KR20160075955A - 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드를 포함하는 pcr 조성물 및 이를 이용한 pcr 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO)를 함유하는 PCR 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO), 핵산 중합효소 및 목적핵산을 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 PCR 조성물 및 상기 PRC 조성물을 이용한 핵산의 증폭방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드를 포함하는 PCR 조성물은 Taq DNA 중합효소와의 상호작용 및 방향성 상호작용 (π-π stacking)으로, PCR 효율을 현저히 향상시키는 효과가 있다.

Description

금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드를 포함하는 PCR 조성물 및 이를 이용한 PCR 방법{PCR Composition Containing Graphene Oxide Coated by Au Nanoparticles and Method for PCR Using The Same}
본 발명은 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO)를 함유하는 PCR 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO), 핵산 중합효소 및 목적핵산을 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 PCR 조성물 및 상기 PCR 조성물을 이용한 핵산의 증폭방법에 관한 것이다.
중합효소연쇄반응(PCR)은 DNA의 원하는 부분의 복사본(copy)의 수를 기하급수적으로 증폭시킬 수 있는 분자생물학적(molecular biological) 방법이다. DNA의 어느 부분이든지 그 서열만 알면 PCR을 통해서 증폭할 수 있다. PCR은 1980년대 중반 K. Mullis에 의해서 고안되었으며 유전자를 연구, 분석하는 분자유전학을 포함한 많은 생물학 관련 연구에서 현재까지도 널리 이용되고 있는 방법이다. PCR은 DNA 중합효소(polymerase)에 의한 DNA 복제(replication)의 특징을 이용한 방법이다. DNA 중합효소는 외가닥(single stranded) DNA를 주형(template)으로 해서 상보적인(complementary) DNA를 합성할 수 있는데, 이러한 외가닥 DNA는 두 가닥(double stranded) DNA를 끓임(boiling)으로써 간단하게 얻을 수 있다. 이 과정을 DNA 변성(denaturation)이라 한다. DNA 중합효소가 DNA 복제를 시작하기 위해서는 시작 부위가 두 가닥 DNA 형태로 되어 있어야 한다. 따라서 PCR에서는 증폭시킬 DNA 서열의 양 말단에 주형 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 작은 DNA 조각을 함께 넣어 주어야 하며 이것이 특정 DNA 서열의 양 끝에 결합(annealing)하여 두 가닥 형태의 DNA가 되어야 한다. 이럴 경우에만 DNA 중합효소에 의한 DNA 복제가 개시될 수 있다. 주형 DNA 말단과 상보적으로 결합할 수 있는 작은 DNA 조각을 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프라이머(primer) 또는 줄여서 프라이머라 한다. 일단 프라이머가 주형 DNA 말단에 결합한 후에는 DNA 중합효소의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 진행(extension)된다. 이런 일련의 기작에 PCR 반응이 기반하기 때문에 PCR 주기(cycle)는 두 가닥 주형 DNA를 외가닥 DNA로 바꾸어 주는 변성 단계, 프라이머가 주형 DNA 말단에 결합하는 결합 단계 및 DNA 중합효소의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 되는 신장 단계의 3단계로 구성된다. 최초 1회의 PCR 주기가 끝난 후에 그 다음으로 이어지는 PCR 주기에서는 최초(original) 주형 DNA와 PCR에 의해 새로 합성된 DNA 모두가 DNA 주형이 된다. 이렇게 PCR은 주기가 계속적으로 반복될수록 DNA 주형의 수는 계속 늘어나게 된다.
최근까지 개발된 PCR 방법으로는, 증폭에 소요되는 시간을 줄인 래피드 PCR(rapid PCR), 시료의 정제 과정을 생략하고자 하는 직접 PCR(direct PCR), 역전사 반응과 PCR을 결합시켜 RNA를 주형으로 사용하게 한 역전사 효소-PCR(reverse transcriptase PCR; RT-PCR), 상온에서 일어나는 비특이 증폭을 획기적으로 감소시켜 PCR 반응의 특이성(specificity)을 개선시킨 핫-스타트 PCR(hot-start PCR), PCR 반응의 실시간 모니터링(monitering)이 가능한 실시간 PCR(real-time PCR) 등이 있다. 이외에도 매우 많은 방법들과 관련 기술들이 개발되었다.
아울러, PCR 반응 자체의 효율을 개선하려는 시도들이 있어 왔다. PCR 반응의 효율을 높이려는 시도는 다양한 방법이 있었는데, 그 예로 PCR 장치(machine)의 개량, 기존 DNA 중합효소의 단백질 공학(protein engineering)적 개량, PCR 반응 성분(component)들의 고순도화, PCR 반응을 증진시킬 수 있는 PCR 반응 증진제(enhancer)의 적용, 및 DNA 중합효소 등 PCR 반응의 필수 성분들의 안정성(stability)을 높여줄 수 있는 안정화제(stabilizer)의 적용 등의 방법이 있었다.
특히, PCR 효율을 높이기 위하여 그래핀이 사용되어 왔다. 또한 금 나노입자(AuNP)는 독성이 없고, 작은 분자 및 중합효소를 포함하는 단백질을 흡수하는 기능을 한다(Min Li, et al., Nucleic Acids Research, 33(21), e183, 2005).
그러나, 그래핀이나 금나노입자의 경우 핵산중합효소와의 상호작용 및 열전도성 향상에 한계가 있었다.
이에, 본 발명자들은 PCR 반응의 효율을 개선하기 위하여 예의 노력한 결과, PCR 반응용액에 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드를 첨가하는 경우, 그래핀 옥사이드에 비해 PCR 효율을 현저히 향상시킬 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 PCR 효율을 향상시키는데 우수한 효과가 있는 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드를 함유하는 PCR 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드를 함유하는 PCR 조성물을 이용한 목적핵산의 증폭방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드를 함유하는 PCR 조성물을 함유하는 핵산 검출용 키트를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO), 핵산 중합효소 및 목적핵산을 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 PCR 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 PCR 조성물을 이용하는 것을 특징으로 하는 목적 핵산의 증폭방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO)를 포함하는 PCR 조성물을 포함하는 핵산 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드를 포함하는 PCR 조성물은 Taq DNA 중합효소와의 상호작용 및 방향성 상호작용 (π-π stacking)으로, PCR 효율을 현저히 향상시키는 효과가 있다.
도 1은 그래핀 옥사이드(GO)와 핵 염기(nucleobase)의 DNA 사이의 방향성 상호작용(aromatic-aromatic interaction; π-π stacking)을 나타낸 이미지이다.
도 2는 실시예 1에서 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드가 합성되는 과정을 나타낸 이미지이다.
도 3은 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드의 UV 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 1에서 제조된 Au@GO의 TEM 이미지이다. 기준자는 0.1 μm, 10 nm를 나타낸다.
도 5은 실시예의 PCR 프로토콜을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 6는 실시예 3-1의 금 나노입자 (AuNPs) 농도에 따른 PCR 수율을 나타낸 것이다(M: DNA 마커, Con: 금 나노입자가 없는 양성 대조군; (1): AuNPs 1X10-3㎍/㎕, (2): AuNPs 3X10-3㎍/㎕, (3): AuNPs 5X10-3㎍/㎕, (4): AuNPs 7X10-3㎍/㎕, (5): AuNPs 9X10-3㎍/㎕, (6): AuNPs 1X10-2㎍/㎕, (7): AuNPs 3X10-2㎍/㎕, (8): AuNPs 5X10-2㎍/㎕, (9): AuNPs 7X10-2㎍/㎕, (10): AuNPs 9X10-2㎍/㎕).
도 7은 실시예 3-1의 그래핀 옥사이드(GO) 농도에 따른 PCR 수율을 나타낸 것이다(M: DNA 마커, Con: 그래핀 옥사이드가 없는 양성 대조군; (1): GO 1X10-3㎍/㎕, (2): GO 3X10-3㎍/㎕, (3): GO 5X10-3㎍/㎕, (4): GO 7X10-3㎍/㎕, (5): GO 9X10-3㎍/㎕, (6): GO 1X10-2㎍/㎕, (7): GO 3X10-2㎍/㎕, (8): GO 5X10-2㎍/㎕, (9): GO 7X10-2㎍/㎕, (10): GO 9X10-2㎍/㎕).
도 8은 실시예 3-1의 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO) 농도에 따른 PCR 수율을 나타낸 것이다(M: DNA 마커, Con: 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드가 없는 양성 대조군; (1): Au@GO 1X10-3㎍/㎕, (2): Au@GO 3X10-3㎍/㎕, (3): Au@GO 5X10-3㎍/㎕, (4): Au@GO 7X10-3㎍/㎕, (5): Au@GO 9X10-3㎍/㎕, (6): Au@GO 1X10-2㎍/㎕, (7): Au@GO 3X10-2㎍/㎕, (8): Au@GO 5X10-2㎍/㎕, (9): Au@GO 7X10-2㎍/㎕, (10): Au@GO 9X10-2㎍/㎕).
도 9는 실시예 3-2의 금 나노입자(AuNPs), 그래핀 옥사이드(GO)와 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO)의 최적 농도에 따른 PCR 수율을 나타낸 것이다(M: DNA 마커, Con: 나노입자가 없는 양성 대조군; (1): AuNPs 7X10-2㎍/㎕, (2): AuNPs 9X10-2㎍/㎕ (3): Go 1X10-3㎍/㎕, (4): Go 3X10-3㎍/㎕, (5): Au@GO 1X10-2㎍/㎕, (6): Au@GO 3X10-2㎍/㎕).
도 10은 어류 DNA, 리스테리아 모노사이트 DNA(LM), 그린 형광 단백질이 삽입되어 있는 대장균 BL21 DNA(EGFP) 각 DNA 샘플에 대하여 금 나노입자(AuNPs), 그래핀 옥사이드(GO), 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO)를 첨가했을 때의 정량적인 PCR(qPCR) 수율을 나타낸 그래프이다.
도 11은 어류 DNA, 리스테리아 모노사이트 DNA(LM), 그린 형광 단백질이 삽입되어 있는 대장균 BL21 DNA(EGFP) 각 DNA 샘플에 대하여 정량 PCR(qPCR)에 대한 복제가 시작되는 사이클(Cq)을 나타낸 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서, "GO"는 그래핀 옥사이드를 나타내고, "AuNP"는 금 나노입자를 나타내며, "Au@GO"는 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드를 나타낸다.
본 발명에서, 정량 PCR(qPCR)에 있어 Cq(quantitative cycle)는 모든 주형(template)이 반응하기 시작하여 증폭이 활발히 시작되는 점인 threshold 를 나타내는 형광 신호의 사이클 수로 즉, DNA 복제가 시작되는 사이클의 수를 나타내며, 사이클이 먼저 나타날수록 더 많은 주형(template)이 복제되는 것을 말한다.
본 발명에서는, 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO)를 포함하는 PCR 조성물을 제조하여, 이를 첨가한 PCR 방법을 수행하였다. 그 결과, 아무 것도 포함되지 않은 양성 대조군과 금 나노입자(AuNPs) 및 그래핀 옥사이드(GO)와 비교하여, 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO)를 포함하는 PCR 조성물이 PCR 효율을 현저히 향상시킨다는 것을 확인하였다.
본 발명에서 사용된 금 나노입자가 포함된 그래핀 옥사이드(Au@GO)는 1) Au@GO와 Taq DNA 중합효소의 상호작용 (양성 전하를 가지는 Au@GO-Taq 복합체는 음성 전하를 가지는 목적 DNA 및 프라이머를 끌어당김), 2) 그래핀 옥사이드(GO)와 핵염기(nucleobase)의 DNA 사이의 방향성 상호작용 (aromatic-aromatic interaction; π-π stacking)에 의한 DNA 친화력(도 1), 3) 골드 나노입자와 DNA 사이의 화학적 상호작용 (chemical interaction) 및 뛰어난 열전도성을 포함하여 PCR 효율을 현저히 향상시킨다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO), 핵산 중합효소 및 목적핵산을 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 PCR 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 중합효소, 특정 핵산부위와 결합하여 증폭할 수 있는 형광 물질, 프라이머 쌍 및 완충액을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머쌍은 서열번호 1~2, 서열번호 3~4 및 서열번호 5~6으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 중합효소는 Taq 폴리머라아제, VENT 폴리머라아제, DEEPVENT 폴리머라아제, PWO 폴리머라아제 및 Pfu 폴리머라아제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 완충액은 젤 로딩 완충액(Gel loading buffer)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 목적 핵산과 결합하여 형광을 발하는 형광 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 SYBR GREEN, Cy5.5, Cy5, Cy3.5 및 Cy3으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO)의 농도는 1 X 10-2㎍/㎕ 내지 3 X 10-2㎍/㎕인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 PCR 조성물을 이용하는 것을 특징으로 하는 목적 핵산의 증폭방법에 관한 것이다.
본 발명에서, "목적 핵산"은 PCR 등의 증폭반응으로 증폭시킬 수 있는 모든 핵산을 말하며, 일 예로, 1개 또는 복수 개의 염기 변이 부위를 함유하고 있는 DNA 나 RNA 등의 핵산일 수 있다.
본 발명의 일양태에서는 고등어의 DNA를 주형으로 하여, 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO)와 대조군으로 그래핀옥사이드(GO)와 금나노입자(AuNP)를 사용한 PCR 조성물을 이용하여, 고등의 유전자를 검출한 결과, 금 나노입자(AuNP), 그래핀 옥사이드(GO) 및 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(GO@Au)를 이용한 경우가 대조군(Con)보다 PCR에 대한 특이도 및 수율이 높게 나타났으며, 특히 금 나노 입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO)의 경우, 금 나노입자(AuNP), 그래핀 옥사이드(GO)에 비해 더 강한 밴드가 나타났음을 확인하였다(도 9의 lane 5,6).
본 발명의 다른 양태에서는 녹색형광단백질(GFP)인 EGFP DNA, 그리고 박테리아균인 Listeria monocytogenes(ATCC 19115) DNA를 이용하여 qPCR을 수행한 결과, DNA 종류에 상관없이 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO)의 최종 증폭량이 가장 큰 것을 확인하였다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 PCR 조성물을 포함하는 핵산 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트의 한 양태로서는, 상기의 DNA 폴리머라제 외, PCR 법에 의한 DNA 합성에 필요한 각종 성분, 예를 들어 dNTP, 염화마그네슘, 반응액을 적정한 pH 로 유지하기 위한 완충성분 등을 포함한 조성물을 들 수 있다. 또한, 이 조성물은 상기의 산성물질을 포함해도 된다. 이와 같은 조성물은, 목적의 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머 및 주형 DNA 를 첨가한 후, 필요에 따라 물 또는 완충액을 가함으로써 반응액을 제조할 수 있도록 작성할 수 있다. 또한, 해당 키트가 증폭해야하는 DNA 단편이 결정되어 있는 경우에는, 이 조성물은 이 단편의 증폭에 적합한 프라이머를 포함해도 된다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
시료 및 장비의 준비
그래핀 옥사이드(Graphene oxide)의 합성에 사용되는 오산화인(P2O5),과황산칼륨(K2S2O8),황산(H2SO4,95~98%),과망가니즘칼륨(KMnO4)은 Sigma-Aldrich(USA)로부터 구입하였고, 그래파이트 분말(graphite powder)는 ANTO(China)로부터 구입했다. 염산(HCl, 35.0 % ~ 37.0 %)는 SAMCHUN으로부터 구입하였다.
금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO)의 합성에 사용되는 염화금(Gold(III) Chloride trihydrate)는 Sigma-Aldrich(USA)로부터 구입하였고, sodium citrate는 Bio Basic(CANADA)에서 구입 하였다.
0.1 μm 필터용지는 Whatman(Germany)에서 구입하였고, 3차 증류수(Milli-Q grade water 18.2 MΩ cm, Millipore)가 모든 실험에서 사용되었다.
실시예 1: GO@Au의 제조
1-1. 그래핀 옥사이드의 제조
그래핀 옥사이드(Graphene oxide) 합성의 대표적인 방법인 Hummer and Offeman 방법(J. Am. Chem. Soc. 80 (1958) 1339) 을 이용하여 그래핀 옥사이드를 합성하였다. 100 mL 비이커에 27 mL 50 wt% 황산(H2SO4)을 넣고 84˚C까지 온도를 올렸다. 과황산칼륨(K2S2O8) 2g, 오산화인(P2O5) 2g을 넣고 용해될 때까지 교반하고, 온도를 84˚C 를 유지하면서 그래파이트(Graphite powder)을 넣고 5시간동안 교반하였다. 온도를 상온까지 내리고 증류수 500 mL를 넣고 15시간 동안 교반하였다. 0.1μm 필터용지를 이용해서 필터를 하고 상온에서 건조시켰다. 50 wt% 황산(H2SO4) 270mL를 차갑게 만들어 주고, 건조시킨 그래파이트(graphite powder)를 넣었다. 그리고 과망가니즘칼륨(KMnO4) 10g을 천천히 넣어 주면서 교반하였다. 그 후, 용액을 차가운 상태로 유지하면서 1 시간동안 교반 후, 상온에서 24 시간동안 교반 한 다음, 증류수 500 mL와 30 wt% 과산화수소(H2O2)를 넣고 5분동안 교반하였다. 그리고 0.1 μm 필터 용지를 이용해서 필터를 하고 10 wt% 염산(HCl), 증류수를 이용해서 세척하였다.
1-2. 금 나노입자 도포된 그래핀 옥사이드
증류수 275 mL에 그래핀 옥사이드(Graphene oxide) 75 mg을 넣고 초음파를 1 시간 동안 가하였다. 증류수 250 mL에 0.51 mM의 염화금(HAuCl4)을 만들었다. 초음파를 가한 그래핀 옥사이드 용액에 250 mL의 염화금(HAuCl4)용액을 넣고 30 분동안 교반했다. 온도를 80˚C까지 올리고 0.88 M sodium citrate(C6H5Na3O7·2H2O)를 10 mL 넣고 1 시간동안 교반한 다음, 상온까지 온도를 내리고 15 시간동안 교반했다. 0.1 μm 필터용지로 필터를 하고 60˚C 오븐에서 건조시켰다.
이후 제조된 나노입자가 첨가된 균일하게 희석된 용액을 제조하였다. 나노입자(1 mg)를 오토클레이브된 증류수(1 ml)에 개별적으로 부유시켰다. 나노입자는 소수성 물질로써 물과 섞이지 않기 때문에, 수조 초음파분쇄기(무지개, 한국)를 이용하여 30분 동안 초음파처리(진동수 40 kHz, 초음파 100 W)를 하였다 (도 2). 그 다음, 볼텍스 및 증류수를 이용하여, 나노입자의 농도를 희석하였다. 적절한 혼합 및 증류수 내 나노입자 간 응집 방지를 위하여, 희석 단계 직전에 초음파 처리를 하였다. 흡광스펙트럼(UV/visible spectroscopy)과 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 그래핀 옥사이드상에 금 나노입자가 도포되었음을 확인하였다(도 3, 도 4).
실시예 2: GO@Au를 이용한 PCR 방법
2-1. PCR 절차
먼저, 특정한 두 개의 프라이머(VF2_t1_M13 서열번호 1; FishR2_t1_M13 서열번호 2)를 이용하여 DNA를 증폭시키기 위한 PCR을 수행하였다(표 1). DNA의 최적화 및 증폭은 MAXIME PCR preMIX Kit(INtRON, 한국)를 이용하여 수행하였다. DNA 주형으로 고등어에서 G-DEXTMIIc For Cell/Tissue Genomic DNA Extraction Kit(INtRON,한국)를 이용해 추출한 DNA extraction을 사용하였다. PCR 반응 혼합물은 다음의 최종 농도를 포함하였다: 반응 완충액 내 i-Taq TM DNA 중합효소 2.5 U/㎕, dNTP 2.5 mM, 반응 완충액 1X, 젤 로딩 완충액(Gel loading buffer) 1X. 이러한 반응 완충액 혼합물 내에, 전체 부피가 20 ㎕이 될 때까지, 나노입자의 농도를 동일 또는 상이하게 하면서, 주형 DNA 1 ㎕, 정방향 프라이머(10 pmol/㎕) 1 ㎕, 역방향 프라이머(10 pmol/㎕) 1 ㎕ 및 증류수를 첨가하였다.
BIO-RAD T100TMThermalcycler를 이용한 PCR 후, PCR 산물을 가시화하기 위하여 0.8% wt/v 아가로스 젤(Seakemㄾ LE Agarose, LANZA)을 이용하여 전기영동을 하였다. 전기영동 장치로 Mupidㄾ-2plus(ADVANCE)를 사용하였다. 또한, 사이즈 마커로 Marker 1 kb plus(ACCUGEN)를 사용하였다.
정방향 프라이머
VF2_t1_M13(# 1) 		역방향 프라이머
FishR2_t1_M13(# 2) 		밴드(amplicon)
사이즈
서열 5'-CAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3' 5'-ACTTCAGGGTGACC
GAAGAATCAGAA-3'

800bp
Tm (℃) 63 62
GC content (%) 48 33.3
2-2. PCR 프로토콜
우선, 초기 변성단계(95℃, 5분)에서 온도를 95℃까지 지속적으로 증가시켰다. 나노입자와 프라이머 사이의 상호작용에 따라 비특이적 어닐링이 나타났다. 프라이머가 나노입자의 표면에 부착되었고, Au@GO-Taq 복합체를 형성하였다. 이로써, 주형 DNA에 프라이머가 잘못 붙는 현상을 최소화할 수 있었다. 결국, PCR 효율이 향상될 수 있음을 알 수 있었다.
변성단계(단계1; 95℃, 30초)에서 이중가닥 DNA 내 수소결합이 끊어진다.
어닐링단계(단계2; 55℃, 30초)에서 특정 프라이머와 결합한 Au@GO -Taq 복합체는 강한 친화력을 가지고 π-π stacking 상호작용으로 DNA를 끌어당긴다 (도 1). 게다가, 수소성 상호작용(hydrophobic interaction)은 목적 DNA를 끌어당기는 효과가 있다. 프라이머가 Au@GO 표면에 부착된 단일가닥 DNA와 결합하도록 반응 혼합물을 55℃까지 냉각시켰다.
연장단계(단계3; 72℃, 50초)에서 목적 DNA의 상보적 사슬의 합성이 일어난다 (도 5). Au@GO 는 높은 열 전도성을 가진다. 따라서, 나노입자에 첨가된 PCR 산물은 가열 및 냉각 단계 동안에 신속히 열적 평형에 도달할 수 있었다. 최종적으로, 신속한 열적 평형이 PCR 시스템에 높은 효율을 가져온다. 상기 3 단계의 증폭을 동일하게 30회 수행하였다. 최종적으로 4℃를 유지하였다.
PCR 후, 0.8% wt/v 아가로스 젤 내 분석하여, Gel-Doc을 이용하여 가시화하였다. 전기영동을 하기 위하여, 젤 로딩 완충액을 PCR 반응 완충액이 포함하고 있기 때문에, 어떠한 처리도 없이 젤 로딩을 할 수 있었다.
실시예 3: PCR 결과
3-1 : 나노입자의 농도에 따른 PCR 수율
PCR 시스템에서, 주형으로 어류(고등어) DNA extraction 800 bp 단편을 사용하였다. 우선, 각 그래핀 옥사이드(GO)와 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO)의 최적의 농도를 선택하기 위하여, GO, Au@GO 각각 1X10-3㎍/㎕에서 9X10-2㎍/㎕ 사이의 열 가지 다른 농도에서 실험을 하였다. 나노입자의 전체 부피는 10 ㎕이었다. 극도의 농도가(>1 ㎍/㎕)이 PCR 혼합물에 첨가되면, PCR 반응은 완전히 억제된다. 이는 나노입자 사이의 응집으로 판단된다. GO, AuNP, Au@GO 모두 나노입자가 없는 양성대조군에 비해 증폭 효율을 향상시킨다는 것을 알 수 있었다(도 6, 도 7 및 도 8). GO의 농도가 1 X 10-3~3X10-3㎍/㎕ 일 때 (lane 1 및 2), 7 X 10-3~9X10-3㎍/㎕ 일 때 (lane 4 및 5), Au@GO 의 농도가 1 X 10-2㎍/㎕, 3 X 10-2㎍/㎕ 일 때 (lane 6 및 7), 나노입자가 들어가지 않은 양성 대조군에 비해 강한 밴드를 나타내었다. 이러한 결과, PCR 수율이 나노입자의 농도에 크게 의존적이라는 것을 확인할 수 있었다.
3-2 : GO@Au의 PCR 수율 향상 효과
도 9의 경우, 각 나노입자의 최적의 농도에서 PCR을 수행한 결과, 금 나노입자(AuNP), 그래핀 옥사이드(GO) 및 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO)를 이용한 경우가 대조군(Con)보다 PCR에 대한 특이도 및 수율이 높게 나타난 결과물을 획득하였다. 특히 금 나노 입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO)의 경우, 금 나노입자(AuNP) 및 그래핀 옥사이드(GO)에 비해 더 강한 밴드가 나타났음을 확인하였다(도 9의 lane 5,6).
실시예 4: GO@Au를 이용한 qPCR 방법
4-1 : qPCR 절차
서로 다른 여섯 개의 프라이머(VF2_t1_M13 서열번호 1; FishR2_t1_M13 서열번호 2; EGFP_F_Nd 서열번호 3; EGFP_R_H3 서열번호 4; LM0_F 서열번호 5; LM0_R 서열번호 6;)를 이용하여 DNA를 증폭시키기 위한 PCR을 수행하였다(표 1~3). DNA 주형으로 어류 DNA에서 G-DEXTMIIc For Cell/Tissue Genomic DNA Extraction Kit(INtRON,한국)를 이용해 추출한 DNA와 파란색 가시광선에서 자외선 범위의 빛에 노출되었을 때 밝은 녹색의 형광 빛을 내는 녹색형광단백질(GFP)인 EGFP DNA, 그리고 박테리아균인 Listeria monocytogenes(ATCC 19115)을 사용하였다. qPCR 반응 혼합물은 다음을 포함하였다: Taq DNA 중합효소, SYBR Green qPCR 버퍼, SYBR Green Ⅰ, ROX Passive reference dye. 이러한 반응 완충액 혼합물 내에, 전체 부피가 20 ㎕이 될 때까지, 나노입자의 농도를 동일 또는 상이하게 하면서, 주형 DNA 1 ㎕, 정방향 프라이머(10 pmol/㎕) 1 ㎕, 역방향 프라이머(10 pmol/㎕) 1 ㎕ 및 증류수를 첨가하였다.
BIO-RAD CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System을 이용한 qPCR 후, PCR 산물을 가시화하기 위하여 BIO-RAD CFX Manager 3.1을 이용하였다.
정방향 프라이머
EGFP_F_Nd(# 3) 		역방향 프라이머
EGFP_R_H3(# 4) 		밴드(amplicon)
사이즈
서열 5'-AAAATTCCATAT
GGTGAGCAAGGGCGA-3' 		5'-TTCTAAGCTTTTA
CTTGTACAGCTCGTC-3'

800bp
Tm (℃) 64.9 55.4
GC content (%) 44.4 39.3
정방향 프라이머
LM0_F(# 5) 		역방향 프라이머
LM0-R(# 6) 		밴드(amplicon)
사이즈
서열 5'-GCGCCACTACGGAC
GTTTAACCAAG-3' 		5'-ACAATCGCATCCGCAA
GCACTGTAG-3'

200bp
Tm (℃) 55.7 47.3
GC content (%) 56 52
4-2 : qPCR 프로토콜
우선, 초기 변성단계(95℃, 5분)에서 온도를 95℃까지 지속적으로 증가시켰다. 변성단계(단계1; 95℃, 30초)에서 이중가닥 DNA 내 수소결합이 끊어진다. 어닐링단계(단계2; 55℃, 30초)에서 특정 프라이머와 목적 DNA가 결합한다. 여기서 나타나는 특징은 실시예 2-3과 같다.
상기 2 단계의 증폭을 동일하게 50회 수행하였다.
연장단계(단계3)에서 목적 DNA의 상보적 사슬의 합성이 일어나며 DNA의 큰 홈 부분에 붙어 특정 파장의 빛 에너지 (500 nm)를 흡수하였다가 고유 파장으로 빛 (530 nm)을 발산하는 형광 물질인 SYBR Green Ⅰ이 함께 결합하였다.
qPCR 후, BIO-RAD CFX Manager 3.1 내 분석하여 가시화 하였다. DNA 내에 붙은 SYBR Green Ⅰ의 형광 정도를 측정함으로써 증폭되는 DNA의 양을 정량할 수 있었다. Gel-Doc을 이용하여 가시화하였다.
실시예 5: qPCR 결과
5-1 : Au@GO의 qPCR 수율 향상 효과
도 10의 경우, 각 DNA 종류에 따른 qPCR을 반복적으로 수행한 결과, 어떤 DNA 종류에 상관없이 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO)의 최종 증폭량이 가장 큰 것을 확인하였다. 이로서 qPCR 수율 사이에 눈에 띄는 차이가 나타났음을 확인하였다.
5-1 : Au@GO의 qPCR 복제 사이클 수 변화
qPCR에서 Cq(Quantification cycle)은 복제가 시작되는 사이클 수를 말한다. Cq의 사이클 수가 적을수록 목적 DNA와의 발현이 크다는 것을 뜻한다.
도 11의 경우, 각 DNA 반응 산물의 크기가 다른 세 종류 DNA를 사용하여, Au@GO의 Cq값을 비교하였다. 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드 (Au@GO)의 Cq 값이 대조군에 비하여 가장 작은 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> PCR Composition Containing Graphene Oxide Coated by Au Nanoparticles and Method for PCR Using The Same <130> P14-B337 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 caaccaacca caaagacatt ggcac 25 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 acttcagggt gaccgaagaa tcagaa 26 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aaaattccat atggtgagca agggcga 27 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttctaagctt ttacttgtac agctcgtc 28 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcgccactac ggacgtttaa ccaag 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 acaatcgcat ccgcaagcac tgtag 25

Claims (11)

  1. 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO), 핵산 중합효소 및 목적핵산을 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 PCR 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산 중합효소는 Taq 폴리머라아제, VENT 폴리머라아제, DEEPVENT 폴리머라아제, PWO 폴리머라아제 및 Pfu 폴리머라아제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 PCR 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 목적 핵산과 결합하여 형광을 발하는 형광 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 qPCR 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 형광물질은 SYBR GREEN, Cy5.5, Cy5, Cy3.5 및 Cy3으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 PCR 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 완충용액을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 완충용액은 젤로딩 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 프라이머쌍은 서열번호 1~2, 서열번호 3~4 및 서열번호 5~6으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 PCR 조성물.
  8. 제1항에 있어서, qPCR용 조성물인 것을 특징으로 하는 PCR 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 금 나노입자가 도포된 그래핀 옥사이드(Au@GO)의 농도가 1 X 10-3㎍/㎕ 내지 3 X 10-3㎍/㎕ 인 것을 특징으로 하는 PCR 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 PCR 조성물을 이용하는 것을 특징으로 하는 목적핵산의 증폭방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 PCR 조성물을 포함하는 핵산 검출용 키트.
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