DNA. Tasheva, E.S. und Roufa, D.J., Mol. Cell. Biol. 14 (1994) 5636-5644 offenbaren die Verwendung einer 1 M Bisulfitlösung bei einem pH-Wert von 5 und einer Temperatur von 50°C für 48 Std. bei der Bisulfitbehandlung genomischer DNA-Fragmente. Grigg, G.W., DNA Seq. 6 (1996) 189-198 offenbart die Verwendung einer 3,1 M Bisulfitlösung bei einem pH-Wert von 5 und einer Temperatur von 50°C für 16 Std. bei der Bisulfitbehandlung von DNA. Komiyama, M. und Oshima, S., Tetrahedron Letters 35 (1994) 8185-8188 offenbaren die Verwendung einer 1 M Bisulfitlösung bei einem pH-Wert von 5 und einer Temperatur von 37°C für 4 Std. bei der Bisulfitbehandlung von DNA, wobei Diethylentriamin zugegen ist.
  • Olek, A., et al., Nucleic Acids Res. 24 (1996) 5064-5066 offenbaren ein Verfahren für die Bisulfit-Basensequenzierung, wobei die Bisulfitbehandlung und die nachfolgenden PCR-Schritte an Material durchgeführt werden, das in Agarosekügelchen eingebettet ist. Eine 5 M Bisulfitlösung bei einem pH-Wert von 5 und einer Temperatur von 50°C wird 4 Std. bei der Bisulfitbehandlung von DNA verwendet.
  • Ein Überblick über die DNA-Methylierungsanalyse findet sich in Oakeley, E.J., Pharmacol. Ther. 84 (1999) 389-400.
  • Verschiedene zusätzliche Komponenten im Bisulfitgemisch werden in WO 01/98528 , WO 02/31186 oder von Paulin, R., et al., Nucleic Acids Res. 26 (1998) 5009-5010 offenbart.
  • Kits zum Durchführen von Bisulfitbehandlungen sind von Intergen kommerziell erhältlich, und werden nun durch Serologicals Corporation, Norcross, GA, USA, verteilt, beispielsweise CpGenomeTM DNA-Modifizierungs-Kit (http://www.serologicals.com/products/intprod/index.html).
  • Alle Bisulfitbehandlungsverfahren des Standes der Technik haben Nachteile. Folglich war das durch die vorliegende Erfindung zu lösende Problem die Bereitstellung eines Verfahrens, das die Nachteile der Verfahren des Standes der Technik überwindet.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Umwandlung einer Cytosin-Base, vorzugsweise Cytosin-Basen, in einer Nukleinsäure in eine Uracil-Base, vorzugsweise Cytosin-Basen, bereit, wobei vorzugsweise eine 5-Methylcytosin-Base, vorzugsweise 5-Methylcytosin-Basen, nicht signifikant umgewandelt werden, umfassend die Schritte:
    • a) Inkubieren einer Lösung, welche die Nukleinsäure umfasst, für einen Zeitraum von 1,5 bis 3,5 Stunden bei einer Temperatur zwischen 70 und 90°C, wobei die Konzentration an Bisulfit in der Lösung zwischen 3 M und 6,25 M beträgt und wobei der pH-Wert der Lösung zwischen 5,0 und 6,0 liegt, wodurch die Nukleinsäure desaminiert wird, und
    • b) Inkubieren der Lösung, welche die desaminierte Nukleinsäure umfasst, unter alkalischen Bedingungen, wodurch die desaminierte Nukleinsäure desulfoniert wird.
  • Die Erfindung stellt zudem eine Lösung mit einem pH-Wert zwischen 5,4 und 5,6, die Bisulfit in einer Konzentration zwischen 3 M und 6,25 M umfasst, Verwendungen davon und Kits, die diese Lösung umfassen, bereit.
  • Wie dem Fachmann bekannt ist und gemäß der Erfindung wird der Begriff "Bisulfit" austauschbar für "Hydrogensulfit" verwendet.
  • Gemäß der Erfindung bedeutet die Bezeichnung "Bisulfitreaktion", "Bisulfitbehandlung" oder "Bisulfitverfahren" eine Reaktion zur Umwandlung einer Cytosin-Base, vorzugsweise Cytosin-Basen, in einer Nukleinsäure in eine Uracil-Base, vorzugsweise Uracil-Basen, in Anwesenheit von Bisulfitionen, wobei vorzugsweise eine 5-Methylcytosin-Base, vorzugsweise 5-Methylcytosin-Basen nicht signifikant umgewandelt wird. Diese Reaktion für den Nachweis der methylierten Cytosine wird ausführlich von Frommer et al., siehe oben, und Grigg und Clark, siehe oben, beschrieben. Die Bisulfitreaktion enthält einen Desaminierungschritt und einen Desulfonierungsschritt, die separat oder gleichzeitig durchgeführt werden können (siehe 1; Grigg und Clark, siehe oben). Die Aussage, dass 5-Methylcytosin-Basen nicht signifikant umgewandelt werden, zieht nur die Tatsache in Betracht, dass es nicht ausgeschlossen werden kann, dass ein kleiner Prozentsatz von 5 Methylcytosin-Basen in Uracil umgewandelt wird, obgleich nur und ausschließlich die (nicht-methylierten) Cytosin-Basen umgewandelt werden sollen (Frommer et al., siehe oben). Der Fachmann weiß, wie er die Bisulfitreaktion durchführen muss, beispielsweise durch Bezugnahme auf Frommer et al., siehe oben, oder Grigg und Clark, siehe oben, welche die Hauptparameter der Bisulfitreaktion offenbaren. Von Grunau et al., siehe oben, weiß der Fachmann, welche Veränderungen des Bisulfitverfahrens möglich sind. Zusammengefasst werden im Desaminierungschritt ein Puffer, der Bisulfitionen, gegebenenfalls chaotrope Mittel und gegebenenfalls weitere Reagenzien enthält, wie einen Alkohol, oder Stabilisatoren, wie Hydrochinon eingesetzt, und der pH-Wert ist im sauren Bereich. Die Bisulfitkonzentration ist zwischen 0,1 und 6 M Bisulfit, vorzugsweise zwischen 1 M und 5,5 M, die Konzentration des chaotropen Mittels ist zwischen 1 und 8 M, wobei vorzugsweise Guanidiniumsalze eingesetzt werden, der pH-Wert ist im sauren Bereich, vorzugsweise zwischen 4,5 und 6,5, die Temperatur ist zwischen 0°C und 90°, vorzugsweise zwischen Raumtemperatur (25°C) und 90°C, und die Reaktionszeit ist zwischen 30 Min. und 24 Std. oder 48 Std. oder sogar länger, aber vorzugsweise zwischen 1 Std. und 24 Std. Der Desulfonierungsschritt erfolgt durch Hinzufügen einer alkalischen Lösung oder eines Puffers, wie beispielsweise einer Lösung, die nur ein Hydroxid, beispielsweise Natriumhydroxid, enthält oder eine Lösung, die Ethanol, Natriumchlorid und Natriumhydroxid enthält (beispielsweise 38% EtOH, 100 mM NaCl, 200 mM NaOH) und Inkubieren bei Raumtemperatur oder erhöhten Temperaturen für einige Minuten, vorzugsweise zwischen 5 Min. und 60 Min.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren gewährt eine verhältnismäßig kurze Reaktionszeit der Bisulfitreaktion, so dass ein DNA-Test innerhalb eines Arbeitstages durchgeführt werden kann. Ein Parameter zur Beschleunigung der Reaktion ist die Temperatur. Zur Verringerung des DNA-Abbauprozesses ist ein niedriger pH-Wert von Vorteil. Durch die Verwendung einer 5 M Bisulfitlösung mit einem pH-Wert von 5,5 bei einer Temperatur von ungefähr 80°C ist eine Reaktionszeit zwischen beispielsweise 120 und 180 Min. möglich. Zudem ist die Reaktion unter erfindungsgemäßen Bedingungen spezifischer für Cytosin als für 5-Methylcytosin, wie mit Standardbedingungen nach 16 Std. Additive für die Stabilisierung des Bisulfitreagens, wie Hydrochinon, sind möglich.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Umwandlung einer Cytosin-Base, vorzugsweise Cytosin-Basen, in einer Nukleinsäure in eine Uracil-Base, vorzugsweise Uracil-Basen, wobei vorzugsweise eine 5- Methylcytosin-Base, vorzugsweise 5-Methylcytosin-Basen, nicht signifikant umgewandelt wird, umfassend die Schritte
    • a) Inkubieren einer Lösung, welche die Nukleinsäure umfasst, für einen Zeitraum von 1,5 bis 3,5 Stunden bei einer Temperatur zwischen 70 und 90°C, wobei die Konzentration an Bisulfit in der Lösung zwischen 3 M und 6,25 M beträgt und wobei der pH-Wert der Lösung zwischen 5,0 und 6,0 liegt, wodurch die Nukleinsäure desaminiert wird, und
    • b) Inkubieren der Lösung, welche die desaminierte Nukleinsäure umfasst, unter alkalischen Bedingungen, wodurch die desaminierte Nukleinsäure desulfoniert wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das Verfahren weiter den Schritt 'Entsalzen der Lösung' umfassen, welche die desaminierte und desulfonierte Nukleinsäure umfasst. Dieses kann beispielsweise durch Ultrafiltration, Gelfiltration, Fällung, wie dem Fachmann bekannt, oder durch Binden an magnetische Glasteilchen, wie in WO 96/41811 beschrieben, erfolgen.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Temperatur im erfindungsgemäßen Verfahren zwischen 75 und 85°C. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Konzentration an Bisulfit zwischen 3,2 M und 6 M, vorzugsweise zwischen 4,75 M und 5,5 M. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der pH-Wert der Lösung zwischen 5,25 und 5,75. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Zeitraum zwischen 1,75 und 3 Stunden. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Zeitraum zwischen 2 und 3 Stunden, vorzugsweise zwischen 2 und 2,5 Stunden. Die Reaktion ist auch in einem Zeitraum zwischen 0,75 und 3,5 Stunden möglich. In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, ist in Schritt a) die Temperatur 80°C, die Bisulfitkonzentration ist 5 M, der pH-Wert der Lösung ist 5,5, und der Zeitraum ist vorzugsweise zwischen 2 und 2,5 oder 3 Stunden, am stärksten bevorzugt 2 Stunden.
  • Das Verfahren wird vorzugsweise in Lösung durchgeführt, jedoch kann das erfindungsgemäße Verfahren auch durchgeführt werden, während die Nukleinsäure in einer Festphasen-gebundenen Form ist, d.h. sie ist unter geeigneten Bedingungen an eine Festphase gebunden. Die Festphase kann ein Siliciumoxid, vorzugsweise in Form von Glasvliesen oder Fasern oder magnetischen Glasteilchen sein, wie in WO 96/41811 , WO 00/32762 und WO 01/37291 beschrieben. Das prinzipielle Verfahren beim Durchführen einer Bisulfitbehandlung, während die Nukleinsäure an eine Festphase gebunden ist, ist beispielsweise beschrieben in der europäischen Patentanmeldung mit der Nummer EP 02 019 097.1 und EP 02 028 114.3 .
  • Der Fachmann weiß, wie er die Bisulfitreaktion durchführen muss, beispielsweise durch Bezugnahme auf Frommer et al., siehe oben, Grigg und Clark, siehe oben, oder Grunau et al., siehe oben, welche die Hauptparameter der Bisulfitreaktion offenbaren.
  • Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist die Nukleinsäure Desoxyribonukleinsäure (DNA), insbesondere genomische DNA oder Nukleinsäure, d.h. die DNA oder Nukleinsäure, die sich im Genom des Organismus befindet und die den Nachkommen als überlebensnotwendige Information weitergegeben wird. Der Begriff wird verwendet, um zwischen anderen DNA-Typen zu unterscheiden, die sich z.B. innerhalb von Plasmiden befinden. Die Quelle für die Nukleinsäure kann eukaryotisch oder prokarytisch sein, vorzugsweise von Wirbeltieren, insbesondere Säugetieren, am stärksten bevorzugt von Tieren oder Menschen.
  • Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird die Nukleinsäure von einer biologischen Probe erhalten, wobei die oben beschriebenen Festphasen und die dem Fachmann bekannten Verfahren verwendet werden. Die biologische Probe umfasst Zellen von mehrzelligen Organismen, wie beispielsweise Mensch- und Tierzellen wie Leukozyten und immunologisch aktive nieder- und hochmolekulare chemische Verbindungen, wie Haptene, Antigene, Antikörper und Nukleinsäuren, Blutplasma, Cerebrospinal-Flüssigkeit, Sputum, Stuhl, Biopsieproben, Knochenmark, Mundspülungen, Blutserum, Gewebe, Urin oder Mischungen davon. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die biologische Probe eine Flüssigkeit aus Mensch- oder Tierkörper. Die biologische Probe kann Blut, Blutplasma, Blutserum, Gewebe oder Urin sein. Die biologische Probe, welche die Nukleinsäuren umfasst, wird lysiert, so dass ein Gemisch von biologischen Verbindungen erzeugt wird, das Nukleinsäuren und andere Komponenten enthält. Verfahren zum Lysieren biologischer Proben sind dem Fachmann bekannt und können chemischer, enzymatischer oder physikalischer Natur sein. Eine Kombination dieser Verfahren ist ebenfalls anwendbar. Zum Beispiel kann die Lyse mit Ultraschall, Hochdruck, Scherkräften, Alkali, Detergenzien oder chaotropen Salzlösungen oder Proteasen oder Lipasen durchgeführt werden. Für das Lyseverfahren zur Gewinnung von Nukleinsäuren werden insbesondere Sambrook, J. et al., in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989), Hrsg. J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY; und Ausubel, F., et al., in "Current protocols in molecular biology" (1994), Hrsg. F. Ausubel, R. Brent und K. R.E., Wiley & Sons, New York, herangezogen. Dann werden die Nukleinsäuren aus dem Lysegemisch mit den Verfahren isoliert, die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise unter Verwendung von Festphasen als magnetische Glasteilchen ( WO 96/41811 ) und können dann den erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen werden, d.h. der erfindungsgemäßen Bisulfitbehandlung. Chaotrope Mittel werden auch zum Lysieren von Zellen verwendet, um ein Gemisch zwischen Nukleinsäuren und anderen biologischen Substanzen herzustellen (siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989) oder EP 0 389 063 ). Danach kann ein Material, das Glas oder ein Siliciumdioxid umfasst, zugefügt werden und ein Reinigungseffekt ergibt sich aus dem Verhalten von DNA oder RNA, zur Bindung an Material mit einer Glasoberfläche unter diesen Bedingungen, d.h. in Anwesenheit bestimmter Konzentrationen eines chaotropen Mittels, höheren Konzentrationen organischer Lösungsmittel oder unter sauren Bedingungen. Sequenzspezifisches Fangen kann für diesen Zweck auch verwendet werden.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Nukleinsäure nach den Schritten des erfindungsgemäßen Verfahrens mit der Polymerasekettenreaktion amplifiziert (PCR: EP 0 201 184 ; EP-A-0 200 362 ; US 4 683 202 ). Das Amplifikationsverfahren kann auch die Ligasekettenreaktion (LCR: Wu, D.Y. und Wallace, R.B., Genomics 4 (1989) 560-569; und Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 189-193), Polymerase-Ligase-Kettenreaktion (Barany, F., PCR Methods Appl. 1 (1991) 5-16), Gap-LCR (PCT Patent-Veröffentlichung-Nr. WO 90/01069 ), Reparatur-Kettenreaktion (europäische Patent-Veröffentlichung-Nr. EP-A 0 439 182 ), 3SR (Kwoh, D.Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-1177; Guatelli, J.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874-1878; PCT Patent-Veröffentlichung-Nr. WO 92/0880A ) und NASBA (U.S. Pat.-Nr. US 5 130 238 ) sein. Weiter gibt es Strang-Verdrängungsamplifikation (SDA), transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA) und Q⎕-Amplifikation (für einen Überblick siehe beispielsweise Whelen, A.C. und Persing, D.H., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-373; Abramson, R.D. und Myers, T.W., Curr. Opin. Biotechnol. 4 (1993) 41-47). Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren sind das in US 5 786 146 offenbarte methylierungsspezifische PCR-Verfahren (MSP), das die Bisulfitbehandlung und die allelspezifische PCR kombiniert (siehe beispielsweise US 5 137 806 , US 5 595 890 , US 5 639 611 ).
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann das Verfahren zudem den Schritt 'Erfassen der amplifizierten Nukleinsäure' umfassen. Die amplifizierte Nukleinsäure kann durch analytische Standardverfahren festgestellt oder ermittelt werden, die dem Fachmann bekannt sind und beispielsweise beschrieben sind von Sambrook J., et al., in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989), Hrsg. J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lottspeich und Zorbas, in "Bioanalytik" (1998), Hrsg. L. a. Zorbas, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Deutschland; oder von Ausubel, F., et al., in "Current protocols in molecular biology" (1994), Hrsg. F. Ausubel , R. Brent und K. R. E ., Wiley & Sons Verlag, New York. Es kann auch weitere Reinigungsschritte geben, bevor die Zielnukleinsäure nachgewiesen wird, beispielsweise einen Fällungsschritt. Die Nachweisverfahren können einschließen, sind aber nicht eingeschränkt auf die Bindung oder die Interkalation spezifischer Farbstoffe, wie Ethidiumbromid, das in die doppelsträngige DNA interkaliert und seine Fluoreszenz danach ändert. Die gereinigten Nukleinsäuren können auch durch Elektrophoreseverfahren getrennt werden, gegebenenfalls nach einer Restriktionsspaltung, und danach sichtbar gemacht werden. Es gibt auch Tests auf Sondenbasis, die die Oligonukleotid-Hybridisierung an spezifische Sequenzen und den anschließenden Nachweis des Hybrids ausnutzen. Man kann auch die Zielnukleinsäure nach weiteren Schritten, die dem Fachmann bekannt sind, sequenzieren. Andere Verfahren verwenden verschiedene Nukleinsäuresequenzen auf einem Silicium-Chip, an den spezifische Sonden gebunden sind, und ergeben ein Signal, wenn eine komplementäre Sequenz bindet.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Nukleinsäure nachgewiesen, indem man die Intensität des Fluoreszenzlichts während der Amplifikation misst. Dieses Verfahren bringt die Überwachung der Echtzeitfluoreszenz mit sich. Ein besonders bevorzugtes Verfahren, das gleichzeitige Amplifikation und Nachweis ausnutzt, indem es die Intensität des fluoreszierenden Lichts misst, ist das TaqMan®-Verfahren, das in WO 92/02638 und in den entsprechenden US-Patenten US 5 210 015 , US 5 804 375 , US 5 487 972 offenbart ist. Dieses Verfahren nutzt die Exonuklease-Aktivität einer Polymerase aus, um ein Signal zu erzeugen. Im Detail wird die Nukleinsäure durch ein Verfahren nachgewiesen, umfassend das Zusammenbringen der Probe mit einem Oligonukleotid, das eine Sequenz enthält, die komplementär zu einer Region der Ziel-Nukleinsäure ist, und einem markierten Oligonukleotid, das eine Sequenz enthält, die komplementär ist zu einer zweiten Region des gleichen Ziel-Nukleinsäurestrangs, aber nicht die vom ersten Oligonukleotid definierte Nukleinsäuresequenz enthält, so dass man unter Hybridisierungsbedingungen ein Gemisch von Doppelsträngen erhält, wobei die Doppelstränge die Ziel-Nukleinsäure enthalten, die an das erste Oligonukleotid und an das markierte Oligonukleotid hybridisiert ist, so dass das 3'-Ende des ersten Oligonukleotids nächst dem 5'-Ende des markierten Oligonukleotids ist. Dann wird dieses Gemisch mit einer Template-abhängigen Nukleinsäure-Polymerase mit 5' bis 3'-Nukleaseaktivität behandelt, und zwar unter Bedingungen, die es ermöglichen, dass die 5' bis 3'-Nukleaseaktivität der Polymerase das hybridisierte markierte Oligonukleotid spaltet, und die markierten Fragmente freisetzt. Das durch Hydrolyse des markierten Oligonukleotids erzeugte Signal wird nachgewiesen und/oder gemessen. Bei der TaqMan®-Technologie muss kein festphasengebundener Reaktionskomplex gebildet und nachweisbar gemacht werden. Allgemeiner ausgedrückt ist die Amplifikations- und/oder Nachweisreaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens ein homogener Lösungsphasen-Test. Weiter bevorzugte Verfahren sind die Formate, die in dem LightCycler®-Gerät (siehe z.B. US 6 174 670 ) verwendet werden. Die Verwendung einer Bisulfitbehandlung, Amplifikation mit oder ohne methylierungsspezifische Primer in Anwesenheit einer methylierungsspezifischen Sonde und Echtzeitfluoreszenznachweis, wie in US 6 331 393 beschrieben, sind besonders bevorzugt.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren automatisiert, d.h. das Verfahren führt ein automatisierbares Verfahren, wie beispielsweise in WO 99/16781 beschrieben, durch. Automatisierbares Verfahren bedeutet, dass sich die Schritte des Verfahrens zur Durchführung mit einer Vorrichtung oder einer Maschine eignen, die mit wenig oder keiner externen Steuerung oder Einfluss durch einen Menschen, arbeiten kann. Automatisiertes Verfahren bedeutet, dass die Schritte des automatisierbaren Verfahrens mit einer Vorrichtung oder einer Maschine durchgeführt werden, die mit wenig oder keiner externen Steuerung oder Einfluss durch einen Menschen, arbeiten kann. Nur die Präparationsschritte für das Verfahren müssen von Hand erfolgen, beispielsweise müssen die Aufbewahrungsbehälter aufgefüllt werden und an Ort und Stelle untergebracht werden, die Auswahl der Proben muss durch einen Menschen erfolgen und weitere Schritte, die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise der Betrieb des Steuercomputers. Die Vorrichtung oder Maschine kann beispielsweise automatisch Flüssigkeiten zuführen, die Proben mischen oder die Inkubationsschritte bei spezifischen Temperaturen durchführen. Eine solche Maschine oder Vorrichtung ist in der Regel ein Roboter, der von einem Computer gesteuert wird, welcher ein Programm durchführt, in dem die einzelnen Schritte und Befehle spezifiziert sind. Bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Verfahren in einem Hochdurchsatzformat, d.h. die automatisierten Verfahren werden in einem Hochdurchsatzformat durchgeführt, was bedeutet, dass das Verfahren und die verwendete Maschine oder Vorrichtung für einen Hochdurchsatz von Proben in einer kurzen Zeit optimiert sind.
  • Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren in der Diagnose, für eine diagnostische Analyse oder für die Bioanalytik oder für das Screening von Gewebe oder Flüssigkeiten von Mensch- oder sogar Tierkörper auf die Anwesenheit eines bestimmten Methylierunsmusters verwendet. Weiter wird das erfindungsgemäße Verfahren verwendet, um die Geschwindigkeit, die Genauigkeit oder die Empfindlichkeit des Nachweises der Methylierungsstellen in Nukleinsäuren zu erhöhen.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Lösung mit einem pH-Wert zwischen 5,25 und 5,75 und mit Bisulfit in einer Konzentration zwischen 3 M und 6,25 M in einer Reaktion bei einer Reaktionstemperatur zwischen 70 und 90°C verwendet, worin eine Cytosin-Base, vorzugsweise Cytosin-Basen, in einer Nukleinsäure in eine Uracil-Base, vorzugsweise Uracil-Basen, in Anwesenheit von Bisulfitionen umgewandelt werden, wobei vorzugsweise eine 5-Methylcytosin-Base, vorzugsweise 5-Methylcytosin-Basen, nicht erheblich umgewandelt werden. Die Bisulfitkonzentration ist vorzugsweise zwischen 3,2 M und 6 M, vorzugsweise zwischen 4,75 M und 5,5 M. In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist der pH-Wert der Lösung 5,5 und die Bisulfitkonzentration ist 5 M. Die Lösung kann auch Hydrochinon zur Stabilisierunug enthalten. Die erfindungsgemäße Lösung ist vorzugsweise eine wässrige Lösung. Vorzugsweise ist die Reaktionstemperatur zwischen 75 und 85°C.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst ein Kit eine erfindungsgemäße Lösung. Die Lösung hat vorzugsweise einen pH-Wert zwischen 5,25 und 5,75, vorzugsweise zwischen 5,4 und 5,6 und umfasst Bisulfit in einer Konzentration zwischen 3 M und 6,25 M. Vorzugsweise ist die Konzentration an Bisulfit zwischen 3,5 M und 6 M, vorzugsweise zwischen 4,75 M und 5,5 M. Die Lösung kann gegebenenfalls Hydrochinon enthalten. In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist der pH-Wert der Lösung 5,5 und die Konzentration an Bisulfit ist 5 M. Solche Kits des Standes der Technik umfassen weiter Kunststoffware, die während des Bisulfitverfahrens verwendet werden kann, wie beispielsweise Mikrotiterplatten im Format mit 96 oder 384 Vertiefungen oder Reaktionsröhrchen, beispielsweise hergestellt von Eppendorf Hamburg, Deutschland. Der Kit kann zudem eine Waschlösung umfassen, die sich für den Waschschritt der Festphase, insbesondere des Glasvlieses oder der Membran oder der magnetischen Glasteilchen, eignet. Häufig wird die Waschlösung als Stammlösung zur Verfügung gestellt, die vor der Verwendung verdünnt werden muss. Der Kit kann zudem ein Elutionsmittel umfassen, beispielsweise eine Lösung oder einen Puffer (beispielsweise TE, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) oder reines Wasser, zur Elution der an der Festphase gebundenen DNA oder RNA. Zudem können zusätzliche Reagenzien zugegen sein, die Puffer enthalten, die sich zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignen. Vorzugsweise wird der erfindungsgemäße Kit für eine Reaktion verwendet, worin eine Cytosin-Base, vorzugsweise Cytosin-Basen, in einer Nukleinsäure in eine Uracil-Base, vorzugsweise Uracil-Basen, in Anwesenheit von Bisulfitionen umgewandelt werden, wobei vorzugsweise eine 5-Methylcytosin-Base, vorzugsweise 5-Methylcytosin-Basen, nicht signifikant umgewandelt werden.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Lösung mit einem pH-Wert zwischen 5,4 und 5,6 und mit Bisulfit in einer Konzentration zwischen 3,5 M und 6,25 M bereitgestellt. Die Lösung enthält gegebenenfalls Hydrochinon oder andere Radikalfänger. Vorzugsweise ist die Bisulfitkonzentration zwischen 3,75 M und 6 M, vorzugsweise zwischen 4,75 M und 5,5 M. In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist der pH-Wert der Lösung 5,5, und die Bisulfitkonzentration ist 5 M.
  • Die folgenden Beispiele, Referenzen, das Sequenzprotokoll und die Figuren sollen lediglich das Verständnis der vorliegenden Erfindung unterstützen, deren wahrer Schutzumfang in den angefügten Ansprüchen dargelegt wird.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1: Die Schritte des Bisulfitverfahrens
  • 2 bis 14: HPLC-Profile der Reaktionsgemische nach bestimmten Zeitabschnitten, wie in den Beispielen angezeigt.
  • 1 Beispiele
  • 1.1 Vergleich optimierter Bedingungen mit Standardbedingungen unter Verwendung eines Modellsystems (Oligonukleotid) und Analyse durch HPLC
  • 1.1.1 Verfahren:
  • 1.1.1.1 Zusammensetzung der Reagenzien
  • Bisulfitreagens
    pH = 5,0/50°C: 1,9 g Na2S2O5
    ("Standard") 2 ml Millipore-Wasser
    0,7 ml 2 M NaOH
    0,5 ml 1 M Hydrochinon (ggf.)
    Zugabe von Millipore-Wasser auf ein Volumen von 4 ml.
    Bisulfitreagens
    pH = 5,5/80°C: 1,9 g Na2S2O5
    1 ml Millipore-Wasser
    2 ml 2 M NaOH
    0,5 ml 1 M Hydrochinon (ggf.)
    Zugabe von Millipore-Wasser auf ein Volumen von 4 ml.
  • Hydrochinon kann gegebenenfalls hinzugefügt werden; es ist nicht notwendig, wenn das Reagens frisch für das Experiment vorbereitet wird.
  • Sequenzen:
  • Die Oligonukleotide werden mit automatischem Standard-Festphasensyntheseverfahren unter Anwendung der Phosphoramiditchemie synthetisiert.
  • GSTP1-Sequenz:
    • SEQ.-ID.-NR. 1: 5'-d(GAGGGGCGCCCTGGAGTCCC)-3' (Sense-Strang)
    • SEQ.-ID.-NR. 2: 5'-d(GGGACTCCAGGGCGCCCCTC)-3' (Antisense-Strang)
    • SEQ.-ID.-NR. 3: 5'-d(GAGGGGUGUUUTGGAGTUUU)-3' (Sense-Strang, C umgewandelt in U (Produkt))
    • SEQ.-ID.-NR. 4: 5'-d(GGGAUTUUAGGGUGUUUUTU)-3' (Antisense-Strang, C umgewandelt in U (Produkt))
    • C oder CMe in der Mittelposition von T10:
    • SEQ.-ID.-NR. 5: 5'-d(T5CT5)-3'
    • SEQ.-ID.-NR. 6: 5'-d(T5CMeT5)
    • SEQ.-ID.-NR. 7: 5'-d(T5UT5)-3'
    • SEQ.-ID.-NR. 8: 5'-d(T11)-3'
  • 1.1.1.2 Reaktionsbedingungen:
  • Ca. 5 nmol eines einzelsträngigen Oligonukleotids oder 5 nmol jedes Strangs eines doppelsträngigen Oligonukleotids werden in 20 μl Millipore-Wasser gelöst, dann werden 200 μl des Bisulfitreagens hinzugefügt. Danach wird das Reaktionsröhrchen in einem Thermomischer (50°C oder 80°C; 600 U/min) untergebracht. Nach t = x Stunden wird die Reaktion durch Zugabe von 500 μl 2,5 M NaOH (Desulfonierung) angehalten. Nach 30 min bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch über einer Sephadex G25-Säule entsalzt. Der Anteil, der Oligonukleotid enthält, wird verdampft und in 200 μl Millipore-Wasser gelöst; und durch HPLC analysiert.
  • 1.1.1.3 Auswertung
  • Analytische HPLC: Säule: Dionex DNA Pac PA-100 SEL
    Puffer A: 0,01 M NaOH, 0,2 M NaCl
    Puffer B: 0,01 M NaOH, 1 M NaCl
    Gradient: 50-100% B in 25 min
  • Auswertung der Daten: Die HPLC-Chromatogramme werden in Bezug auf HPLC-Flächen% des Produkt-Peaks bei t = x verglichen und sind in 2 bis 12 gezeigt
  • 1.1.2 Ergebnisse
  • 1.1.2.1 Reaktions-Kinetiken GSTP1 ds bei T = 80°C, pH = 5,5
  • Eine doppelte Bestimmung wurde gemäß dem vorstehend beschriebenen Standardprotokoll mit den GSTP1-Sequenzen SEQ.-ID.-NR. 1, d.h. dem Sense-Strang, und SEQ.-ID.-NR. 2, d.h. dem Antisense-Strang, durchgeführt, und es werden Mittelwerte errechnet.
    t [min] HPLC Flächen% Produkt Figur
    10 0 2
    30 27,0 3
    60 77,5 4
    90 87,5 5
    120 89,9 6
    150 90,4 7
    180 88,6 8
  • 1.1.2.2 Reaktions-Kinetiken GSTP1 ds bei T = 50°C, pH = 5,0 ("Standardbedingungen")
  • Eine doppelte Bestimmung wurde gemäß dem vorstehend beschriebenen Standardprotokoll mit den GSTP1-Sequenzen SEQ.-ID.-NR. 1, d.h. dem Sense-Strang, und SEQ.-ID.-NR. 2, d.h. dem Antisense-Strang, durchgeführt, und es werden Mittelwerte errechnet.
    t [Std.] HPLC Flächen% Produkt Figur
    1 15,6 9
    2 41,2 10
    4 72,5
    8 89,4 11
    16 91,8 12
    20 85,0
  • 1.1.2.3. Spezifität der Bisulfitreaktion T5CMeT5 bei T = 80°C, pH = 5,5 (optimierte Bedingungen) verglichen mit "Standardbedingungen" bei T = 50°C, pH = 5,0
  • Zur Bestimmung der Spezifität der Bisulfitreaktion wurde das Oligonukleotid 5'-T5CMeT5-3' (SEQ.-ID.-NR. 6) unter den angegebenen Bedingungen bewertet. Die Resultate waren wie folgt: 5 M Bisulfit pH 5,0/T = 50°C/t = 16 Std. (Standardbedingungen) (siehe Fig. 13 für ein beispielhaftes Chromatogramm):
    Probe HPLC Flächen% T5CMeT5 HPLC-Flächen% T11 Verh. HPLC-Flächen% T11/T5CMeT5
    1 82,4 5,20 0,0630
    2 83,3 5,11 0,0614
    3 80,2 5,52 0,0688
    4 80,5 5,92 0,0735
    Mittel-Wert 81,6 5,44 0,0667
    5 M Bisulfit pH 5,5/T = 80°C/t = 2 Std. (optimierte Bedingungen) (siehe Fig. 14 für ein beispielhaftes Chromatogramm)
    Probe HPLC Flächen% T5CMeT5 HPLC-Flächen% T11 Verh. HPLC-Flächen% T11/T5CMeT5
    1 89,9 2,65 0,0295
    2 89,5 2,46 0,0275
    3 90,2 2,24 0,0248
    4 89,7 2,88 0,0322
    Mittel-Wert 89,8 2,56 0,0285
  • 1.1.3 Schlussfolgerungen
  • Die erfindungsgemäßen Bedingungen ergeben eine ähnliche Produktausbeute nach 2 Std. Reaktionszeit wie Standardbedingungen nach 8-16 Std. Die Spezifität der Bisulfitreaktion ist für die erfindungsgemäßen Bedingungen nach 2 Std. verglichen mit "Standardbedingungen" nach 16 Std. erheblich besser.
  • 1.2 Vergleich bestimmter Bedingungen des Bisulfitverfahrens mit PCR von Bisulfit-behandelter genomischer DNA
  • 1.2.1 Allgemeines
  • Die Tatsache, dass die Bisulfitreaktion funktioniert und nicht-methylierte Cytosine in Uracil umgewandelt hat, kann auch durch eine Polymerasekettenreaktion gezeigt werden, wobei Primer verwendet werden, die für eine Region der Nukleinsäuresequenz spezifisch sind, worin nicht-methylierte Cytosine in Uracile umgewandelt worden sind, d.h. die Base Adenin im Primer befindet sich gegenüber dem Uracil, das das Bisulfitreaktions-Produkt von nicht-methylierten Cytosinen ist. Bei einer unvollständigen Umwandlung könnten die Primer nicht an diese Region hybridisieren, da es Cytosine gäbe, welche nicht zu den Adenin-Basen in dem Primer passen. Dadurch würde kein PCR-Produkt erhalten.
  • Ein verbessertes Verfahren zur Durchführung schneller Polymerasekettenreaktionen ist beispielsweise in US 6 174 670 offenbart und wird im LightCycler®-Gerät (Roche, Mannheim, Deutschland) verwendet. In diesem Verfahren können zwei markierte Sonden in unmittelbare Nähe in einer amplifikatabhängigen Weise kommen, so dass die beiden Markierungen eine Fluoreszenzenergieübertragung (FRET) durchführen können. Die Menge des Amplifikats korreliert dadurch mit der Intensität des ausgestrahlten Lichts einer bestimmten Wellenlänge. Mit diesem spezifischen PCR-Verfahren kann man daher analysieren, ob eine vollständige Umwandlung nicht-methylierter Cytosine erreicht wurde, beispielsweise durch Analysieren der Promotorregion des Glutathion-S-Transferase π-Gens (siehe beispielsweise US 5 552 277 , Genbank-Zugangscode M24485 und Morrow et al. (1989) Gene 75, 3-11) mittels geeigneter Sonden und Primer. Der Fachmann weiß jedoch, dass außerdem andere Verfahren für diese Auswertung verwendet werden können. Fluoreszenzmessungen werden normalisiert durch Division durch eine Ausgangsfluoreszenzmessung, d.h. der Hintergrundfluoreszenz, die während eines Zyklus früh in der Reaktion erhalten wurde, während die Fluoreszenzmessungen zwischen Zyklen, verhältnismäßig konstant zu sein scheinen. Die Zykluszahl, die für die Ausgangsfluoreszenzmessung gewählt wird, ist für alle verglichenen Reaktionen die selbe, damit alle Messungen Anstiege im Verhältnis zu dem gleichen Reaktionszyklus darstellen. In den frühen Zyklen einer Polymerasekettenreaktions-Amplifikation kann die Zahl der Zielmoleküle durch die geometrische Gleichung Ni = No × (1 + E)i beschrieben werden, wobei:
    • No
    = die Anzahl Zielmoleküle zu Beginn der Reaktion,
    Ni
    = die Anzahl Zielmoleküle bei Beendigung des i-ten Zyklus,
    E
    = die Effizienz der Amplifikation (0 ≤ E ≤ 1) ist.
  • Während dieser geometrischen Wachstumsphase der Amplifikation ist die Zahl der Zyklen, die erforderlich sind, damit ein bestimmter Schwellenwert (CT-Wert oder Kreuzungspunkt) erreicht wird, umgekehrt proportional zum Logarithmus von (1 + E). So stellt der CT-Wert ein Maß für die Reaktionseffizienz dar, die Vergleiche zwischen Reaktionen erlaubt. Eine Abnahme des CT-Werts, die bedeutet, dass die Reaktion den Schwellenwert in weniger Zyklen erreichte, zeigt eine Zunahme der Reaktionseffizienz. Während die Zunahme des Amplifikationsprodukts überwacht wird, indem man die Zunahme der Reaktionsfluoreszenz misst, wird CT hierin als die Anzahl der Amplifikationszyklen definiert, die durchgeführt wurden, bis die Fluoreszenz ein willkürliches Fluoreszenzniveau (AFL) überstieg. Das AFL wurde nahe dem Grundlinien-Fluoreszenzniveau, aber oberhalb des Bereichs statistischer Fluktuationen in der gemessenen Fluoreszenz gewählt, so dass die Reaktionskinetiken während der geometrischen Wachstumsphase der Amplifikation gemessen wurden. Die Anreicherung von amplifiziertem Produkt in späteren Zyklen hemmt die Reaktion und führt schließlich zu einem Reaktionsplateau. Ein AFL von 1,5 wurde für alle Reaktionen gewählt. Weil eine PCR-Amplifikation aus getrennten Zyklen besteht und die Fluoreszenzmessungen einmal pro Zyklus durchgeführt werden, steigt die gemessene Fluoreszenz in einem einzelnen Zyklus gewöhnlich von einem Wert unter dem AFL auf einen Wert über dem AFL. Zur Verbesserung der Genauigkeit der Messungen, wurde eine "genaue" Anzahl von Zyklen zum Erreichen der AFL-Schwelle, die hierin als der CT-Wert oder Kreuzungspunkt bezeichnet wird, durch Interpolation der Fluoreszenzmessungen zwischen den Zyklen errechnet.
  • 1.2.2 Verfahren
  • 1.2.2.1 Denaturierung von DNA
  • 100 μl methylierte DNA (Intergen, verteilt von Serologicals Corporation, Norcross, GA, USA; Kat. S 7821), Verdünnung (100 ng/Assay, gegeben in 1000 ng Human-DNA-Hintergrund, Roche Kat. 1691112; 4-Fachansätze pro Verfahren) und 12 μl 2 M NaOH werden gemischt und für 15 Minuten bei 37°C inkubiert.
  • 1.2.2.2 Desaminierung von DNA
  • 112 μl denaturierte DNA werden mit 200 μl Bisulfitreagens (2,5 M Natriumdisulfit, 125 mM Hydrochinon, pH 5,1) gemischt und für 20 Std. bei 50°C inkubiert ("Standardverfahren")
    oder
  • 112 μl denaturierte DNA werden mit 200 μl Bisulfitreagens (2,5 M Natriumdisulfit, 125 mM Hydrochinon, pH 5,5) gemischt und für 2 Std. bei 80°C inkubiert ("BIS-VERFAHREN").
  • 1.2.2.3 Verarbeitung mit magnetischen Glasteilchen (MGPs)
  • 312 μl der desaminierten DNA (jeweils von beiden Verfahren) werden mit 600 μl Bindungspuffer (MagNAPure DNA Isolation Kit I, Roche Kat. Nr. 3 003 990) und 75 μl Magnetglasteilchenlösung (MagNAPure DNA Isolation Kit I) gemischt und für 15 min/Raumtemperatur unter kontinuierlichem Mischen inkubiert, damit die Nukleinsäure entsprechend dem in den europäischen Patentanmeldungen mit den Nr. EP 02019097.1 oder EP 02028114.3 beschriebenen Verfahren an die MGPs bindet. Danach werden die magnetischen Glasteilchen (MGPs) dreimal mit 1 ml 70% Ethanol gewaschen. Eine Sound-Free-Trennung erfolgt in einem Magnetseparator (Roche Kat. 1641794). Danach erfolgt die Desulfonierung durch Hinzufügen von 250 μl 38% EtOH/100 mM NaCl/200 mM NaOH zur DNA, die an die MGPs gebunden ist; das Gemisch wird für 5 min bei Raumtemperatur unter Mischen inkubiert. Danach werden die MGPs zweimal mit 90% Ethanol gewaschen. Zum Beseitigen von Ethanolresten wurden die MGPs 15 Min./60°C in einem Thermomischer mit offenem Deckel erhitzt. Danach wird die DNA mit 50 μl 10 mM Tris/0,1 mM EDTA pH 7,5 (15 Min/60°C) eluiert. 10 μl der eluierten DNA werden für die folgende PCR-Analyse verwendet.
  • 1.2.2.4 Nachweis der Bisulfit-behandelten DNA mittels spezifischer PCR auf dem LightCycler®-Gerät (Hyprobeformat)
  • 1.2.2.4.1 Zusammensetzung von Mastermix
    • LightCycler® FastStart DNA Masterhybridisierungssonde 1x (Roche 2239272), 2 mM MgCl2, Vorwärts-Primer 0,5 μM, Revers-Primer 0,5 μM, Donator-Sonde 250 nM, Akzeptor-Sonde 250 nM, Matrize 10 μl, Gesamt-PCR-Volumen 20 μl.
  • 1.2.2.4.2 PCR-Bedingungen
  • Denaturierung 10 min/95°C
    55 Zyklen 95°C/10 sec
    65°C/10 sec – Signalgewinn
    72°C/10 sec Anlaufzeit 20°C/sec
  • Der Probendurchlauf erfolgte parallel im gleichen Lauf auf dem LightCycler®-Gerät.
  • 1.2.2.5 Ergebnisse:
  • Proben-Nr.* BIS-Verfahren Ct-Wert Mittl. Ct-Wert
    1 "Standard" 30,08
    2 "Standard" 30,07
    3 "Standard" 30,13
    4 "Standard" 30,13 30,10
    5 "BIS-Verfahren" 29,11
    6 "BIS-Verfahren" 30,14
    7 "BIS-Verfahren" 30,14
    8 "BIS-Verfahren" 29,58 29,74
  • Die Kreuzungspunkte zeigen, dass das erfindungsgemäße "BIS-Verfahren" etwas empfindlicher ist als das "Standard"-Verfahren.
  • 1.2.3 Beispiel: Veränderung der Temperatur und Zeit des erfindungsgemäßen Bisulfitverfahrens
  • Die folgenden Experimente wurden mit der experimentellen Einstellung des Beispiels unter 1.2.1 durchgeführt, wobei die Temperatur und die Inkubationszeit verändert wurden und die angezeigten Ct-Werte gemessen wurden.
    Probe Inkubationszeit [min] Ct-Wert Temperatur Mittl. Ct-Wert
    1 180 28,56 80°C 28,35
    2 180 28,15 80°C
    3 180 28,03 80°C
    4 180 28,64 80°C
    5 150 28,86 80°C 28,57
    6 150 28,64 80°C
    7 150 28,08 80°C
    8 150 28,71 80°C
    9 120 28,94 80°C 28,94
    10 120 29,02 80°C
    11 120 28,77 80°C
    12 120 29,04 80°C
    13 90 29,76 80°C 29,67
    14 90 29,76 80°C
    15 90 29,60 80°C
    16 90 29,57 80°C
    17 60 30,02 95°C 30,86
    18 60 29,86 95°C
    19 60 33,54 95°C
    20 60 30,01 95°C
  • Dieses Experiment zeigt, dass die Ausdehnung der Inkubationszeit auf 3 Stunden nicht kritisch ist, während eine Verkürzung der Inkubationszeit auf 90 Min zu einem kleinen Verlust der Empfindlichkeit führt. Ein höherer Verlust der Empfindlichkeit ergab sich, als die Inkubationszeit auf 60 Minuten verkürzt wurde, aber die Inkubationstemperatur auf 95°C erhöht wurde.
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    Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Figure 00320001

Claims (14)

  1. Verfahren zur Umwandlung einer Cytosinbase in einer Nukleinsäure in eine Uracilbase, umfassend die Schritte: a) Inkubieren einer Lösung, welche die Nukleinsäure umfasst, für einen Zeitraum von 1,5 bis 3,5 Stunden bei einer Temperatur zwischen 70 und 90°C, wobei die Konzentration an Bisulfit in der Lösung zwischen 3 M und 6,25 M beträgt und wobei der pH-Wert der Lösung zwischen 5,0 und 6,0 liegt, wodurch die Nukleinsäure desaminiert wird, und b) Inkubieren der Lösung, welche die desaminierte Nukleinsäure umfasst, unter alkalischen Bedingungen, wodurch die desaminierte Nukleinsäure desulfoniert wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt a) die Temperatur zwischen 75 und 85°C liegt.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an Bisulfit zwischen 3,2 M und 6 M beträgt.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der Lösung zwischen 5,25 und 5,75 liegt.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeitraum zwischen 1,75 und 3 Stunden beträgt.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeitraum zwischen 2 und 3 Stunden beträgt.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt a) die Temperatur 80°C ist, die Konzentration an Bisulfit 5 M ist, der pH-Wert der Lösung 5,5 beträgt und der Zeitraum zwischen 2 und 3 Stunden beträgt.
  8. Verwendung einer Lösung mit einem pH-Wert zwischen 5,25 und 5,75, die Bisulfit in einer Konzentration zwischen 3 M und 6,25 M umfasst, bei einer Reaktionstemperatur zwischen 70 und 90°C, und die gegebenenfalls Hydrochinon umfasst, bei einer Umsetzung, wobei eine Cytosinbase in einer Nukleinsäure in Gegenwart von Bisulfitionen in eine Uracilbase umgewandelt wird.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Konzentration an Bisulfit zwischen 3,2 M und 6 M beträgt.
  10. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 9, wobei der pH-Wert der Lösung 5,5 beträgt und wobei die Konzentration an Bisulfit 5 M beträgt.
  11. Kit, umfassend eine Lösung mit einem pH-Wert zwischen 5,25 und 5,75, die Bisulfit in einer Konzentration zwischen 3 M und 6,25 M umfasst und die gegebenenfalls Hydrochinon umfasst.
  12. Lösung mit einem pH-Wert zwischen 5,4 und 5,6, die Bisulfit in einer Konzentration zwischen 3,5 M und 6,25 M umfasst und die gegebenenfalls Hydrochinon umfasst.
  13. Lösung nach Anspruch 12, wobei die Konzentration an Bisulfit zwischen 3,75 M und 6 M beträgt.
  14. Lösung nach einem der Ansprüche 12 bis 13, wobei der pH-Wert der Lösung 5,5 beträgt und die Konzentration an Bisulfit 5 M beträgt.
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