CN108350435B - Rna病毒的收集装置和方法 - Google Patents

Abstract

本公开主要涉及用于在环境条件下灭活和干燥储存含有RNA病毒的生物样品的方法和装置。还提供用于从生物样品收集和回收RNA并随后分析病毒的方法。

Description

RNA病毒的收集装置和方法

序列表

本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且特此通过参照以其全部结合。在2015年11月17日创建的所述ASCII拷贝被命名为283554-1_SL.txt，并且大小为1602字节。

背景

RNA病毒，并且更具体地讲为其核酸，由于化学自水解和酶介导的降解两者而为最难以稳定的生物分子之一。样品储存的温度通常为RNA病毒样品质量的关键决定因素，因此，含有RNA病毒的样品一般地以冷藏状态(即4℃或更低)保持和运输。进一步地，如果不能使样品失活，处理含有病毒的样品由于病毒感染的风险而不安全。

因此，目前用于在环境条件下以液态保存核酸比如RNA的方法学已集中于通过使用例如洗涤剂、离液化合物(chaotropic compound)、还原剂、过渡金属、有机溶剂、螯合剂、蛋白酶、RNA酶肽抑制剂和抗RNA酶抗体使RNA酶失活。为了防止转酯作用和自水解，另外的努力已集中于化学修饰RNA。

大部分市售可用的RNA保存产品仅能在室温下以液态保存RNA数天或数周。声称以干燥形式成功收集和保存RNA的技术一般地需要在储存RNA之前首先将RNA从生物材料(例如生物样品，比如血液、血清、组织、唾液等)“预纯化”并浓缩。

因此，将从生物样品提取核酸、稳定和储存/保存整合在单一过程中的方法和装置为期望的和需要的。进一步地，为了安全处理，病毒的生物灭活也为期望的。这种方法和装置将允许在环境条件下长期储存核酸，并且使得完整核酸能够被快速测试或回收用于进一步分析，而没有与感染性物质相关的繁重处理要求。

简述

本公开主要涉及整合从在干燥固体基质上收集的生物样本提取核酸和稳定的步骤的方法和装置，从而使得能够保存和储存其中使病毒失活的RNA病毒。所收集样品的RNA质量在收集、提取、稳定和储存和/或运输步骤期间得以保持。

在一些实施方案中，在干燥固体基质上于环境状态下储存的RNA可经受处理以便以适合于进一步分析的完整形式从固体基质释放RNA。描述了用于确定样品内RNA病毒存在或不存在的方法。还提供了使用本发明的固体基质用于从生物样品提取和储存核酸的方法。

在一些实施方案中，RNA为存在于例如血液样品中的病毒RNA。

附图简述

当参照附图阅读以下详述时，化学修饰的多孔膜的这些和其他特征、方面和优点将变得更好理解，其中在所有附图中同样的标记表示同样的部件。

图1提供现场收集和运输埃博拉病毒样本的疾病控制中心(CDC)指南(现有技术)的图解说明。

图2A-B提供用于干燥固体基质的一种框架类型的图解说明的实例，图2A为俯视图和图2B为仰视图。

图3为用于包裹干燥固体基质和框架的储存套筒的图解说明。

图4为概述用于灭活和干燥储存含有RNA病毒的生物样品的方法的流程图。

图5为显示在用掺入有活埃博拉病毒的滤纸接种后通过蛋白质印迹法检测EBOVG2蛋白的图解说明。

图6为显示EBOV PFU与通过RT-qPCR从干血斑洗脱液回收和检测的平均总病毒RNA拷贝数关系的图表。

图7为与未储存样品的Trizol提取相比，在环境储存过夜之后从干血斑洗脱液回收的总RNA的Agilent Bioanalyzer电泳图数据和RNA完整性数目(Integrity Number,RIN)的图解说明。

图8为图解说明直接从滤纸上的干血斑无提取地RT-qPCR检测埃博拉病毒RNA的图表。

图9A-C为显示直接从滤纸上的干血斑无提取地等温扩增和检测埃博拉病毒RNA，以证实来自RSM的组合等温逆转录/扩增的电泳凝胶的图像。图9A的A-C列为对照反应，D列另外含有0.5 μl全人血。图9B的E和F列为对照反应，其中E不含模板，而F含有扎伊尔(Zaire)埃博拉病毒RNA。图9C的G和H列为先前已用人血和埃博拉病毒RNA点样的经过洗涤的RSM的反应体积，H列具有扎伊尔埃博拉病毒的额外拷贝，和I列为未洗涤的1 RSM，其用人血和埃博拉病毒RNA点样。

详述

RNA病毒为在其遗传材料中包含核糖核酸(RNA)的病毒。某些称为逆转录病毒的RNA病毒在病毒生命周期期间可进一步将RNA遗传材料转化为DNA。已知数种RNA病毒会引起包括埃博拉病毒出血热、流感、肝炎和西尼罗热在内的严重疾病。涉及疾病的著名逆转录病毒包括HIV。病毒性出血热(VHF)指的是一组由几个不同病毒家族引起的疾病。一般而言，VHF用于描述干扰血液凝结能力的许多感染性疾病之一。引起VHF的病毒属于4个出血性病毒家族：沙粒病毒、丝状病毒、布尼亚病毒和黄病毒。沙粒病毒包括拉沙热病毒和马秋波(Machupo)、Junin、瓜纳里托(Guanarito)和萨比亚(Sabia)出血热病毒。在丝状病毒中有臭名昭著的埃博拉病毒和马尔堡病毒。布尼亚病毒包括裂谷热(RVF)、克里米亚-刚果出血热(CCHF)和汉坦病毒。黄热病和登革热病毒为黄病毒。

VHF为覆盖或包封在脂肪(脂质)覆层中的所有RNA病毒。这些病毒的存活能力取决于动物或昆虫宿主生物体或宿主来源的流体。人在其遭遇感染的宿主时会受到感染。然而，对于这些病毒中的一些，在从天然宿主传播之后，可以通过宿主来源的流体进行人-人传播。由这些病毒引起的出血热的人病例或爆发偶尔发生并且不规则。爆发的发生难以容易地预测。进一步地，只有少数例外，对VHF没有有效的药物治疗，因此VHF的爆发被视为重大公共健康风险。

VHF具有1-10个生物体的感染剂量(infectious dose)，因此具有高传染性。早期检测和隔离为控制爆发的关键。通常，对于VHF，比如埃博拉病毒，病毒仅在症状(通常为发热)发作之后才能在血液中检测到。推荐进行诊断测试，比如实时PCR测试，然而实施病毒测试的设施通常距离遥远，因此针对潜在感染性样品实施特殊的收集、处理和运输方案。

用于收集和运输埃博拉病毒样本的疾病控制中心(CDC)指南显示在图1中，并且代表了目前的技术水平。通常依照CDC指南，4 mL全血的最小收集体积是优选的，并且推荐在2-8℃下运输样品。作为A类感染性物质，使用由包裹有吸收性材料的一级密封容器、二级容器(水密和防泄漏)和外部运输包装组成的三重包装系统。这种三重包装系统确保在样品运输期间含有活的和潜在感染性生物液体。

对于测试感染性样品，存在另外的CDC指南。样品处理方法通常在生物安全级别3(BSL-3)条件下实施，以减少病毒感染性和允许处理从现场接收的活样品。在实施病毒灭活步骤之后，BSL-2条件允许继续样品测试。对于任何病原体的分子诊断，灭活处理应确保感染性的完全丧失，同时保持核酸的完整性用于病毒的适当鉴定。

在某些实施方案中，提供一种用于收集和储存生物样品用于随后的RNA病毒诊断分析的装置。装置包括用于支持所收集的生物样品的经处理的干燥固体基质、用于支持固体基质的框架和用于在收集样品之后包裹框架和干燥固体基质的储存套筒。在某些实施方案中，经处理的干燥固体基质允许自样品的环境提取和储存核酸(例如RNA、DNA或其组合)，其中RNA病毒的存在可通过分析病毒RNA来确定。在进一步的实施方案中，装置包括用于支持过滤膜和经处理的干燥固体基质的框架，目的是在收集点分级分离(fractionate)所收集的生物样品。

术语“提取”指的是用于从样品，更特别的是从生物样品分别或分离核酸的任何方法。核酸比如RNA和DNA可例如通过细胞溶解来释放。在一个实施方案中，核酸可在蒸发性细胞溶解期间释放。在另一个实施方案中，细胞在与包含细胞溶解试剂的基质接触时溶解。使包含细胞的生物样品与基质接触导致细胞溶解，后者释放核酸，例如通过使用FTA^TM Elute纤维素纸。为了清楚起见，描述了用于从干燥固体基底提取、收集、保存和回收核酸的方法。本文使用的提取可指从细胞提取核酸(例如细胞溶解)或在储存之后从基质回收(“基质提取”)。还描述了用于从干燥固体基底无提取地快速测试的方法，其中所收集的核酸不必在分析之前从基质提取。

在一个实施方案中，生物样品中的RNA可通过在样品干燥期间的蒸发性样品细胞溶解，或通过存在浸渍在化学修饰的固体基质内的化合物而释放到干燥固体基质上，所述化合物在与生物样品接触时导致细胞溶解和核酸释放(例如FTA^TM和FTA^TM Elute纤维素纸)。以这种方式，从样品(例如未纯化的生物样品)提取核酸(特别是RNA，并且更具体地讲为病毒RNA)使得核酸可以非纯态保持在经处理的固体基质上和被分析。关于以适合于进一步分析和诊断的形式保持所提取的核酸，术语“储存”或“保存”在本文中可互换使用。

术语“核酸”指的是所有形式的RNA (例如mRNA、miRNA、rRNA、tRNA、piRNA、ncRNA)、DNA (例如基因组DNA、mtDNA)以及重组RNA和DNA分子或者使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可为单链或双链的。链可包括编码或非编码链。天然存在的RNA或DNA分子的核酸片段包括在本发明中，并且可使用所公开的组合物和方法回收。“片段”指的是核酸(例如RNA或DNA)的一部分。在某些实施方案中，目标核酸为病毒的RNA。

在某些实施方案中，干燥固体基质包括(但不限于)基于纤维素的产品、纤维素、乙酸纤维素、玻璃纤维或其任何组合。本申请的固体基质可为多孔的。在特定实施方案中，固体基质为来自Whatman^TM的多孔纤维素纸，比如903、31-ETF、FTA^TM或FTA^TM Elute(GEHealthCare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)。术语膜、纸、纤维素纸、固体基质和基底贯穿本公开可互换使用。

在某些实施方案中，干燥固体基质利用以干态掺入固体基质中的蛋白质变性剂、还原剂、缓冲剂和任选的自由基捕获剂或RNA酶抑制剂处理。在其他实施方案中，经处理的干燥固体基质属于2015年5月26日发布的美国专利9040679中描述的类型，在此以其全部结合。在一个优选的实施方案中，经处理的干燥固体基质属于2015年6月2日发布的美国专利9044738和2015年5月26日发布的美国专利9040675中描述的类型，两者在此以其全部结合。

本领域技术人员将会意识到，存在许多这种方法来完成将组合物掺入到干燥固体基质中以提供经处理的基质。方法包括(但不限于)浸渍、喷涂或湿式分批处理。在将组合物掺入到干燥固体基质中之后，所生成的经处理的固体基质可按照任何合适的方法干燥。

本文定义的“生物样品”包括(但不限于)从任何生物体(包括人)获得的血液、血清、组织、鼻粘液和唾液，或者源自培养细胞的流体。生物样品可由经历自诊断测试(例如血糖监测)的个体或由受训过的医学专业人员通过各种技术获得，所述技术包括例如使用针抽血或者刮擦或擦拭特定区域，比如患者皮肤上的病灶。用于收集各种生物样品的方法为本领域熟知的。在某些实施方案中，生物样品指的是用于鉴定RNA病毒存在情况的诊断目的的样品。在某些实施方案中，RNA病毒为埃博拉病毒。

在某些实施方案中，包含蛋白质变性剂、还原剂和缓冲剂的经处理的固体基质组合物存在于本公开的干燥固体基质中，其可在样品收集和提取步骤期间用生物样品再水合。该组合物可包含一种或多种以上列出的组分中的每一种。组合物可任选地进一步包含紫外线(UV)抑制剂、自由基捕获剂、RNA酶抑制剂、螯合剂或其任何组合。技术人员将会意识到，许多蛋白质变性剂为本领域已知的，并且可根据经验选择用于在此描述的组合物和方法。

示例性的蛋白质变性剂包括(但不限于)硫氰酸胍、盐酸胍、精氨酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素或其任何组合。

不旨在受限于特定的蛋白质变性剂，以下示出示例性蛋白质变性剂的一个示意图：

其中每一个R可独立地为选自氢、含有杂原子的基团或烃基的成员。

含有杂原子的基团为包含一个或多个选自氮、氧、硫、磷、硅和硼的成员的基团。一个目的为使用反应性官能团结合含胍化合物。带有杂原子的典型反应性基团包括环氧基、丙烯酸酯、马来酰亚胺、酰基卤、烷基卤、叠氮化物、氰酸酯、异氰酸酯、芳基卤、醛、胺、肟、硫醇、醇、酸、氮丙啶、偶氮、异硫氰酸酯、酐、混酐、内酯、磺内酯和酮。

烃基为包含碳和氢两者的基团，尽管还可含有杂原子以增强亲水性。一个目的为使用反应性官能团结合含胍化合物。带有烃的典型反应性基团包括烯丙基、苯乙烯基、乙烯基和炔烃。含有杂原子的烃基包括2、3或4-氧基苯乙烯基、氨基烯丙基、氧基烯丙基、氧基乙烯基、氨基乙烯基。X为阴离子，其为含有一个或多个形式负电荷的基团。一个或多个成员选自氯化物、硫氰酸盐、硫酸盐、磷酸盐、溴化物、亚氯酸盐、氯酸盐、硫代硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、甲酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐。预期可使用一种或多种阴离子和可使用带有各种水平(二价、一价、三价)形式电荷的阴离子的组合。阴离子的分子量可从10-100000变化。

在某些实施方案中，蛋白质变性剂为包含IA族或IIA族金属阳离子的金属硫氰酸盐。金属硫氰酸盐包括(但不限于)硫氰酸钠、硫氰酸钾、硫氰酸镁、硫氰酸钙、硫氰酸钡和硫氰酸锌。

术语“还原剂”指的是向另一个化学物类提供电子的化学物类。多种还原剂为本领域已知的，并且下文和权利要求书中提供的示例性列表决不旨在限制可用于本公开的组合物和方法的还原剂。示例性的还原剂包括二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(2-ME)和三(2-羧基乙基)膦(TCEP)及其相关的盐(例如TCEP-盐酸盐)。此外，这些或其他还原剂的任何组合可用于实践本发明。在特定实施方案中，还原剂为TCEP。在特定实施方案中，TCEP可作为其盐酸盐TCEP-HCl加入。

本文使用的缓冲剂包括例如2-氨基-2-羟基甲基-丙-1,3-二醇(Tris)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、枸橼酸盐缓冲剂、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)和磷酸盐缓冲剂。潜在缓冲剂的这种列表仅用于说明性目的。技术人员将认识到，选择用于本文公开的组合物和方法的缓冲液的pH是相应的。缓冲液的pH一般地在3-8的范围内。

如以上指明的那样，存在于经处理的固体基质中的组合物可任选地包含UV防护剂或自由基捕获剂。在本发明的某些方面，掺入用于核酸提取和储存的干燥固体基质中的组合物需要UV防护剂或自由基。不旨在受限于任何具体UV防护剂，示例性的防护剂包括例如氢醌单甲醚(MEHQ)、氢醌(HQ)、甲基氢醌(THQ)和抗坏血酸或维生素C。在某些方面，自由基捕获剂为MEHQ或THQ。关于以未修饰的状态保持所提取的核酸用于进一步分析，术语“UV防护剂”或“自由基捕获剂”在本文中可互换使用。固体基质中的组合物还可包括RNA酶抑制剂比如氧钒核糖核苷复合物(VRC)或任何市售可用的RNA酶抑制剂(例如SUPERase-In™,Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)。

在某些实施方案中，基质进一步包含RNA酶抑制剂，其中RNA酶抑制剂包含氧钒核糖核苷复合物(VRC)、核苷酸类似物或市售可用的RNA酶抑制剂(例如SUPERase-In^TM)。RNA酶抑制剂可进一步包含焦磷酸盐化合物。在一个实施方案中，焦磷酸二钠(sodiumpyrophosphate dibasic)可用作RNA酶抑制剂。RNA酶抑制剂的一个或多个实施方案可进一步包含三磷酸盐，比如三磷酸钠。在一个实例中，向酸滴定的缓冲液加入焦磷酸钠增强RNA在液态和干燥形式下的稳定性。

基质的实施方案包括干态的酸或酸滴定的缓冲试剂，其可在从生物样品提取核酸期间再水合。酸的实例包括(但不限于)乙酸、枸橼酸、酒石酸、磷酸、盐酸、三(2-羧基乙基)膦-盐酸(TCEP-HCl)、氧化的三(2-羧基乙基)膦-盐酸(TCEP-O-HCl)、硫酸、硝酸、香草酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸或其组合。如所指出的那样，基质在水合时提供酸性pH，这提取和稳定所提取的核酸，其中水合可通过加入样品、水或任何其他溶液(例如缓冲溶液)实现。基质的一个或多个实施方案在水合时提供2-7范围内的pH。在一些实施方案中，基质在水合时提供3-6范围内的pH。

装置包括用于支持经处理的固体基质的框架。在某些实施方案中，框架可为刚性的，能够支撑经处理的固体基质。框架可具有对准机构和偏置(offset)用于将基质插入到框架中。在某些实施方案中，框架可具有延伸连接以形成矩形类型形状的角的4个侧轨。至少一个侧轨具有大小和位置适合于接收固体基质的边缘部分。

在其他实施方案中，框架为如2015年4月6日提交的美国专利申请14/712290中描述的框架，在此以其全部结合。在某些实施方案中，框架为具有外部弯曲部分和内部弯曲部分的单片基底。弯曲部分被配置成支持经处理的干燥固体基质以及能够收集生物样品并将一部分样品转移至经处理的干燥固体基质的第二收集膜或基质。因此，在某些实施方案中，生物样品例如血斑可直接加入到经处理的干燥固体基质。在备选方法中，可将生物样品收集在单独的基质上并转移至经处理的干燥固体基质。经处理的干燥固体基质因此起分离膜的作用，并且这些术语可互换使用。内部弯曲部分由多个第一狭槽形成和外部弯曲部分由多个第二狭槽形成。内部弯曲部分被配置成使分离膜(经处理的固体基质)的远端对准外部弯曲部分的远端部分下方。外部和内部弯曲部分被进一步配置成使收集膜的近端对准外部弯曲部分的远端部分和内部弯曲部分的远端部分下方，使得收集膜的近端与分离膜的远端具有限定的重叠接触区域。基底内两个膜之间的重叠接触区域促进从血液样品适当分离和收集血浆。因此，装置可用于提取或洗脱样品的关键组分，更具体地讲为RNA，以用于进一步测试。

图2A和图2B为配置作为血浆夹(plasma clip)100的框架的本发明一个实施方案的代表性视图。图2A显示夹100，其包括内部弯曲部分102和外部弯曲部分104。夹100进一步包括多个支持机构106、多个引导机构108和多个固定装置110，其显示于图2B。

在某些实施方案中，框架可为聚合物材料比如聚丙烯、尼龙(聚酰胺)、高密度聚乙烯(HDPE)和聚醚醚酮(PEEK)。在某些其他实施方案中，框架可具有不同形状，比如圆形、椭圆形、矩形等。

装置可包括储存套筒。在某些实施方案中，储存套筒可被配置成允许固体基底上含有的生物样品从一个位置到另一个位置的运输和安全处理。其还可允许存档式储存所收集的样品用于以后的分析。在某些实施方案中，储存套筒可具有用于接收含有经处理的固体基质的框架的口袋及一个或多个与套筒连接的突出部，突出部可以提供套筒内框架和基质的完全装入的方式定位。在一些实施方案中，储存套筒可以各种形状、大小和/或颜色配置以易于鉴定。在某些实施方案中，样品鉴定可通过标记套筒来实施，在其他实施方案中，标记可通过使用附着于装置的鉴定标签比如RFID芯片或条形码进行。采用这种储存套筒的跟踪系统可允许快速鉴定档案生物样品，使得样品在运送或测试中的位置可通过与相应储存套筒的物理连接而容易地鉴定。

进一步提供使用本文描述的装置的方法。在一个实施方案中，方法允许储存和/或保存其中病毒被灭活的干态RNA病毒。在另一个实施方案中，方法进一步提供整合从生物样品提取和稳定核酸，由此测试所提取的核酸，更具体地讲为病毒RNA，以用于RNA病毒的诊断。在进一步的实施方案中，方法使得能够表征RNA病毒和/或宿主转录物组(transcriptome)。

在某些实施方案中，方法包括在环境温度下将提取的核酸以干态储存在基质上数天至数周的时间。在一些实施方案中，核酸可储存超过1个月的时间。在一些实施方案中，核酸可储存超过6个月的时间。由于RNA通常容易降解，使用该基质提取和保存RNA为有用的，并且可进一步用于各种下游应用。

在某些实施方案中，如图4的流程图中显示的那样，方法包括以下步骤：a) 提供固体基质，其中将包含至少一种蛋白质变性剂、至少一种还原剂、生物缓冲剂和任选的自由基捕获剂或RNA酶抑制剂的组合物以干燥形式掺入到固体基质中；b) 将待分析RNA病毒的样品(例如生物样品)应用于装置的经处理的固体基质上以提取核酸，其中基质由装置的框架含有；c) 干燥固体基质；d) 将固体基质装入储存套筒内。在某些实施方案中，固体基质被支持在框架中以便于处理。

在某些实施方案中，方法进一步包括以下步骤中的至少一个：储存装置(图4，步骤e)，所述装置含有在环境条件下以干态存在于固体基质上的核酸。然后可将装置运输到远程位置用于在环境条件下进行测试。因此，尽管病毒为灭活的，但是RNA仍以完整状态保存以允许适当的分析。

在某些实施方案中，如图4中显示的步骤d和步骤e可以颠倒，因为样品可在密封于储存套筒中之后进行干燥。例如，可将干燥剂加入到套筒以实现干燥或完成样品的干燥。

在某些方面，固体基质为多孔的基于纤维素的纸，比如市售可用的903、31-ETF或FTA Elute^TM。该方法的实施允许在环境温度下以干燥形式(例如在固体基质上)储存核酸，特别是广泛已知为储存不稳定的生物分子的RNA。该方法中采用的样品包括(但不限于)从任何生物体(包括人)获得的生物样品，比如血液、血清、组织、鼻粘液和唾液，或者源自培养细胞的流体。

以上描述的方法可任选地包括从固体基质回收核酸用于进一步分析的步骤。

因此，在本发明的另一方面，包括用于在图4中如以上描述的储存之后进一步处理样品的方法。方法包括从储存的样品提取核酸或应用工作流程直接从基质分析样品的另外步骤。

在某些实施方案中，固体基质包含干燥试剂的固定组合物，其使得能够在水合时从生物样品有效提取核酸比如RNA，随后使提取的RNA在环境温度下稳定。因此，在某些实施方案中，基质在从生物样品提取之后将RNA的稳定性和完整性保持在期望的水平。在一个实施方案中，基质用核酸稳定试剂浸渍。这些稳定试剂可包括RNA酶抑制剂、酸滴定的缓冲剂或螯合剂(例如EDTA)。组合物可进一步包含紫外线(UV)抑制剂或自由基清除剂。

因此，在某些实施方案中，RNA可通过使固体基质(例如纤维素纸)在水溶液、如以上定义的缓冲溶液或有机溶液中再水合来回收。在从基质提取之后，可分析所回收的RNA以用于诊断目的，比如确定病毒来源。更具体地讲，使该RNA与RNA病毒相关。

或者，RNA可通过电洗脱从固体基质回收。本领域技术人员将会意识到，能够从固体基质回收RNA的任何方法均可用于实践所公开的方法。

因此，在某些实施方案中，RNA提取基质为固相提取基质。使用固相提取方法的基质在本文称为固相提取基质。可调整固相提取(SPE)技术以减少用于测序和其他应用的高纯度核酸的提取时间。固相提取为使用固相和液相从材料分离一种或多种相同类型或不同类型的分子的提取方法。固相提取基质用于例如纯化色谱方法或其他分析方法上游的样品。方法的一个实例包括：将样品(例如生物样品)加载到固相提取基质上，在环境温度下储存基质以实现基本上干态，和用合适的缓冲液使基质再水合以从基质差别地(differentially)提取RNA。

在本发明的另一方面，包括用于在图4中如以上描述的储存之后进一步处理样品的方法。方法包括从基质提取核酸的另外步骤。因此可进一步处理或分析纯化的核酸。或者，核酸可直接从基质处理或分析。在该实施方案中，可将含有核酸的基质直接加入到工作流程。在某些实施方案中，样品可在不进一步纯化核酸部分的情况下进行分析或处理。

在方法的某些方面，固体基质为多孔的基于纤维素的纸，比如市售可用的903、31-ETF或FTA Elute^TM。该方法的实施允许在环境温度下以干燥形式(例如在固体基质上)储存核酸，特别是广泛已知为储存不稳定的生物分子的RNA。该方法中采用的样品包括(但不限于)从任何生物体(包括人)获得的生物样品，比如血液、血清、组织、鼻粘液和唾液。

在方法的某些方面，固体基质可在没有单独提取步骤或RNA回收步骤的情况下进行分析。例如，含有干燥生物样品的固体基质的一部分可直接加入到用于检测目的的酶促反应中。合适的酶促反应包括逆转录反应。在又一个实施方案中，逆转录反应可与DNA扩增反应比如PCR或qPCR结合。在再一个实施方案中，DNA扩增反应为使用等温DNA聚合酶的等温反应。在一个实施方案中，固体基质为来自Whatman^TM的多孔纤维素纸，比如FTA^TM Elute(GE HealthCare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)。在一些实施方案中，未洗脱的固体基质可如2014年5月15日公开的公开号WO2014072354A1中所述的那样进行分析。

实施例：

以下实施例为了说明而提供，而非为了限制。

实施例1：埃博拉病毒的灭活和检测

Vero细胞从ATCC获得，并且基于供应商提供的说明书使用标准组织培养技术在T-75烧瓶中常规传代。在测定前一天，将细胞按1:2分开以确保其在感染时处于指数生长期。使用血细胞计数器和台盼蓝排除法实施总细胞数和百分比存活率测定。测定中待采用的细胞的细胞存活率必须大于95%。

用于该测定的病毒为扎伊尔埃博拉病毒株199510621。对于每个测定，从冰箱(-80℃)取出预滴定的病毒等分试样，并允许其在BSL-4实验室的生物安全柜中缓慢解冻至室温。在组织培养基或小鼠全血中稀释病毒以获得实验需要的接种物。

为了确定滤纸洗脱液是否直接引起Vero细胞的细胞病变，将来自每个滤纸(T、R、E)的1或2-7 mm打孔片加入到1 mL细胞培养基中。滤纸的组成显示在以下表1中。

在室温下30分钟之后，将样品高速涡旋1分钟，并在未处理的细胞培养基中制备稀释系列(1:10、1:50、1:100)。然后将1 mL未稀释或稀释的洗脱液加入到T-25烧瓶中的汇合单层Vero细胞中，一式两份。在37℃下1小时之后，将4 mL另外的未处理的细胞培养基加入到烧瓶中并且监测7天。使用标准化量表(0至4+ CPE)记录任何明显的细胞病变效应(CPE)。以下表1中提供来自滤纸洗脱液的细胞病变效应的概述。

表1. 所测试的滤纸的细胞病变效应的概述

为了确定滤纸是否使活的EBOV失活，将细胞培养物来源的病毒(1.7 x 10⁵和1 x10³ PFU/25 µL)加入到各纸的一式两份样品中，并且允许其在室温下干燥。包括不含病毒的细胞培养基作为阴性对照。使用含有10 PFU病毒的阳性对照感染单层细胞(未在滤纸上点样)，以证实如果存在少量病毒，那么我们的方法将确保有效的EBOV繁殖和检测。干燥之后，将7 mm打孔片加入到1 mL细胞培养基中，随后在室温下温育30分钟，并剧烈混合以确保任何活病毒颗粒释放到细胞培养物洗脱液中。然后将该初级洗脱液的1:10稀释液转移至汇合单层Vero细胞。在1小时感染步骤之后，将另外的细胞培养基加入到烧瓶中，并且观察细胞7天的细胞病变效应(CPE)。在感染后第7天，收集来自各烧瓶的上清液，转移至新的汇合单层Vero细胞，并且观察该烧瓶另外7天的CPE。在该第二次温育(总计14天)之后，收集来自各烧瓶的上清液，并通过噬斑测定和蛋白质印迹法分析EBOV抗原。病毒灭活研究结果的概述提供在以下表2中。

表2. 滤纸上EBOV灭活的证据

表2中的结果显示未经处理的纤维素(T)上的病毒在干燥和回收期间的显著损失，但是在经处理的纤维素(R, E)上注意到EBOV的彻底失活。因为埃博拉病毒峰值滴度在感染的个体中接近~10⁶ PFU/mL，所以在RSM (R)和FTA Elute (E)上观察到~10⁵个感染性颗粒的灭活在临床上是显著的。RSM指的是RNA稳定基质，其为如上述美国专利9044738中描述的基质的一个实施方案。

通过噬斑测定评估的相同样品(以上在表2中)还通过蛋白质印迹法评估，以检测感染14天之后的EBOV G2蛋白。图5中提供的结果通过蛋白质印迹法证实了表2中显示的那些，其显示从未经处理的纤维素(T)而非经处理的纤维素(R, E)检测到EBOV G2蛋白质。滤纸的组成进一步描述于表1中。

为了确定在提取干血斑之后EBOV RNA是否可从滤纸定量检测，将已知量的EBOV(10⁵、10⁴、10²和10¹ PFU)掺入到小鼠全血中。将样品(50 µL)点样，然后在BSC中在滤纸上干燥30分钟，并且然后转移至含有干燥剂包的Mylar自封袋中以在室温下储存。24小时之后，取出两个7 mm打孔片，并用15 μL蛋白酶K溶液(4 mg/ml蛋白酶K + 0.5% SDS)再水合10分钟。将打孔片转移至含有TRIzol的管中，涡旋，并通过以300 rpm振摇管60分钟在室温温育。稀释系列的等分试样未被点样到滤纸上，而是直接加入到TRIzol用于回收比较。然后总RNA按照制造商的建议提取并纯化。然后评估在干燥储存24小时之后从滤纸回收的病毒RNA的数量和质量。使用Agilent生物分析仪分析各RNA洗脱液的样品，以评价在干燥储存24小时之后回收的总RNA的质量。按照制造商的建议，随后使用Agilent RNA 6000 Pico Kit。使用定量逆转录酶PCR来评估滤纸洗脱液中存在的完整病毒基因组的数目。所使用的测定先前被公开(Weidmann等人, 2004. J. Clinical Virology 30: 94-99)，其被设计为检测EBOV的核蛋白基因。EBOV RNA拷贝数使用从BEI Resources (NIAID, NIH: RNA from ZaireEbolavirus, Mayinga, NR-31806)获得的RNA测定。通过将各滤纸洗脱液中检测到的EBOVRNA拷贝数除以从未暴露于滤纸的(相同EBOV接种物的)成对样品检测到的EBOV RNA拷贝总数，计算回收百分比。该比率乘以100%给出回收百分比。

图6显示作为感染性颗粒(PFU)的函数，从所提取的干血斑一步法RT-qPCR检测EBOV核蛋白基因的结果。EBOV核蛋白基因成功地使用~100 bp扩增子从所有剂量的滤纸样本检测到，所述扩增子由于其尺寸小而对RNA降解相对不敏感。然而，总RNA的生物分析仪分析揭示，仅有RSM滤纸(R)成功地保存RNA完整性(RIN>5)，类似于Trizol标准实践(图7)。总而言之，表3中这些实验的比较概述了最高测试病毒剂量下的埃博拉病毒失活和总RNA完整性的确定。

表3：埃博拉病毒失活和RNA完整性的比较：

表3中的结果证实，RSM滤纸表现类似于标准Trizol去污染，但是不像Trizol，使得能够进行干燥处理和环境稳定。因此，RSM的性能符合病原体分子诊断的CDC指南，因为观察到感染性完全丧失，同时保持核酸的完整性。

实施例2：从滤纸无提取地RT-PCR检测埃博拉病毒

埃博拉病毒特异性引物从Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)订购。SEQ ID NO1和SEQ ID NO2通过脱盐纯化。埃博拉病毒RNA通过BEI Resources, NIAID,NIH: RNA from Zaire Ebolavirus, Mayinga, NR-31806获得。该病毒原液在Vero E6细胞RNA的背景中含有4.5 x 10⁸个基因组RNA拷贝/μl。将用枸橼酸盐-磷酸盐-右旋糖溶液稳定的人全血与埃博拉病毒RNA同时点样到31-ETF、FTA Elute、RSM滤纸上(使用单独加样吸液管，其排出到纸的相同区域上)，至最终埃博拉病毒基因组当量为10⁷-10⁹/mL。这些埃博拉病毒浓度(RNA拷贝数/mL)模拟人发热后约3天的疾病负担。允许掺入过的血液样品(约25 μL)在滤纸上干燥，并且在干燥器柜中于环境温度下储存过夜以模拟延迟处理。

对于埃博拉病毒的无提取检测，使用Harris Micro-punch从每个干血斑的中心获得单个1.2 mm打孔片，并直接投入到20 μL cDNA合成反应中。通过体积吸收，估计每个打孔片含有约1 μL的原始样品，因此埃博拉病毒RNA的模板输入范围预计为10⁴-10⁶个拷贝/打孔片。因此，出于对照目的，通过RT-qPCR与滤纸样品一起测试等效输入的原液埃博拉病毒RNA(10⁴或10⁶个拷贝)。使用AffinityScript cDNA合成试剂盒(Agilent Technologies)，以使用随机引物从各自的埃博拉病毒RNA对照和1.2 mm干血斑产生cDNA。建立含有埃博拉病毒RNA对照或1.2 mm干血斑但是缺乏逆转录酶的平行反应，以评价来自基因组DNA的背景信号。将所有cDNA反应在25℃下温育5分钟，随后在42℃下温育45分钟，并且然后在95℃下灭活5分钟。然后将生成的cDNA应用于含有埃博拉病毒特异性引物的qPCR反应，以使用ABI7500装置(Thermo Fisher Scientific)实时检测埃博拉病毒信号。简而言之，对于每个样品，将5 μL的cDNA与12.5 μL的2X SensiMix SYBR Master混合物(OriGeneTechnologies)、1 μL的10 μM引物混合物和6.5 μL的无核酸酶水混合，以建立25 μL实时qPCR反应。这些反应在95℃下温育10分钟，然后在95℃下5秒和60℃31秒循环总计40个循环。在每个循环读取SYBR荧光并绘图，以计算可检测到埃博拉病毒的CT阈值。

图8显示使用以上描述的无提取方案，从不同滤纸打孔片两步法RT-qPCR检测埃博拉病毒RNA的结果。在整个掺入范围(10⁷-10⁹个RNA拷贝/mL)，从FTA Elute和RSM滤纸上的干血斑直接成功地检测到埃博拉病毒RNA。对照反应验证了这些滤纸打孔片含有约10⁴-10⁶个RNA拷贝/μl。在缺乏逆转录酶的对照反应中未观察到检测，证实了对cDNA而不是基因组DNA的引物特异性。重要的是，没有从未经处理的滤纸样品(31-ETF)成功检测，并且在之前的cDNA合成步骤中注意到血液已经从31-ETF滤纸浸出，如图7显示的那样。相比之下，FTAElute和RSM样品两者均保留滤纸基质上的血液组分。因此，使用这种无提取方法进行埃博拉病毒检测的成功取决于滤纸收集基质在打孔片中cDNA合成和随后的下游qPCR检测步骤期间保留血液抑制剂的程度。

实施例3：从滤纸无提取地等温扩增和检测埃博拉病毒

埃博拉病毒特异性引物从Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)订购。SEQ ID NO3和SEQ ID NO4通过脱盐纯化，而SEQ ID NO5和SEQ ID NO6通过HPLC纯化。产生切口的核酸内切酶Nt.BbvCI(New England Biolabs, Inc.)的识别位点加下划线，和切口位点以脱字符号注释。

SEQ ID NO1: 5’-d[TCT GAC ATG GAT TAC CAC AAG ATC]-3’

SEQ ID NO2: 5’-d[GGA TGA CTC TTT GCC GAA CAA TC]-3’

SEQ ID NO3: 5’-d[GTC CTC AGA AAA TCT GGA T]-3’

SEQ ID NO4: 5’-d[TTC AAG ATT GTT TAC TTG ATA CAC]-3’

SEQ ID NO5: 5’-d[GCA TAA TAC TAC CAG TCT CCT ^ CAG CTC TGA CAT GGATTA CCA C]-3’

SEQ ID NO6: 5’-d[GCA TAA TAC TAC CAG TCT CCT ^ CAG CTG ACT CTT TGCCGA AC]-3’

以下试剂通过BEI Resources, NIAID, NIH: RNA from Zaire Ebolavirus,Mayinga, NR-31806获得。该病毒原液在Vero E6细胞RNA的背景中含有4.5E+08基因组RNA拷贝/μl，并且在不含RNA酶的TET缓冲液(10 mM Tris, pH 8 (Sigma Aldrich), 含有0.1mM EDTA (Life Technologies)和0.01% Tween 20 (Sigma Aldrich))中以1:10000稀释(现在为45000埃博拉病毒基因组当量/µl)。将稀释的RNA在-80℃下以100 μl等分试样储存。从所公开的序列(GenBank: AY142960)设计扎伊尔埃博拉病毒的引物，Mayinga RNA(SEQ ID NO 1-4)。

10 μl组合等温逆转录/扩增反应(RT-iSDA)含有以下组分：50 nM Seq ID NO3、50nM SEQ ID NO4、0.5 µM SEQ ID NO5、0.25 µM Seq ID NO6、200 µM dATP (GEHealthcare)、200 µM dCTP (GE Healthcare)、200 µM dGTP (GE Healthcare)、200 µMdTTP (GE Healthcare)、50 mM Tris-HCl, pH 7.4 (Sigma Aldrich)、5 mM硫酸镁(NewEngland Biolabs, Inc.)、40 mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4) (J.T. Baker)、10单位RNA酶抑制剂(Life Technologies)、2单位

逆转录酶(Qiagen)、8单位Bst WarmStart® DNA聚合酶(New England Biolabs, Inc.)和3.2单位Nt.BbvCI (New EnglandBiolabs, Inc.)。按比例缩放增加体积的反应，例如50 μl或75 μl。将埃博拉病毒RNA模板以指明的拷贝数或者作为RNA稳定基质(RSM)的1.2 mm打孔片(Harris MICRO-PUNCH®)的部分/连同其一起加入到溶液中。所有反应在50℃下温育20分钟，并且通过经15% TBE-Urea凝胶(Life Technologies)的70℃下电泳分析来自各自的等分试样。就在电泳之前，将来自反应的2 μl与6 μl Gel Loading Buffer II (Life Technologies)混合，在95℃下变性2分钟，并立即在冰上猝灭。将来自每个变性样品的5微升立即加载到凝胶孔中。在按照制造商的说明书稀释的SYBR® Green II (Life technologies)的2X溶液中电泳之后将凝胶染色15分钟，然后使用Typhoon^TM FLA 9500 (GE Healthcare)可变模式激光扫描仪进行可视化。

使用批准的IRB方案＃13095从GE Medical Services (Niskayuna, NY)获得人血。通过在一个吸液管端具有8 μl血液和在另一个吸液管端具有8 μl的45000个拷贝/μl的扎伊尔埃博拉病毒RNA，并同时将其排出到纸的相同区域，来制备含有人血和病毒RNA的RSM。将血液和RNA混合，使得斑点中心距纸边缘约0.7 cm。允许斑点风干，并且在室温下储存变干的纸。干燥之后，将一些RSM样品切成条，使得血液RNA斑点位于底部，并且使用TET缓冲液和CF7纸芯(wick)(GE Healthcare)通过横向流来洗涤各条。一旦经过洗涤，在使用之前允许条带风干，并且使用1.2 mm打孔片进行等温扩增。在其他情况下，RSM样品未通过横向流洗涤，而是将来自干血斑的1.2 mm打孔片直接投入到75 μL等温扩增反应中。

图9A-9C证实在反应之前洗涤或不洗涤1.2 mm打孔片的情况下，来自RSM的组合等温逆转录/扩增。箭头指示预计的逆转录扩增产物(完全切口的81个碱基扩增子和部分切口的102个碱基扩增子)。图9A显示对照反应A、B和C，每个反应具有50 μl的体积。反应A不含模板，而B和C各自含有45000个扎伊尔埃博拉病毒RNA拷贝。反应D另外含有0.5 μl人全血。图9B显示对照反应E和F，反应体积各为10 μl。反应E不含模板，而F含有45000个扎伊尔埃博拉病毒RNA拷贝。图9C显示反应G和H，反应体积各为10 μl，含有先前已用人血和埃博拉病毒RNA点样的经过洗涤的RSM的1.2 mm打孔片。除了经过洗涤的RSM打孔片之外，反应H还单独加入了额外的45000个扎伊尔埃博拉病毒RNA拷贝到反应中。反应I的反应体积为为75-μl，含有用人血和45000个埃博拉病毒RNA拷贝点样的未经洗涤的1.2 mm RSM打孔片。在等温扩增期间没有观察到血液组分从RSM滤纸中浸出。

<110> KVAM, ERIK LEEMING

NELSON, JOHN

DUTHIE, SCOTT

<120> RNA病毒的收集装置和方法

<130> 283554-1

<140>

<141>

<160> 6

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成引物

<400> 1

tctgacatgg attaccacaa gatc 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成引物

<400> 2

ggatgactct ttgccgaaca atc 23

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成引物

<400> 3

gtcctcagaa aatctggat 19

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成引物

<400> 4

ttcaagattg tttacttgat acac 24

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成引物

<400> 5

gcataatact accagtctcc tcagctctga catggattac cac 43

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成引物

<400> 6

gcataatact accagtctcc tcagctgact ctttgccgaa c 41

Claims (24)

1.一种灭活和干燥储存含有RNA病毒的生物样品的方法，所述方法包括：

提供掺入有组合物的不可溶解的干燥固体基质，所述组合物包含以干态浸渍于其中的至少一种蛋白质变性剂、至少一种酸或酸滴定的缓冲试剂，以在水合时提供酸性pH；

使所述生物样品与所述不可溶解的干燥固体基质接触，以有效地溶解所述生物样品的细胞以从溶解的细胞提取RNA，并以完整状态保存提取的RNA；

干燥所述固体基质上的所述生物样品；和

在环境条件下以干态在所述固体基质上储存所述生物样品，

其中在所述干燥步骤期间使得所述生物样品无感染性，并且其中所述酸性pH在2-7的范围内。

2.权利要求1的方法，其中所述酸包括乙酸、枸橼酸、酒石酸、磷酸、盐酸、三(2-羧基乙基)膦-盐酸(TCEP-HCl)、氧化的三(2-羧基乙基)膦-盐酸(TCEP-O-HCl)、硫酸、硝酸、香草酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸或其组合。

3.权利要求1的方法，其中所述组合物进一步包含UV防护剂、自由基清除剂、螯合剂、还原剂或其组合。

4.权利要求1的方法，其中所述组合物进一步包含RNA酶抑制剂。

5.权利要求4的方法，其中所述RNA酶抑制剂包含三磷酸盐、焦磷酸盐、氧钒核糖核苷复合物(VCR)或焦磷酸钠中的至少一种。

6.权利要求3的方法，其中所述还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(2-ME)、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)及其组合。

7.权利要求1的方法，其中提取并保存的RNA具有大于5的RNA完整性数目(RIN)。

8.权利要求1的方法，其中所述RNA病毒为血源性病毒。

9.权利要求8的方法，其中所述血源性病毒为埃博拉病毒、肝炎病毒、沙粒病毒、丝状病毒、慢病毒或相关亚组。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述方法进一步包括从所述不可溶解的干燥固体基质回收所述RNA。

11.权利要求10的方法，其中回收所述RNA包括通过使所述不可溶解的干燥固体基质再水合、固相提取、电洗脱或其组合来提取所述RNA。

12.权利要求11的方法，其中再水合包括使用水溶液、缓冲溶液、有机溶液或其组合。

13.一种用于测试生物样品的RNA病毒存在情况的方法，所述方法包括：

提供掺入有组合物的不可溶解的干燥固体基质，所述组合物包含以干态浸渍于其中的至少一种蛋白质变性剂、至少一种酸或酸滴定的缓冲试剂，以在水合时提供酸性pH；

将包含RNA的所述生物样品施加到所述不可溶解的干燥固体基质；

干燥所述不可溶解的干燥固体基质上的所述生物样品，以便以完整状态保存所述RNA；

从所述不可溶解的干燥固体基质回收所述生物样品的RNA；和

分析所回收的RNA的病毒RNA存在情况以确定所述RNA病毒的存在情况，

其中在所述干燥步骤期间使得所述生物样品无感染性，并且其中所述酸性pH在2-7的范围内。

14.权利要求13的方法，其中所述回收步骤包括通过使所述不可溶解的干燥固体基质再水合、电洗脱、固相提取、将一部分所述固体基质直接加入到扩增反应或其组合来提取所述RNA。

15.权利要求14的方法，其中再水合包括使用水溶液、缓冲溶液、有机溶液或其组合。

16.权利要求13的方法，其中所述酸包括乙酸、枸橼酸、酒石酸、磷酸、盐酸、三(2-羧基乙基)膦-盐酸(TCEP-HCl)、氧化的三(2-羧基乙基)膦-盐酸(TCEP-O-HCl)、硫酸、硝酸、香草酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸或其组合。

17.权利要求13的方法，其中所述组合物进一步包含UV防护剂、自由基清除剂、螯合剂、还原剂或其组合。

18.权利要求13的方法，其中所述组合物进一步包含RNA酶抑制剂。

19.权利要求18的方法，其中所述RNA酶抑制剂包含三磷酸盐、焦磷酸盐、氧钒核糖核苷复合物(VCR)或焦磷酸钠中的至少一种。

20.权利要求17的方法，其中所述还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(2-ME)、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)及其组合。

21.权利要求13的方法，其中所述生物样品为血液。

22.权利要求13的方法，其中所述RNA病毒为血源性病毒。

23.权利要求22的方法，其中所述血源性病毒为埃博拉病毒、肝炎病毒、沙粒病毒、丝状病毒、慢病毒或相关亚组。

24.权利要求13-23中任一项的方法，其中所述方法还包括在干燥形式和环境条件下以完整形式长期储存所述RNA，且其中使得存在于所述生物样品中的任何病毒失活。

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