KR101461222B1 - 탄소화 폴리도파민이 도포된 실리카 나노입자를 포함하는 pcr 조성물 및 이를 이용한 pcr 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Taq 중합효소와의 상호작용 및 방향성 상호작용 (π-stacking)으로, PCR 효율성을 향상시키는 효과가 있는 탄소화 폴리도파민이 도포된 실리카 나노입자를 포함하는 PCR 조성물 및 이를 이용한 PCR 방법에 관한 것이다.

Description

탄소화 폴리도파민이 도포된 실리카 나노입자를 포함하는 PCR 조성물 및 이를 이용한 PCR 방법{PCR Composition Containing Silica Nanoparticles Coated By Carbonized Polydopamine and PCR Method Using Thereof}
본 발명은 탄소화 폴리도파민이 도포된 실리카 나노입자(C-PD SNP)를 포함하는 PCR 조성물 및 이를 이용한 PCR 방법에 관한 것이다.
중합효소연쇄반응(PCR)은 DNA의 원하는 부분의 복사본(copy)의 수를 기하급수적으로 증폭시킬 수 있는 분자생물학적(molecular biological) 방법이다. DNA의 어느 부분이든지 그 서열만 알면 PCR을 통해서 증폭할 수 있다. PCR은 1980년대 중반 K. Mullis에 의해서 고안되었으며 유전자를 연구, 분석하는 분자유전학을 포함한 많은 생물학 관련 연구에서 현재까지도 널리 이용되고 있는 방법이다. PCR은 DNA 중합효소(polymerase)에 의한 DNA 복제(replication)의 특징을 이용한 방법이다. DNA 중합효소는 외가닥(single stranded) DNA를 주형(template)으로 해서 상보적인(complementary) DNA를 합성할 수 있는데, 이러한 외가닥 DNA는 두 가닥(double stranded) DNA를 끓임(boiling)으로써 간단하게 얻을 수 있다. 이 과정을 DNA 변성(denaturation)이라 한다. DNA 중합효소가 DNA 복제를 시작하기 위해서는 시작 부위가 두 가닥 DNA 형태로 되어 있어야 한다. 따라서 PCR에서는 증폭시킬 DNA 서열의 양 말단에 주형 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 작은 DNA 조각을 함께 넣어 주어야 하며 이것이 특정 DNA 서열의 양 끝에 결합(annealing)하여 두 가닥 형태의 DNA가 되어야 한다. 이럴 경우에만 DNA 중합효소에 의한 DNA 복제가 개시될 수 있다. 주형 DNA 말단과 상보적으로 결합할 수 있는 작은 DNA 조각을 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프라이머(primer) 또는 줄여서 프라이머라 한다. 일단 프라이머가 주형 DNA 말단에 결합한 후에는 DNA 중합효소의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 진행(extension)된다. 이런 일련의 기작에 PCR 반응이 기반하기 때문에 PCR 주기(cycle)는 두 가닥 주형 DNA를 외가닥 DNA로 바꾸어 주는 변성 단계,프라이머가 주형 DNA 말단에 결합하는 결합 단계 및 DNA 중합효소의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 되는 신장 단계의 3단계로 구성된다. 최초 1회의 PCR 주기가 끝난 후에 그 다음으로 이어지는 PCR 주기에서는 최초(original) 주형 DNA와 PCR에 의해 새로 합성된 DNA 모두가 DNA 주형이 된다. 이렇게 PCR은 주기가 계속적으로 반복될수록 DNA 주형의 수는 계속 늘어나게 된다.
최근까지 개발된 PCR 방법으로는, 증폭에 소요되는 시간을 줄인 래피드 PCR(rapid PCR), 시료의 정제 과정을 생략하고자 하는 직접 PCR(direct PCR), 역전사 반응과 PCR을 결합시켜 RNA를 주형으로 사용하게 한 역전사 효소-PCR(reverse transcriptase PCR; RT-PCR), 상온에서 일어나는 비특이 증폭을 획기적으로 감소시켜 PCR 반응의 특이성(specificity)을 개선시킨 핫-스타트 PCR(hot-start PCR), PCR 반응의 실시간 모니터링(monitering)이 가능한 실시간 PCR(real-time PCR) 등이 있다. 이외에도 매우 많은 방법들과 관련 기술들이 개발되었다.
아울러, PCR 반응 자체의 효율성을 개선하려는 시도들이 있어 왔다. PCR 반응의 효율성을 높이려는 시도는 다양한 방법이 있었는데, 그 예로 PCR 장치(machine)의 개량, 기존 DNA 중합효소의 단백질 공학(protein engineering)적 개량, PCR 반응 성분(component)들의 고순도화, PCR 반응을 증진시킬 수 있는 PCR 반응 증진제(enhancer)의 적용, 및 DNA 중합효소 등 PCR 반응의 필수 성분들의 안정성(stability)을 높여줄 수 있는 안정화제(stabilizer)의 적용 등의 방법이 있었다.
특히, PCR 효율성을 높이기 위하여, 그래핀이 사용되어 왔다. 이와 구조가 유사한 실리카 나노입자(SNP)는 리소자임, 카탈라아제, 트립신 및 중합효소를 포함하는 단백질을 흡수하는 기능을 한다. 게다가, SNP의 중공(hollow) 형태는 생체분자를 포획하기 위한 상위 표면을 향상시킨다(Liu, R. et al., Angew . Chem ., 50:6799-6802, 2011). 이는 최종적으로 우수한 PCR 효율성을 나타내는 중요한 힘 중 하나의 역할을 한다. 따라서, SNP를 PCR 효율성을 높이기 위하여 사용할 수 있으나, SNP는 전자 및 열 모두에 대한 좋지 못한 도체이다(Bonel, L. et al., Biosens. Bioelectron ., 26:3254-9, 2011; Alexey A et al., Langmuir, 20:6800-7, 2004).
따라서, PCR 효율성을 높일 수 있는 극복 방안의 제시가 매우 미흡한 실정인바, 유전공학 등의 분야에서 널리 활용되는 PCR의 효율성을 높일 수 있는 새로운 방안이 절실히 요구된다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 탄소화 폴리도파민이 도포된 실리카 나노입자가 Taq DNA 중합효소와의 상호작용 및 방향성 상호작용 (π-stacking)으로 PCR 효율성을 현저히 향상시킬 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 탄소화 폴리도파민이 도포된 실리카 나노입자를 포함하여 PCR 효율성을 향상시키는데 우수한 효과가 있는 PCR 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 탄소화 폴리도파민이 도포된 실리카 나노입자(C-PD SNP)를 포함하는 PCR 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 탄소화 폴리도파민이 도포된 실리카 나노입자(C-PD SNP)를 포함하는 PCR 조성물을 이용하는 것을 특징으로 하는 목적 핵산의 PCR 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 탄소화 폴리도파민이 도포된 실리카 나노입자를 포함하는 PCR 조성물은 Taq DNA 중합효소와의 상호작용 및 방향성 상호작용 (π-stacking)으로, PCR 효율성을 향상시키는 효과가 있으므로, 생명공학 분야 등에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 탄소화 폴리도파민과 핵염기(nucleobase)의 DNA 사이의 방향성 상호작용(aromatic-aromatic interaction; π-stacking)을 나타낸 이미지이다.
도 2는 실시예 1에서 제조된 C-PD SNP의 TEM 이미지이다. 기준자는 100 nm를 나타낸다.
도 3은 실시예 2-3의 PCR 프로토콜을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 3-1의 나노입자의 농도에 따른 PCR 수율을 나타낸 것으로, M은 DNA 마커, Con은 나노입자가 없는 양성 대조군; (1)은 SNP 100㎍/10㎕, (2)는 SNP 10㎍/10㎕, (3)은 SNP 1㎍/10㎕, (4)는 SNP 1X10-1㎍/10㎕, (5)는 SNP 1X10-2㎍/10㎕, (6)은 PD SNP 100㎍/10㎕, (7)은 PD SNP 10㎍/10㎕, (8)은 PD SNP 1㎍/10㎕, (9)는 PD SNP 1X10-1㎍/10㎕, (10)은 PD SNP 1X10-2 ㎍/10㎕, (11)은 C-PD SNP 100㎍/10㎕, (12)는 C-PD SNP 10㎍/10㎕, (13)은 C-PD SNP 1㎍/10㎕, (14)는 C-PD SNP 1X10-1㎍/10㎕ 및 (15)는 C-PD SNP 1X10-2㎍/10㎕를 나타낸다.
도 5는 실시예 3-1의 나노입자의 농도에 따른 PCR 수율을 나타낸 것으로, M은 DNA 마커, Con은 나노입자가 없는 양성 대조군; (1)은 SNP 1㎍/10㎕, (2)는 SNP 1X10-1㎍/10㎕, (3)은 SNP 1X10-2㎍/10㎕, (4)는 SNP 1X10-3 ㎍/10㎕, (5)는 SNP 1X10-4㎍/10㎕, (6)은 PD SNP 1㎍/10㎕, (7)은 PD SNP 1X10-1㎍/10㎕, (8)은 PD SNP 1X10-2㎍/10㎕, (9)는 PD SNP 1X10-3㎍/10㎕, (10)은 PD SNP 1X10-4㎍/10㎕, (11)은 C-PD SNP 1㎍/10㎕, (12)는 C-PD SNP 1X10-1㎍/10㎕, (13)은 C-PD SNP 1X10-2㎍/10㎕, (14)는 C-PD SNP 1X10-3㎍/10㎕ 및 (15)는 C-PD SNP 1X10-4㎍/10㎕를 나타낸다.
도 6은 실시예 3-2의 PCR 수율과 희석률의 관련도를 나타낸 것으로, (a)는 C-PD SNP, (b)는 SNP 및 (c)는 PD SNP의 결과를 나타낸다. (a), (b) 및 (c)에서 M은 DNA 마커, Con은 나노입자가 없는 양성 대조군, (1)은 나노입자의 농도가 1㎍/10㎕, (2)는 1X10-1㎍/10㎕, (3)은 2X10-2㎍/10㎕, (4)는 4X10-2㎍/10㎕, (5)는 6X10-2㎍/10㎕, (6)은 8X10-2㎍/10㎕, (7)은 1X10-2㎍/10㎕, (8)은 2X10-3㎍/10㎕, (9)는 4X10-3㎍/10㎕, (10)은 6X10-3㎍/10㎕, (11)은 8X10-3㎍/10㎕ 및 (12)는 1X10-3㎍/10㎕인 것을 각각 나타낸다.
도 7은 실시예 3-3의 라운드 횟수에 따른 PCR 수율을 나타낸 것으로, (a)는 C-PD SNP, (b)는 GO와 SNP 및 (c)는 PD-SNP의 결과를 나타낸다. (a), (b) 및 (c)에서 M은 DNA 마커, Con은 나노입자가 없는 양성 대조군, C는 C-PD SNP, G는 GO, S는 SNP 및 P는 PD-SNP를 나타낸다.
도 8은 실시예 3-4의 PCR 반복 횟수에 따른 PCR 수율을 나타낸 것으로, M은 DNA 마커, Con은 나노입자가 없는 양성 대조군, (1)은 GO 8X10-3 ㎍, (2)는 SNP 2X10-2 ㎍, (3)은 PD SNP 1X10-1 ㎍, (4)는 PD SNP 1X10-2 ㎍, (5)는 PD SNP 1X10-3 ㎍, (6)은 C-PD SNP 1X10-1 ㎍, (7)은 C-PD SNP 1X10-2 ㎍ 및 (8)은 C-PD SNP 1X10-3 ㎍를 나타낸다.
도 9는 실시예 3-5의 어닐링 온도 변화에 따른 효과를 나타낸 것으로, 어닐링 온도가 (a)는 35℃, (b)는 40℃, (c)는 45℃, (d)는 50℃ 및 (e)는 55℃인 것을 각각 나타낸다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서, "SNP"는 실리카 나노입자를 나타내고, "PD-SNP"는 폴리도파민이 도포된 실리카 나노입자를 나타내며, "C-PD SNP"는 탄소화(carbonized) 폴리도파민이 도포된 실리카 나노입자를 나타낸다. 또한, "GO"는 그래핀 산화물을 나타낸다.
본 발명에서는, 탄소화 폴리도파민이 도포된 실리카 나노입자(C-PD SNP)를 포함하는 PCR 조성물을 제조하여, 이를 첨가한 PCR 방법을 수행하였다. 그 결과, SNP, PD SNP 및 GO와 비교하여, C-PD SNP를 포함하는 PCR 조성물이 PCR 효율성을 현저히 향상시킨다는 것을 확인하였다.
본 발명에서 사용된 C-PD SNP는 1) C-PD SNP와 Taq DNA 중합효소의 상호작용(양성 전하를 가지는 C-PD SNP-Taq 복합체는 음성 전하를 가지는 목적 DNA 및 프라이머를 끌어당김), 2) 탄소화 폴리도파민과 핵염기(nucleobase)의 DNA 사이의 방향성 상호작용(aromatic-aromatic interaction; π-stacking)에 의한 DNA 친화력(도 1), 3) 아민기의 화학적 변화로 인한 DNA 포획(아민기는 높은 농도의 질소 컨텐츠(양성 전하)를 포함하여, 목적 DNA를 끌어당기기 위한 아노드 물질로써 우수한 전기화학적 성질을 나타냄)으로 PCR 효율성을 현저히 향상시킨다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 탄소화 폴리도파민이 도포된 실리카 나노입자(C-PD SNP)를 포함하는 PCR 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 중합효소, 특정 핵산부위와 결합하여 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 완충액을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머쌍은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 중합효소는 Taq DNA 중합효소인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 완충액은 젤 로딩 완충액(Gel loading buffer)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 C-PD SNP의 농도가 바람직하게는 1 X 10-5㎍/㎕ 내지 1㎍/㎕, 보다 바람직하게는 1 X 10-3㎍/㎕ 내지 0.1㎍/㎕인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 탄소화 폴리도파민이 도포된 실리카 나노입자(C-PD SNP)를 포함하는 PCR 조성물을 이용하는 것을 특징으로 하는 목적 핵산의 PCR 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, "목적 핵산"은 PCR 반응으로 증폭시킬 수 있으며, 1개 또는 복수 개의 염기 변이 부위를 함유하고 있는 DNA 나 RNA 등의 핵산을 말한다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실시예 1: C- PD SNP 의 제조
실리카 합성의 대표적인 방법인 Stober 방법(Stober et al., J. Colloid Interface Sci., 26:62-69, 1968)을 이용하여 실리카를 합성하였다. 원형플라스크 500 mL 에 250 mL 에탄올을 넣고 증류수 8.7 mL와 Tetraethylorthosilicate (TEOS, Sigma-Aldrich) 10.8 mL와 수산화암모늄(NH4OH) 16.99 mL을 넣어 3시간 정도 교반하였다. 투명했던 용액에 뿌옇게 현탁액이 되고, 에탄올과 아세톤으로 각 2~3 회씩 세척과 원심분리를 반복해 주었다. 세척을 마친 실리카를 오븐 80 ℃에 24시간 건조시키고, 막자와 막자사발을 이용하여 곱게 갈아서 사용하였다.
실리카 표면에 폴리도파민을 코팅하기 위해서는, 실리카 분말 100mg을 Tris buffer (pH 8.5, 10 mM) 100 mL 용액에 초음파를 30분 동안 가하여서 잘 분산 시켜 주었다. 실리카가 잘 분산된 용액에 도파민 전구체 (Dopamine hydrochloride)를 200 mg (2mg/mL)을 넣고 6시간 동안 교반시켜 주었다. 용액은 반응초기에 선홍색을 보이다가 반응이 진행되면서 점점 흑갈색을 보였다. 용액을 원심분리 후, 상층액을 제거하고 증류수로 5회 분산 및 원심분리를 통하여 세척하였다. 세척을 완료한 도파민이 코팅된 실리카 분말을 오븐에 60 ℃ 24시간 건조시켰다.
폴리도파민 코팅의 탄화를 위해서 준비된 도파민이 코팅된 실리카 분말을 곱게 갈아서 도가니에 담았다. 도가니를 가열장비에 넣었다. 가열장비 내부의 공기를 제거하여 진공상태를 만들고 이후에 질소를 가열장비 내부로 불어 넣어 질소 분위기를 만들어 주었다. 가열은 1분에 1 ℃ 씩 450 ℃까지 열을 가하고, 450 ℃에서 6시간 유지시켜 주었다.
이후 제조된 나노입자가 첨가된 균일하게 희석된 용액을 제조하였다. 각각의 나노입자(1 mg)를 오토클레이브된 증류수(1 ml)에 개별적으로 부유시켰다. 나노입자는 소수성 물질로써 물과 섞이지 않기 때문에, 수조 초음파 분쇄기(무지개, 한국)를 이용하여 2 시간 동안 초음파처리하였다. 진동수는 40 kHz이었고, 초음파는 100 W이었다. 그 다음, 볼텍스 및 증류수를 이용하여, 나노입자의 농도를 희석하였다. 적절한 혼합 및 증류수 내 나노입자 간 응집 방지를 위하여, 희석 단계 직전에 초음파 처리를 하였다. 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 C-PD SNP를 확인하였다(도 2).
실시예 2: C- PD SNP 를 이용한 PCR 방법
2-1 : PCR 절차
특정한 두 개의 프라이머(EGFP_F_Nd 서열번호 1; EGFP_R_H3 서열번호 2)를 이용하여 DNA를 증폭시키기 위한 PCR을 수행하였다(표 1). DNA의 최적화 및 증폭은 MAXIME PCR preMIX Kit(INtRON, 한국)를 이용하여 수행하였다. DNA 주형으로 파란색 가시광선에서 자외선 범위의 빛에 노출되었을 때 밝은 녹색의 형광빛을 내는 녹색형광단백질(GFP)인 pEGFP C1을 사용하였다. PCR 반응 혼합물은 다음의 최종 농도를 포함하였다: 반응 완충액 내 i- Taq TM DNA 중합효소 2.5 U/㎕, dNTP 2.5 mM, 반응 완충액 1X, 젤 로딩 완충액(Gel loading buffer) 1X. 이러한 반응 완충액 혼합물 내에, 전체 부피가 20 ㎕이 될 때까지, 나노입자의 농도를 달리하거나 하지 않으면서, 주형 DNA 1 ㎕, 정방향 프라이머(10 pmol/㎕) 1 ㎕, 역방향 프라이머(10 pmol/㎕) 1 ㎕ 및 증류수를 첨가하였다.
BIO-RAD T100TM Thermal cycler를 이용한 PCR 후, PCR 산물을 가시화하기 위하여 0.8% wt/v 아가로스 젤(Seakem® LE Agarose, LANZA)을 이용하여 전기영동을 하였다. 전기영동 장치로 Mupid®-2plus(ADVANCE)를 사용하였다. 또한, 사이즈 마커로 Marker 1 kb plus(ACCUGEN)를 사용하였다. 최종적으로, 증폭된 PCR 산물을 Gel-Doc, Slite 140S(AVEGENE)을 이용하여 정량하였다.
정방향 프라이머
EGFP_F_Nd		 역방향 프라이머
EGFP_R_H3		 밴드(amplicon)
사이즈
서열 5'-AAAATTCCATAT
GGTGAGCAAGGGCGA-3'		 5'-TTCTAAGCTTTTA
CTTGTACAGCTCGTC-3'

800bp
Tm (℃) 64.9 55.4
GC content (%) 44.4 39.3
2-2 : PCR 프로토콜
전체적인 PCR 프로토콜은 도 3과 같다.
우선, 초기 변성단계(94℃, 5분)에서 온도를 94℃까지 지속적으로 증가시켰다. 나노입자와 프라이머 사이의 상호작용에 따라 비특이적 어닐링이 나타났다. 프라이머가 나노입자의 표면에 부착되었고, C-PD SNP-Taq 복합체를 형성하였다. 이로써, 주형 DNA에 프라이머가 잘못 붙는 현상을 최소화할 수 있었다. 결국, PCR 효율성이 향상될 수 있음을 알 수 있었다.
변성단계(단계1; 94℃, 30초)에서 이중가닥 DNA 내 수소결합이 끊어진다.
어닐링단계(단계2; 50℃, 30초)에서 특정 프라이머와 결합한 양성 전하를 띄고 있는 C-PD SNP-Taq 복합체는 강한 친화력을 가지고 음성 전하를 띄고 있는 목적 DNA를 끌어당긴다. 게다가, π-stacking 상호작용은 목적 DNA를 끌어당기는 효과가 있다. 프라이머가 C-PD SNP 표면에 부착된 단일가닥 DNA와 결합하도록 반응 혼합물을 55℃까지 냉각시켰다.
연장단계(단계3; 72℃, 50초)에서 목적 DNA의 상보적 사슬의 합성이 일어난다. C-PD SNP는 높은 열 전도성을 가진다. 따라서, 나노입자에 첨가된 PCR 산물은 가열 및 냉각 단계 동안에 신속히 열적 평형에 도달할 수 있었다. 최종적으로, 신속한 열적 평형이 PCR 시스템에 높은 효율성을 가져온다.
상기 3 단계의 증폭을 동일하게 25회 수행하였다.
최종적으로 4℃를 유지하였다.
PCR 후, 0.8% wt/v 아가로스 젤 내 분석하여, Gel-Doc을 이용하여 가시화하였다. 전기영동을 하기 위하여, 젤 로딩 완충액을 PCR 반응 완충액이 포함하고 있기 때문에, 어떠한 처리도 없이 젤 로딩을 할 수 있었다.
2-3 : PCR 산물의 측정
PCR 산물의 양을 확인하기 위하여, DNA를 측정하였다. PCR 증폭 후, PCR 산물을 MEGA quick-spinTM, Total Fragment DNA purification Kit(INtRON, 한국)를 이용하여 정제하였다. 그 후, 정제된 PCR 산물을 전체 부피가 50 ㎕이고, 높이가 15 mm인 Micro Quartz Cell을 이용한 분광광도계, OPIZEN POP(MECASY, 한국)을 이용하여 측정하였다.
실시예 3: PCR 결과
3-1 : 나노입자의 농도에 따른 PCR 수율
PCR 시스템에서, 주형으로 pEGFP C1 (향상된 녹색형광단백질) 800 bp 단편, 플라스미드 DNA를 사용하였다. 우선, 각각의 나노입자의 최적의 농도를 선택하기 위하여, SNP, PD SNP, C-PD SNP 각각 1X10-2 ㎍에서 100 ㎍ 사이의 다섯 가지 다른 농도에서 실험을 하였다. 나노입자의 전체 부피는 10 ㎕이었다. 극도의 C-PD SNP(>10 ㎍) 및 PD SNP(>1 ㎍)이 PCR 혼합물에 첨가되면, PCR 반응은 완전히 억제된다. 이는 나노입자 사이의 응집으로 판단된다. 게다가, SNP 보다 C-PD CNP가 농도에 좀 더 의존적이나, C-PD SNP가 SNP에 비해 증폭 효율성을 향상시킨다는 것을 알 수 있었다(도 4). PD SNP 농도가 100 ㎍, 10 ㎍일 때(lane 6 및 7) 및 C-PD SNP 농도가 100 ㎍일 때(lane 11)에는 아가로스 젤에 밴드가 나타나지 않았다. C-PD SNP가 다른 나노입자들에 비해 강한 밴드를 나타내었다(lane 13, 14 및 15).
상기 결과를 고려하여, PCR 증폭을 억제시키는 농도를 제외한, SNP, PD SNP, C-PD SNP 각각 1X10-4 ㎍에서 100 ㎍ 사이의 다섯 가지 다른 농도에서 실험을 하였다. 나노입자의 전체 부피는 10 ㎕이었다. 그 결과, 나노입자의 너무 높고 낮은 농도에서는 아가로스 젤에 약한 밴드가 나타났다. 이러한 결과는 C-PD SNP가 1X10-2 ㎍에서 1 ㎍ 사이의 넓은 지역에서 PCR 효율성을 향상시킨다는 것을 나타낸다. 밴드 강도는 나노입자가 감소된 농도만큼 점차 강해졌다. 희석 단계를 반복하면 할수록, 목적 밴드(800bp)는 점차 감소하였다. PCR 수율이 나노입자의 농도에 크게 의존적이라는 것을 확인할 수 있었다(도 5). SNP는 lane 3 및 4에서 강한 밴드를 나타내었고, PD SNP는 lane 9 및 10에서 강한 밴드를 나타낸 반면, C-PD SNP는 lane 11, 12, 13 및 14에서 강한 밴드를 나타내었다.
3-2 : PCR 수율과 희석률의 관련도
희석률의 관련도를 확인하기 위하여 다른 농도에서 PCR를 수행하였다. 그 결과, C-PD SNP는 양성 대조군과 비교하여 강한 밴드를 나타냈다. 특히, 강한 밴드가 1X10-2 ㎍ ~ 1X10-1 ㎍의 범위에서 가시화되었다(도 6의 a, lane 2~7). 상기 농도 중에서, 1X10-2 ㎍가 최고의 농도임을 확인할 수 있었다. 게다가, 최적의 부분 또는 농도에서 강한 밴드보다 약한 밴드가 나타나는 현상을 확인할 수 있었다. 결국, 각각의 나노입자의 최적의 특정 농도를 알 수 있었다. 같은 방식으로, SNP는 2X10-2 ㎍에서 강한 밴드를 나타냈다(도 6의 b, lane 6). PD SNP는 1X10-3 ㎍에서 강한 밴드를 나타냈다(도 6의 c, lane 12). GO는 8X10-3 ㎍에서 최적의 농도를 나타낸다고 보았다.
3-3 : C- PD SNP 의 PCR 수율 향상 효과
도 7의 경우, PCR 결과물을 반복적으로 수행한 결과, 5회째 PCR결과의 경우, C-PD SNP를 이용한 경우가 대조군(Con)보다 PCR에 대한 특이도 및 수율이 높게 나타났으며, 특히 GO 및 PD-SNP를 이용한 나머지의 경우에는 4회째 PCR까지만 결과물을 획득하였다. 이로서 PCR 수율 사이에 눈에 띄는 차이가 나타났음을 확인하였다.
PCR 수율에 대한 C-PD SNP의 효과를 증명하기 위하여, 6 라운드 PCR을 실시하였다. 실시예 3-1 및 3-2에서 선택된 각각의 나노입자의 최적의 농도를 이용하였다. 첫 번째 라운드 PCR 후, 각각의 라운드의 산물은 DNA fragment purification Kit를 이용하여 다음 라운드의 주형으로 사용되었다.
나노입자가 없는 경우(Con), 밴드는 5 라운드 PCR까지 나타났다. 같은 방식으로, 반복된 라운드 PCR은 5 라운드까지 C-PD SNP 1X10-2 ㎍을 첨가함으로써 향상되었다.
C-PD SNP가 있거나 없는 밴드 모두 6 라운드에서 사라졌다. 그러나 C-PD SNP가 없는 경우 (양성 대조군), 4 라운드에서 적은 산물을 얻을 수 있었다. 다른 농도의 C-PD SNP를 조사하여, 반복되는 PCR 시스템에서 높은 효율성을 유지하기 위한 최고의 농도가 1X10-2 ㎍임을 확인할 수 있었다(도 7의 a).
또한, 다른 나노입자들, SNP, PD SNP, GO 또한 6 라운드 PCR을 수행하였다. GO 8X10-3 ㎍이 첨가된 PCR 산물의 밴드는 4 라운드까지 나타났다(도 7의 b). SNP 또는 PD SNP가 첨가된 밴드는 5 라운드에서 약간 나타났으나, 6 라운드에서 완전히 사라졌다(도 7의 b 및 c).
3-4 : PCR 반복 횟수에 따른 효과
PCR 수율은 일반적으로 주기의 수에 의존적이다. 초과적인 PCR 주기은 플래토 효과 때문에 문제가 된다. 플래토 효과는 PCR 내 산물 축적을 기하급수적으로 감소시키는 것을 말하는 것으로, 이러한 감소는 초과적인 PCR 주기에 기인한 것이다. PCR 주기을 줄이는 것이 C-PD SNP 효율성을 나타내는 또 다른 요인이라고 추정할 수 있다. 이에, 25 주기에서 10 주기까지, 5 주기 간격으로 PCR 주기을 감소시켰다.
10 주기 PCR은 PCR 산물의 어떠한 밴드도 나타내지 않았다. 15 주기 PCR에서는, C-PD SNP가 첨가된 PCR 산물[(6), (7) 및 (8)]이 약간 두껍고 강한 밴드를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, C-PD SNP의 효과는 작은 수의 주기 내에서 확인할 수 있었다. 플래토 효과를 회피하기 위하여, 25 주기 PCR을 수행하였다(도 8).
3-5 : 어닐링 온도 변화에 따른 효과
어닐링 온도는 PCR 효율성에 영향을 미친다. 일반적으로, 부적절한 어닐링 온도는 하나의 또는 모든 특정 프라이머가 비특이적 타겟에 어닐링하는 결과를 초래할 수 있다. 이는 DNA 내부 단일염기 불균형 또는 부분적 어닐링을 일으킨다. 따라서, 부적절한 어닐링 온도는 비특이적 산물 또는 PCR 증폭의 낮은 수율을 초래한다.
35℃에서 55℃까지 다양한 어닐링 온도를 사용하여, C-PD SNP의 수율 효과를 관찰하였다. UV-VIS 분광광도계를 이용하여 PCR 산물의 DNA 정량화를 측정하였다. C-PD SNP가 첨가된 PCR 산물이 심지어 낮은 어닐링 온도에서도 안정적인 증폭을 가능하게 한다. 40℃와 비교할 때, C-PD SNP가 첨가된 PCR 산물의 DNA 정량화는 50℃에서와 거의 동일하였다. 그러나 양성 대조군과 C-PD SNP가 첨가된 PCR 산물 사이의 차이는 40℃에서 보다 컸다. 게다가, 모든 나노입자를 가진 PCR 산물은 양성 대조군에 비해 우월하였다. 어닐링 온도 55℃에서 나노입자를 가진 PCR 산물의 정량화는 양성 대조군과 유사하거나 낮았다. 따라서, 최적의 어닐링 온도가 50℃임을 알 수 있었다(도 9).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> CHUNG-ANG UNIVERSITY Industry-Academy Cooperation Foundation <120> PCR Composition Containing Silica Nanoparticles Coated By Carbonized Polydopamine and PCR Method Using Thereof <130> P13-B371 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP_F_Nd forward primer <400> 1 aaaattccat atggtgagca agggcga 27 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP_R_H3 reverse primer <400> 2 ttctaagctt ttacttgtac agctcgtc 28

Claims (7)

  1. 탄소화 폴리도파민이 도포된 실리카 나노입자(C-PD SNP)를 포함하는 PCR 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 중합효소, 특정 핵산부위와 결합하여 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 완충액을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 프라이머쌍은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머인 것을 특징으로 하는 PCR 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 중합효소는 Taq DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 PCR 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 완충액은 젤 로딩 완충액(Gel loading buffer)을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 C-PD SNP의 농도가 1 X 10-3㎍/㎕ 내지 0.1㎍/㎕인 것을 특징으로 하는 PCR 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 탄소화 폴리도파민이 도포된 실리카 나노입자(C-PD SNP)를 포함하는 PCR 조성물을 이용하는 것을 특징으로 하는 목적 핵산의 PCR 방법.
KR1020140005284A 2014-01-15 2014-01-15 탄소화 폴리도파민이 도포된 실리카 나노입자를 포함하는 pcr 조성물 및 이를 이용한 pcr 방법 KR101461222B1 (ko)

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