CN203238276U - 一种从石蜡包埋组织中提取miRNA的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种从石蜡包埋组织切片中快速提取miRNA的试剂盒。本实用新型的一种从石蜡包埋组织中提取miRNA的试剂盒，包括试剂盒本体，在所述试剂盒本体内盛装无菌离心管、RNA离心柱、脱蜡剂试剂瓶、无水乙醇试剂瓶、消化缓冲液试剂瓶、蛋白酶K试剂瓶、4M的NaCl玻璃瓶、80%酒精试剂瓶和无核酶水试剂瓶。所述无菌离心管的大小为1.5ml。与现有技术相比，本实用新型试剂盒包括了脱蜡剂试剂瓶，使得脱蜡无毒、无味、对身体无害。本实用新型的试剂盒组减少了提取步骤、降低了成本，miRNA提取质量较好。

Description

一种从石蜡包埋组织中提取miRNA的试剂盒

技术领域

本实用新型涉及一种提取miRNA的试剂盒，特别是一种从石蜡包埋组织中提取miRNA的试剂盒。

背景技术

miRNA是一段被编码的RNA，它在转录水平干扰特定基因的表达，影响蛋白的表达，和疾病关系密切。近几年被广泛研究并被重视。miRNA不同于mRNA，它有着不易被降解的特性，这就使得石蜡组织成为回顾性研究miRNA的重要宝贵资源。在10%中性福尔马林溶液中固定，石蜡包埋组织(FFPE)是医院和科研单位最常用的保存病理组织的一种方法，这给进行回顾性肿瘤生物分子miRNA研究提供了广阔的科研材料。因此，提取石蜡组织材料中的miRNA成为必要而且非常重要的环节。最近几年，国外关于提取miRNA的试剂盒产品不断出现并被简化，但提取方法和步骤仍然繁琐冗长，且进口试剂盒成本昂贵，提取效率也有差别，所得miRNA的产量及扩增效率也存在很大差别。鉴于以上这些问题不能很好满足国内大量标本的快速诊断和研究miRNA的应用，本实用新型在目前技术原理的基础上，结合miRNA的特性和实践经验，优化实验步骤，加快了提取速度，降低了其成本，有着重要的应用价值。

实用新型内容

本实用新型目的是提供一种从石蜡包埋组织中快速、便捷的提取miRNA的试剂盒。

为了实现上述目的，本实用新型采取的技术方案是：

本实用新型的一种从石蜡包埋组织中提取miRNA的试剂盒，包括试剂盒本体，在所述试剂盒本体内盛装无菌离心管、RNA离心柱、脱蜡剂试剂瓶、无水乙醇试剂瓶、消化缓冲液试剂瓶、蛋白酶K试剂瓶、4M的NaCl玻璃瓶、80%酒精试剂瓶和无核酶水试剂瓶。

所述无菌离心管的大小为1.5ml。

所述消化缓冲液试剂瓶为含DNase I酶和250mL蛋白酶K缓冲液的试剂瓶。

其中，脱蜡剂可购置于上海宏兹生物公司。RNA离心柱可购置于天根生化公司。

利用本实用新型的试剂盒从石蜡组织样本中提取miRNA的主要步骤如下：

1）脱蜡：

将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为10μm的组织片，取4片组织片置于无菌的1.5ml离心管内，加入lml脱蜡剂，漩涡震荡混匀，55℃水浴5分钟，室温条件下，12000rpm离心3分钟，弃上清；加lml无水乙醇，混匀，室温条件下，12000rpm离心3分钟，弃上清，重复操作1次，所得样品37℃空气干燥20分钟。

2）蛋白消化：

向步骤1）所得样品中加入150μl消化缓冲液（含DNase I酶）和10μl蛋白酶K（20mg/ml），56℃水浴20分钟；85℃，10min。消化液配方：蛋白酶K缓冲液250mL（1M Tris-Cl(pH8.0)2.5mL；0.5M EDTA(pH8.0)2.5mL；加水H2O至250mL）。

3）miRNA提取：

冷却后，继续添加4M的NaCl320μl，混合均匀，静止2分钟。然后加入1120μl无水乙醇，吹打均匀，过RNA离心柱，12000rpm，1min，弃上清，加80%酒精洗吹打均匀，12000rmp，601min。丢上清，室温，干燥30分钟，20μl无核酶水溶解。

4)纯化、收集：

加40μl的90℃预热的无核酸酶水，室温静置30分钟，12000rPm离心1分钟，反复收集一次，可以提高得率。

与现有技术相比，本实用新型试剂盒使用脱蜡剂进行脱蜡，无毒、无味道、对身体无害，而且miRNA提取及纯化步骤中由于采取了核酸盐析原理，使得步骤更为快速简捷。本实用新型的试剂盒减少了提取步骤、降低了成本，miRNA提取质量较好。

附图说明

图1是本实用新型试剂盒的结构组成示意图。

具体实施方式

为使本实用新型更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。下面结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步说明，但不作为对本实用新型的限定。

实施例1：本实用新型的一种从石蜡包埋组织中提取miRNA的试剂盒的优选实施例

本实用新型的一种从石蜡包埋组织中提取miRNA的试剂盒具体结构可见图1，图1是本实用新型试剂盒的结构组成示意图，包括试剂盒本体1，在试剂盒本体1内盛装无菌离心管2、RNA离心柱3、脱蜡剂试剂瓶4、无水乙醇试剂瓶5、消化缓冲液试剂瓶6、蛋白酶K试剂瓶7、4M的NaCl玻璃瓶8、80%酒精试剂瓶9和无核酶水试剂瓶10。无菌离心管2的大小为1.5ml。消化缓冲液试剂瓶6为含DNase I酶和250mL蛋白酶K缓冲液的试剂瓶。

实施例2：用本试剂盒从小鼠和人石蜡组织中提取的miRNA样品

MMTV转基因鼠能够自发形成乳腺癌，本实施例对10周龄老鼠乳腺癌组织石蜡标本进行验证，保存期接近2-3个月。同时对临床乳腺癌组织石蜡标本，利用实施例1中的试剂盒按照如下所述步骤进行miRNA提取实验：

1）脱蜡：

将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为8－10μm的组织片，取4片组织片置于无菌的1.5ml离心管2内，从脱蜡剂试剂瓶4中取lml脱蜡剂加入，漩涡震荡混匀，55℃水浴5分钟，室温条件下，12000rpm离心3分钟，弃上清；从无水乙醇试剂瓶5中取lml无水乙醇加入，混匀，室温条件下，12000rpm离心3分钟，弃上清，重复操作1次，所得样品37℃干燥20分钟。

2）蛋白消化：

从消化缓冲液试剂瓶6取150μl消化缓冲液、从蛋白酶K试剂瓶7中取10μl蛋白酶K（20mg/ml），加入到步骤1）所得样品中，56℃水浴20分钟；85℃，10min。

3）miRNA提取：

冷却后，从4M的NaCl玻璃瓶8中取4M的NaCl320μl，混合均匀，静止2分钟。然后从无水乙醇试剂瓶5中取1120μl无水乙醇，吹打均匀，过RNA离心柱3，12000rpm，1min，弃上清，从80%酒精试剂瓶9中取80%酒精洗吹打均匀，12000rmp，601min。丢上清，室温，干燥30分钟，从无核酶水试剂瓶10中取20μl无核酶水溶解。

4)纯化、收集：

加入从无核酶水试剂瓶10中取出的40μl90℃预热的无核酶水，室温静置30分钟，12000rPm离心1分钟，反复收集一次，可以提高得率。

实施例3：对实施例2中得到的miRNA样品进行电泳及纯度和产量的分析

琼脂糖电泳分析：称取0.5g琼脂糖加入到25ml TAE中，微波炉加热使琼脂糖溶解均匀，取出，冷却10分钟，加入10μl的10mg/ml EB替代液，摇均匀。倒入配胶槽，放置好梳子，配制成2%琼脂糖胶；然后，将其放入电泳缓冲液，分别加入用本试剂盒从MMTV基因工程鼠乳腺癌石蜡组织和人乳腺癌石蜡组织提取的miRNA样品（预先混合6×上样缓冲液）。接通电源进行电泳电压120伏，电泳30分钟；在伯乐凝胶成像仪中拍照，从电泳结果可以看出，用该试剂盒提取的miRNA，均形成彗星扫尾状亮区条带，可以通过电泳检测到miRNA。说明采用本试剂盒可以成功提取到总miRNA。

MMTV自发乳腺癌基因工程鼠中乳腺癌石蜡组织miRNA的提取纯度和产量分析：用微量核酸分光光度计（美国热电公司）进行检测，所列举的代表样品标本检测结果见表1，表1数据提示，该试剂盒能够提取到检测合格的miRNA。其浓度满足逆转录反应（足够应用100ng）。

表1

临床乳腺癌患者石蜡组织miRNA的提取纯度和产量检测分析：分析数据见表2，提示，该试剂盒能够提取到合格的miRNA。

表2

实施例4：和国外公司产品提取的miRNA进行提取结果对比

通过和国外公司的试剂盒提取对比，分析结果见表3，我们发现，同样的组织蜡块提取的浓度和纯度（A260/280OD值）没有差异意义。但是在时间方面，本试剂盒要比国外试剂盒方法节约三分之一的时间。

表3

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本实用新型的技术方案而非对本实用新型保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本实用新型作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本实用新型的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本实用新型技术方案的实质和范围。

Claims (2)

1.一种从石蜡包埋组织切片中提取miRNA的试剂盒，包括试剂盒本体，其特征在于，在所述试剂盒本体内盛装无菌离心管、RNA离心柱、脱蜡剂试剂瓶、无水乙醇试剂瓶、消化缓冲液试剂瓶、蛋白酶K试剂瓶、4M的NaCl玻璃瓶、80%酒精试剂瓶和无核酶水试剂瓶。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述无菌离心管的大小为1.5ml。

Images