KR102214211B1 - 핵산의 추출 및 저장을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

핵산의 추출, 안정화 및 저장을 위한 고체 매트릭스를 제공한다. 1종 이상의 단백질 변성제 및 1종 이상의 산 또는 산-적정된 완충제 시약은 매트릭스에 건식 상태로 함침되고; 매트릭스는 수화시에 산성 pH를 제공하도록 구성된다. 매트릭스는 샘플로부터 핵산을 추출하고, 추출된 핵산, 특히, RNA를 주변 조건하에서 건식 포맷으로 장기간 동안 안정화시키도록 구성된다. 건식 고체 매트릭스에 저장된 핵산의 수집 및 회수 방법이 또한 기재된다.

Description

핵산의 추출 및 저장을 위한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR EXTRACTION AND STORAGE OF NUCLEIC ACIDS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2012년 4월 30일 출원된 미국 특허 출원 번호 13/460076 (발명의 명칭: "Methods and compositions for extraction and storage of nucleic acids"); 2012년 12월 20일 출원된 미국 특허 출원 번호 13/721948 (발명의 명칭: "Formulations for nucleic acid stabilization on solid substrates")의 부분계속출원이고; 상기 출원은 본원에서 참조로 포함된다.

분야

본 발명은 생물학적 샘플로부터의 핵산을 건식 포맷으로 주변 조건에서 추출 및 안정화시키는 고체 기판 및 방법에 관한 것이다. 건식 고체 기판으로부터 핵산을 수집, 추출, 보존, 및 회수하는 방법이 또한 기재된다.

다양한 하류 적용을 위해서는 생물학적 샘플로부터 단리 또는 정제하는 동안 생체분자의 구조 및 기능적 완전성을 보존하는 것이 필수적이다. 정제된 생체분자의 하류 적용은 분석물 검출, 감지, 법의학적, 진단학적, 또는 치료학적 적용, 서열분석, 증폭 등을 포함할 수 있다. 이러한 하류 적용의 성공은 표적 생체분자의 완전한 구조 및 기능의 유지에 좌우될 수 있다. 다양한 인자, 예컨대 온도, 압력, pH, 화학적 또는 효소적 가수분해, 또는 오염물질의 존재가 생체분자, 예컨대 DNA, RNA 또는 단백질의 분해를 유발할 수 있다.

RNA는 화학적 자가 가수분해 및 효소 매개 분해로 인해 가장 불안정한 생체분자 중 하나이다. 생물학적 샘플로부터 유래된 RNA의 추출 및 안정화는 RNA 추출 및 수집에 사용되는 완충제, 용액 pH, 온도, 및 특히 강건한 리보뉴클레아제 (RNase)의 편재적 존재를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 많은 환경적 인자에 민감하다. RNA는 전형적으로, 가수분해 및 효소적 분해를 방지함으로써 RNA 샘플의 완전성을 보존하기 위해, 정제된 및 정제되지 않은 형태 둘 다에서 냉동 저장 (예컨대, 4℃, -20℃, 또는 -80℃)된다. RNA 샘플의 완전성 유지를 위한 냉동과 연관된 비용 및 공간의 요구를 피하기 위해서는 주변 온도하에서 RNA를 추출 및 안정화시키는 방법 및 물품이 바람직하다.

주변 온도하에서 RNA를 안정화시키는 현행 방법은, 예를 들어 세제, 카오트로픽 화합물, 환원제, 전이 금속, 유기 용매, 킬레이트화제, 프로테아제, RNase 펩티드 억제제, 및 항-RNase 항체의 과량의 액체 용액 중에서 RNase를 불활성화시키는 것에 초점을 두었다. 부가적인 노력은 에스테르교환 및 자가 가수분해를 제한하기 위한 RNA의 화학적 변형에 초점을 두었다. RNA를 건식 포맷으로 성공적으로 수집하고 보존하는 것을 요구하는 건식 상태 기술은 전형적으로는 RNA를 RNA 저장 이전에 샘플로부터 "미리 정제하고" 농축시키는 것을 필요로 한다. RNA를 건식 포맷으로 보존하기 위한 다른 건식 상태 기술은 추가의 건조 설비 (예컨대, 강제 공기 유동, 동결 건조, 또는 열 처리)를 필요로 한다. 그러므로, 이러한 방법은 유의한 샘플 처리 없이 샘플 (예컨대, 생물학적 샘플)로부터 직접 RNA를 수집하는데에는 도움이 되지 않는다.

따라서, 단일 공정 단계 내에서 주변 조건하에 생물학적 샘플로부터 RNA를 건식 상태로 추출하고 안정화시킬 수 있는 조성물 및 방법이 요구되고 있다. 또한, 건조된 생물학적 샘플을 주변 온도에서 상당기간 동안 저장하고, 이후 추가 분석을 위해 무손상 RNA를 회수할 수 있는 능력이 매우 바람직하다.

고체 매트릭스의 한 실시양태는 건식 상태로 함침된 1종 이상의 단백질 변성제 및 1종 이상의 산 또는 산-적정된 완충제 시약을 포함하고; 여기서 매트릭스는 수화시에 산성 pH를 제공하고, 샘플로부터 핵산을 추출하고, 핵산을 주변 온도에서 실질적으로 건식 상태로 보존하도록 구성된다.

또 다른 실시양태에서, RNA 추출 매트릭스는 건식 상태로 함침된 카오트로픽제, 세제 또는 그의 조합을 포함하는 단백질 변성제, 및 산 또는 산-적정된 완충제 시약을 포함하고, 여기서 매트릭스는 RNA의 추출을 위해 수화시에 2 내지 7의 pH를 제공하고, 추출된 RNA를 4 이상의 RNA 완전성 수치 (RIN)로 안정화시키도록 구성된 다공성 비-용해성 건식 물질이다.

한 실시양태에서, RNA 추출 매트릭스는 건식 상태로 함침된 카오트로픽제, 세제 또는 그의 조합을 포함하는 단백질 변성제, 산 또는 산-적정된 완충제 시약, 및 트리포스페이트 염 또는 피로포스페이트 염을 포함하는 RNase 억제제를 포함하고, 여기서 매트릭스는 수화시에 2 내지 7의 pH를 제공하고, RNA를 4 이상의 RNA 완전성 수치 (RIN)로 안정화시키도록 구성된 다공성 비-용해성 건식 물질을 포함한다.

샘플로부터 핵산을 추출하고 저장하는 방법의 한 예는 단백질 변성제 및 산 또는 산-적정된 완충제 시약을 포함하는 건식 고체 매트릭스에 샘플을 제공하는 단계; 샘플로부터의 핵산의 추출을 위해 수화시에 산성 pH를 생성하는 단계; 추출된 핵산을 포함하는 매트릭스를 건조시키는 단계; 및 매트릭스 상의 추출된 핵산을 주변 온도에서 실질적으로 건식 상태로 저장하는 단계를 포함한다.

본 발명의 상기 및 다른 특징, 측면, 및 이점은, 도면 전반에 걸쳐 유사 문자가 유사 부분을 나타내는 첨부 도면을 참조로 하여 하기의 상세한 설명을 읽을 때 더욱 잘 이해될 것이다.
도 1은 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)의 산화 및 TCEP 옥시드 (TCEP-O)의 제조를 보여주는 P³¹ NMR 프로파일이다.
도 2는 셀룰로스 샘플에 대한 TCEP 및 TCEP-O 환원 활성에 대한 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산) (DTNB) 비색 검정으로부터 도출된 막대 그래프를 보여준다.
도 3은 TCEP 또는 TCEP-O를 함유하는 화학적으로 처리된 셀룰로스 종이 상에서 수집된 건조된 혈반에 대한 RNA 완전성 수치 (RIN)를 보여준다.
도 4는 다양한 화학적으로-처리된 셀룰로스 매트릭스 상에서 수집되고, 애질런트 2100 바이오애널라이저(Agilent 2100 Bioanalyzer) 상에서의 RNA 분석 이전에 주변 온도에서 5, 6, 또는 12일 동안 저장된 건조된 혈반에 대한 RNA 완전성 수치 (RIN)를 보여준다.

본 발명의 실시양태는 핵산, 예컨대 RNA를 주변 온도에서 추출 및 보존하는 데 적합한 매트릭스 및 방법을 제공한다. RNA는 일반적으로 무손상 형태로 보존하기 어려운 불안정한 분자인 것으로 알려져 있다. 본 발명의 하나 이상의 실시양태는 단일 공정 단계 내에서 생물학적 샘플로부터 핵산을 장기간 동안 수집, 추출 및 저장한 후, 다양한 적용에서 사용될 수 있도록 구성된 핵산 추출 매트릭스에 관한 것이다. 매트릭스는 핵산을 주변 온도에서 실질적으로 건식 상태로 저장하고, 핵산의 완전성을 실질적으로 유지하도록 구성된다.

청구하는 본 발명의 대상을 보다 명백하고, 간결하게 기술하기 위해, 하기 설명 및 첨부된 청구범위에서 사용된 특정 용어에 대한 하기 정의가 제공된다. 명세서 전반에 걸쳐 특정 용어의 예시는 비제한적인 예인 것으로 간주되어야 한다.

단수 형태는 문맥상 달리 분명하게 명시되지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 본 명세서 및 청구범위 전반에서 걸쳐 본원에서 사용되는 근사식 표현은 그와 관련된 기본 기능에는 변화를 일으키지 않으면서, 허용가능하게 달라질 수 있는 임의의 정량적 표현을 수식하기 위해 적용될 수 있다. 따라서, 예컨대 "약"이라는 용어로 수식되는 값은 명시된 그 정확한 값으로 한정되지 않는다. 일부 경우에서, 근사식 표현은 값을 측정하기 위한 장치의 정밀도에 상응할 수 있다. 필요할 경우, 범위로 제공되었고, 그 범위는 그 범위 사이에 포함되는 모든 부분 범위를 포함한다.

본원에서 언급되는 "핵산"이라는 용어는 모든 형태의 RNA (예컨대, mRNA, miRNA, rRNA, tRNA, piRNA, ncRNA), DNA (예컨대, 게놈 DNA, mtDNA)뿐만 아니라, 재조합 RNA 및 DNA 분자 또는 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA 유사체를 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산은 코딩 또는 비-코딩 가닥을 포함할 수 있다. 본 용어는 또한 핵산의 단편, 예컨대 개시된 추출 방법을 사용하여 회수될 수 있는 자연 발생 RNA 또는 DNA를 포함한다. "단편"이란 핵산 (예컨대, RNA 또는 DNA)의 일부를 의미한다.

본원에서 언급되는 "생물학적 샘플"이라는 용어는 인간을 비롯한, 임의의 유기체로부터 수득된 혈액, 혈청, 조직, 및 타액을 포함한다. 생물학적 샘플은 자가 진단 검사 (예컨대, 혈당 모니터링)를 받은 개체에 의해, 또는 예를 들어, 바늘을 이용하여 혈액을 흡입하는 기법, 또는 특정 부위, 예컨대 환자 피부 상의 병변을 긁어내거나 또는 면봉으로 긁어내는 기법을 비롯한 다양한 기법을 통해 숙련된 전문 의료진에 의해 수득될 수 있다. 다양한 생물학적 샘플을 수집하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. "샘플"이라는 용어는 상기 정의된 바와 같은 생물학적 샘플을 포함할 뿐만 아니라, 예를 들어, 조직 배양된 세포 및 정제된 핵산을 포함한다.

본원에서 언급되는 "환원제"라는 용어는 전자를 또 다른 화학 종에 제공하는 임의의 화학 종을 포함한다. 다양한 환원제가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 환원제는 디티오트레이톨 (DTT), 2-메르캅토에탄올 (2-ME), 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)을 포함한다. 또한, 상기 또는 다른 환원제의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 환원제는 TCEP이다.

본원에서 사용되는 "완충제"라는 용어는 예를 들어, 2-아미노-2-히드록시메틸-프로판-1,3-디올 (트리스), 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES), 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 (MOPS), 시트레이트 완충제, 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES), 및 포스페이트 완충제를 포함한다. 이러한 잠재 완충제의 목록은 단지 예시적인 목적을 위한 것이다. 본원에 개시된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 것으로 선택된 완충제의 pH는 전형적으로 2 내지 7 범위로 산-적정된다.

고체 매트릭스의 하나 이상의 실시양태는 건식 상태로 함침된 1종 이상의 단백질 변성제 및 1종 이상의 산 또는 산-적정된 완충제 시약을 포함하고, 여기서 매트릭스는 수화시에 산성 pH를 제공하도록 구성된다. 매트릭스는 또한 샘플로부터 핵산을 추출하고, 상기 핵산을 주변 온도에서 실질적으로 건식 상태로 보존하도록 구성된다. 본원에서 사용되는 "실질적으로 건식 상태"라는 용어는 수분 함량이 대략 2% 미만이 되도록 샘플을 추가로 건조시키는 것을 의미한다.

샘플로부터 핵산을 추출 및 저장하기 위한 고체 매트릭스는 건식 상태의 1종 이상의 산 또는 산-적정된 완충제 및 단백질 변성제를 포함한다. "매트릭스"라는 용어는 본원에서 "추출 매트릭스"로서 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는 "고체 매트릭스"라는 용어는 비-용해성 매트릭스를 의미한다. 매트릭스는 매트릭스 물질을 가용화시키지 않고도 핵산의 수집, 추출, 및 저장을 가능하게 한다. 고체 매트릭스는 물질, 예컨대 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 니트로셀룰로스, 유리 섬유 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 조성물의 매트릭스 내로의 "혼입"은 하기 기술되는 "침지" 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 방법을 통해 조성물을 건식 고체 매트릭스 내로 혼입시킬 수 있다. 조성물을 건식 고체 매트릭스 내로 혼입시킨 후, 임의의 적절한 방법을 사용하여 고체 매트릭스를 건조시킨다.

언급한 바와 같이, 고체 매트릭스는 건식 상태의 조성물을 포함하고, 이는 또한 건조 조건하에서 추출된 핵산을 보존한다. 추출 및 저장을 위해서는 액체 기반 추출보다는 건식 고체 매트릭스를 사용하는 것이 이로운데, 그 이유는 건식 매트릭스를 통해서는 확실히 매트릭스에 적용되는 샘플의 부피가 최소로 희석되기 때문이다. 통상의 기술자는 액체 기반 추출이 과량의 안정화 시약 중에 샘플의 농도를 희석시킨다는 것을 이해할 것이다. 샘플을 수집, 추출, 및 보존하기 위해 건식 고체 매트릭스를 사용하면, 샘플 농도를 유지할 수 있고, 예컨대 샘플 분해와 같이, 액체 보존제 중에 샘플을 부적절하게 희석시키는 것과 관련된 문제점들이 제거된다. 추가로, 고체 매트릭스는 건식 시약의 고정 조성물을 포함하며, 이는 수화시에 핵산, 예컨대 RNA를 효율적으로 추출할 수 있고, 이어서 추출된 RNA를 주변 온도에서 안정화시킬 수 있다.

이하 "주변 조건" 또는 "주변 온도"라는 용어는 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는 "주변 온도"라는 용어는 0℃ 내지 60℃ 범위의 온도를 의미한다. 하나 이상의 실시양태에서, 주변 온도는 실온이다. 일부 실시양태에서, 매트릭스는 주변 온도하에서 핵산을 건조된 상태로 저장 또는 보존하도록 구성된다.

언급된 바와 같이, 고체 매트릭스는 장기간 동안 핵산을 건식 상태하에 저장 또는 보존하도록 구성된다. "~하도록 구성된" 또는 "~하기 위해 구성된"이라는 용어는 본원에서 매트릭스의 구조 또는 조성물이 매트릭스가 주변 온도에서 일정 기간 동안 핵산을 추출하고 저장할 수 있게 한다는 것을 의미한다. "저장" 또는 "보존"이라는 용어는 추출된 핵산을 추가 분석에 적합한 포맷으로 유지시키는 것과 관련하여 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로, 핵산은 고체 핵산 추출 매트릭스에 저장 또는 보존될 수 있으며, 여기서 매트릭스는 분자의 완전성을 확실히 유지시킨다.

일부 실시양태에서, 핵산 추출 매트릭스는 고체상 추출 매트릭스이다. 고체상 추출 방법이 사용되는 경우, 매트릭스는 본원에서 고체상 추출 매트릭스로서 지칭된다. 고체상 추출 (SPE) 기술은 서열분석 및 다른 적용을 위하여 고순도 핵산의 추출 횟수를 감소시키기 위해 차입되어 왔다. 고체상 추출은 동일 유형, 또는 상이한 유형의 하나 이상의 분자를 물질로부터 단리시키기 위해 고체상 및 액체상을 사용하는 추출 방법이다. 고체상 추출 매트릭스는 예를 들어, 크로마토그래피 또는 다른 분석 방법의 상류에서 샘플을 정제하는 데 사용된다. 일반적 경향의 상기 방법의 예는 샘플 (예컨대, 생물학적 샘플)을 고체상 추출 매트릭스 상에 로딩하고, 주변 온도에서 매트릭스를 저장하여 실질적으로 건식 상태가 되게 만들고, 매트릭스를 적합한 완충제로 재수화시켜 RNA를 매트릭스로부터 차별적으로 추출하는 단계를 포함한다.

"추출"이라는 용어는 샘플, 더욱 특히, 생물학적 샘플로부터 핵산을 분리하고, 단리시키는 임의의 방법을 의미한다. 핵산, 예컨대 RNA 및 DNA는 예를 들어, 세포 용해에 의해 유리될 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산은 증발식 세포 용해 동안 유리될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 세포 시약을 포함하는 매트릭스와의 접촉시에 용해된다. 예를 들어, FTA™ 엘루트(Elute) 셀룰로스 종이를 사용하여 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 매트릭스와 접촉시키면, 세포는 핵산을 유리시킨다.

고체 매트릭스는 다공성일 수 있다. 한 실시양태에서, 고체 매트릭스는 다공성 셀룰로스 종이, 예컨대 와트만(Whatman)™으로부터의 셀룰로스 매트릭스이다. 한 예에서, 와트만™으로부터의 셀룰로스 매트릭스는 903-셀룰로스, FTA™ 또는 FTA™ 엘루트를 포함한다.

하나 이상의 예에서, 추출 매트릭스에는 하나 이상의 시약이 함침된다. 언급된 바와 같이, 예시적인 실시양태에서, 매트릭스는 건식 상태로 함침된 하나 이상의 단백질 변성제를 포함한다. 한 실시양태에서, 매트릭스는 하나 이상의 산 또는 산-적정된 완충제 시약을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 매트릭스는 하나 이상의 환원제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 함침되는 시약은 용해 시약, 핵산 안정화 시약, 핵산 저장용 화학 물질 및 그의 조합을 포함한다.

일부 실시양태에서, 매트릭스에 함침된 건조된 시약은 완충제, 물 또는 샘플을 첨가함으로써 수화된다. 한 실시양태에서, 함침된 건조된 시약은 핵산의 추출 또는 저장을 위해서 매트릭스 상에 배치된 샘플, 더욱 구체적으로 생물학적 샘플에 의해 수화된다. 일부 다른 실시양태에서, 샘플 이외에도, 매트릭스를 수화시키고, 매트릭스 내에 포매되어 있는 시약을 재구성하거나, 활성화시키기 위해 물 또는 완충제가 첨가된다. 일부 실시양태에서, 매트릭스의 수화는 매트릭스 상에 산성 pH를 생성시킨다. 일부 실시양태에서, 수화는 추가로 매트릭스 중에 건조된 형태로 존재하는 시약, 예컨대 단백질 변성제, 산 또는 산-적정된 완충제 시약을 재구성시킨다.

하나 이상의 실시양태에서, 매트릭스는 단백질 변성제를 포함한다. 단백질 변성제는 카오트로픽제 또는 세제를 포함할 수 있다. 특정 변성제로 제한하고자 하지 않으면서, 단백질 변성제는 그의 생물리학적 특성 및 생물학적 효소 활성 (예컨대, RNase)을 완전하게 억제시킬 수 있는 능력에 따라 약한 변성제 또는 강한 변성제로서 분류될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약한 단백질 변성제 (예컨대, 세제)는 핵산은 변성시키지 않으면서, 세포를 용해시키고, 단백질-단백질 상호작용을 파괴시키는 데 사용될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 강한 단백질 변성제 (예컨대, 카오트로픽 염) 사용은 또한 세포 및 단백질을 변성시키는 것 이외에도 핵산의 2차 구조를 변성시킬 수 있다. 다수의 단백질 변성제가 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 이는 본원에 기술된 조성물 및 방법에서 사용하기 위해 선택될 수 있다. 특정 단백질 변성제로 제한하고자 하지 않으면서, 예시적인 단백질 변성제는 구아니디늄 티오시아네이트, 구아니디늄 히드로클로라이드, 소듐 티오시아네이트, 포타슘 티오시아네이트, 아르기닌, 소듐 도데실 술페이트 (SDS), 우레아 또는 그의 조합을 포함한다. 예시적인 세제는 이온성 세제, 비이온성 세제, 또는 쯔비터이온성 세제로서 분류될 수 있다. 이온성 세제는 음이온성 세제, 예컨대 소듐 도데실술페이트 (SDS) 또는 양이온성 세제, 예컨대 에틸 트리메틸 암모늄 브로마이드를 포함할 수 있다. 세포용 비이온성 세제에 대한 비제한적인 예는 트리톤X-100, NP-40, Brij 35, Tween 20, 옥틸 글루코시드, 옥틸 티오글루코시드 또는 디기토닌을 포함한다. 일부 쯔비터이온성 세제는 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트 (CHAPS) 및 3-[(3-콜아미도프로필) 디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판술포네이트 (CHAPSO)를 포함할 수 있다.

하나 이상의 실시양태에서, 단백질 변성제는 티오시아네이트 염을 포함한다. 매트릭스의 하나 이상의 실시양태는 건식 상태로 함침된 산-적정된 티오시아네이트 염을 포함한다. 예시적인 티오시아네이트 염은 구아니디늄 티오시아네이트, 소듐 티오시아네이트, 포타슘 티오시아네이트 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

추출 매트릭스는 생물학적 샘플로부터의 RNA 추출 이후, RNA의 안정성 및 완전성을 원하는 수준으로 유지시킨다. 한 실시양태에서, 매트릭스에는 핵산 안정화 시약이 함침된다. 이러한 안정화 시약은 RNAse 억제제, 산-적정된 완충제, 또는 킬레이트화제 (예컨대, EDTA)를 포함할 수 있다. 조성물은 자외선 (UV) 억제제 또는 자유 라디칼 스캐빈저를 추가로 포함할 수 있다.

언급된 바와 같이, 매트릭스는 RNase 억제제를 추가로 포함하며, 여기서 RNase 억제제는 바나딜 리보뉴클레오시드 복합체 (VRC), 뉴클레오티드 유사체, 또는 상업적으로 이용가능한 RNase 억제제 (예컨대, SUPERase-In™)를 포함한다. RNAse 억제제는 피로포스페이트 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 이염기성 소듐 피로포스페이트가 RNase-억제제로서 사용될 수 있다. RNAse 억제제의 하나 이상의 실시양태는 트리포스페이트 염, 예컨대 소듐 트리포스페이트를 추가로 포함할 수 있다. 한 예에서, 소듐 피로포스페이트를 산-적정된 완충제에 첨가하면, 액체 상태 및 건식 포맷, 둘 모두의 RNA의 안정성은 증진된다.

매트릭스의 실시양태는 건식 상태의 산 또는 산-적정된 완충제 시약을 포함하며, 이는 핵산 추출 동안 재수화될 수 있다. 산의 예는 아세트산, 시트르산, 타르타르산, 인산, 염산, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀-염산 (TCEP-HCl), 산화된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀-염산 (TCEP-O-HCl), 황산, 질산, 바닐산, 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산, 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 언급된 바와 같이, 매트릭스는 추출하고, 추출된 핵산을 안정화시키는 산성 pH를 수화시에 제공하며, 수화는 샘플, 물 또는 임의의 다른 용액 (예컨대, 완충제 용액)을 첨가함으로써 달성될 수 있다. 매트릭스의 하나 이상의 실시양태는 수화시에 2 내지 7 범위의 pH를 제공한다. 일부 실시양태에서, 매트릭스는 수화시에 3 내지 6 범위의 pH를 제공한다.

추출된 핵산, 특히, RNA는 하기 표 IV에 제시된 바와 같이, 산성 조건하에서 안정화된다. 한 실시양태에서, 산-적정된 완충제는 구아니딘 티오시아네이트를 포함한다. 2 내지 7의 산성 pH에서, 더욱 특히, 3 내지 6의 pH에서, 건식 고체 매트릭스 상의 산성 범위의 구아니딘 티오시아네이트 및 소듐 피로포스페이트로 이루어진 건식 상태의 혼합물은 도 4의 RIN 점수로 제시된 바와 같이, 주변 온도에서 건조된 혈반 중 고품질 RNA를 안정화시킨다. 한 실시양태에서, 산-적정된 완충제는 구아니딘 티오시아네이트를 포함하며, 2 내지 7의 산성 pH에서, 더욱 특히, 3 내지 6의 pH에서, 건식 고체 매트릭스 중 소듐 트리포스페이트의 존재는 도 4의 RIN 점수로 제시된 바와 같이, 고품질 RNA를 안정화시킨다.

언급된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 매트릭스는 UV 보호제, 자유 라디칼 스캐빈저, 킬레이터 또는 그의 조합을 추가로 포함한다. 임의의 구체적인 UV 보호제로 제한하고자 하지 않으면서, 예시적인 항산화제는 예를 들어, 히드로퀴논 모노메틸 에테르 (MEHQ), 히드로퀴논 (HQ), 톨루히드로퀴논 (THQ), 및 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항산화제는 THQ이다.

일부 실시양태에서, 매트릭스는 디티오트레이톨 (DTT), 2-메르캅토에탄올 (2-ME), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 환원제를 추가로 포함한다.

추출된 핵산은 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 그의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, 추출된 핵산은 RNA를 포함한다. RNA는 mRNA, tRNA, rRNA, 소형 RNA, siRNA, miRNA, 비-코딩 RNA, 동물 RNA, 식물 RNA, 바이러스 RNA 또는 박테리아 RNA일 수 있다.

매트릭스는 실질적으로 무손상 조건하의 주변 온도에서 핵산을 건식 포맷으로 저장하도록 구성된다. RNA 상태는 RNA의 품질 또는 RNA의 완전성을 의미한다. RNA의 안정성 및 품질은 mRNA 표적의 정량적 RT-PCR 증폭; 총 세포 RNA의 벌크를 손상시키는 28s:18s 리보솜 RNA (rRNA)의 비, 및 애질런트 2100 바이오애널라이저 상에서 수행되는 RIN 분석을 기반으로 평가될 수 있다. 언급된 바와 같이, RNA 품질은 28S 및 18S 리보솜 RNA 강도 값의 비로서 측정되며, 여기서 비는 추출된 rRNA의 겔 전기영동 후, 에테디움 브로마이드 염색을 수행함으로써 28S 및 18S rRNA의 강도를 수득하여 계산된다. 고품질의 세포 RNA는 일반적으로 1 초과의 28s:18s rRNA 비를 나타낸다. 또한, 고품질의 세포 RNA는 존재비가 낮은 mRNA 및 크기가 큰 (예컨대, 1 kB 초과인) mRNA, 둘 모두의 효율적인 증폭을 지지한다. 편의 목적을 위해, 겔 전기영동에 의해 강건한 RNA 저장 특성을 갖는 샘플을 신속하게 스크리닝하고 확인하는 데 rRNA 신호 강도 및 28s:18s rRNA 비가 빈번하게 사용된다.

언급된 바와 같이, 한 실시양태에서, RNA 품질은 바이오애널라이저를 통한 추출된 RNA의 모세관 전기영동에 의해 측정된다. 관례상, RNA 품질은 RIN으로서 정량화되며, 여기서 RIN은 추출된 RNA 내에 존재하는 다양한 RNA의 양의 알고리즘적 평가에 의해 계산된다. 고품질의 세포 RNA는 일반적으로 10에 근접한 RIN 값을 보인다. 하나 이상의 실시양태에서, 건식 매트릭스로부터 추출된 RNA는 4 이상의 RIN 값을 가진다. 일부 실시양태에서, 매트릭스는 주변 조건하에서의 생체샘플의 추출 및 안정화를 제공하고, RIN 값이 4 내지 10 범위인 무손상의 고품질 RNA를 제조하거나, 또는 한 실시양태에서, RIN 값은 5 내지 8 범위이다.

샘플로부터 핵산을 추출하고 저장하는 방법의 예는 단백질 변성제 및 산 또는 산-적정된 완충제 시약을 포함하는 고체 매트릭스 상에 샘플을 제공하는 단계, 샘플 또는 외부에서 첨가된 임의의 액체로 고체 매트릭스를 수화시켰을 때, 샘플로부터의 핵산의 추출을 위해 산성 pH를 생성하는 단계, 추출된 핵산을 포함하는 매트릭스를 건조시키는 단계, 및 매트릭스 상의 추출된 핵산을 주변 온도에서 실질적으로 건식 상태로 저장하는 단계를 포함한다. "샘플을 제공하는"이라는 용어의 비제한적인 예는 피펫, 카테터, 시린지 또는 도관을 이용하여 추출 매트릭스 상에 샘플을 적용시키거나, 샘플을 배치하는 것을 포함한다. 샘플을 매트릭스 상에 주입할 수도 있다.

본 방법은 추출된 핵산을 매트릭스 상에서 건식 상태로 주변 온도에서 저장하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산을 1개월 초과의 기간 동안 저장할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산을 6개월 초과의 기간 동안 저장할 수 있다. RNA는 일반적으로는 쉽게 분해되기 때문에, 매트릭스를 사용하여 RNA를 추출 및 보존하는 것이 유용하고, 이는 추가로 다양한 하류 적용을 위해 사용될 수 있다.

본 방법의 하나 이상의 실시양태는 고체상 추출 기법에 의해 매트릭스로부터 핵산을 회수하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 실시양태에서, 매트릭스를 수용액, 완충제, 또는 유기 용액 중에서 재수화시킴으로써 고체 매트릭스로부터 핵산을 회수하고, 여기서 핵산은 추가 분석된다. 샘플 (예컨대, 정제되지 않은 생물학적 샘플)로부터 핵산, 특히, RNA를 추출할 수 있는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 상기 기술된 방법은 임의적으로 추가 분석을 위하여 핵산을 고체 매트릭스로부터 회수하기 이전에 매트릭스를 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산을 회수하기 이전에 매트릭스를 적합한 완충제 또는 물로 1회 이상 동안 세척할 수 있다. 고체 매트릭스 (예컨대, 셀룰로스 종이)를 상기 정의된 바와 같이, 수용액, 완충제 용액, 또는 유기 용액 중에서 재수화시킴으로써 핵산을 회수할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전기용리에 의해 핵산을 고체 매트릭스로부터 회수한다.

한 실시양태에서, 핵산 (예컨대, RNA, DNA, 또는 그의 조합)을 추출 및 보존하는 방법은 고체 매트릭스를 제공하는 단계로서, 여기서 조성물은 고체 매트릭스 내에 건식 포맷으로 혼입된 1종 이상의 단백질 변성제, 산 또는 산-적정된 완충제 시약, 및 임의적으로 자유 라디칼 스캐빈저를 포함하는 것인 단계; 샘플 (예컨대, 생물학적 샘플)을 고체 매트릭스에 적용시켜 산성 pH하에서 핵산을 추출하는 단계; 및 고체 매트릭스 상의 핵산을 주변 온도에서 실질적으로 건식 상태로 저장하는 단계를 포함한다.

본 방법의 특정 예에서, 매트릭스는, 저장하기가 불안정한 생체분자인 것으로 널리 알려져 있는 핵산, 특히 RNA가 주변 온도에서 건식 포맷으로 (예컨대 고체 매트릭스 상에서) 저장되도록 한다. 본 방법에서 사용되는 샘플은 인간을 비롯한, 임의의 유기체로부터 수득된 생물학적 샘플, 예컨대 혈액, 혈청, 조직, 및 타액을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

실시예

시약: 31-ETF는 GE 헬스케어(GE Healthcare)로부터 입수하였다. TCEP는 솔텍크 바이오 사이언스(Soltec Bio Science: 미국 매사추세츠주 베벌리)로부터 입수하고, MOPS는 알드리치(Aldrich: 미국 미주리주)로부터 구입하였다.

실시예 1. TCEP의 산화에 의한 TCEP -O 제조

환원 활성이 건조된 생체샘플 중 RNA 보존에 미치는 기여를 분석하기 위하여 TCEP를 TCEP-O로 산화시켰다. 대략 1 g의 TCEP를 25 mL의 30% 과산화수소에 용해시키고, 수산화나트륨을 이용하여 용액의 pH를 8.0으로 조정하였다. 반응 혼합물을 산화 반응이 완료될 때까지 3시간 동안 인큐베이션시키고, 후속 분석을 위해 생성물을 오븐에서 건조시켰다. P³¹ NMR을 통해 TCEP 참조와 비교하여 반응 생성물 중의 TCEP 손실량을 확인하였다. 항산화제 THQ의 존재하에서 상기 산화 반응을 반복하였고, 유사한 결과를 얻었다. 본 결과는 도 1에 제시되어 있다.

실시예 2 TCEP -O로 코팅된 건식 매트릭스 상에서의 환원 활성 손실 확인

간단한 침지 코팅 공정을 사용하여 TCEP 또는 TCEP-O를 함유하는 용액 중에서 종이 샘플을 제조하였다. 간략하게, 코팅 용액을 하기 표 I에 기술되어 있는 바와 같이 제조하였다. 대조군 샘플인 25-1에서는 pH 3.5인 최종 용액을 수득하였으며, 모든 다른 샘플을 HCl을 이용하여 pH 3.5로 조정하였다. 31-ETF 셀룰로스 종이를 각각의 코팅 용액 내에 침지시키고, 완전히 포화된 이후에 종이를 닙 롤러를 통해 통과시켜 과량의 용액을 제거하였다. 이어서, 종이 샘플을 오븐에서 건조시키고, 건조제와 함께 마일러(Mylar) 호일 백에 패키징하고, 사용시까지 4℃에서 저장하였다.

[표 I]

TCEP 또는 TCEP-O를 함유하는 종이 샘플 제조

샘플 제조 후, DTNB 비색 검정법을 이용하여 종이의 환원 활성을 분석하였다. 1 mM DTNB 작업용 용액을 물 중 2.5 mM 스톡 용액으로부터 PBS 중에서 제조하였다. 표 I에 기술된 각 종이로부터 (직경인 3 mm인) 샘플 펀치를 코어링하고, 5 mL의 DTNB 작업용 용액 내에 침지시키고, 30분 동안 진탕시켰다. 이어서, 생성된 용액 중 TNB (티오비스-(2-니트로벤조산)을 412 nm에서의 UV 흡광도에 의해 측정하였고, 이는 도 2에 제시되어 있다. TCEP-O를 함유하는 샘플 25-3 및 27-6은 DTNB에서 TNB로의 환원을 보이지 않았고, 이는 환원력의 손실을 나타내는 것이다. TCEP를 함유하는 샘플 25-1 및 27-5는 DTNB 비색 검정법을 사용하였을 때, DTNB를 TNB로 전환시킴으로써 강력한 환원 활성을 보였다. 본 결과를 통해 실시예 1의 이전 NMR 분석 결과를 확인할 수 있었다.

실시예 3- 건조된 혈반으로부터의 RNA 안정성 분석

표 I에 기술된 바와 같이, 실시예 2로부터의 샘플에 전혈을 점적하고, 실온에서 RNA를 안정화시킬 수 있는 능력에 대하여 시험하였다. 50 μL의 래트의 전혈을 시험 동물의 꼬리 정맥으로부터 수집하고, 이를 샘플 25-1, 25-3, 27-5, 및 27-6 상에 점적하였다. 혈반을 대기 건조시키고, 주변 온도에서 제어식 습도하에 (~20% RH) 5일 (25-1, 25-3) 또는 12일 (27-5, 27-6) 동안 저장하였다. 베타-메르캅토에탄올로 강화된 RLT 용해 완충제 (퀴아젠(Qiagen))을 이용하여 7 mm 센터 펀치로부터 RNA를 추출하고, 관련 기술분야에 공지된 프로토콜에 따라 종래 실리카 막 회전 칼럼을 사용하여 정제하였다 (예컨대, 퀴아젠 QIAamp RNA 혈액 키트). 뉴클레아제 무함유 물을 이용하여 회전 칼럼으로부터 정제된 RNA를 용리시키고, RNA 6000 피코 랩칩스(RNA 6000 Pico LabChips)를 이용하여 애질런트 2100 바이오애널라이저 상에서 각 샘플에 대한 RIN을 측정하였다. 관례상, RIN > 6인 것이 고품질 RNA임을 나타내고, 정량적 하류 분석, 예컨대 RT-PCR 또는 마이크로어레이 적용에 고도로 바람직할 수 있다.

언급한 바와 같이, RNA 6000 피코 랩 칩스를 이용하여 애질런트 2100 바이오애널라이저에 의해 표 1에 열거된 각 조성물에 대하여 RIN 값을 측정하였고, 데이터는 도 3에 제시되어 있다. 예상밖으로, TCEP-O를 함유하는 샘플은 TCEP를 함유하는 것과 유사한 RNA 완전성을 제공하였다. RIN 점수는 완전히 산화된 TCEP의 것보다 (샘플 25-3, 27-6) TCEP 존재하의 것 (샘플 25-1, 27-5)이 단지 약간 더 높았다. TCEP-HCl을 함유하는 대조군 제제인 25-1의 천연 pH 종점을 모사하기 위하여 모든 샘플이 최종 pH 3.5로 적정된 코팅 용액으로부터 제조되었기 때문에, 상기와 같은 현상은 산성 pH에 의존하는 것일 수 있다.

실시예 4- 산성 또는 염기성 pH 프로파일에서의 대안적 화학법의 기판 제조

상이한 용액 pH에서 산, 항산화제, 카오트로픽 염, 세제, 및 피로포스페이트 또는 폴리포스페이트 염으로 이루어진 상이한 혼합물이 미치는 효과를 조사하기 위해 실시예 4를 디자인하였다. 상기 기술된 바와 같이 간단한 침지 코팅 공정을 사용하여 종이 샘플을 제조하였다. 간략하게, 코팅 용액을 하기 표 II에 기술되어 있는 바와 같이 제조하였다. 31-ETF 셀룰로스 종이를 각각의 코팅 용액 내에 침지시키고, 완전히 포화된 이후에 종이를 닙 롤러를 통해 통과시켜 과량의 용액을 제거하였다. 이어서, 종이 샘플을 오븐에서 건조시키고, 사용시까지 건조제와 함께 마일러 호일 백에 패키징하였다.

[표 II]

산성 또는 염기성 pH 프로파일에서의 종이 샘플 제조: 산

[표 III]

산성 또는 염기성 pH 프로파일에서의 종이 샘플 제조: 폴리포스페이트 및 피로포스페이트 염

실시예 5- 대안적 화학법에서의 건조된 혈반으로부터의 RNA 안정성 분석

표 II 및 표 III에 기술된, 실시예 4로부터의 샘플에 전혈을 점적하고, 주변 온도에서 RNA를 안정화시킬 수 있는 능력에 대하여 시험하였다. 50 μL의 래트의 전혈을 시험 동물의 꼬리 정맥으로부터 수집하고, 이를 종이 샘플 상에 직접 점적하였다. 혈반을 건조시키고, 주변 온도에서, 단, 제어식 습도에서 (~20% RH) 5, 6 또는 12일 동안 저장하였다. 용해 완충제로 7 mm 센터 펀치로부터 RNA를 추출하고, 관련 기술분야에 공지된 프로토콜에 따라 실리카 막 회전 칼럼을 통해 정제하였다. 정제 및 용리시킨 후, RNA 6000 피코 랩 칩스를 이용하여 애질런트 2100 바이오애널라이저 상에서 RIN을 측정하였다. RIN > 6인 것이 고품질 RNA임을 나타내고, 정량적 하류 분석, 예컨대 RT-PCR 또는 마이크로어레이 적용에 바람직할 수 있다.

실시예 5의 결과는 도 4에 제시되어 있다. 비록 RIN 점수에 기초하였을 때 특정 제제가 다른 것에 비하여 바람직할 수 있지만, 산-적정된 카오트로픽 염 또는 세제 조성물은 건조된 혈반으로부터 적당한 품질로 RNA를 수득하였다는 것을 발견할 수 있었다. 예를 들어, 샘플 28-2 및 28-5는 구아니듐 티오시아네이트 (GuSCN)를 함유하고, 이는 각각 아세트산 및 타르타르산 중 pH 3.5에서 RIN 값 7.8 및 7.0을 보였다. 아세트산 (7.8) 및 타르타르산 (7.0)의 RIN 값은 pH 3.5에서 시트르산 (샘플 28-4, RIN 5.8) 및 인산 (샘플 28-3, RIN 4.9) 중의 같은 조성물의 것보다 더 높은 값이었다. 특히, 피로포스페이트 또는 트리포스페이트 염의 효능은 카오트로픽제의 존재하에서 RNA를 안정화시키는 데 있어 뚜렷한 pH 의존성을 보였고, 전반적인 산성 pH가 매우 높은 RIN 점수를 제공하였다. 중성 pH로 적정된 동일 제제의 경우, RNA가 심각하게 분해된 결과가 나타났다. 예를 들어, pH 3.5에서 구아니디늄 티오시아네이트 (GuSCN) 또는 소듐 티오시아네이트 (NaSCN) 및 소듐 트리포스페이트로 코팅된 샘플 27-10 및 28-6은 pH 7.2에서 같은 시약을 함유하는 샘플 26-11 및 28-7과 비교하였을 때, 각각 7.1 및 7.0인 높은 RIN 값을 보였다. 유사하게, 샘플 27-11 및 26-12는 GuSCN 및 소듐 피로포스페이트를 함유하고, 이는 각각 pH 3.5에서는 RIN 값 6.7, 및 pH 7.2에서는 RIN 값 1.6을 보였다. 피로포스페이트 및 트리포스페이트 모이어티는 일반적으로 소형 분자 RNase 억제제인 것으로 이해되며, 건식 상태에서의 pH 의존적 작용 기전은 직관적이지 않다.

실시예 6- RIN 수행능과 고체 매트릭스 pH와의 상관관계

실시예 1 (표 I에 기술된), 및 실시예 4 (표 II 및 표 III에 기술된)로부터의 샘플을 사용하여 고체 매트릭스의 pH를 측정하고, 생물학적 RIN 수행능과 비교하였다. 고체 매트릭스 pH를 측정하기 위해, 각 종이로부터 9개의 펀치 (7 mm 원형)을 코어링하고, 1 mL 물에 침지시켰다. 고전단 실험실용 균질기를 이용하여 펀치를 펄프 내에 균질화시키고, pH 테스트 스트립으로 수성상의 pH를 측정하였다.

실시예 6의 결과는 하기 표 IV에 기재되어 있다. 비록 특정 제제가 다른 것에 비하여 더 바람직할 수는 있지만, 본 용액으로 코팅된 각 건식 고체 매트릭스의 pH는 일반적으로 상기 용액의 원래의 pH로부터 유지되었다. 특정 이론으로 한정하지 않으면서, 본 결과를 통해, 주변 조건하에서 수일 동안 저장된 후 산성 pH 하의 조성으로부터 유래된 RNA 샘플에 대한 RIN 값이 4 이상이었기 때문에, 산성 pH를 띠는 고체 매트릭스가 건조된 혈반으로부터 적당한 품질의 RNA를 수득할 수 있다는 것이 확인되었다.

[표 IV]

산성 또는 염기성 pH에서 및 주변 조건하에서의 상이한 매트릭스 조성에 대한 RIN 값

본원에서는 본 발명의 특정 특징만이 예시되고, 기술되었지만, 통상의 기술자는 다수의 수정 및 변형을 떠올릴 수 있을 것이다. 그러므로, 상기와 같은 모든 수정 및 변형이 본 발명의 범위 내에 포함되며, 첨부된 청구범위는 그를 포함하고자 하는 것임을 이해하여야 한다.

Claims (42)

1. 건식 상태로 함침된
   1종 이상의 단백질 변성제 및
   1종 이상의 산 또는 산-적정된 완충제 시약
   을 포함하는 고체 매트릭스이며,
   여기서 매트릭스는 수화시에 산성 pH를 제공하고, 샘플로부터 핵산을 추출하고, 핵산을 주변 온도에서 실질적으로 건식 상태로 보존하도록 구성된 것인 고체 매트릭스.
2. 제1항에 있어서, 고체상 추출 매트릭스인 매트릭스.
3. 제1항에 있어서, 추출 및 보존된 핵산이 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 그의 조합을 포함하는 것인 매트릭스.
4. 제1항에 있어서, 추출 및 보존된 핵산이 RNA를 포함하는 것인 매트릭스.
5. 제4항에 있어서, 추출 및 보존된 RNA가 4 이상의 RNA 완전성 수치 (RIN)를 갖는 것인 매트릭스.
6. 제1항에 있어서, 산이 아세트산, 시트르산, 타르타르산, 인산, 염산, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀-염산 (TCEP-HCl), 산화된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀-염산 (TCEP-O-HCl), 황산, 질산, 바닐산, 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 또는 그의 조합을 포함하는 것인 매트릭스.
7. 제1항에 있어서, 산-적정된 완충제 시약이 2 내지 7 범위의 pH를 생성하는 것인 매트릭스.
8. 제1항에 있어서, 산-적정된 완충제 시약이 3 내지 6 범위의 pH를 생성하는 것인 매트릭스.
9. 제1항에 있어서, UV 보호제, 자유 라디칼 스캐빈저, 킬레이터 또는 그의 조합을 추가로 포함하는 매트릭스.
10. 제9항에 있어서, UV 보호제 또는 자유 라디칼 스캐빈저가 히드로퀴논 모노메틸 에테르 (MEHQ), 히드로퀴논 (HQ), 톨루히드로퀴논 (THQ), 및 아스코르브산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 매트릭스.
11. 제1항에 있어서, RNase 억제제를 추가로 포함하는 매트릭스.
12. 제11항에 있어서, RNase 억제제가 트리포스페이트 염, 피로포스페이트 염 또는 그의 조합을 포함하는 것인 매트릭스.
13. 제11항에 있어서, RNase 억제제가 바나딜 리보뉴클레오시드 복합체 (VRC), 소듐 피로포스페이트, 뉴클레오티드 유사체, 또는 상업적으로 이용가능한 RNase 억제제를 포함하는 것인 매트릭스.
14. 제11항에 있어서, RNase 억제제가 소듐 트리포스페이트를 포함하는 것인 매트릭스.
15. 제1항에 있어서, 1종 이상의 환원제를 추가로 포함하는 매트릭스.
16. 제15항에 있어서, 환원제가 디티오트레이톨 (DTT), 2-메르캅토에탄올 (2-ME), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP-HCl) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 매트릭스.
17. 제1항에 있어서, 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 니트로셀룰로스, 유리 섬유 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 매트릭스.
18. 제1항에 있어서, 다공성인 매트릭스.
19. 제1항에 있어서, 단백질 변성제가 구아니디늄 히드로클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 소듐 티오시아네이트, 포타슘 티오시아네이트, 아르기닌, 소듐 도데실 술페이트 (SDS), 우레아 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 매트릭스.
20. 제1항에 있어서, 샘플이 생물학적 샘플인 매트릭스.
21. 건식 상태로 함침된
    카오트로픽제, 세제 또는 그의 조합을 포함하는 단백질 변성제 및
    산 또는 산-적정된 완충제 시약
    을 포함하는 RNA 추출 매트릭스이며,
    여기서 매트릭스는 RNA의 추출을 위해 수화시에 2 내지 7 범위의 pH를 제공하고, 추출된 RNA를 4 이상의 RIN으로 안정화시키도록 구성된 다공성 비-용해성 건식 물질인 RNA 추출 매트릭스.
22. 제21항에 있어서, MEHQ, HQ, THQ, 아스코르브산 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 UV 보호제 또는 자유 라디칼 스캐빈저를 추가로 포함하는 매트릭스.
23. 건식 상태로 함침된
    카오트로픽제, 세제 또는 그의 조합을 포함하는 단백질 변성제,
    산 또는 산-적정된 완충제 시약 및
    트리포스페이트 염 또는 피로포스페이트 염을 포함하는 RNase 억제제
    를 포함하는 RNA 추출 매트릭스이며,
    여기서 매트릭스는 수화시에 2 내지 7의 pH를 제공하고, RNA를 4 이상의 RIN 값으로 안정화시키도록 구성된 다공성 비-용해성 건식 물질을 포함하는 것인 RNA 추출 매트릭스.
24. 단백질 변성제 및 산 또는 산-적정된 완충제 시약을 포함하는 건식 고체 매트릭스 상에 샘플을 제공하는 단계;
    샘플로부터의 핵산의 추출을 위해 수화시에 산성 pH를 생성하는 단계;
    추출된 핵산을 포함하는 매트릭스를 건조시키는 단계; 및
    매트릭스 상의 추출된 핵산을 주변 온도에서 실질적으로 건식 상태로 저장하는 단계
    를 포함하는, 샘플로부터 핵산을 추출하고 저장하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 매트릭스로부터 핵산을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
26. 제25항에 있어서, 매트릭스로부터 핵산을 회수하는 단계가 매트릭스를 수용액, 완충제, 또는 유기 용액 중에서 재수화시키는 것을 포함하는 것인 방법.
27. 제25항에 있어서, 매트릭스로부터 핵산을 회수하는 단계가 전기용리를 포함하는 것인 방법.
28. 제24항에 있어서, 샘플이 생물학적 샘플인 방법.
29. 제28항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액, 혈청, 조직, 타액, 또는 세포를 포함하는 것인 방법.
30. 제28항에 있어서, 샘플이 세포 추출물, 조직 배양 세포 시료, 불순한 핵산 또는 정제된 핵산인 방법.
31. 제24항에 있어서, 추출된 핵산이 RNA, DNA 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
32. 제24항에 있어서, 추출된 핵산이 RNA을 포함하는 것인 방법.
33. 제32항에 있어서, 추출된 RNA가 4 이상의 RIN을 갖는 것인 방법.
34. 제24항에 있어서, 매트릭스가 UV 보호제, 자유 라디칼 스캐빈저, 킬레이터 또는 그의 조합을 추가로 포함하는 것인 방법.
35. 제34항에 있어서, UV 보호제 또는 자유 라디칼 스캐빈저가 MEHQ, HQ, THQ, 및 아스코르브산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
36. 제24항에 있어서, 산성 pH가 2 내지 7 범위인 방법.
37. 제24항에 있어서, 매트릭스가 RNase 억제제를 추가로 포함하는 것인 방법.
38. 제24항에 있어서, 매트릭스가 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 유리 섬유 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
39. 제24항에 있어서, 매트릭스가 다공성 셀룰로스 종이를 포함하는 것인 방법.
40. 제24항에 있어서, 단백질 변성제가 구아니디늄 히드로클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 소듐 티오시아네이트, 포타슘 티오시아네이트, 아르기닌, SDS, 우레아 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
41. 제24항에 있어서, 매트릭스가 DTT, 2-ME, TCEP, tTCEP-HCl 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 환원제를 추가로 포함하는 것인 방법.
42. 제24항에 있어서, 산이 아세트산, 시트르산, 타르타르산, 인산, 염산, TCEP-HCl, TCEP-O-HCl, 황산, 질산, 바닐산, 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.

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