CN106442421A - 一种基于spr技术的端粒酶抑制剂筛选系统 - Google Patents

一种基于spr技术的端粒酶抑制剂筛选系统 Download PDF

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尹焕才
田晶晶
陆泓
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Abstract

本发明提供一种基于SPR技术的端粒酶抑制剂筛选系统，其包括：试剂盒，其具有第一反应液、第二反应液和稀释液，所述第一反应液包含100～120mmol/L的dNTP和dNTP储备液；所述第二反应液包含端粒酶及端粒酶储备液；所述稀释液为pH7.3的10～200mmol/L PB或PBS缓冲液；SPR芯片，其具有玻璃片、覆盖于所述玻璃片上的金属镀膜、连接于所述镀膜的端粒DNA。本发明端粒酶抑制剂筛选系统通过采用市场上成熟的SPR仪器，能够实现简单、快速且稳定可靠的端粒酶抑制剂的筛选工作。

Description

一种基于SPR技术的端粒酶抑制剂筛选系统
技术领域
本发明涉及端粒酶抑制剂筛选系统。更具体地说，本发明涉及一种基于SPR技术的端粒酶抑制剂筛选系统。
背景技术
端粒酶(telomerase)是一种逆转录酶，是一种真核生物线性染色体末端的能够以端粒DNA为底物，对端粒DNA末端进行重复DNA扩增的一种RNA核糖--蛋白复合体。端粒酶对端粒DNA的扩增能够使得细胞无限分裂而不会自然凋亡，从而导致癌症的发生。目前，在85％以上的癌细胞中发现了端粒酶的过量表达，研究表明对端粒酶活性进行抑制能够达到杀死癌细胞的作用，所以以端粒酶为靶点的药物筛选成为癌症研究治疗的热点。从庞大的化合物库中筛选出能够抑制端粒酶活性的物质，为开发新型治疗癌症药剂提供帮助具有重要的意义。目前，端粒酶抑制剂的筛选主要通过竞争性平衡透析等方法发现能特异性结合端粒DNA的物质，通过一系列体外方法验证其选择性结合效果，然后通过细胞实验检验该物质对肿瘤细胞中端粒酶活性的抑制效果。首先，研究人员将选中的化合物溶于缓冲溶液中，然后选择不同的DNA序列分别放入透析袋，在溶液中平衡24小时以上，然后取出通过紫外等方法检测该物质对各DNA序列不同的结合量。第二步，在得到对端粒DNA有良好选择性结合的物质后，通过荧光、紫外、质谱等手段研究其与DNA结合的信息。最后，选择具有良好抑制端粒酶活性潜力的物质进行细胞实验，考察体内抑制效果。上述方法是存在工作量大，时间长，费用高昂的缺点。
发明内容
作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人已经发现，将基于表面等离子共振(SPR)生物传感芯片应用于端粒酶抑制剂的筛选系统中，可实现端粒酶抑制剂的高效筛选，为新型抗癌药物的研发开辟新途径。基于这种发现，完成了本发明。
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种基于SPR技术的端粒酶抑制剂筛选系统，其能够配合市场上成熟的SPR仪器，能够实现简单、快速且稳定可靠的端粒酶抑制剂的筛选工作。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种基于SPR技术的端粒酶抑制剂筛选系统，其包括：
试剂盒，其具有第一反应液、第二反应液和稀释液，所述第一反应液包含100～120mmol/L的dNTP和dNTP储备液；所述第二反应液包含端粒酶及端粒酶储备液；所述稀释液为pH7.3的10～200mmol/L PB或PBS缓冲液；为保持端粒酶活性及dNTP的稳定性，端粒酶和DNTP平时分别储存于各自的储备液中，当进行测试工作时，试剂盒中的第一反应液、第二反应液均采用稀释液稀释成所需的浓度；
SPR芯片，其具有玻璃片、覆盖于所述玻璃片上的金属镀膜、连接于所述镀膜的端粒DNA。
利用现有SPR仪器，将上述筛选系统应用于端粒酶抑制剂筛选的具体过程如下：
试剂盒中的第一反应液使用稀释液配制成所需的浓度后，作为检测过程中的流动液通过蠕动泵进入流通池，由于稀释液中钠离子或钾离子的引入，芯片上的端粒DNA在钠离子或钾离子的存在条件下易形成分子内四股螺旋结构，并形成动态平衡。通过SPR仪器自带的控温模块控制温度为37℃，保证流通池内的端粒酶活性在最佳状态。待稳定后，使用试剂盒中的稀释液将第二反应液稀释成所需浓度的端粒酶测试液加入体系中。由于端粒酶只能作用于单链状态的端粒DNA，如果目标分子能够稳定端粒DNA形成的四股螺旋结构，就能够有效阻止端粒酶对端粒DNA的延长，从而达到抑制端粒酶活性的目的。根据SPR工作原理，其共振角的变化与芯片上质量的改变直接相关，通过检测SPR信号改变情况，就能检测到芯片上修饰的端粒DNA是否有延长，从而得到该目标分子对端粒酶活性的抑制效率。
优选的是，其中，所述SPR芯片的构建步骤为：
步骤一，将所述玻璃片镀覆一层金属薄膜后，得到第一芯片；
步骤二，将所述第一芯片置于5～15μmol/L的所述端粒DNA溶液中，0～10℃温度条件下保持10～24h，得到第二芯片；
步骤三，将所述第二芯片置于1～3mmol/L的巯基醇类的磷酸缓冲液中封闭2～6h，得到SPR芯片。
优选的是，其中，所述所述dNTP具有等摩尔比的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，以确保端粒DNA的正确扩增。
优选的是，所述dNTP储备液为10～200mmol/L的Tris-HCl缓冲液，所述端粒酶储备液包括10～200mmol/L的PB或PBS缓冲液、3～15mmol/L的MgCl2以及8～10wt％的甘油，所述dNTP储备液和端粒酶储备液的pH均为7.3，所述dNTP储备液和端粒酶储备液分别用以保证dNTP在长期储存过程的稳定性和端粒酶在长期储存过程中的活性。
优选的是，其中，所述镀膜为金膜或银膜，金属元素的性质各不相同，对SPR光谱也将产生较大的影响。金属材料的选择需要综合考虑其反射率及稳定性，金、银、铜、铝的反射率均较高，但铝和铜的稳定性较差，易被氧化形成氧化层，影响SPR的产生，金和银较为适合。
优选的是，所述镀膜为金膜，其具有更强的化学惰性，确保芯片的长期使用，所述端粒DNA的5’端修饰有巯基，巯基-SH和金Au之间具有较强的相互作用，所述端粒DNA通过巯基连接于金膜可自发的形成有序结构，且稳定性非常高。
优选的是，其中，所述端粒DNA通过三硫代金刚烷衍生物连接于所述金膜，三硫代金刚烷衍生物具有良好的稳定性，通过三个硫对金膜表面进行鳌合，可获得极高的金膜表面包被的稳定性，从而显著提高了端粒DNA与金膜连接的稳定性。
优选的是，其中，所述镀膜的厚度为43～46nm，，金属镀膜的厚度直接影响共振深度，直接影响SPR信号的灵敏度。
优选的是，所述巯基醇类选自巯基乙醇、巯基己醇、巯基十一醇的任意一种。
优选的是，所述巯基醇类为巯基乙醇，巯基乙醇优异的还原性可保证最佳的封闭效果，避免非特异性吸附的产生。
本发明至少包括以下有益效果：
(1)不需要进行长时间的透析、分析、细胞实验，能够快速高效的筛选出对端粒酶有抑制效果的物质，显著加快端粒酶抑制剂的筛选研制工作；
(2)根据SPR信号的响应速度以及强度，还能直接比较各种端粒酶抑制剂抑制端粒酶活性的效果；
(3)通过改变缓冲液的条件，如离子种类、浓度、分子拥挤试剂等，本端粒酶抑制剂筛选系统可成为研究多种因素对端粒酶活性影响的平台。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明一个实例中端粒酶延长单链状态端粒DNA的过程；
图2为本发明另一实中抑制剂通过稳定端粒DNA分子内四股螺旋结构阻止端粒DNA延长的过程。
图中：1、金属镀膜，2、带有巯基的端粒DNA，3、端粒酶，4、延长后的端粒DNA，5、端粒DNA分子内四股螺旋结构，6、端粒酶抑制剂。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
参照图1，SPR芯片的金属镀膜1表面连有一层端粒DNA分子2，第二反应液中的端粒酶3能够以芯片上的端粒DNA为底物，以第一反应液中的dNTP为原料进行扩增，使结合在金属镀膜表面的端粒DNA延长，从而质量增加。
参照图2，在一定浓度钠离子或钾离子的环境中，端粒DNA可自组装形成分子内四股螺旋结构，既保持四股螺旋状态的存在，又使其不是特别稳定，形成动态平衡。端粒酶只能作用于单链状态的端粒DNA，若添加的抑制剂能够稳定端粒DNA形成的四股螺旋结构，就能够有效阻止端粒酶对端粒DNA的延长，从而达到抑制端粒酶活性的目的。
SPR芯片上端粒DNA的质量与端粒酶的活性直接相关，SPR芯片共振角的变化又与芯片表面质量的改变具有直接相关性，通过SPR仪器检测SPR信号改变情况，就能检测到芯片上修饰的端粒DNA是否有延长，从而得到抑制剂对端粒酶活性的抑制效果。
<实例1>
1)试剂盒的制备，其具有第一反应液、第二反应液和稀释液，所述第一反应液包含10mmol/L的磷酸盐缓冲液和100mmol/L的dNTP，所述缓冲液的pH为7.3；所述第二反应液包含100000U/ml的端粒酶及pH为7.3的端粒酶储备液，端粒酶储备液包含10mmol/L PB缓冲液、3mmol/L的MgCl2以及8wt％的甘油，所述稳定液的pH为7.3；所述稀释液为pH7.3的10mmol/L PB缓冲液，用以在实际测试过程中，将第一反应液和第二反应液分别稀释成合适浓度的dNTP和端粒酶测试工作液；
2)芯片的构建：玻璃片上镀覆一层厚度为43nm的银膜后，置于5μmol/L的修饰有巯基的端粒DNA溶液中0℃孵育10小时，将端粒DNA通过巯基连接于银膜表面，其中，DNA序列如下：5’-SH-AAA AAA AAA AAA TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG。修饰完成后用1mmol/L的巯基乙醇的磷酸缓冲液封闭2小时，最后将制备好的芯片真空干燥，氮气保护封存，能够长期储存，测试时直接使用；
3)使用：将修饰好的芯片放入双通道SPR仪，测试流动液为配置好的dNTP测试工作液，在一个通道的流动液中加入一定浓度的待测抑制剂，另一通道中不加入抑制剂作为参照。当基线稳定后，通过六元阀在两个通道中加入等量配制好的端粒酶测试溶液，通过对比不同通道的信号能够得到端粒酶抑制剂的效果。
<实例2>
1)试剂盒的制备，其具有第一反应液、第二反应液和稀释液，所述第一反应液包含200mmol/L的磷酸盐缓冲液和120mmol/L的dNTP，所述缓冲液的pH为7.3；所述第二反应液包含100000U/ml的端粒酶及pH为7.3的端粒酶储备液，端粒酶储备液包含200mmol/L PBS缓冲液、15mmol/L的MgCl2以及10wt％的甘油，所述稳定液的pH为7.3；所述稀释液为pH7.3的200mmol/L PBS缓冲液，用以在实际测试过程中，将第一反应液和第二反应液分别稀释成合适浓度的dNTP和端粒酶测试工作液；
2)芯片的构建：玻璃片上镀覆一层厚度为46nm的金膜后，置于15μmol/L的修饰有三硫代金刚烷衍生物的端粒DNA溶液中10℃孵育24小时，三硫代金刚烷衍生物的结构式如下：
其中，R表示三硫代金刚烷衍生物的功能基团，
端粒DNA的序列为：5’-X-AAA AAA AAA AAA TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG，其中X为三硫代金刚烷衍生物，将端粒DNA通过三巯基连接于金膜表面。修饰完成后用3mmol/L的巯基乙醇的磷酸缓冲液封闭6小时，最后将制备好的芯片真空干燥，氮气保护封存，能够长期储存，测试时直接使用；
3)使用：将修饰好的芯片放入双通道SPR仪，测试流动液为配置好的dNTP测试工作液，在一个通道的流动液中加入一定浓度的待测抑制剂，另一通道中不加入抑制剂作为参照。当基线稳定后，通过六元阀在两个通道中加入等量配制好的端粒酶测试溶液，通过对比不同通道的信号能够得到端粒酶抑制剂的效果。
<实例3>
1)试剂盒的制备，其具有第一反应液、第二反应液和稀释液，所述第一反应液包含100mmol/L的磷酸盐缓冲液和110mmol/L的dNTP，所述缓冲液的pH为7.3；所述第二反应液包含100000U/ml的端粒酶及pH为7.3的端粒酶储备液，端粒酶储备液包含100mmol/L PB缓冲液、10mmol/L的MgCl2以及9wt％的甘油，所述稳定液的pH为7.3；所述稀释液为pH7.3的100mmol/L PBS缓冲液，用以在实际测试过程中，将第一反应液和第二反应液分别稀释成合适浓度的dNTP和端粒酶测试工作液；
2)芯片的构建：玻璃片上镀覆一层厚度为44nm的金膜后，置于10μmol/L的修饰有巯基的端粒DNA溶液中5℃孵育18小时，将端粒DNA通过巯基连接于金膜表面，其中，DNA序列如下：5’-SH-AAA AAA AAA AAA TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG。修饰完成后用2mmol/L的巯基己醇的磷酸缓冲液封闭4小时，最后将制备好的芯片真空干燥，氮气保护封存，能够长期储存，测试时直接使用；
3)使用：将修饰好的芯片放入双通道SPR仪，测试流动液为配置好的dNTP测试工作液，在一个通道的流动液中加入一定浓度的待测抑制剂，另一通道中不加入抑制剂作为参照。当基线稳定后，通过六元阀在两个通道中加入等量配制好的端粒酶测试溶液，通过对比不同通道的信号能够得到端粒酶抑制剂的效果。
<实例4>
1)试剂盒的制备，其具有第一反应液、第二反应液和稀释液，所述第一反应液包含50mmol/L的磷酸盐缓冲液和105mmol/L的dNTP，所述缓冲液的pH为7.3；所述第二反应液包含100000U/ml的端粒酶及pH为7.3的端粒酶储备液，端粒酶储备液包含150mmol/L PBS缓冲液、5mmol/L的MgCl2以及8wt％的甘油，所述稳定液的pH为7.3；所述稀释液为pH7.3的150mmol/L PB缓冲液，用以在实际测试过程中，将第一反应液和第二反应液分别稀释成合适浓度的dNTP和端粒酶测试工作液；
2)芯片的构建：玻璃片上镀覆一层厚度为44nm的银膜后，置于12μmol/L的修饰有巯基的端粒DNA溶液中4℃孵12小时，将端粒DNA通过巯基连接于银膜表面，其中，DNA序列如下：5’-SH-AAA AAA AAA AAA TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG。修饰完成后用1mmol/L的巯基乙醇的磷酸缓冲液封闭3小时，最后将制备好的芯片真空干燥，氮气保护封存，能够长期储存，测试时直接使用；
3)使用：将修饰好的芯片放入双通道SPR仪，测试流动液为配置好的dNTP测试工作液，在一个通道的流动液中加入一定浓度的待测抑制剂，另一通道中不加入抑制剂作为参照。当基线稳定后，通过六元阀在两个通道中加入等量配制好的端粒酶测试溶液，通过对比不同通道的信号能够得到端粒酶抑制剂的效果。
<实例5>
1)试剂盒的制备，其具有第一反应液、第二反应液和稀释液，所述第一反应液包含150mmol/L的磷酸盐缓冲液和115mmol/L的dNTP，所述缓冲液的pH为7.3；所述第二反应液包含100000U/ml的端粒酶及pH为7.3的端粒酶储备液，端粒酶储备液包含150mmol/L PB缓冲液、12mmol/L的MgCl2以及8wt％的甘油，所述稳定液的pH为7.3；所述稀释液为pH7.3的150mmol/L PB缓冲液，用以在实际测试过程中，将第一反应液和第二反应液分别稀释成合适浓度的dNTP和端粒酶测试工作液；
2)芯片的构建：玻璃片上镀覆一层厚度为45nm的金膜后，置于7μmol/L的修饰有三硫代金刚烷衍生物的端粒DNA溶液中8℃孵20小时，三硫代金刚烷衍生物的结构式如下：
其中，R表示三硫代金刚烷衍生物的功能基团，
端粒DNA的序列为：5’-X-AAA AAA AAA AAA TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG，其中X为三硫代金刚烷衍生物，将端粒DNA通过三巯基连接于金膜表面。修饰完成后用3mmol/L的巯基十一醇的磷酸缓冲液封闭5小时，最后将制备好的芯片真空干燥，氮气保护封存，能够长期储存，测试时直接使用；
3)使用：将修饰好的芯片放入双通道SPR仪，测试流动液为配置好的dNTP测试工作液，在一个通道的流动液中加入一定浓度的待测抑制剂，另一通道中不加入抑制剂作为参照。当基线稳定后，通过六元阀在两个通道中加入等量配制好的端粒酶测试溶液，通过对比不同通道的信号能够得到端粒酶抑制剂的效果。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种基于SPR技术的端粒酶抑制剂筛选系统，其特征在于，包括：
试剂盒，其具有第一反应液、第二反应液和稀释液，所述第一反应液包含100～120mmol/L的dNTP和dNTP储备液；所述第二反应液包含端粒酶及端粒酶储备液；所述稀释液为pH7.3的10～200mmol/L PB或PBS缓冲液；
SPR芯片，其具有玻璃片、覆盖于所述玻璃片上的金属镀膜、连接于所述镀膜的端粒DNA。
2.如权利要求1所述的基于SPR技术的端粒酶抑制剂筛选系统，其特征在于，所述SPR芯片的构建步骤为：
步骤一，将所述玻璃片镀覆一层金属薄膜后，得到第一芯片；
步骤二，将所述第一芯片置于5～15μmol/L的所述端粒DNA溶液中，0～10℃温度条件下保持10～24h，得到第二芯片；
步骤三，将所述第二芯片置于1～3mmol/L的巯基醇类的磷酸缓冲液中封闭2～6h，得到SPR芯片。
3.如权利要求1所述的基于SPR技术的端粒酶抑制剂筛选系统，其特征在于，所述所述dNTP具有等摩尔比的dATP、dTTP、dGTP和dCTP。
4.如权利要求1所述的基于SPR技术的端粒酶抑制剂筛选系统，其特征在于，所述dNTP储备液为10～200mmol/L的Tris-HCl缓冲液，所述端粒酶储备液包括10～200mmol/L的PB或PBS缓冲液、3～15mmol/L的MgCl2以及8～10wt％的甘油，所述第一储备液和第二储备液的pH均为7.3。
5.如权利要求1所述的基于SPR技术的端粒酶抑制剂筛选系统，其特征在于，所述镀膜为金膜或银膜。
6.如权利要求1所述的基于SPR技术的端粒酶抑制剂筛选系统，其特征在于，所述镀膜为金膜，所述端粒DNA通过巯基连接于金膜。
7.如权利要求6所述的基于SPR技术的端粒酶抑制剂筛选系统，其特征在于，所述端粒DNA通过三硫代金刚烷衍生物连接于所述金膜。
8.如权利要求1所述的基于SPR技术的端粒酶抑制剂筛选系统，其特征在于，所述镀膜的厚度为43～46nm。
9.如权利要求2所述的基于SPR技术的端粒酶抑制剂筛选系统，其特征在于，所述巯基醇类选自巯基乙醇、巯基己醇、巯基十一醇的任意一种。
10.如权利要求2所述的基于SPR技术的端粒酶抑制剂筛选系统，其特征在于，所述巯基醇类为巯基乙醇。
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