ES2692726T3 - Formulaciones para la estabilización de ácidos nucleicos en sustratos sólidos - Google Patents

Formulaciones para la estabilización de ácidos nucleicos en sustratos sólidos Download PDF

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Abstract

Una matriz sólida seca para la extracción y el almacenamiento de ácidos nucleicos de una muestra, en donde una composición comprende al menos un tiocianato metálico que comprende un catión metálico del Grupo 1 o Grupo 2, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), y se incorpora un tampón en la matriz sólida seca, y la matriz se seca después, en donde la matriz sólida es una matriz porosa que comprende celulosa, acetato de celulosa, fibra de vidrio o cualquier combinación de los mismos.

Description

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DESCRIPCION
Formulaciones para la estabilizacion de acidos nucleicos en sustratos solidos Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad a la solicitud de Patente de Estados Unidos numero 13/721,948 presentada el 20 de Diciembre de 2012, que es una continuacion, en parte, de la solicitud de Patente de Estados Unidos No. de serie 13/460,076, presentada el 30 de Abril de 2012, que se incorpora aqu por referencia en su totalidad.
Investigacion y desarrollo patrocinado federalmente
Esta invencion se hizo con el apoyo del gobierno bajo el numero de contrato (HR0011-11-C0127) otorgado por la Defense Advanced Research Projects Agency. El gobierno tiene ciertos derechos en la invencion.
Campo de la invencion
La presente descripcion se refiere generalmente a sustratos solidos secos y a metodos para su uso para la extraccion, estabilizacion, y conservacion a temperature ambiente de acidos nucleicos, particularmente RNA, a partir de una muestra biologica en un formato seco. Tambien se describen metodos para la extraccion, recogida, conservacion, y recuperacion de acidos nucleicos a partir de sustratos solidos secos.
Antecedentes
El RNA es una de las biomoleculas mas diffciles de estabilizar como consecuencia tanto de la auto hidrolisis qrnmica como de la degradacion mediada por enzimas. Por consiguiente, la extraccion y conservacion del RNA derivado de una muestra biologica es sensible a una serie de factores medioambientales que incluyen pero no se limitan a, el tampon utilizado para extraer o recoger el RNA, pH, temperatura, y particularmente la presencia ubicua de ribonucleasas robustas (RNasas). Como resultado, el RNA en estados tanto purificados como no purificados ha requerido tfpicamente almacenamiento a -80°C para prevenir la hidrolisis y degradacion enzimatica y conservar la integridad de la muestra de RNA. La capacidad para extraer, recoger, y conservar el RNA bajo condiciones ambientales es economicamente deseable para evitar los costos y los requisitos de espacio asociados con la refrigeracion o la congelacion de las muestras a -80°C.
Las metodologfas actuales para conservar el RNA bajo condiciones ambientales en estado lfquido se han centrado en la desactivacion de las RNasas mediante el uso de, por ejemplo, detergentes, compuestos caotropicos, agentes reductores, metales de transicion, disolventes organicos, agentes quelantes, proteasas, inhibidores de peptido RNasa, y anticuerpos anti-RNasa. Esfuerzos adicionales se han centrado en modificar el RNA qmmicamente para evitar la transesterificacion y la auto hidrolisis. La mayona de los productos de conservacion del RNA disponibles comercialmente solo pueden conservar el RNA en estado lfquido durante dfas o semanas a temperatura ambiente. Las tecnologfas actuales que reivindican la recogida y conservacion exitosa del RNA en un formato seco requieren tfpicamente que el RNA primero se “prepurifique” y se concentre a partir del material biologico (por ejemplo, muestras biologicas tales como sangre, suero, tejido, saliva, etc.) antes del almacenamiento del RNA.
Las tecnologfas actuales para la conservacion del RNA en un formato seco requieren instalaciones de secado adicionales. Estos metodos no son, por lo tanto, propicios para la recogida directa de RNA de una muestra (por ejemplo, una muestra biologica) sin un tratamiento significativo de la muestra.
Por consiguiente, las composiciones y metodos que integran la extraccion, estabilizacion, y almacenamiento/conservacion de RNA de una muestra (por ejemplo, una muestra biologica) dentro de un proceso unico son deseables y necesarios en la tecnica. Tales composiciones y metodos permitinan el almacenamiento a largo plazo de RNA en condiciones ambientales y permitinan recuperar el RNA intacto para un analisis posterior.
Breve descripcion
Se describe una matriz solida seca para la extraccion y almacenamiento de acidos nucleicos de una muestra, tal como una muestra biologica como se define aqrn a continuacion, en donde una composicion que comprende un desnaturalizante de protemas, un agente reductor, un tampon, y opcionalmente una trampa de radicales libres o un inhibidor de RNasa esta presente en la matriz solida en un formato seco. En una realizacion, las matrices solidas secas de la presente solicitud permiten el almacenamiento prolongado de una muestra biologica que comprende acidos nucleicos (por ejemplo, RNA, DNA) en un formato seco bajo condiciones ambientales. La matriz solida seca de la invencion comprende al menos una sal de tiocianato metalico que comprende un cation metalico del Grupo 1 o Grupo 2, un agente reductor, un tampon, y opcionalmente una trampa de radicales libres o un inhibidor de RNasa.
Los acidos nucleicos (por ejemplo, RNA, DNA) almacenados en un estado ambiental en matrices solidas secas se pueden someter a un proceso para liberar los acidos nucleicos de la matriz solida en un formato intacto que es adecuado para un analisis posterior de las muestras de acido nucleico recogidas. Tambien se proporcionan metodos para usar las matrices solidas de la invencion para extraer y almacenar acidos nucleicos de una muestra biologica.
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Dibujos
Estas y otras caractensticas, aspectos, y ventajas de las membranas porosas modificadas qmmicamente se entenderan mejor cuando se lea la siguiente descripcion detallada con referencia a los dibujos adjuntos en los que caracteres similares representan partes similares en todos los dibujos, en lo que:
La Fig. 1 proporciona un electroforetograma representativo de acidos nucleicos recuperados de celulosa mediante electroelucion despues de detectar celulas humanas cultivadas en matrices solidas de diferentes composiciones. Se indican DNA genomico de alto peso molecular y bandas de rRNA 28s/18s. Se proporciona adicionalmente la cuantificacion de DNA y RNA utilizando Imagne J. Se trazo una lmea vertical desde la parte superior de cada carril de gel hasta la inferior en el panel A, y la intensidad de pixel (unidades arbitrarias de valores de gris) se trazo en funcion de la distancia de lmea (cm) utilizando la funcion Plot Profile. Los picos correspondientes al DNA genomico y rRNA 28s/18s se muestran en los recuadros. Se detallan detalles experimentales adicionales a continuacion en la seccion de Ejemplos.
La Fig. 2 proporciona las intensidades de pfxeles de gel, presentadas como unidades arbitrarias de valores de gris, para rRNA 28s y 18s para cada una de las composiciones representadas. Las muestras de celulosa se almacenaron durante 10 dfas a temperatura ambiente en una camara de desecacion antes del analisis. La relacion de rRNA 28s a 18s se establece por encima de cada barra en el grafico. Se detallan detalles experimentales adicionales a continuacion en la seccion de Ejemplos.
La Fig. 3 proporciona las intensidades de pfxeles de gel para rRNA 28s y 18s para cada una de las composiciones representadas. Los sustratos de celulosa se almacenaron durante 13 dfas a temperatura ambiente en una camara de desecacion antes del analisis. La relacion de rRNA 28s a 18s para cada una de las condiciones experimentales aparece sobre cada barra en el grafico. Se detallan detalles experimentales adicionales a continuacion en la seccion de Ejemplos.
La Fig. 4 proporciona las intensidades de pfxeles de gel para rRNA 28s y 18s para cada una de las composiciones representadas. Las muestras de celulosa se almacenaron durante 10 dfas a temperatura ambiente en una camara de desecacion antes del analisis. La relacion de rRNA 28s a 18s para cada una de las condiciones experimentales aparece sobre cada barra en el grafico. Se detallan detalles experimentales adicionales a continuacion en la seccion de Ejemplos.
La Fig. 5 proporciona las intensidades de pfxeles de gel para las bandas de rRNA 28s y 18s para cada una de las composiciones mostradas. Las muestras de celulosa se almacenaron durante 30 dfas a temperatura ambiente en una camara de desecacion antes del analisis. La relacion de rRNA 28s a 18s para cada una de las condiciones experimentales aparece sobre cada barra en el grafico. Se detallan detalles experimentales adicionales a continuacion en la seccion de Ejemplos.
La Fig. 6 proporciona los numeros de integridad de RNA (RIN) medidos a partir de manchas de sangre secas en sustratos de celulosa, como se determina en un bioanalizador Agilent 2100 utilizando RNA 6000 Pico LabChips, para cada una de las condiciones listadas. Se detallan detalles experimentales adicionales a continuacion en la seccion de Ejemplos.
La Fig. 7 proporciona la evidencia para la proteccion de mRNA frente al dano solar en sustratos de celulosa. Cada barra en el grafico representa la diferencia en los umbrales del ciclo de qRT-PCR entre las muestras tratadas con UV y las muestras no tratadas que comprenden las composiciones indicadas en la figura. Se detallan detalles experimentales adicionales a continuacion en la seccion de Ejemplos.
La Fig. 8 proporciona la actividad TCEP en papeles basados en celulosa en presencia de diferentes tampones y a diferentes temperaturas durante un periodo de tiempo de 4 semanas. Se detallan detalles experimentales adicionales a continuacion en la seccion de Ejemplos.
La Fig. 9 proporciona los numeros de integridad de RNA (RIN) para celulas humanas cultivadas que se encuentran sobre sustratos de celulosa impregnados qmmicamente. Las muestras se almacenaron a temperatura ambiente durante al menos una semana antes del analisis de RNA en un bioanalizador Agilent 2100. Se detallan detalles experimentales adicionales a continuacion en la seccion de Ejemplos.
La Fig. 10 proporciona los numeros de integridad de RNA (RIN) para manchas de sangre secas en sustratos de celulosa impregnados qmmicamente. Las manchas de sangre secas se almacenaron a temperatura ambiente durante 19 dfas antes del analisis de RNA en un bioanalizador Agilent 2100. Se detallan detalles experimentales adicionales a continuacion en la seccion de Ejemplos.
Descripcion detallada
Se describen aqm matrices solidas secas para la extraccion y almacenamiento a temperatura ambiente de acidos nucleicos (por ejemplo, RNA, DNA, o una combinacion de los mismos) de una muestra (por ejemplo, una muestra biologica), en la que una composicion que comprende un desnaturalizante de protemas, un agente reductor, un
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tampon, y opcionalmente una trampa de radicales libres o un inhibidor de RNasa se incorpora en la matriz solida en un estado seco. Los sustratos solidos para extraccion y almacenamiento en seco de acidos nucleicos (por ejemplo, RNA, DNA, o una combinacion de los mismos) bajo condiciones ambientales comprenden al menos una sal de tiocianato que comprende un cation metalico del Grupo 1 o Grupo 2, un agente reductor, un tampon, y opcionalmente una trampa de radicales libres o un inhibidor de RNasa presentes en la matriz solida en un formato seco. La “incorporacion” de las composiciones descritas anteriormente incluye pero no se limita al procedimiento de “inmersion” que se describe a continuacion. Un experto en la tecnica apreciara que existen muchos de tales metodos para lograr la incorporacion de la composicion en la matriz solida seca. Despues de la incorporacion de la composicion en la matriz solida seca, la matriz solida se seca de acuerdo con un metodo apropiado.
Las composiciones de la invencion permiten la conservacion seca prolongada de acidos nucleicos de una muestra bajo condiciones de almacenamiento ambientales. Esta observacion es de particular importancia con respecto al RNA, que es ampliamente conocido por ser inestable bajo condiciones ambientales. El termino “matriz solida” como se utiliza aqrn incluye productos basados en celulosa, celulosa, acetato de celulosa, fibras de vidrio, o cualquier combinacion de las mismas. Una matriz solida de la presente solicitud es porosa. En realizaciones particulares, la matriz solida es un papel de celulosa poroso de Whatman™, tal como 903, 31-ETF, FTATM o FTAtm Elute. Los terminos membrana, papel, papel de celulosa, matriz solida, y sustrato se pueden utilizar indistintamente a lo largo de esta descripcion. Un experto en la tecnica reconocena inmediatamente que estos se utilizan en la tecnica para referirse al mismo tipo de composicion.
El termino “extraccion” se refiere a cualquier metodo para separar y aislar los acidos nucleicos de una muestra, mas particularmente una muestra biologica. Los acidos nucleicos tales como RNA y DNA se pueden liberar, por ejemplo, durante la lisis de celulas de muestras evaporativas en el aire o por la presencia de compuestos en una matriz solida modificada qmmicamente que al ponerse en contacto con las muestras da como resultado la lisis celular y la liberacion de los acidos nucleicos (por ejemplo, papeles de celulosa FTATM Elute). Un experto en la tecnica apreciara que cualquier metodo que de como resultado la extraccion de acidos nucleicos, particularmente RNA, de una muestra (por ejemplo, una muestra biologica no purificada) de modo que los acidos nucleicos puedan capturarse en la matriz solida para su estabilizacion, y conservacion de los acidos nucleicos se pueden utilizar en las composiciones y metodos descritos. Los ejemplos anteriores de metodos para la extraccion de acidos nucleicos de una muestra se proporcionan solo con fines ilustrativos. Los terminos “almacenamiento” o “conservacion” se pueden utilizar indistintamente aqrn con respecto al mantenimiento de los acidos nucleicos extrafdos en un formato adecuado para un analisis posterior.
Los expertos en la tecnica en el campo de los acidos nucleicos, particularmente RNA, evaluan tradicionalmente la estabilidad y calidad del RNA en base a: (1) la amplificacion RT-PCR cuantitativa de las dianas de mRNA; (2) el analisis de los numeros de integridad del RNA (RlN) en un bioanalizador Agilent 2100; y (3) la relacion de RNA ribosomal (rRNA) 28s:18s, que comprende la mayor parte del RNA celular total. El RNA celular de alta calidad muestra generalmente una relacion de rRNA 28s:l8s mayor que 1 y un valor de RIN cercano a 10. En la practica, un valor de RIN deseable es generalmente mayor que 5. Ademas, el RNA celular de alta calidad admite una amplificacion eficiente de mRNAs tanto de baja como de gran abundancia (por ejemplo, mayor que 1 kB). Para fines de conveniencia, la intensidad de senal del rRNA y la relacion de rRNA 28s:18s se utilizan frecuentemente para seleccionar e identificar rapidamente muestras con propiedades robustas de almacenamiento de RNA mediante electroforesis en gel.
Como se define aqrn, una “muestra biologica” incluye pero no se limita a sangre, suero, tejidos, mucosa nasal, y saliva obtenida de cualquier organismo, incluyendo un ser humano. Las muestras biologicas se pueden obtener de un individuo sometido a una prueba de autodiagnostico (por ejemplo, monitorizacion de glucosa en sangre) o por un profesional medico entrenado a traves de una variedad de tecnicas que incluyen, por ejemplo, aspirar sangre utilizando una aguja o raspar o frotar un area particular, como una lesion en la piel de un paciente. Los metodos para recoger diversas muestras biologicas son bien conocidos en la tecnica. El termino “muestra” incluye muestras biologicas como se definio anteriormente, pero tambien incluye, por ejemplo, celulas cultivadas de tejido y acidos nucleicos purificados.
Una composicion que comprende un desnaturalizante de protemas, un agente reductor, y un tampon esta presente en la matriz solida seca de esta descripcion. La composicion puede comprender ademas opcionalmente un inhibidor de ultravioleta (UV), una trampa de radicales libres, un inhibidor de RNasa, un quelante, o cualquier combinacion de los mismos. Numerosos desnaturalizantes de protemas son conocidos en la tecnica incluyendo tiocianato de guanidina, clorhidrato de guanidina, arginina, dodecil sulfato de sodio (SDS), urea, o cualquier combinacion de los mismos. A continuacion se expone un esquema de un ejemplo de desnaturalizante de protemas:
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R6
I
R5 —N +
A y
R4—N N —R2 ^
1 I R3 R1
en donde R puede ser independientemente un miembro seleccionado del grupo que consiste en hidrogeno, un heteroatomo que contiene un radical o un radical hidrocarbonado.
El heteroatomo que contiene un radical es un grupo que comprende un miembro o miembros seleccionados de nitrogeno, oxfgeno, azufre, fosforo, silicio, y boro. Es un objetivo unir un compuesto que contiene guanidina utilizando grupos funcionales reactivos. Los grupos reactivos tipicos que llevan heteroatomos incluyen epoxi, acrilato, maleimida, haluro de acilo, haluro de alquilo, azida, ester de cianato, isocianato, haluro de arilo, aldehfdo, amina, oxima, tiol, alcohol, acido, aziridina, azo, isotiocianato, antndrido, antndrido mixto, lactona, sultona, y cetona.
El radical hidrocarbonado es un grupo que comprende tanto carbono como hidrogeno, aunque tambien puede contener heteroatomos para mejorar la hidrofilicidad. Es un objetivo unir un compuesto que contiene guanidina utilizando grupos funcionales reactivos. Grupos reactivos tfpicos que llevan hidrocarburos incluyen alilo, estirilo, vinilo, y alquino. Heteroatomos que contienen grupos hidrocarbonados incluyen 2, 3 o 4-oxiestirilo, aminoalilo, oxialilo, oxivinilo, aminovinilo.
X es un anion, que es un radical que contiene una o mas carga(s) formales negativas. Un miembro o miembros seleccionados del grupo que consiste en cloruro, tiocianato, sulfato, fosfato, bromuro, clorito, clorato, tiosulfato, carbonato, hidrogeno carbonato, acetato, formiato, hidrogeno fosfato, dihidrogeno fosfato. Se pueden utilizar uno o mas aniones y se pueden utilizar combinaciones de aniones que tengan diversos niveles de carga formal (divalentes, monovalentes, trivalentes). El peso molecular del anion puede variar de 10 a 100.000.
El termino “agente reductor” se refiere a una especie qrnmica que proporciona electrones a otra especie qrnmica. De nuevo, se conocen en la tecnica una variedad de agentes reductores incluyendo ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol (2-ME), y tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) y sus sales relacionadas (por ejemplo, clorhidrato de TCEP). El agente reductor de la presente invencion es TCEP. En realizaciones particulares, la TCEP se puede anadir como su sal de clorhidrato, TCEP-HCl.
Un “tampon” como se utiliza aqrn incluye, por ejemplo, 2-amino-2-hidroximetilpropan-1,3-diol (Tris), acido 2-(N- morfolin) etano sulfonico (MES), acido 3-(N-morfolin) propano sulfonico (MOPS), tampones de citrato, acido 4-(2- hidroxietil)-1-piperazinetanosulfonico (HEPES), y tampones fosfato. Esta lista de posibles tampones es solo con fines ilustrativos. Los expertos en la tecnica reconocenan que el pH del tampon seleccionado para su uso en las composiciones y metodos descritos aqrn es relevante. El pH del tampon estana tfpicamente en el intervalo de 3 a 8.
Como se indico anteriormente, la composicion presente en la matriz solida puede comprender opcionalmente un protector de UV o una trampa de radicales libres. En ciertos aspectos de la invencion, se requiere un protector de UV o una trampa de radicales libres en la composicion del incorporado en la matriz solida seca para la extraccion y almacenamiento de acidos nucleicos. Sin pretender limitarse a ningun protector de UV espedfico, los ejemplos de agentes incluyen, por ejemplo, hidroquinona monometil eter (MEHQ), hidroquinona (HQ), toluhidroquinona (THQ), y acido ascorbico o vitamina C. En ciertos aspectos, la trampa de radicales libres es MEHQ o THQ. Los terminos “protector de UV” y “trampa de radicales libres” se pueden utilizar aqrn indistintamente con respecto al mantenimiento de los acidos nucleicos extrafdos en un estado no modificado para un analisis posterior. La composicion en la matriz solida puede incluir tambien inhibidores de RNasa tales como complejo vanadil ribonucleosido (VRC) o uno cualquiera de los inhibidores de RNasa disponibles comercialmente (por ejemplo, SUPERasa-InTM). Ejemplos de inhibidores de RNasa adicionales se describen en Kumar y colaboradores, (2003) Biochemical and Biophysical Research Communications 300:81-86.
Se proporcionan ademas metodos para utilizar las composiciones descritas aqrn anteriormente. En una realizacion, un metodo para extraer y conservar los acidos nucleicos (por ejemplo, RNA, DNA, o una combinacion de los mismos) comprende las etapas de: a) proporcionar la matriz solida de la invencion; b) aplicar una muestra (por ejemplo, una muestra biologica) a la matriz solida para extraer los acidos nucleicos; c) secar la matriz solida; y d) almacenar los acidos nucleicos en la matriz solida en un estado seco baja condiciones ambientales. En ciertos aspectos del metodo, la matriz solida es un papel poroso basado en celulosa tal como el 903, 31-ETF, o FTA Elute™ disponibles comercialmente. La realizacion de este metodo permite el almacenamiento de acidos nucleicos, particularmente RNA que es ampliamente conocido por ser una biomolecula inestable para almacenar, en un formato seco (por ejemplo, en una matriz solida) bajo temperatura ambiente. Las muestras utilizadas en este metodo
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incluyen pero no se limitan a muestras biologicas tales como sangre, suero, tejidos, mucosa nasal, y saliva obtenidas de cualquier organismo, incluyendo un ser humano.
El metodo descrito anteriormente puede incluir opcionalmente una etapa para recuperar los acidos nucleicos de la matriz solida para un analisis posterior. Por ejemplo, los acidos nucleicos se pueden recuperar mediante rehidratacion de la matriz solida (por ejemplo, papel de celulosa) en una solucion acuosa, una solucion tampon, como se definio anteriormente, o una solucion organica. Alternativamente, los acidos nucleicos se podnan recuperar de la matriz solida mediante electroelucion. Un experto en la tecnica apreciara que cualquier metodo capaz de recuperar los acidos nucleicos de la matriz solida se puede utilizar para practicar los metodos descritos.
En ciertos aspectos, la sal de tiocianato metalico incluye pero no se limita a tiocianato de sodio, tiocianato de potasio, tiocianato de magnesio, tiocianato de calcio, tiocianato de bario, y tiocianato de zinc.
En ciertos aspectos del metodo, la matriz solida es un papel poroso basado en celulosa tal como 903, 31-ETF, o FTA Elute™ disponibles comercialmente. La realizacion de este metodo permite el almacenamiento de los acidos nucleicos, particularmente RNA que es ampliamente conocido por ser una biomolecula inestable para almacenar, en un formato seco (por ejemplo, en una matriz solida) bajo temperatura ambiente. Las muestras utilizadas en este metodo incluyen pero no se limitan a muestras biologicas tales como sangre, suero, tejidos, mucosa nasal, y saliva obtenidas de cualquier organismo, incluyendo un ser humano.
El termino “acido nucleico” se refiere a todas las formas de RNA (por ejemplo, mRNA, miRNA, rRNA, tRNA, piRNA, ncRNA), DNA (por ejemplo, DNA genomico, mtDNA), asf como moleculas de RNA y DNA recombinantes o analogos de DNA o RNA generados utilizando analogos de nucleotidos. Las moleculas de acido nucleico pueden ser monocatenarias o bicatenarias. Las cadenas pueden incluir la cadena codificante o no codificante. Los fragmentos de acidos nucleicos de moleculas de RNA y DNA naturales se abarcan en la presente invencion y se pueden recuperar utilizando las composiciones y metodos descritos. Un “fragmento” se refiere a una porcion del acido nucleico (por ejemplo, RNA o DNA).
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustracion y no como limitacion:
Ejemplos
Ejemplo 1: Analisis de RNA general
Una lmea celular de linfocitos humanos cultivados (es decir, celulas Jurkat) se utilizo como fuente de RNA celular total. Las celulas se secaron en discos de celulosa de 7 mm impregnados con los reactivos indicados, se almacenaron a temperatura ambiente durante 10 dfas en una camara de desecacion, y los acidos nucleicos celulares se electroeluyeron de acuerdo con los protocolos estandar. Brevemente, los discos se rehidrataron con 15 |jL de proteinasa K 2 mg/mL en agua libre de nucleasas para eliminar el exceso de protema y se secaron durante ~30 min. Los pinchazos se colocaron en pocillos individuales de un gel de agarosa Tris-borato-EDTA (TBE) al 1% y se suspendieron en 1X Gel Loading Buffer II que contiene formamida (Ambion). Los acidos nucleicos celulares se sometieron a electroforesis a 110 voltios durante 1-2 horas, y el RNA y DNA se tineron posteriormente con SYBR Gold (Invitrogen) y se detectaron utilizando un Typhoon Imager (GE Healthcare). Todos los equipos y superficies se trataron con RNAZap (Ambion) para conservar la integridad del RNA celular durante y despues de la electroelucion de la celulosa. Estandares internos, incluyendo RNA 6000 Nano Ladder (Agilent Technologies) y RNA total humano purificado de musculo (Origene) se incluyeron en geles de agarosa tanto para controlar la contaminacion de RNasa como identificar las bandas de rRNA de control.
Los electroforetogramas se cuantificaron digitalmente utilizando el software Image J. Brevemente, se dibujo una lmea vertical desde la parte superior a la inferior de cada carril de gel, y se trazo la intensidad de pfxeles (en unidades arbitrarias de valor de gris) como funcion de la distancia de lmea (cm) utilizando la funcion Plot Profile. Los picos correspondientes al DNA genomico y rRNA 28s/18s se identificaron y utilizaron para calcular la relacion de rRNA 28s/18s.
La Fig. 1 proporciona un electroforetograma representativo de los acidos nucleicos recuperados de la celulosa utilizando electroelucion. Se indican las bandas del DNA genomico de alto peso molecular y de rRNA 28s/18s.
La Fig. 1 proporciona ademas la cuantificacion de DNA y RNA utilizando Image J. Se dibujo una lmea vertical desde la parte superior de cada carril a la inferior en el panel A, y se trazo la intensidad de pfxeles (en unidades arbitrarias de valor de gris) como funcion de la distancia de lmea (cm) utilizando la funcion Plot Profile. Los picos correspondientes al DNA genomico y rRNA 28s/18s se “encuadraron”.
Ejemplo 2: Determinacion empmca de las condiciones favorables para la extraccion y almacenamiento del RNA
La finalidad principal de este ejemplo fue evaluar el efecto de cada factor individual y el efecto de la combinacion de los factores ensayados (por ejemplo, agente quelante, tampon, pH, desnaturalizante de protemas, agente reductor, e inhibidor de la RNasa peptfdica) en la conservacion del RNA en el papel de celulosa. Un aspecto adicional de este
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ejemplo fue evaluar la presencia de un agente reductor (DTT) para mejorar potencialmente el efecto del desnaturalizante de la protema.
Las celulas Jurkat se utilizaron otra vez como la fuente del RNA celular total, y las celulas se aplicaron directamente sobre las muestras de papel de celulosa y se secaron al aire para imitar una aplicacion tipica de usuario final. El RNA celular total se recupero por electroelucion, siguiendo el protocolo descrito anteriormente en el Ejemplo 1, en un gel de agarosa al 1% y se analizaron para el contenido en rRNA 28s/18s basandose en estandares conocidos. Las muestras que conteman los componentes listados debajo cada barra en el grafico de la Fig. 2 se almacenaron durante 10 dfas a temperatura ambiente en una camara de desecacion antes del analisis.
Los resultados del Ejemplo 2 se exponen en la Fig. 2. Los numeros sobre cada barra corresponden a la relacion de rRNA 28s a 18s. Una relacion 28s:18s > 1 indica generalmente un RNA intacto. Varias composiciones no lograron estabilizar el rRNA, incluyendo las muestras que carecen del agente reductor (DTT) o SUPERasa-In para inactivar RNasa, o muestras que poseen un pH alcalino. Las muestras que contienen GITC, DTT, y tampon neutro superaron a todas las demas combinaciones de reactivos ensayados.
Ejemplo 3: Determinacion empmca continuada de condiciones favorables para la extraccion y almacenamiento de RNA
Despues de que los componentes clave para conservar el RNA se identificaran en el Ejemplo 2, el Ejemplo 3 se diseno para investigar el efecto de DTT y SDS solos o en combinacion sobre la capacidad para conservar el RNA, y el efecto de una trampa de radicales libres y un agente quelante en el rendimiento de combinaciones de GITC/DTT que mostraban propiedades de estabilizacion del RNA favorables en el Ejemplo 2.
Las celulas Jurkat se aplicaron directamente sobre muestras de papel de celulosa y se secaron al aire para imitar una aplicacion tfpica de usuario final. El RNA celular total se recupero por electroelucion, siguiendo el protocolo descrito anteriormente en el Ejemplo 1, en un gel de agarosa al 1% y se analizaron para el contenido de rRNA 28s:18s basandose en estandares conocidos.
Las muestras de celulosa se almacenaron durante 13 dfas a temperatura ambiente en una camara de desecacion antes del analisis. Los numeros sobre cada barra corresponden a la relacion de rRNA 28s a 18s. Una relacion 28s:18s > 1 indica generalmente un RNA intacto. Los resultados del Ejemplo 3 se proporcionan en la Fig. 3. Las combinaciones GITC/DTT muestran generalmente mejores propiedades de estabilizacion del RNA que las combinaciones SDS/DTT. La suplementacion de cualquier combinacion con un agente quelante (EDTA) dio como resultado una calidad del RNA comparativamente mas baja.
Ejemplo 4: Determinacion empmca continuada de condiciones favorables para la extraccion y almacenamiento de RNA
Despues de que se identificaron los componentes clave adicionales para el almacenamiento de RNA en el Ejemplo 3, el Ejemplo 4 se diseno para investigar si un agente reductor alternativo (TCEP), que tiene una estabilidad mejor y mucho menos olor, podna ser sustituido por DTT. Otro factor introducido en este ejemplo fue el complejo vanadil ribonucleosido (VRC), un inhibidor de RNasa de molecula pequena. Estas sustituciones se compararon y evaluaron para determinar la capacidad de estabilizar el rRNA.
Las celulas Jurkat se aplicaron directamente sobre muestras de papel de celulosa y se secaron al aire para imitar una aplicacion tfpica de usuario final. El RNA celular total se recupero por electroelucion, siguiendo el protocolo descrito anteriormente en el Ejemplo 1, en un gel de agarosa al 1% y se analizaron para determinar el contenido de rRNA 28s:18s basandose en estandares conocidos. Las muestras de celulosa se almacenaron durante 10 dfas a temperatura ambiente en una camara de desecacion antes del analisis. Los numeros encima de cada barra corresponden a la relacion de rRNA 28s a 18s. Una relacion de 28s:18s > 1 indica generalmente un RNA intacto. Los resultados del Ejemplo 4 se proporcionan en la Fig. 4. TCEP y DTT se pueden utilizar indistintamente para estabilizar el RNA en varias composiciones de sustrato.
Ejemplo 5: Rendimiento a largo plazo de composiciones seleccionadas para el almacenamiento de RNA en celulosa
El Ejemplo 5 se diseno para evaluar el rendimiento a largo plazo de composiciones seleccionadas despues de 30 dfas de almacenamiento a temperatura ambiente. Las celulas Jurkat se aplicaron directamente sobre las muestras de papel de celulosa y se secaron al aire para imitar una aplicacion tfpica de usuario final. El RNA celular total se recupero por electroelucion, siguiendo el protocolo descrito anteriormente en el Ejemplo 1, en un gel de agarosa al 1% y se analizaron para determinar el contenido de rRNA 28s:18s basandose en estandares conocidos. Las muestras de celulosa se almacenaron durante 30 dfas a temperatura ambiente en una camara de desecacion antes del analisis. Los numeros encima de cada barra corresponden a la relacion de rRNA 28s a 18s. Una relacion de 28s:18s > 1 indica generalmente un RNA intacto. Los resultados del Ejemplo 5 se exponen en la Fig. 5.
Ejemplo 6: Analisis de estabilidad de RNA en manchas de sangre seca
El ejemplo 6 se diseno para evaluar el rendimiento de una composicion de papel estabilizadora de RNA seleccionado (GITC/TCEP/MEHQ) con sangre total fresca en una variedad de condiciones de tampon. Aproximadamente 50 pL de sangre total de rata se recogieron de la vena de la cola de un sujeto de ensayo y se colocaron en el papel FTA o papel estabilizador de RNA preparado con los componentes de tampon indicados. Las 5 tarjetas se secaron y se almacenaron a temperatura ambiente pero con la humedad controlada (-20% de humedad relativa) durante 5 a 22 dfas. El RNA se extrajo de un punzon central de 7 mm en un tampon de lisis y se purifico a traves de una columna de centrifugado de membrana de sflice de acuerdo con los protocolos conocidos en la tecnica. Despues de la purificacion y elucion, los Numeros de Integridad del RNA (RIN) se midieron en un Bioanalizador Agilent 2100 utilizando RNA 6000 Pico LabChips. Por convencion, RIN > 5 son buenos pero RIN > 6 10 son los mejores para los analisis cuantitativos posteriores tales como aplicaciones RT-PCR o de micromatrices. Los resultados del Ejemplo 6 se presentan en la Fig. 6. La calidad general del RNA de esta composicion de papel seleccionada (GITC/TCEP/MEHQ) en todas las composiciones de tampon ensayadas supero el rendimiento del papel FTA.
Ejemplo 7: Impacto de la proteccion UV en la estabilidad del RNA
15 El Ejemplo 7 se diseno para demostrar la proteccion del mRNA mediante inhibidores de UV y trampas de radicales libres presentes en la matriz seca seleccionada (GITC/TCEP/Tris). El RNA Jurkat total libre de DNA (1 pg) se encontro por duplicado en un papel estabilizador de RNA que contema los componentes indicados. Cada tarjeta se dividio y una mitad se mantuvo en la oscuridad a 35°C durante 20 horas, mientras que la otra se trato en una camara de ensayo Q-SUN Xe-1 Xenon durante 20 horas (35°C, 0,3 W/cm2, 340 nm) para replicar todo el espectro de 20 energfa de la luz solar (21,7 KJ/m2 de energfa total). Se tomo una puncion de 1,2 mm de cada muestra y se dejo caer directamente en las reacciones de transcriptasa inversa para crear una biblioteca de cDNA, que despues se sondo frente a cebadores espedficos para HPRT1 y mRNA de clatrina mediante qPCR. Los umbrales de ciclo (Ct) para las muestras expuestas a UV se restaron de las Ct de las parejas de companeros sin tratar almacenadas en la oscuridad. Los resultados del Ejemplo 7 se presentan en la Fig. 7. La Vitamina C se utiliza como sinonimo en la 25 figura para el acido ascorbico.
Ejemplo 8: Estabilidad del agente reductor en papel bajo condiciones ambientales
El papel basado en celulosa 31ETF de Whatman™ se sumergio en concentraciones crecientes de TCEP o DTT en presencia de GITC en tampon Tris, pH 7,4. Los papeles basados en celulosa se almacenaron a temperatura ambiente sin regulacion de la humedad. A los dfas 5, 19, y 105 se coloco acido 5,5'-ditio-bis(2-nitrobenzoico) 30 (“DTNB”) en cada muestra de papel. En presencia de un agente reductor activo, se observo un cambio instantaneo de color a amarillo. Hasta 105 dfas de almacenamiento bajo condiciones ambientales, el papel de celulosa recubierto de la solucion de TCEP, en todas las concentraciones, estaba todavfa activo y podfa reducir el DTNB, segun lo indicado por un cambio visible en el color del papel de blanco a amarillo. Las muestras de papel sumergidas en DTT no pudieron reducir el DTNB y, en consecuencia, el color del papel permanecio blanco. Estas 35 figuras no transmiten su significado en blanco y negro y, como tales, no se han incluido aqu pero estan disponibles a solicitud del Examinador. La reaccion qrnmica relevante para la reduccion de DTNB se proporciona en Cline y colaboradores (2004) Biochemistry 43: 15195-15203.
Ejemplo 9: Analisis cualitativo del envejecimiento de los agentes reductores
Las muestras de papel de celulosa 31-ETF conteman GITC en tampon Tris, pH 7,4, con diferentes concentraciones 40 de agentes reductores TCEP y DTT. Las muestras de papel se almacenaron bajo las siguientes condiciones diferentes: 1) 21°C, 10% de humedad relativa; 2) 21°C, 80% de humedad relativa; y 3) 41°C, 10% de humedad relativa.
Al dfa 0, 1, 6, y 25, una muestra de 10 mg de papel de celulosa bajo cada condicion se coloco en una solucion de DTNB, se agito brevemente y se tomaron imagenes en color. En el dfa 1, todas las muestras de TCEP en cada una 45 de las condiciones ambientales pudieron cambiar el color de la solucion de DTNB a amarillo, lo que indica que aun podfa funcionar como un agente reductor. A diferencia, la DTT no logro que las muestras se volvieran amarillas en presencia de DTNB, incluso a 21°C y 10% de humedad relativa. En el dfa 25, el papel de TCEP almacenado a 21°C y 10% de humedad relativa continuo mostrando una actividad reductora funcional. Sin embargo, un aumento en la humedad o en la temperatura dio como resultado una disminucion notable en la actividad de TCEP como agente 50 reductor, lo que indica que tanto la temperatura como la humedad son factores relevantes en la funcion de TCEP como agente reductor.
Ejemplo 10: Analisis cualitativo de la actividad de TCEP en el papel basado en celulosa
Se prepararon composiciones de TCEP que comprenden ademas GITC y MEHQ en diferentes tampones (Tris, pH 7,4; MES, pH 6,2; y MOPS, pH 7,0) y una muestra de control que no comprende tampon. El papel basado en 55 celulosa se recubrio despues, cada uno con una de las disoluciones anteriores, se seco rapidamente a 50°C en un horno con soplado de aire, se sello con desecantes en bolsas de papel de aluminio para mantener baja la humedad y despues se almaceno a 4°C, temperatura ambiente, o 41°C.
5
10
15
20
25
30
En las semanas indicadas en la Figura (0, 1 y 4), la actividad de TCEP se analizo utilizando un ensayo colorimetrico de DTNB en el que se anadio DTNB a cada perforacion de papel de 3,6 mm, se agito durante 30 minutes, y despues se midio la absorbancia del lfquido a 412 nm.
Todas las muestras se mantuvieron estables a 4°C con aproximadamente una actividad del 100% a un mes. Despues de un mes a temperatura ambiente, la actividad de TCEP mostro una variabilidad basada en el tampon utilizado (por ejemplo, MOPS (100%) > Sin tampon (90%) > MES (86%) > Tris (81%)). Despues de un mes a 41°C, todavfa se observo la variabilidad en la actividad de TCEP (por ejemplo, MOPS (67%) > mEs (63%) > Tris (48%) > Sin tampon (39%)). En general, el poder reductor de TCEP en la celulosa fue mas alto en presencia de tampon MOPS en las condiciones ambientales ensayadas.
Ejemplo 11: Condiciones para la preparacion de un sustrato robusto, almacenamiento en seco a temperatura ambiente, y extraccion y analisis del RNA
Se utilizo una lmea celular de linfocitos humanos cultivados, mas particularmente la lmea celular Jurkat, para proporcionar una muestra de RNA celular total. Las celulas se pusieron en discos de celulosa de 7 mm impregnados con los reactivos indicados en la siguiente tabla en las concentraciones especificadas. Los discos que contienen los reactivos que se exponen a continuacion se prepararon mediante un protocolo de “inmersion” en el que piezas ( ~ 25,81 cm2, (~4 pulgadas2)) de papel de celulosa (papel Whatman™ 31-ETF) se saturaron al colocar el papel Whatman™ 31-ETF en placas de Petri de las disoluciones de inmersion que conteman las cantidades de los reactivos indicados en la Tabla 1. Las disoluciones de inmersion se prepararon anadiendo agua desionizada a la sal de tiocianato indicada (por ejemplo, NaSCN, KSCN, NH4SCN, Ca(SCN)2, Mg(SCN)2, Ba(SCN)2, Co(SCN)2, Zn(SCN)2, o NaClO4), mOpS, TCeP-HCI, y MEHQ o THQ para lograr las concentraciones deseadas de cada uno de estos reactivos en las disoluciones de inmersion. Las disoluciones de inmersion se agitaron en un vortice para asegurar la disolucion completa de los reactivos solidos, y el pH de cada una de las disoluciones de inmersion final se determino de acuerdo con los metodos conocidos en la tecnica.
Tabla 1: Concentraciones de reactivos en las disoluciones de revestimiento por inmersion
Sal
[-SCN] [TCEP-HCl] [MOPS] [MEHQ] [THQ] pH
(mM) (mM) (mM) (mM) (mM)
NaSCN
420 35 96 40 0 2,0
NaSCN
420 35 88 40 0 4,5
NaSCN
420 35 88 40 0 7,0
NaSCN
308 35 88 40 0 4,6
NaSCN
208 35 88 40 0 4,3
NaSCN
104 35 88 40 0 5,0
KSCN
420 35 88 40 0 4,5
NH4SCN
420 35 88 40 0 4,5
Ca(SCN)2
424 35 96 0 40 3,3
Mg(SCN)2
424 35 96 0 40 3,3
Ba(SCN)2
424 35 96 0 40 3,3
Co(SCN)2
424 35 96 0 40 3,2
Zn(SCN)2
424 35 96 0 40 3,2
NaClO4
424 35 96 0 40 3,2
Una vez que el papel de celulosa se saturo, el exceso de solucion se elimino con un rodillo de presion y el papel se seco a 50°C bajo una corriente de gas N2. Se aplicaron celulas Jurkat (por ejemplo, una fuente de RNA celular total) al sustrato de papel seco que comprende la combinacion de los reactivos indicados en la Tabla 1. Los sustratos de celulosa que comprenden el RNA celular total de las celulas Jurkat junto con los reactivos como en la tabla anterior se secaron y se almacenaron a temperatura ambiente durante 7-17 dfas en una camara de desecacion mantenida a -20% de humedad relativa (RH).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
El RNA celular se extrajo de cada muestra de celulosa y se midio de acuerdo con los protocolos estandar. Brevemente, las muestras de celulosa se rehidrataron con 15 pL de proteinasa K 4mg/mL y el RNA celular se extrajo de la matriz de celulosa en un tampon de lisis y se purifico en columnas de centrifugado de membrana de sflice de acuerdo con los protocolos conocidos en la tecnica. Despues de la purificacion y elucion en agua libre de nucleasas, los Numeros de Integridad del RNA (RIN) se midieron en un Bioanalizador Agilent 2100 utilizando RNA 6000 Pico LabChips. Por convencion, RIN > 5 se consideran buenos pero RIN >6 se consideran preferibles para los analisis cuantitativos posteriores tales como aplicaciones RT-PCR o de micromatrices.
Los resultados del Ejemplo 11 se exponen en la Fig. 9. Se observo que el NaSCN podfa sustituirse directamente por GuSCN para extraer y estabilizar el RNA celular a temperatura ambiente. A diferencia del caso de GuSCN, este fenomeno fue independiente del pH de la disolucion final utilizado para impregnar el papel de celulosa (pH 4 o pH 7). Debido a que GuSCN contiene un cation guanidinio que actua como una base debil a un pH neutro, se supone que GuSCN puede provocar la hidrolisis alcalina del RNA a un pH 7. Tambien se observaron fuertes propiedades de estabilizacion del RNA para sales de tiocianato relacionadas que conteman cationes de metal o de amonio, pero no para una sal de perclorato utilizada comunmente para extraer acidos nucleicos. De estas sales inorganicas relacionadas, las sales de tiocianato con los cationes metalicos del Grupo 1 y Grupo 2 (por ejemplo, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Ba2+) demostraron ser mas efectivas en la estabilizacion del RNA (RIN > 5). Un experto en la tecnica apreciana que los cationes metalicos, especialmente cationes divalentes, son cofactores estimuladores de las enzimas RNasa y RNAs catalfticos (por ejemplo, ribozimas). Por lo tanto, la aplicabilidad de las sales de tiocianato basadas en Mg2+ o Ca2+ a la conservacion del RNA no habna sido anticipada por los expertos en la tecnica.
Ejemplo 12: Analisis de estabilidad de RNA de manchas de sangre secas
El ejemplo 12 se diseno para evaluar el rendimiento de tres diferentes sales inorganicas para estabilizar el RNA celular total de la sangre total. Se recogieron aproximadamente 50 pL de sangre total de rata de la vena de la cola de un sujeto de ensayo y se colocaron sobre papel tratado qmmicamente que contema las sales indicadas en concentraciones equimoleculares en combinacion con un agente reductor (por ejemplo, TCEP), un tampon (por ejemplo, Tris), y un antioxidante (por ejemplo, THQ) en un formato seco. Los papeles de celulosa secos tratados qmmicamente se prepararon esencialmente como se describio anteriormente en el Ejemplo 11. Las manchas de sangre en los papeles de celulosa impregnados qmmicamente se secaron y almacenaron a temperatura ambiente a una humedad controlada de aproximadamente 20% de humedad relativa durante 19 dfas. El RNA se extrajo de una puncion central de 7 mm en un tampon de lisis y se purifico a traves de una columna de centrifugado de membrana de sflice de acuerdo con los protocolos conocidos en la tecnica. Despues de la purificacion y elucion, los Numeros de Integridad del RNA (RIN) se midieron para cada muestra en un Bioanalizador Agilent 2100 RNA 6000 Pico LabChips. Otra vez, un RIN >5 se considera bueno pero un RIN > 6 se considera preferible para los analisis cuantitativos posteriores tales como aplicaciones RT-PCR o de micromatrices.
Los resultados del Ejemplo 12 se exponen en la Fig. 10. Las sales de tiocianato indicadas impregnadas en los sustratos de papel de celulosa en el Ejemplo 11 fueron igualmente eficaces para extraer y estabilizar el RNA de la sangre de rata a temperatura ambiente. Sobre la base de estos resultados el experto en la tecnica apreciana que se pueden utilizar sales de tiocianato relacionadas para practicar los metodos descritos.
Las formas singulares “un”, “una” y “el” incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El lenguaje de aproximacion, como se utiliza aqm a lo largo de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones, se puede aplicar para modificar cualquier representacion cuantitativa que pueda variar de manera permisible sin dar lugar a un cambio en la funcion basica con la que esta relacionada. En consecuencia, un valor modificado por un termino como “aproximadamente” no se limita al valor preciso especificado. En algunos casos, el lenguaje aproximado puede corresponder a la precision de un instrumento para medir el valor. Donde fue necesario, se suministraron rangos, y esos rangos incluyen todos los subrangos entre ellos.

Claims (11)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Una matriz solida seca para la extraccion y el almacenamiento de acidos nucleicos de una muestra, en donde una composicion comprende al menos un tiocianato metalico que comprende un cation metalico del Grupo 1 o Grupo 2, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), y se incorpora un tampon en la matriz solida seca, y la matriz se seca despues, en donde la matriz solida es una matriz porosa que comprende celulosa, acetato de celulosa, fibra de vidrio o cualquier combinacion de los mismos.
  2. 2. La matriz solida seca de la reivindicacion 1, en donde dicho cation metalico del Grupo 1 o Grupo 2 se selecciona del grupo que consiste en Na+, K+, Li+, Mg2+, Ca2+, y Ba2+.
  3. 3. La matriz solida seca de la reivindicacion 1, en donde la composicion presente en la matriz solida comprende ademas un inhibidor de UV, una trampa de radicales libres, un quelante, o cualquier combinacion de los mismos.
  4. 4. La matriz solida seca de la reivindicacion 1, en donde la composicion incorporada en la matriz solida seca comprende ademas un inhibidor de RNasa.
  5. 5. La matriz solida seca de la reivindicacion 1, en donde los acidos nucleicos son RNA.
  6. 6. La matriz solida seca de la reivindicacion 1, en donde el tampon se selecciona del grupo que consiste en 2-
    amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol (Tris), acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico (MES), acido 3-(N-
    morfolino)propanosulfonico (MOPS), acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfonico (HEPES), un tampon citrato, y un tampon fosfato.
  7. 7. La matriz solida seca de la reivindicacion 3, en donde el protector de UV o la trampa de radicales libres se selecciona del grupo que consiste en hidroquinona monometil eter (MEHQ), hidroquinona (HQ), toluhidroquinona (THQ), y acido ascorbico.
  8. 8. La matriz solida seca de la reivindicacion 4, en donde el inhibidor de RNasa es el complejo vanadil ribonucleosido (VRC), un analogo de nucleotido, o un inhibidor de RNasa disponible comercialmente y dicha matriz solida comprende ademas una trampa de radicales libres, en donde la trampa de radicales libres comprende MEHQ o THQ.
  9. 9. La matriz solida seca de la reivindicacion 1, en donde la matriz solida es una matriz porosa basada en celulosa y:
    a) la sal de tiocianato metalico se compone de un cation metalico del Grupo 1 o Grupo 2;
    b) el agente reductor es TCEP; y
    c) el tampon es MOPS.
  10. 10. Un metodo para extraer y almacenar acidos nucleicos de una muestra que comprende:
    a) proporcionar una matriz solida seca para extraer y almacenar los acidos nucleicos de una muestra, en donde una composicion se incorpora en la matriz solida seca que comprende un tiocianato metalico que comprende un cation metalico del Grupo 1 o Grupo 2, TCEP, y un tampon en donde la matriz solida seca es una matriz porosa que comprende celulosa, acetato de celulosa, fibra de vidrio o cualquier combinacion de los mismos;
    b) secar la matriz solida despues de la incorporacion de la composicion en la matriz solida seca;
    c) aplicar una muestra a una matriz solida seca para recoger los acidos nucleicos;
    d) secar la matriz solida que comprende los acidos nucleicos; y
    e) almacenar los acidos nucleicos en la matriz solida en un estado seco bajo condiciones ambientales.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 10, en donde dicho cation metalico se selecciona del grupo que consiste en Na+, K+, Li+, Mg2+, Ca2+, y Ba2+.
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