ES2609763T3 - Métodos y composiciones para la extracción y el almacenamiento de ácidos nucleicos - Google Patents

Métodos y composiciones para la extracción y el almacenamiento de ácidos nucleicos Download PDF

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Abstract

Una matriz sólida para extracción y almacenamiento de ácidos nucleicos a partir de una muestra, en donde la matriz sólida está impregnada con una composición que comprende al menos un desnaturalizante de proteínas, al menos un agente reductor, un protector UV y está presente un tampón en la matriz sólida en un estado seco y donde la matriz sólida es una matriz porosa que comprende celulosa, acetato de celulosa, fibra de vidrio, o cualquier combinación de los mismos y donde el desnaturalizante de proteínas se selecciona de hidrocloruro de guanidinio, tiocianato de guanidinio (GITC), arginina, dodecilsulfato sódico (SDS), urea, y cualquier combinación de los mismos; el agente reductor se selecciona de ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol (2-ME), tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), y una combinación de los mismos; y el protector UV se selecciona de monometil éter de hidroquinona (MEHQ), hidroquinona (HQ), toluhidroquinona (THQ), y ácido ascórbico.

Description

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DESCRIPCION
Metodos y composiciones para la extraccion y el almacenamiento de acidos nucleicos Campo de la invencion
La presente invencion se refiere normalmente a composiciones solidas para la extraccion, estabilizacion y conservacion ambiental de acidos nucleicos a partir de una muestra biologica en un formato seco. Tambien se describen metodos para extraer, recoger, conservar y recuperar acidos nucleicos a partir de composiciones solidas.
Antecedentes
El ARN es una de las biomoleculas mas inestables como consecuencia de la degradacion tanto de la propia hidrolisis qmmica como de la degradacion mediada por enzimas. Por consiguiente, la extraccion y conservacion del ARN derivado de una muestra biologica es sensible a un numero de factores ambientales que incluyen pero no se limitan al tampon utilizado para extraer o recoger el ARN, pH, temperatura, y particularmente la presencia generalizada de ribonucleasas resistentes (RNasas). Como resultado, el ARN en ambos estados purificado y no purificado normalmente ha requerido de almacenamiento a -80°C para prevenir la hidrolisis y la degradacion enzimatica y conservar la integridad de la muestra de ARN. La capacidad para extraer, recoger, y conservar el ARN bajo condiciones ambientales es deseable economicamente para evitar los costes y el espacio requeridos que se asocian con la refrigeracion a -80°C.
Las metodologfas actuales para conservar el ARN bajo condiciones ambientales en un estado lfquido se han focalizado en la desactivacion de las RNasas a traves del uso de, por ejemplo, detergentes, compuestos caotropicos, agentes reductores, metales de transicion, disolventes organicos, agentes quelantes, proteasas, inhibidores de la RNasa peptfdica, y anticuerpos anti-RNasa. Se han focalizado esfuerzos adicionales en la modificacion qmmica del aRn para prevenir la transesterificacion y la auto-hidrolisis. Muchos productos de conservacion de ARN estan disponibles comercialmente pero solo pueden conservar el ARN durante dfas o semanas a temperatura ambiente. Las tecnologfas actuales que reclaman la recoleccion y conservacion eficaz del ARN en un formato seco normalmente requieren que el ARN primero se “pre-purifique” y concentre a partir del material biologico (por ejemplo, muestras tales como sangre, suero, tejido, saliva, etc.) antes del almacenamiento del ARN.
Las tecnologfas actuales para la conservacion del ARN en un formato seco requieren de instalaciones de secado adicionales. Estos metodos no conducen por lo tanto a la recoleccion directa de ARN a partir de una muestra (por ejemplo, una muestra biologica) sin un procesado significativo de la muestra.
Por consiguiente, son deseables y necesarios en la tecnica composiciones y metodos que integren dentro de un unico proceso la extraccion, la estabilizacion, y el almacenamiento/conservacion de ARN a partir de una muestra (por ejemplo, una muestra biologica). Tales composiciones y metodos permitiran el almacenamiento a largo plazo del aRn bajo condiciones ambientales y permitiran recuperar el ARN intacto para posteriores analisis.
Breve descripcion
Se describe una matriz solida para la extraccion y almacenamiento de acidos nucleicos a partir de una muestra, tal como una muestra biologica como se define mas abajo en la presente memoria, en donde una composicion que comprende un desnaturalizante de protemas, un agente reductor, y un tampon esta presente en la matriz solida en un formato seco. La aplicacion instantanea de las matrices solidas permiten un almacenamiento prolongado del ARN y del ADN en un formato seco bajo condiciones ambientales. Las matrices solidas que comprenden acidos nucleicos (por ejemplo, ARN) en un formato seco se pueden someter a un proceso para liberar los acidos nucleicos desde la matriz solida en un formato intacto que es adecuado para analisis posteriores de las muestras de acido nucleico obtenido. Se proporcionan tambien metodos de utilizacion de las matrices solidas de la invencion para extraer y almacenar acidos nucleicos a partir de una muestra biologica.
Dibujos
Estas y otras caractensticas, aspectos, y ventajas de las membranas porosas qmmicamente modificadas se entenderan mejor cuando se lean las siguientes descripciones detalladas en referencia a los dibujos que acompanan, en los que las caractensticas se presentan como partes, a traves de los dibujos, en donde:
La FIG. 1 proporciona un electroferograma representativo de acidos nucleicos recuperados a partir de celulosa utilizando electro-elucion despues de detectar celulas humanas cultivadas en matrices solidas de diferentes composiciones. Se indican bandas de DNA genomico de alto peso molecular y ARNr 28s/18s. Se proporciona ademas la cuantificacion de ADN y ARN utilizando Image J. Se dibujaron una vertical desde la cima de cada carril hasta la base en el panel A, y la intensidad de pfxeles (unidades arbitrarias del valor gris) se trazo en funcion de la lmea de distancia (cm) utilizando la funcion Dibujar Perfil. En las cajas se muestran los picos correspondientes al ADN genomico y al ARNr 28s/18s. En la seccion de Ejemplos de abajo se establecen detalles experimentales adicionales.
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La FIG.2 proporciona las intensidades de pfxeles del gel, presentadas como unidades arbitrarias del valor gris, para ARNr 28s y 18s para cada una de las composiciones representadas. Las muestras de celulosa se almacenaron durante 10 dfas a temperatura ambiente en un cabina desecadora antes del analisis. La relacion de ARNr 28s para el 18s se indica encima de cada barra en la grafica. En la seccion de Ejemplos de abajo se establecen detalles experimentales adicionales.
La FIG. 3 proporciona las intensidades de pfxeles del gel para el ARNr 28s y 18s para cada una de las composiciones representadas. Las muestras de celulosa se almacenaron durante 13 dfas a temperatura ambiente en una cabina desecadora antes del analisis. La relacion de ARNr 28s para el 18s para cada una de las condiciones
experimentales aparece encima de cada barra en la grafica. En la seccion de Ejemplos de abajo se establecen
detalles experimentales adicionales.
La FIG. 4 proporciona las intensidades de pfxeles del gel para el ARNr 28s y 18s para cada una de las composiciones representadas. Las muestras de celulosa se almacenaron durante 10 dfas a temperatura ambiente en una cabina desecadora antes del analisis. La relacion de ARNr 28s para el 18s para cada una de las condiciones
experimentales aparece encima de cada barra en la grafica. En la seccion de Ejemplos de abajo se establecen
detalles experimentales adicionales.
La FIG. 5 proporciona las intensidades de pfxeles del gel para las bandas de ARNr 28s y 18s para cada una de las composiciones mostradas. Las muestras de celulosa se almacenaron durante 30 dfas a temperatura ambiente en una cabina desecadora antes del analisis. La relacion de ARNr 28s para el 18s para cada una de las condiciones experimentales aparece encima de cada barra en la grafica. En la seccion de Ejemplos de abajo se establecen detalles experimentales adicionales.
La FIG.6 proporciona los Numeros de Integridad del ARN (RIN) medidos a partir de las gotas de sangre seca en papel de celulosa, como se determino en un Bionalizador Agilent 2100 usando ARN 6000 Pico LabChips para cada una de las condiciones enumeradas. En la seccion de Ejemplos de abajo se establecen detalles experimentales adicionales.
La FIG.7 proporciona la evidencia de la proteccion del ARNm contra el dano solar en el papel de celulosa. Cada barra en la grafica representa la diferencia de los umbrales del ciclo qRT-PCR entre las muestras tratadas con UV y las no tratadas que comprenden las composiciones indicadas en la figura. En la seccion de Ejemplos de abajo se establecen detalles experimentales adicionales.
La FIG.8 proporciona la actividad TCEP en los papeles basados en celulosa en presencia de diferentes tampones y a diferentes temperaturas durante un periodo de 4 semanas. En la seccion de Ejemplos se proporcionan detalles adicionales.
Descripcion detallada
En la presente memoria se describen matrices solidas para la extraccion y almacenamiento de acidos nucleicos (por ejemplo, ARN, ADN, o una combinacion de los mismos) a partir de una muestra (por ejemplo, una muestra biologica), en donde en la matriz solida esta presente una composicion en un estado seco que comprende un desnaturalizante de protemas, un agente reductor, y un tampon. Las composiciones de la invencion permiten la conservacion seca prolongada de acidos nucleicos bajo condiciones de almacenamiento ambientales. Esta observacion es de una importancia particular con respecto a la conservacion ambiental del ARN, el cual es muy conocido por ser inestable. El termino “matriz solida” como se utiliza en la presente memoria incluye pero no se limita a productos basados en celulosa, celulosa, acetato de celulosa, fibras de vidrio, o cualquier combinacion de los mismos. Una matriz solida de la presente aplicacion puede ser porosa. En realizaciones particulares, la matriz solida es un papel de celulosa porosa de Whatman™, tales como FTAtm o FTAtm Elute. El termino “extraccion” se refiere a cualquier metodo para separar y aislar los acidos nucleicos a partir de una muestra, mas particularmente una muestra biologica. Se pueden recuperar acidos nucleicos tales como ARN y ADN, por ejemplo durante la lisis celular de la muestra por evaporacion en el aire o por la presencia de compuestos en una matriz solida qmmicamente modificada que en contacto con las muestras dan como resultado la lisis celular y la liberacion de los acidos nucleicos (por ejemplo, papeles de celulosa FTATM Elute). Un experto en la tecnica apreciara que se puede usar en las composiciones y metodos descritos cualquier metodo que de como resultado la extraccion de acidos nucleicos, particularmente ARN, a partir de una muestra (por ejemplo, una muestra biologica sin purificar) tal que se capturen los acidos nucleicos en la matriz solida para la estabilizacion y conservacion de los acidos nucleicos. Los ejemplos anteriores de los metodos para la extraccion de acidos nucleicos a partir de una muestra se proporcionan solo con fines ilustrativos. Los terminos “almacenamiento” o “conservacion” se pueden utilizar de forma intercambiable en la presente memoria con respecto a la conservacion de los acidos nucleicos extrafdos en un formato adecuado para posteriores analisis.
Los artesanos expertos en el campo de los acidos nucleicos, particularmente el ARN, tradicionalmente ensayan la estabilidad y calidad del ARN en base a: (1) la amplificacion RT-PCR cuantitativa de los ARNm dianas; (2) el analisis del Numero de Integridad del ARN (RIN) en un Bioanalizador Agilent 2100; y (3) la razon de ARN ribosomal (ARNr) 28s:18s, que comprende la mayona del ARN celular total. El ARN celular de alta-calidad se muestra generalmente
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en una razon de ARNr 28s:18s mayor de 1 y a una puntuacion RIN proxima a 10. Por otra parte, el ARN celular de alta-calidad ayuda a la amplification eficiente de tanto el ARNm de baja abundancia como el ARNm de gran abundancia (por ejemplo mayor de 1 kB). Por razones de conveniencia, se utilizan frecuentemente la intensidad de la senal de ARNr y la razon de ARNr 28s:18s para cribado rapido e identification de muestras con fuertes propiedades de almacenamiento de ARN por electroforesis en gel.
Como se define en la presente memoria, una “muestra biologica” incluye pero no se limita a sangre, suero, tejido, y saliva obtenida a partir de cualquier organismo, incluyendo un ser humano. Las muestras biologicas se pueden obtener mediante un test auto-diagnostico al que se somete un individuo (por ejemplo, monitorizacion de la glucosa en sangre) o mediante un profesional medico cualificado a traves de una variedad de tecnicas que incluyen, por ejemplo, aspiration de la sangre utilizando una aguja o raspado o hisopado de un area particular, tal como una lesion en la piel del paciente. Los metodos para la recogida de las distintas muestras biologicas son bien conocidos en la tecnica. El termino “muestra” incluye muestras biologicas como se definio anteriormente, pero tambien incluye, por ejemplo, celulas cultivadas de tejidos y acidos nucleicos purificados.
En la matriz solida seca de esta divulgation esta presente una composition que comprende un desnaturalizante de protelnas, un agente reductor, y un tampon. La composicion puede comprender uno o mas de cada uno de los componentes enumerados anteriormente. La composicion puede comprender ademas opcionalmente un inhibidor ultravioleta (UV), un recolector de radicales libres, un inhibidor de RNasa, un quelante, o cualquier combination de los mismos. El artesano experto en la tecnica apreciara que son conocidas en la tecnica numerosas protelnas desnaturalizadas y que se pueden seleccionar emplricamente para usarse en las composiciones y metodos que aqul se describen. Sin la intention de limitar a un desnaturalizante de protelnas particular, ejemplos de protelnas desnaturalizadas incluyen tiocianato de guanidinio, hidrocloruro de guanidinio, arginina, dodecilsulfato sodico (SDS), urea, o cualquier combinacion de los mismos. Debajo se indica un esquema de un ejemplo de un desnaturalizante de protelnas:
RS
R6
■N *
imagen1
imagen2
En donde cada radical R puede ser independientemente un miembro que se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno, un radical que contiene un heteroatomo o un radical hidrocarburo.
El radical que contiene el heteroatomo es un grupo que comprende un miembro o miembros seleccionados a partir de nitrogeno, oxlgeno, azufre, fosforo, silicio, y boro. Un objetivo es unir un compuesto que contiene una guanidina utilizando grupos funcionales reactivos Grupos reactivos tlpicos que llevan heteroatomos incluyen epoxido, acrilato, maleimida, haluro de acilo, haluro de alquilo, azida, ester de cianato, isocianato, haluro de arilo, aldehldo, amina, oxima, tiol, alcohol, acido, aziridina, azo, isotiocianato, anhldrido, anhldrido mixto, lactona, sultona, y cetona.
El radical hidrocarburo es un grupo que comprende tanto carbono como hidrogeno, aunque tambien puede contener heteroatomos para mejorar la hidrofilia. Un objetivo es unir un compuesto que contiene una guanidina utilizando grupos funcionales reactivos. Grupos reactivos tlpicos que llevan hidrocarburo incluyen alilo, estirilo, vinilo, y alquino. Grupos hidrocarburos que contienen heteroatomos incluyen 2,3 o 4-oxiestirilo, aminoalilo, oxialilo, oxivinilo, aminovinilo.
X es un anion, que es un radical que contiene uno o mas cargas negativas formales. Un miembro o miembros que se seleccionan del grupo que consiste en cloruro, tiocianato, sulfato, fosfato, bromuro, clorito, clorato, tiosulfato, carbonato, carbonato de hidrogeno, acetato, formiato, fosfato de hidrogeno, fosfato de dihidrogeno. Esta previsto que se puedan usar uno o mas aniones y combinaciones de aniones que tienen varios niveles (divalente, monovalente, trivalente) de cargas formales. El peso molecular del anion puede variar de 10-100.000.
El termino “agente reductor” se refiere a unas especies qulmicas que proporcionan electrones a otras especies qulmicas. De nuevo, son conocidos en la tecnica una variedad de agentes reductores, y la lista de ejemplos que se proporciona abajo y en las reivindicaciones no pretenden limitar el agente o agentes reductores que se podrlan usar en las composiciones y metodos de la presente divulgacion. Ejemplos de agentes reductores incluyen ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol (2-ME), y tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP). Por otra parte, se puede utilizar cualquier combinacion de estos u otros agentes reductores para ensayar la invention. En realizaciones particulares, el agente reductor es TCEP.
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“Tampon” como se emplea en la presente memoria incluye, por ejemplo, 2-Amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol (Tris), acido 2-(W-morfolino)etanosulfonico (MES), acido 3-(A/-morfolino)propanosulfonico (MOPS), tampones citrato, acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfonico (HEPES), y tampones fosfato. Esta lista de tampones potenciales solo es con fines ilustrativos. El artesano experto en la tecnica reconocera que el pH del tampon seleccionado es relevante para el uso en la composicion y metodos descritos en la presente memoria. El pH del tampon estara normalmente en el intervalo de 3 a 8.
Como se indico anteriormente, la composicion presente en la matriz solida puede comprender opcionalmente un protector UV o un recolector de radicales libres. Sin intencion de limitar a ningun protector UV espedfico, ejemplos de agentes incluyen, por ejemplo, monometil eter de hidroquinona (MEHQ), hidroquinona (HQ), toluhidroquinona (THQ), y acido ascorbico. En determinados aspectos, el radical libre es MEHQ. La composicion en la matriz solida puede incluir tambien inhibidores RNasa tales como el complejo vanadil ribonucleosido (VRC) o cualquiera de los inhibidores RNasa disponibles comercialmente (por ejemplo SuPERasa-InTM). Se describen ejemplos de inhibidores de RNasa adicionales en Kumar et al. (2003) Biochemical and Biophysical Research Communications 300:81-86, que se incorporan en la presente memoria en referencia a su conjunto.
Se proporcionan ademas los metodos de utilizacion de las composiciones que se describen anteriormente en la presente memoria. En una realizacion, un metodo para extraer y conservar acidos nucleicos (por ejemplo, ARN, ADN, o una combinacion de los mismos) comprende las etapas de: a) proporcionar una matriz solida, en donde una composicion que comprende al menos un desnaturalizante de protemas, al menos un agente reductor, un tampon biologico, y opcionalmente un recolector de radicales libres se incorpora en la matriz solida en un formato seco; b) aplicar una muestra (por ejemplo, una muestra biologica) a la matriz solida para extraer los acidos nucleicos; c) secar la matriz solida; y d) almacenar los acidos nucleicos en la matriz solida en un estado seco bajo condiciones ambientales. En determinados aspectos del metodo, la matriz solida es un papel basado en celulosa porosa tal como FTA Elute™ disponible comercialmente. El rendimiento de este metodo permite el almacenamiento de los acidos nucleicos, particularmente ARN que es muy conocida por ser una biomolecula inestable para almacenar, en un formato seco (por ejemplo, en una matriz solida) bajo temperaturas ambientales. Las muestras utilizadas en este metodo incluyen pero no se limitan a muestras biologicas tales como sangre, suero, tejido, y saliva obtenidas a partir de cualquier organismo, incluyendo un ser humano.
El metodo que se define anteriormente puede incluir opcionalmente una etapa para recuperar los acidos nucleicos a partir de la matriz solida para analisis posteriores. Por ejemplo, los acidos nucleicos se pueden recuperar por rehidratacion de la matriz solida (por ejemplo, papel de celulosa) en una disolucion acuosa, una disolucion tampon, como se definio anteriormente, o una disolucion organica. Alternativamente, los acidos nucleicos se podnan recuperar a partir de la matriz solida mediante electroelucion. Un experto en la tecnica apreciara que se puede utilizar para ensayar los metodos descritos cualquier metodo capaz de recuperar los acidos nucleicos a partir de la matriz solida.
El termino “acido nucleico” se refiere a todas las formas de ARN (por ejemplo, ARNm), ADN (por ejemplo ADN genomico), asf como moleculas de ADN y ARN recombinante o analogos de ADN o ARN generados utilizando analogos de nucleotido. Las moleculas de acido nucleico pueden ser monocatenarias o bicatenarias. Las hebras pueden incluir hebras codificantes o no-codificantes. Los fragmentos de acidos nucleicos que aparecen naturalmente en las moleculas de ARN o ADN se engloban en la presente invencion y se pueden recuperar utilizando las composiciones y los metodos descritos. “Fragmento” se refiere a una porcion del acido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN).
Los ejemplos siguientes se presentan a modo de ejemplo y no como limitacion:
Ejemplos
Ejemplo 1: Analisis de ARN en general
Se utilizo una lmea celular de linfocitos humanos cultivados (por ejemplo, celulas Jurkat) como la fuente del ARN celular total. Las celulas se secaron en discos de celulosa de 7 mm impregnados con los reactivos indicados, se almacenaron a temperatura ambiente durante 10 dfas en una cabina desecadora, y los acidos nucleicos celulares se electroeluyeron de acuerdo con los protocolos estandar. Brevemente, los discos se rehidrataron con 15 pL de proteinasa K 2 mg/mL en agua libre de nucleasa para eliminar el exceso de protema y se secaron durante ~30 minutos. Los punzones se colocaron en pocillos individuales de un gel de agarosa 1% Tris-borato-EDTA (TBE) y se suspendio en Gel de Carga IX Tampon II que contiene formamida (Ambion). Los acidos nucleicos celulares se sometieron a electroforesis a 110 voltios durante 1-2 horas, y el ARN y ADN se tineron posteriormente con SYBR Gold (Invitrogen) y se detectaron utilizando un generador de Imagenes Typhoon (Ge Healthcare). Todo el equipamiento y las superficies se trataron con ARNZap (Ambion) para conservar la integridad del ARN celular durante y despues de la electro-elucion a partir de celulosa. Los estandares internos, incluyendo el ARN 6000 Nano Escalera (Tecnologfas Agilent) y el ARN total humano purificado a partir de musculo (Origene), se incluyeron en geles de agarosa para controlar la contaminacion de RNasa e identificar las bandas de ARN control.
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Los electroferogramas se cuantificaron digitalmente utilizando el programa informatico Image J. Brevemente, se dibujo una lmea vertical desde la cima hasta la base de cada carril, y se represento la intensidad de los pfxeles (unidades arbitrarias del valor gris) como funcion de la distancia de la lmea (cm) utilizando la funcion Dibujar Perfil. Se identificaron los picos correspondientes al ADN genomico y al ARN 28s/18s y se utilizaron para calcular la razon de ARNr 28s:18s.
La Fig.1 proporciona un electroferograma representativo de los acidos nucleicos recuperados a partir de celulosa utilizando electroelucion. Se identificaron las bandas de ADN genomico de alto peso molecular y de ARNr 28s/18s.
La Fig.1 proporciona ademas la cuantificacion de ADN y ARN utilizando Image J. Se dibujo una lmea vertical desde la cima hasta la base en el panel A, y se represento la intensidad de los pfxeles (unidades arbitrarias del valor gris) como funcion de la distancia de la lmea (cm) utilizando la funcion Dibujar Perfil. Los picos que corresponden al ADN genomico y al ARNr 28s/18s estan “en el cuadro”.
Ejemplo 2: Determinacion Empmica de las Condiciones Favorables para la Extraccion y el Almacenamiento del ARN
El primer objetivo de este ejemplo era evaluar el efecto de cada factor en solitario y el efecto de la combinacion de los factores ensayados (por ejemplo, agente quelante, tampon, pH, un desnaturalizante de protemas, agente reductor, e inhibidor de RNasa peptfdica) en la conservacion del ARN en papel de celulosa. Un aspecto adicional de este ejemplo era evaluar la presencia del agente reductor (DTT) para mejorar potencialmente el efecto del desnaturalizante de protemas.
Se utilizaron de nuevo celulas Jurkat como fuente del ARN celular total, y las celulas se aplicaron directamente en las muestras de papel de celulosa y secaron al aire para imitar una aplicacion final tfpica. El ARN celular total se recupero mediante electroelucion, siguiendo el protocolo descrito anteriormente en el Ejemplo 1, en gel de agarosa 1% y se analizo el contenido de ARNr 28s:18s segun los conocimientos estandar. Las muestras que contienen los componentes enumerados debajo de cada barra en la grafica de la Fig. 2 se almacenaron durante 10 dfas a temperatura ambiente en una cabina desecadora antes del analisis.
Los resultados del Ejemplo 2 se indican en la Fig. 2. Los numeros sobre cada barra corresponden a la razon de ARNr 28s para ARNr 18s. Una razon 28s:18s >1 generalmente indica ARN intacto. Fallaron varias composiciones para estabilizar el ARNr, incluyendo las muestras con agente reductor ausente (DTT) o SUPERasa-In para inactivar la RNasa, o en muestras que poseen un pH alcalino. Las muestras que contienen GITC, DTT, y un tampon neutral superaron a todas las otras combinaciones de reactivo ensayadas.
Ejemplo 3: Continuacion de la Determinacion Empmca de las Condiciones Favorables para la Extraccion y el Almacenamiento del ARN
Despues de que se identificaron los componentes clave para el almacenamiento del ARN en el Ejemplo 2, el Ejemplo 3 se diseno para investigar el efecto del DTT y del SDS tanto en solitario como en combinacion en la capacidad para conservar el ARN, y el efecto de la adicion de un recolector de radicales libres y un agente quelante para las combinaciones GITC/DTT sobre el rendimiento que mostro propiedades de estabilizacion del ARN favorables en el Ejemplo 2.
Se aplicaron celulas Jurkat directamente en las muestras de papel de celulosa y se secaron al aire para imitar una aplicacion final tfpica. El ARN celular total se recupero mediante electroelucion, siguiendo el protocolo descrito anteriormente en el Ejemplo 1, en gel de agarosa 1% y se analizo el contenido de ARNr 28s:18s segun los conocimientos estandar. Las muestras de celulosa se almacenaron durante 13 dfas a temperatura ambiente en una cabina desecadora antes del analisis. Los numeros sobre cada barra corresponden a la razon de ARNr 28s para ARNr 18s. Una razon 28s:18s >1 generalmente indica ARN intacto. Los resultados del Ejemplo 3 se proporcionan en la Fig.3.
Ejemplo 4: Continuacion de la Determinacion Empmca de las Condiciones Favorables para la Extraccion y el Almacenamiento del ARN
Despues de que se identificaron los componentes clave adicionales para el almacenamiento del ARN en el Ejemplo 3, el Ejemplo 4 se diseno para investigar si un agente reductor alternativo (TCEP), que tiene mejor estabilidad y mucho menos olor, podna sustituir al DTT. Otro factor que se introduce en este ejemplo fue el complejo vanadil ribonucleosido (VRC), una pequena molecula inhibidora de RNasa. Estos cambios se compararon y evaluaron para la capacidad de estabilizar el ARNr.
Se aplicaron celulas Jurkat directamente en las muestras de papel de celulosa y se secaron al aire para imitar una aplicacion final tfpica. El ARN celular total se recupero mediante electroelucion, siguiendo el protocolo descrito anteriormente en el Ejemplo 1, en gel de agarosa 1% y se analizo el contenido de ARNr 28s:18s segun los conocimientos estandar. Las muestras de celulosa se almacenaron durante 10 dfas a temperatura ambiente en una cabina desecadora antes del analisis. Los numeros sobre cada barra corresponden a la razon de ARNr 28s para ARNr 18s. Una razon 28s:18s >1 generalmente indica ARN intacto. Los resultados del Ejemplo 4 se proporcionan en la Fig.4.
Ejemplo 5: Rendimiento a Largo-Plazo de las Composiciones Seleccionadas para el Almacenamiento de ARN en Celulosa
El Ejemplo 5 se diseno para evaluar el rendimiento a largo-plazo de las composiciones seleccionadas despues de 30 dfas de almacenamiento a temperatura ambiente. Las celulas Jurkat se aplicaron directamente en las muestras de 5 papel de celulosa y se secaron al aire para imitar una aplicacion final tipica. El ARN celular total se recupero mediante electroelucion, siguiendo el protocolo descrito anteriormente en el Ejemplo 1, en gel de agarosa 1% y se analizo el contenido de ARNr 28s:18s segun los conocimientos estandar. Las muestras de celulosa se almacenaron durante 30 dfas a temperatura ambiente en una cabina desecadora antes del analisis. Los numeros sobre cada barra corresponden a la razon de ARNr 28s para ARNr 18s. Una razon 28s:18s >1 generalmente indica ARN intacto. 10 Los resultados del Ejemplo 5 se proporcionan en la Fig.5.
Ejemplo 6: Analisis de la Estabilidad del ARN Sangumeo
El Ejemplo 6 se diseno para evaluar el rendimiento de una composicion de papel seleccionada con sangre entera fresca en una variedad de condiciones tampon. Se recogio de la vena caudal de rata de un sujeto de ensayo aproximadamente 50 pL de sangre entera y se detecto la estabilizacion del ARN en el papel preparado con los 15 componentes tampon indicados. Las tarjetas se secaron y almacenaron a temperatura ambiente pero se controlo la humedad (~20% de humedad relativa) de 5 a 22 dfas. Se extrajo el ARN a partir del centro de un punzon de 7 mm en un tampon de lisis y se purifico mediante una columna de centrifugacion de membrana de sflice segun los protocolos conocidos en la tecnica. Despues de la purificacion y elucion, se midieron los Numeros de Integridad del ARN (RIN) en un Bionalizador Agilent 2100 usando ARN 6000 Pico LabChips. Convencionalmente, RIN>5 son 20 buenos pero RIN>6 son mejores para cuantificar analisis posteriores tales como RT-PCR o aplicaciones en microarrays. Los resultados del Ejemplo 6 se presentan en la Fig.6.
Ejemplo 7: Impacto de la Proteccion UV en la Estabilidad del ARN
El Ejemplo 7 se diseno para demostrar la proteccion del ARNm mediante inhibidores UV y recolectores de radicales libres presentes en una matriz seca seleccionada. El ARN Jurkat total libre de ADN (1pg) se detecto por duplicado 25 en el papel de ARN que contiene los componentes indicados. Cada tarjeta se dividio en dos, una mitad se mantuvo en oscuridad a 35°C durante 20 horas, mientras que la otra se trato en una camara de ensayo Q-SUN Xe-1 Xenon durante 20 horas (35°C, 0,3W/cm2, 340nm) para replicar el espectro completo de la luz solar (21,7 kJ/m2 energfa total). Se tomo de cada muestra un punzon de 1,2 mm y se dejo reaccionar directamente con la transcriptasa inversa para crear ADNc de estudio, el cual se probo despues contra cebadores espedficos para HPRT1 y ARNm clatrina 30 mediante qPCR. Los umbrales de ciclo (Ct) para las muestras expuestas al UV se sustrajeron a partir de los Ct de las parejas acopladas almacenadas en la oscuridad sin tratar. Los resultados del Ejemplo 7 se presentan en la Fig.7.
Ejemplo 8: Estabilidad del Agente Reductor en el Papel bajo Condiciones Ambientales
El papel de Whatman™ basado en celulosa 31ETF se sumergio en concentraciones ascendentes de TCEP o DTT en presencia de GITC en tampon Tris, pH 7,4. Los papeles basados en celulosa se almacenaron a temperatura 35 ambiente sin regulacion de la humedad. A los 5, 19, y 105 dfas se coloco en cada muestra de papel 5,5'-Ditio-bis(2- acido nitrobenzoico) (“DTNB”). En presencia del agente reductor activo se observo un cambio instantaneo del color hacia el amarillo. A los 105 dfas de almacenamiento bajo condiciones ambientales, el papel de celulosa recubierto de la solucion TCEP, (a todas las concentraciones) era aun activo y capaz de reducir el DTNB, como se indico mediante el cambio de color del papel del blanco al amarillo. Las muestras de papel sumergidas en DTT no fueron 40 capaces de reducir el DTNB, y, por consiguiente, el color del papel permanecio blanco. Estas figuras no expresan su significado en negro y blanco y, como tal, no se han incluido en la presente memoria pero estan disponibles en la solicitud del examinador. La reaccion qrnmica relevante para la reduccion del DTNB se proporciona en Cline et al. (2004) Biochemistry 43:15195-15203.
Ejemplo 9: Analisis Cualitativo del Envejecimiento de los Agentes Reductores
45 Las muestras de papel de celulosa 31ETF conteman GITC en tampon Tris, pH 7,4, con diferentes concentraciones de los agentes reductores TCEP o DTT. Las muestras de papel se almacenaron bajo las diferentes condiciones siguientes: 1) 21°C, 10% de humedad relativa; 2) 21°C, 80% de humedad relativa; y 3) 41°C, 10% de humedad relativa.
En los dfas 0, 1, 6, y 25, una muestra de 10 mg de papel de celulosa bajo cada condicion se puso en disolucion 50 DTNB, se agito brevemente, y se tomaron imagenes en color. En el dfa 1, todas las muestras TCEP bajo cada una de las condiciones ambientales fueron capaces de cambiar el color de la disolucion DTNB al amarillo, indicando que era aun capaz de funcionar como agente reductor. Por el contrario, el DTT fracaso en cambiar el color de las muestras al amarillo en presencia de DTNB, incluso a 21°C y 10% de humedad relativa. En el dfa 25, el papel TCEP almacenado a 21°C y 10% de humedad relativa continuo mostrando actividad reductora funcional. Sin embargo, un 55 aumento o bien de la humedad o bien de la temperatura, resulto en un evidente descenso en la actividad del TCEP como agente reductor, indicando que tanto la temperatura como la humedad son factores relevantes en la funcion del TCEP como un agente reductor.
Ejemplo 10: Analisis Cualitativo de la Actividad del TCEP en Papel Basado en Celulosa
Se prepararon ademas composiciones de TCEP que comprenden GITC y MEHQ en diferentes tampones (Tris, pH 7,4; mEs, pH 6,2; y MPOS, pH 7,0) y una muestra control que no comprende tampon. Despues cada papel basado en celulosa se recubrio, con cada una de las diferentes disoluciones anteriores, se seco rapidamente a 50°C en una 5 estufa con aire caliente, se sello con desecantes en bolsas de papel de aluminio para mantener la humedad baja, y despues se almaceno a 4°C, a temperatura ambiente, o a 41°C.
A las semanas indicadas en las figuras (0, 1, y 4), se analizo la actividad TCEP utilizando un ensayo colorimetrico DTNB en el que se anadio DTMN a cada punzon de papel de 3,6 mm, se agito durante 30 minutos, y despues se midio la absorbancia del lfquido a 412 nm.
10 En un mes todas las muestras eran estables a 4°C con aproximadamente 100% de actividad. En un mes, a temperatura ambiente, la actividad TCEP registro variabilidad en base al tampon utilizado (por ejemplo, MOPS (100%)>Sin tampon (90%)>MES (86%)>Tris (81%)). Despues de un mes a 41°C, aun se observo variabilidad en la actividad TCEP (por ejemplo, MoPs (67%)>MES (63%)>Tris (48%)>Sin tampon (39%)).
Todas las publicaciones, publicaciones de patentes y patentes se incorporan en la presente memoria en referencia 15 al mismo alcance como si cada publicacion individual o patente fuese espedfica e individualmente indicada a incorporarse por referencia.

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Una matriz solida para extraccion y almacenamiento de acidos nucleicos a partir de una muestra, en donde la matriz solida esta impregnada con una composicion que comprende al menos un desnaturalizante de protemas, al menos un agente reductor, un protector UV y esta presente un tampon en la matriz solida en un estado seco y donde la matriz solida es una matriz porosa que comprende celulosa, acetato de celulosa, fibra de vidrio, o cualquier combinacion de los mismos y donde el desnaturalizante de protemas se selecciona de hidrocloruro de guanidinio, tiocianato de guanidinio (GITC), arginina, dodecilsulfato sodico (SDS), urea, y cualquier combinacion de los mismos; el agente reductor se selecciona de ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol (2-ME), tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), y una combinacion de los mismos; y el protector UV se selecciona de monometil eter de hidroquinona (MEHQ), hidroquinona (HQ), toluhidroquinona (THQ), y acido ascorbico.
  2. 2. La matriz solida de la reivindicacion 1, en donde la composicion presente en la matriz solida comprende ademas un inhibidor de RNasa.
  3. 3. La matriz solida de la reivindicacion 1, en donde la matriz solida permite el almacenamiento prolongado de acidos nucleicos en un formato seco bajo condiciones ambientales.
  4. 4. La matriz solida de la reivindicacion 1, en donde los acidos nucleicos son ARN, ADN, o una combinacion de los mismos.
  5. 5. La matriz solida de la reivindicacion 4, en donde los acidos nucleicos son ARN.
  6. 6. La matriz solida de la reivindicacion 1, en donde la matriz porosa es un papel de celulosa.
  7. 7. La matriz solida de la reivindicacion 1, en donde el tampon se selecciona del grupo que consiste en 2-
    amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol (Tris), acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico (Mes), acido 3-(N-
    morfolino)propanosulfonico (MOPS), acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfonico (HEPES), un tampon citrato, y un tampon fosfato.
  8. 8. La matriz solida de la reivindicacion 7, en donde el tampon tiene un pH de un intervalo entre 3 y 8.
  9. 9. La matriz solida de la reivindicacion 2, en donde el inhibidor de RNasa es el complejo vanadil
    ribonucleosido (VRC), un analogo de nucleotido, o un inhibidor de RNasa disponible comercialmente.
  10. 10. La matriz solida de la reivindicacion 1, en donde la matriz solida es una matriz basada en celulosa porosa y:
    a) el desnaturalizante de protemas es GITC, un detergente, o una combinacion de los mismos;
    b) el agente reductor es DTT, TCEP, o una combinacion de los mismos; y
    c) el tampon es Tris, MES, o MOPS.
  11. 11. Un metodo para extraer y almacenar acidos nucleicos a partir de una muestra que comprende:
    a) proporcionar una matriz solida como se define en la reivindicacion 1;
    b) aplicar una muestra a la matriz solida para recoger los acidos nucleicos;
    c) secar la matriz solida; y
    d) almacenar los acidos nucleicos en la matriz solida en un estado seco bajo condiciones ambientales.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 11, en donde el metodo comprende ademas recuperar los acidos nucleicos a partir de la matriz solida.
  13. 13. El metodo de la reivindicacion 11, en donde la muestra biologica es sangre, suero, tejido, saliva, o celulas.
  14. 14. El metodo de la reivindicacion 11, en donde la muestra es una muestra de acido nucleico purificado o una preparacion celular del cultivo de tejidos.
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