JP2022547940A - １６型ヒトパピローマウイルス（ｈｐｖ１６）および１８型ヒトパピローマウイルス（ｈｐｖ１８）を検出するためのプライマーセット、ｈｐｖ１６およびｈｐｖ１８の感染を検出する方法、ｈｐｖ１６およびｈｐｖ１８の感染を検出するためのプライマーセットの使用 - Google Patents

１６型ヒトパピローマウイルス（ｈｐｖ１６）および１８型ヒトパピローマウイルス（ｈｐｖ１８）を検出するためのプライマーセット、ｈｐｖ１６およびｈｐｖ１８の感染を検出する方法、ｈｐｖ１６およびｈｐｖ１８の感染を検出するためのプライマーセットの使用 Download PDF

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Abstract

本発明の第１の目的は、１６型ヒトパピローマウイルスのＬ２遺伝子または１８型ヒトパピローマウイルスのＬ１遺伝子のヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーセットである。本発明の第２の目的は、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８ウイルスを検出するための方法である。本発明の別の目的は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８感染を検出する方法である。本発明の第４の目的は、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８感染を検出するためのキットである。

Description

本発明は、ヒトパピローマウイルス科に属する遺伝子型１６および１８のウイルス（１６型および１８型ヒトパピローマウイルス）を検出するためのプライマーセット、該プライマーセットを用いてヒトパピローマウイルス科からウイルスを検出する方法、およびヒトパピローマウイルス科に属するウイルスを検出するためのプライマーセットの使用に関する。本発明は、医学的診断におけるその用途を有する。
ヒトパピローマウイルスは、遺伝物質がＤＮＡの二本鎖である球状ウイルスである。ヒトパピローマウイルス科は、ＤＮＡ配列の違いによって分類される２００種を超える異なる遺伝子型で構成されており、そのうちの約４０種が性感染症に関するものである。この群から、子宮頸癌、肛門癌および頭頸部癌等を含む腫瘍の形成に関してリスクが高い１４種の発癌性遺伝子型が特定され、そのうち遺伝子型１６および遺伝子型１８が最も一般的に診断されている。ＷＨＯによると、ＨＰＶ１６は子宮頸癌の症例の５５％に関与しており、ＨＶＰ１８はさらに１５％の原因であり、子宮頸癌の残りの症例は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の他の発癌性遺伝子型である発癌性遺伝子型３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、６８、７３、８２の感染によって引き起こされる。
ＨＰＶ１６ウイルスおよび／またはＨＰＶ１８ウイルスを診断するためのＬＡＭＰ法におけるプライマーの使用は、すでに公開されている特許出願：ＣＮ１０２９５２８９４Ａ；ＣＮ１０３１１４０３３Ａ；ＣＮ１０４８０５２１８；ＣＮ１０６９３９３５９Ａ；ＣＮ１０７５５４９２Ａ；ＣＮ１０６１４８５７１Ａ；ＥＰ２１９２１９９Ａ１；ＵＳ２００９０３５７５０Ａ１；ＷＯ２０１４０９２６４７により公知である。ＬＡＭＰ法は、例えば、ＷＯ００２８０８２、ＷＯ０２２４９０２において開示されている。しかしながら、上記の特許出願には、ＨＰＶ１６ウイルスおよびＨＰＶ１８ウイルスの感度と検出限界について記載されておりません。上記の特許出願における検出方法は、それらの定量的測定を可能にするものではなく、検出は、アガロースゲル、または増幅反応の陽性の結果の場合における反応混合物の色の変化に基づく他のマーカー（ヒドロキシ－ナフトール－ブルー、カルセイン）を用いる終点タイプである。
したがって、初期診療においてＬＡＭＰ法を用いてヒトパピローマウイルスの検出および遺伝子型決定を行うための診断方法において用いられる、短時間（≦１５分）で非常に低い検出限界（≧５ＧＥｑ／μｌ）でウイルスの検出が可能なプライマーセット依然として必要とされている。以外にも、上記の問題は本発明によって解決された。
本発明の第１の目的は、１６型ヒトパピローマウイルスのＬ２遺伝子または１８型ヒトパピローマウイルスのＬ１遺伝子のヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーセットであって、以下のＨＰＶ１６のヌクレオチド配列ａ）およびｂ）ならびにＨＰＶ１８のヌクレオチド配列ｃ）およびｄ）を含む内部プライマーセット（internal primer set）を含み、かつ以下のＨＰＶ１６のヌクレオチド配列ｅ）およびｆ）ならびにＨＰＶ１８のヌクレオチド配列ｇ）およびｈ）を含む外部プライマーセット（external primer set）を含むことを特徴とするプライマーセットである：
ａ）ＴＴＴＴブリッジによって配列５’ＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＧＴＴＴＴＧＣＣＴＴ３’－（核酸配列 配列番号５もしくはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列）と結合しているかまたは結合していない５’ＣＡＴＧＣＡＡＡＣＡＧＧＣＡＧＧＴＡ３’（核酸配列 配列番号３もしくはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列）－（Ｌ２遺伝子の配列に相補的な任意の１８～３０ｂｐヌクレオチド配列）、
ｂ）ＴＴＴＴブリッジによって配列５’ＧＧＡＡＧＴＡＴＧＧＧＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＧＧＴＧ３’－（核酸配列 配列番号６もしくはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列）と結合しているかまたは結合していない５’ＡＴＡＴＡＣＣＣＡＧＴＧＣＧＴＣＣＧ３’－（核酸配列 配列番号４もしくはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列）－（Ｌ２遺伝子の配列に相補的な任意の１８～３０ｂｐヌクレオチド配列）、
ｃ）５’ＣＣＣＴＡＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＧＣ３’（核酸配列 配列番号９またはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチド置換または欠失から生じる配列）－（Ｌ１遺伝子の配列に相補的な任意の１８～３０ｂｐヌクレオチド配列）配列５’ＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＴＡＴＡＣＧＧＴＡＴＴ３’－（核酸配列 配列番号１１またはそれに相補的または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチド置換または欠失から生じる配列）とＴＴＴＴブリッジによって連結されているかどうか
ｄ）５’ＣＣＡＡＣＡＧＴＴＡＡＴＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣＴ３’－（核酸配列 配列番号１０またはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチド置換または欠失から生じる配列）－（Ｌ１の配列に相補的な任意の１８～３０ｂｐヌクレオチド配列遺伝子）ＴＴＴＴブリッジによって配列５’ＧＧＣＡＡＧＡＧＴＴＧＴＡＡＡＴＡＣＣＧＡＴＧＡ３’－（核酸配列 配列番号１２またはそれに相補的または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチド置換または欠失から生じる配列）と連結されているかどうか
ｅ）５’ＡＡＡＡＣＧＴＧＣＡＴＣＧＧＣＴＡＣ３’核酸配列 配列番号１またはそれに相補的または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチド置換または欠失から生じる配列、および
ｆ）５’ＧＡＧＧＣＣＴＴＧＴＴＣＣＣＡＡＴＧ３’核酸配列 配列番号２またはそれに相補的であるか、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチド置換または欠失から生じる配列
ｇ）５’ＣＣＴＡＡＧＡＡＡＣＧＴＡＡＡＣＧＴＧＴＴ３’核酸配列 配列番号７またはそれに相補的または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチド置換または欠失から生じる配列、および
ｈ）５’ＣＡＧＧＡＡＣＣＣＴＡＡＡＡＴＡＴＧＧＡＴＴ３’核酸配列 配列番号８またはそれに相補的であるか、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチド置換または欠失から生じる配列。
本発明の好ましい実施形態において、プライマーセットは、ＨＰＶ１６ Ｌ２遺伝子 配列番号１３ ５’ＣＣＴＴＡＧＧＴＡＴＡＡＴＧＴＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡ３’および配列番号１４ ５’ＧＧＴＴＡＧＧＡＡＴＴＧＧＡＡＣＡＧＧＧＴＣ３’またはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列と同一または相補的な核酸配列を含むループプライマー配列のセットを含む。
本発明のさらに好ましい実施形態において、プライマーセットは、ＨＰＶ１８ Ｌ１遺伝子 配列番号１５ ５’ＧＴＣＡＣＴＡＧＧＣＣＧＣＣＡＣＡＡ３’および配列番号１６ ５’ＣＴＣＣＣＡＣＡＡＧＣＡＴＡＴＴＴＴＡＴＣＡＴＧＣ３’またはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列を含む。
本発明の第２の目的は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の核酸配列の選択された領域が、本発明の第１の目的のプライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする、１６型または１８型ヒトパピローマウイルスを検出するための方法であり、増幅方法がＬＡＭＰ法である方法である。
好ましい実施形態において、増幅は、温度プロファイル：
－ＨＰＶ１６：６５℃、３０分
－ＨＰＶ１８：６４℃、４０分
を用いて行われる。
本発明のさらに好ましい実施形態において、終点反応は、８０℃、５分の温度プロファイルで行われる。
本発明の第３の目的は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の感染を検出する方法であって、本発明の第２の目的で定義されるような検出方法を含むことを特徴とする方法である。
本発明の第４の目的は、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８の感染を検出するためのキットであって、本発明の第１の目的で定義されるようなプライマーセットを含むことを特徴とするキットである。
本発明の好ましい実施形態において、感染検出キットは、１２．５μｌのウＷａｒｍＳｔａｒｔ ＬＡＭＰ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを含む。
本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明の第１の目的で定義されるような個々の増幅プライマーにおいて、プライマーは、以下の濃度を有する：ＨＰＶ１６：０．１２μＭ Ｆ３、０．１２μＭ Ｂ３、０．９６μＭ ＦＩＰ、０．９６μＭ ＢＩＰ、０．２４μＭ ＬｏｏｐＦ、０．２４μＭ ＬｏｏｐＢ；およびＨＰＶ１８：０．１５μＭ Ｆ３、０．１５μＭ Ｂ３、１．２０μＭ ＦＩＰ、１．２０μＭ ＢＩＰ、０．３０μＭ ＬｏｏｐＦ、０．３０μＭ ＬｏｏｐＢ；ＢＳＡ－０．２５ｍｇ／ｍｌ；Ｄ－（＋）－トレハロース二水和物－６％；二本鎖ＤＮＡと相互作用する蛍光マーカー－ＥｖａＧｒｅｅｎ≦１Ｘまたは蛍光色素≦０．５μｌまたはＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅ≦１μｌまたはＳｙｔｏ－１３≦１６μＭまたはＳＹＴＯ－８２≦１６μＭまたは増幅反応を阻害しない濃度の二本鎖ＤＮＡと相互作用するその他の蛍光色素。
ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の検出のための本発明のプライマーセットの利点、ならびにＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の感染を検出する方法および増幅産物を検出する方法は、診療現場（ＰＯＣ）におけるポータブル遺伝子アナライザーの形での標的適用による医療診断におけるそれらの使用の可能性である。本発明の反応混合物の凍結乾燥によって、検査の診断パラメータを低下させることなく、診断キットを室温で保存することが可能になる。一方、蛍光色素を用いて増幅産物を検出することにより方法の感度が向上し、検出限界が低下（最大５ＧＥｑ／μｌ）し、検査試料中のウイルスの定量測定も可能になる。
本発明の例示的な実施形態が図示され、図１および３（それぞれＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８について）には、特定の信号をマトリックスで得る（obtained with the matrices）方法の感度特性が示される：
－ＨＰＶ１６：１６型ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＤＮＡ（第１次ＷＨＯ国際規格）－０６／２０２、ＮＩＢＳＣ
－ＨＰＶ１８：１８型ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＤＮＡ（第１次ＷＨＯ国際規格）－０６／２０６、ＮＩＢＳＣ
１０，０００－５ＧＥｑ（ゲノム等価）ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の範囲であるが、ＮＴＣには製品がない；図１：列１：マスマーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）；列２：５ＧＥｑ ＨＰＶ１６；列３：１０ＧＥｑ ＨＰＶ１６；列４：２０ＧＥｑ ＨＰＶ１６；列５：２５ＧＥｑ ＨＰＶ１６；列６：５０ＧＥｑ ＨＰＶ１６；列７：１００ＧＥｑ ＨＰＶ１６；列８：１０００ＧＥｑ ＨＰＶ１６；列９：１００００ＧＥｑ ＨＰＶ１６；列１０：ＮＴＣ。
図３：列１：マスマーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）；列２：１００００ＧＥｑ ＨＰＶ１８；列３：１００００ＧＥｑ ＨＰＶ１８；列４：１００ＧＥｑ ＨＰＶ１８；列５：５０ＧＥｑ ＨＰＶ１８；列６：２５ＧＥｑ ＨＰＶ１８；列７：２０ＧＥｑ ＨＰＶ１８；列８：１０ＧＥｑ ＨＰＶ１８；列９：５ＧＥｑ ＨＰＶ１８；列１０：ＮＴＣ。図２および４は、ＤＮＡ参照物質の一連の希釈物を設定することによって測定された、本発明の方法の感度を示す
－ＨＰＶ１６：１６型ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＤＮＡ、第１次ＷＨＯ国際規格）－０６／２０２、ＮＩＢＳＣ
－ＨＰＶ１８：１８型ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＤＮＡ（第１次ＷＨＯ国際規格）－０６／２０６、ＮＩＢＳＣ
ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の細菌の最小量は５ＧＥｑであり、製品の獲得（product gain）はリアルタイムで測定された。リアルタイムのＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の検出結果を表１および表２に示す。
図５および６は、同時感染に起因するかまたは類似のゲノム配列を有する、天然の生理学的フローラとして試験される生物学的材料に潜在的に存在する病原体の標準マトリックスにより本発明の方法の特異性を示す。図５：列１：マスマーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）；列２：ＨＰＶ１６；列３：ＨＰＶ１８；列４：ストレプトコッカス・アガラクティア（Streptococcus agalactia）；列５：ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）；列６：ストレプトコッカス変異株；列７：スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）；列８：スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）；列９：カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）；列１０：トレパノーマ・パリディウム（Trepanoma pallidium）；列１１：ＨＳＶ１；列１２：ＨＳＶ２；列１３：カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）；列１４：ボレリア・アフゼリ（Borrelia afzeli）；列１５：狭義のボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi sensu stricto）；列１６：ホモ・サピエンス（Homo sapiens）；列１７：ＮＴＣ。図６：列１：マスマーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）；列２：ＨＰＶ１６；列３：ＨＰＶ１８；列４：ストレプトコッカス・アガラクティア（Streptococcus agalactia）；列５：ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）；列６：ストレプトコッカス変異株；列７：スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）；列８：スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）；列９：カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）；列１０：トレパノーマ・パリディウム（Trepanoma pallidium）；列１１：ＨＳＶ１；列１２：ＨＳＶ２；列１３：カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）；列１４：ボレリア・アｆゼリ（Borrelia afzeli）；列１５：狭義のボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi sensu stricto）；列１６：ホモ・サピエンス（Homo sapiens）；列１７：ＮＴＣ。
実施例１ プライマー配列
ＬＡＭＰ技術を用いたＨＰＶ１６遺伝物質の検出に用いられる特定のオリゴヌクレオチドの配列を以下に示し、特性化した。
１．ＨＰＶ１６ Ｌ２Ｆ３オリゴヌクレオチド配列：５’ＡＡＡＡＣＧＴＧＣＡＴＣＧＧＣＴＡＣ３’は、ＨＰＶ１６のＬ２Ｆ２プライマーに３’隣接するＨＰＶ１６のＬ２遺伝子（５’－３’鎖）と同一の配列である。
２．ＨＰＶ１６ Ｌ２Ｂ３オリゴヌクレオチド配列：５’ＧＡＧＧＣＣＴＴＧＴＴＣＣＣＡＡＴＧ３’は、オリゴヌクレオチド１の３’末端から１７４ヌクレオチド離れたＨＰＶ１６のＬ２遺伝子（５’－３’鎖）の相補的フラグメントである。
３．ＨＰＶ１６ Ｌ２Ｆ２オリゴヌクレオチド配列：５’ＣＡＴＧＣＡＡＡＣＡＧＧＣＡＧＧＴＡ３’は、オリゴヌクレオチド１の３’末端から１５ヌクレオチド離れたＨＰＶ１６のＬ２遺伝子（５’－３’鎖）と同一の配列である。
４．ＨＰＶ１６ Ｌ２Ｂ２オリゴヌクレオチド配列：５’ＡＴＡＴＡＣＣＣＡＧＴＧＣＧＴＣＣＧ３’は、オリゴヌクレオチド１の３’末端から１５４ヌクレオチド離れたＨＰＶ１６のＬ２遺伝子（５’－３’鎖）の相補的フラグメントである。
５．ＨＰＶ１６ Ｌ２Ｆ１ｃオリゴヌクレオチド配列：５’ＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＧＴＴＴＴＧＣＣＴＴ３’は、オリゴヌクレオチド１の３’末端から６３ヌクレオチド離れたＨＰＶ１６のＬ２遺伝子（５’－３’鎖）の相補的フラグメントである。
６．ＨＰＶ１６ Ｌ２Ｂ１ｃオリゴヌクレオチド配列：５’ＧＧＡＡＧＴＡＴＧＧＧＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＧＧＴＧ３’は、オリゴヌクレオチド１の３’末端から９８ヌクレオチド離れたＨＰＶ１６のＬ２遺伝子（５’－３’鎖）と同一の配列である。
７．ＨＰＶ１６ Ｌ２ＬｏｏｐＦ配列：５’ＣＣＴＴＡＧＧＴＡＴＡＡＴＧＴＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡ３’
８．ＨＰＶ１６ Ｌ２ＬｏｏｐＢオリゴヌクレオチド配列：５’ＧＧＴＴＡＧＧＡＡＴＴＧＧＡＡＣＡＧＧＧＴＣ３’
Ｆ１ｃおよびＦ２のオリゴヌクレオチド配列は、好ましくはＴＴＴＴブリッジによって連結され、ＦＩＰとして用いられた。Ｂ１ｃおよびＢ２のオリゴヌクレオチド配列は、好ましくはＴＴＴＴブリッジによって連結され、ＢＩＰとして用いられた。
実施例２ プライマー配列
ＬＡＭＰ技術を用いたＨＰＶ１８遺伝物質の検出に用いられる特定のオリゴヌクレオチドの配列を以下に示し、特性化した。
１．ＨＰＶ１８ Ｌ１Ｆ３オリゴヌクレオチド配列：５’ＣＣＴＡＡＧＡＡＡＣＧＴＡＡＡＣＧＴＧＴＴ３’は、ＨＰＶ１８のＬ１Ｆ２プライマーに３’隣接するＨＰＶ１８のＬ１遺伝子（５’－３’鎖）と同一である。
２．ＨＰＶ１８ Ｌ１Ｂ３オリゴヌクレオチド配列：５’ＣＡＧＧＡＡＣＣＣＴＡＡＡＡＴＡＴＧＧＡＴＴ３’は、プライマーＢ２に５’隣接するオリゴヌクレオチド１の３’末端から１５５ヌクレオチド離れたＨＰＶ１８のＬ１遺伝子（５’－３’鎖）の相補的フラグメントである。
３．ＨＰＶ１８ Ｌ１Ｆ２オリゴヌクレオチド配列：５’ＣＣＣＴＡＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＧＣ３’は、オリゴヌクレオチド１の３’末端に直接位置するＨＰＶ１８のＬ１遺伝子（５’－３’鎖）と同一である。
４．ＨＰＶ１８ Ｌ１Ｂ２オリゴヌクレオチド配列：５’ＣＣＡＡＣＡＧＴＴＡＡＴＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣＴ３’は、オリゴヌクレオチド１の３’末端から１３１ヌクレオチド離れたＨＰＶ１８のＬ１遺伝子（５’－３’鎖）の相補的フラグメントである。
５．ＨＰＶ１８ Ｌ１Ｆ１ｃオリゴヌクレオチド配列：５’ＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＴＡＴＡＣＧＧＴＡＴＴ３’は、オリゴヌクレオチド１の３’末端から４１ヌクレオチド離れたＨＰＶ１８のＬ１遺伝子（５’－３’鎖）の相補的フラグメントである。
６．ＨＰＶ１８ Ｌ１Ｂ１ｃオリゴヌクレオチド配列：５’ＧＧＣＡＡＧＡＧＴＴＧＴＡＡＡＴＡＣＣＧＡＴＧＡ３’は、オリゴヌクレオチド１の３’末端から７０ヌクレオチド離れたＨＰＶ１８のＬ１遺伝子（５’－３’鎖）と同一である。
７．ＨＰＶ１８ Ｌ１ＬｏｏｐＦ配列：５’ＧＴＣＡＣＴＡＧＧＣＣＧＣＣＡＣＡＡ３’
８．ＨＰＶ１８ Ｌ１ＬｏｏｐＢオリゴヌクレオチド配列：５’ＣＴＣＣＣＡＣＡＡＧＣＡＴＡＴＴＴＴＡＴＣＡＴＧＣ３’
Ｆ１ｃおよびＦ２のオリゴヌクレオチド配列は、好ましくはＴＴＴＴブリッジによって連結され、ＦＩＰとして用いられた。Ｂ１ｃおよびＢ２のオリゴヌクレオチド配列は、好ましくはＴＴＴＴブリッジによって連結され、ＢＩＰとして用いられた。
実施例３
実施例１および実施例２において以下の反応混合物の組成のＬＡＭＰ技術により特性化されたオリゴヌクレオチドを用いて、ＨＰＶ１８のＬ２遺伝子およびＨＰＶ１８のＬ１遺伝子を増幅する方法。
ＨＰＶ１６
１２．５μｌ ＷａｒｍＳｔａｒｔ ＬＡＭＰ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
０．１２μＭ Ｆ３
０．１２μＭ Ｂ３
０．９６μＭ ＦＩＰ
０．９６μＭ ＢＩＰ
０．２４μＭ ＬｏｏｐＦ
０．２４μＭ ＬｏｏｐＢ
ＢＳＡ－０．２５ｍｇ／ｍｌ
Ｄ－（＋）－トレハロース二水和物－６％
二本鎖ＤＮＡと相互作用する蛍光マーカー－ＥｖａＧｒｅｅｎ≦１Ｘまたは蛍光色素５０Ｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）０．５μｌまたはＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅ（Ｌｕｃｉｇｅｎ製）≦１μｌまたはＳｙｔｏ－１３≦１６μＭまたはＳＹＴＯ－８２≦１６μＭまたは増幅反応を阻害しない濃度の二本鎖ＤＮＡと相互作用する他の蛍光色素。
ＤＮＡテンプレート≧５コピー／反応
ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを含まない水で最大２５μｌの総反応容量。
ＨＰＶ１８
１２．５μｌ ＷａｒｍＳｔａｒｔ ＬＡＭＰ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
０．１５μＭ Ｆ３
０．１５μＭ Ｂ３
１．２０μＭ ＦＩＰ
１．２０μＭ ＢＩＰ
０．３０μＭ ＬｏｏｐＦ
０．３０μＭ ＬｏｏｐＢ
ＢＳＡ－０．２５ｍｇ／ｍｌ
Ｄ－（＋）－トレハロース二水和物－６％
二本鎖ＤＮＡと相互作用する蛍光マーカー－ＥｖａＧｒｅｅｎ≦１Ｘまたは蛍光色素５０Ｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）０．５μｌまたはＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅ（Ｌｕｃｉｇｅｎ製）≦１μｌまたはＳｙｔｏ－１３≦１６μＭまたはＳＹＴＯ－８２≦１６μＭまたは増幅反応を阻害しない濃度の二本鎖ＤＮＡと相互作用する他の蛍光色素。
ＤＮＡテンプレート≧５コピー／反応
ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを含まない水で最大２５μｌの総反応容量。
実施例４
実施例３で特性化された反応混合物の組成のＬＡＭＰ技術により実施例１および実施例２において特性化されたオリゴヌクレオチドを用いて、以下の温度プロファイルによってＨＰＶ１６のＬ１遺伝子またはＨＰＶ１８のＬ２遺伝子を増幅する方法：
１）ＨＰＶ１６：６５℃、３０分
２）ＨＰＶ１８：６４℃、４０分。
３）終点反応の場合、好ましくは８０℃、５分。
実施例５
実施例３で特性化された反応混合物の組成のＬＡＭＰ技術により実施例１および実施例２において特性化されたオリゴヌクレオチドを用いて、実施例４で特性化された温度プロファイルによってＨＰＶ１６のＬ１遺伝子またはＨＰＶ１８のＬ２遺伝子を増幅する方法、および下記の検出する方法。
二本鎖ＤＮＡと相互作用できる蛍光色素が用いられ、反応、リアルタイム測定および／またはエンドポイント測定の開始前に、それぞれ１．２５μｌの量のＥｖａＧｒｅｅｎ２０Ｘ；０．５μＬまたは≦１Ｘ；≦１６μＭの濃度のＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）；ＳＹＴＯ－１３およびＳＹＴＯ－８２を反応混合物に添加した。ＥｖａＧｒｅｅｎ ｄｙｅ；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ ５０Ｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）；ＳＹＴＯ－１３についてはＦＡＭ色素と同様の範囲の励起波長－４９０～５００ｎｍ（最適には４９４ｎｍ）、およびＳＹＴＯ－８２ ｄｙｅについては５３５ｎｍ（最適には５４１ｎｍ）の励起波長、ＥｖａＧｒｅｅｎ ｄｙｅ；ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）；ＳＹＴＯ－１３については５０９～５３０ｎｍ（最適には５１８ｎｍ）の範囲の発光波長、および色素ＳＹＴＯ－８２については５５６ｎｍ（最適には５６０ｎｍ）の発光波長であり、検出方法および登録時間の変更は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８とネガティブコントロールとの反応開始から８分から開始された。
実施例６
実施例３で特性化された反応混合物の組成のＬＡＭＰ技術による実施例１および実施例２において特性化されたオリゴヌクレオチドを用いて、実施例４で特性化された温度プロファイルによってＨＰＶ１６およびＬ１ ＨＰＶ１８ Ｌ２遺伝子を増幅検出および検出するのための、試薬の調製および凍結乾燥の方法、ならびに実施例５で説明された検出方法。
実施例７ 凍結乾燥プロセスの説明
実施例３に記載の組成に従って、ＤＮＡテンプレートを除く反応成分を混合して、総量を２５μｌにした。混合物を０．２ｍｌチューブに移し、以下のパラメータに従って凍結乾燥プロセスにかけた。
試験管に入れた混合物を－２０℃で８時間予冷した。次いで、凍結乾燥プロセスを、温度－５０℃で３．５時間、５－２ｍＢａｒの圧力下で行った。
実施例７ メソッドの感度
感度は、最小ウイルス量５ＧＥｑのＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の規格（ＨＰＶ１６：１６型ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＤＮＡ、ＷＨＯの第１次国際規格）、０６／２０２、ＮＩＢＳＣ；ＨＰＶ１８：１８型ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＤＮＡ（ＷＨＯの第１次国際規格）、０６／２０６、ＮＩＢＳＣ）の一連の希釈液を設定することによって決定され、ここで生成物の増分はリアルタイムで測定された－図２および図４（希釈された一連のＨＰＶ１６（図２）およびＨＰＶ１８（図４）のＲｅａｌＴｉｍｅ－ＬＡＭＰ）。
個々のサンプルの放出された蛍光を検出するために必要な時間は、表１（ＨＰＶ１６）および表２（ＨＰＶ１８）に示される。
特性化されたプライマーは、最小量５ＧＥｑ／μｌで両方のヒトパピローマウイルス遺伝子型（ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８）の検出を可能にした。
Figure 2022547940000002
Figure 2022547940000003
本明細書に記載される増幅法およびオリゴヌクレオチドのＲｅａｌＴｉｍｅ－ＬＡＭＰ技術に基づく試験に対する優位性は、図１および図３に示されているはるかに高い感度と、図２および図４ならびに表１および表２に示される分析時間の短縮によるものである。
Figure 2022547940000004
Figure 2022547940000005
Figure 2022547940000006
Figure 2022547940000007
Figure 2022547940000008
Figure 2022547940000009
Figure 2022547940000010
Figure 2022547940000011

Claims (10)

  1. １６型ヒトパピローマウイルスのＬ２遺伝子または１８型ヒトパピローマウイルスのＬ１遺伝子のヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーセットであって、ＨＰＶ１６のための以下のヌクレオチド配列ａ）およびｂ）ならびにＨＰＶ１８のための以下のヌクレオチド配列ｃ）およびｄ）のを含む内部プライマーセットを含み、かつＨＰＶ１６のための以下のヌクレオチド配列ｅ）およびｆ）ならびにＨＶＰ１８ウイルスのための以下のヌクレオチド配列ｇ）およびｈ）を含む外部プライマーセットを含む、プライマーセット：
    ａ）ＴＴＴＴブリッジによって配列５’ＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＧＴＴＴＴＧＣＣＴＴ３’－（核酸配列 配列番号５もしくはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列）と結合しているかまたは結合していない５’ＣＡＴＧＣＡＡＡＣＡＧＧＣＡＧＧＴＡ３’（核酸配列 配列番号３もしくはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列）－（Ｌ２遺伝子の配列に相補的な任意の１８～３０ｂｐヌクレオチド配列）、
    ｂ）ＴＴＴＴブリッジによって配列５’ＧＧＡＡＧＴＡＴＧＧＧＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＧＧＴＧ３’－（核酸配列 配列番号６もしくはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列）と結合しているかまたは結合していない５’ＡＴＡＴＡＣＣＣＡＧＴＧＣＧＴＣＣＧ３’－（核酸配列 配列番号４もしくはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列）－（Ｌ２遺伝子の配列に相補的な任意の１８～３０ｂｐヌクレオチド配列）、
    ｃ）ＴＴＴＴブリッジによって配列５’ＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＴＡＴＡＣＧＧＴＡＴＴ３’－（核酸配列 配列番号１１もしくはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列）と結合しているかまたは結合していない５’ＣＣＣＴＡＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＧＣ３’（核酸配列 配列番号９もしくはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列）－（Ｌ１遺伝子の配列に相補的な任意の１８～３０ｂｐヌクレオチド配列）、
    ｄ）ＴＴＴＴブリッジによって配列５’ＧＧＣＡＡＧＡＧＴＴＧＴＡＡＡＴＡＣＣＧＡＴＧＡ３’－（核酸配列 配列番号１２もしくはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列）と結合しているかまたは結合していない５’ＣＣＡＡＣＡＧＴＴＡＡＴＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣＴ３’－（核酸配列 配列番号１０もしくはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列）－（Ｌ１遺伝子の配列に相補的な任意の１８～３０ｂｐヌクレオチド配列）、
    ｅ）配列番号１の５’ＡＡＡＡＣＧＴＧＣＡＴＣＧＧＣＴＡＣ３’の核酸配列もしくはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列、および
    ｆ）配列番号２の５’ＧＡＧＧＣＣＴＴＧＴＴＣＣＣＡＡＴＧ３’の核酸配列もしくはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列、
    ｇ）配列番号７の５’ＣＣＴＡＡＧＡＡＡＣＧＴＡＡＡＣＧＴＧＴＴ３’の核酸配列もしくはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列、および
    ｈ）配列番号８の５’ＣＡＧＧＡＡＣＣＣＴＡＡＡＡＴＡＴＧＧＡＴＴ３’核酸配列もしくはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列。
  2. １６型ＨＰＶ Ｌ２遺伝子 配列番号１３ ５’ＣＣＴＴＡＧＧＴＡＴＡＡＴＧＴＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡ３’および配列番号１４ ５’ＧＧＴＴＡＧＧＡＡＴＴＧＧＡＡＣＡＧＧＧＴＣ３’またはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列を含むかまたはそれに相補的な核酸配列を含むループプライマー配列のセットを含む、請求項１に記載のスターターのセット。
  3. １８型ＨＰＶ Ｌ１遺伝子 配列番号１５ ５’ＧＴＣＡＣＴＡＧＧＣＣＧＣＣＡＣＡＡ３’および配列番号１６ ５’ＣＴＣＣＣＡＣＡＡＧＣＡＴＡＴＴＴＴＡＴＣＡＴＧＣ３’またはそれに相補的な配列、または単一ヌクレオチド交換、単一ヌクレオチドの置換もしくは欠失から生じる配列を含むかまたはそれに相補的な核酸配列を含む、請求項１に記載のスターターのセット。
  4. １６型または１８型のヒトパピローマウイルスを検出する方法であって、前記ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の核酸配列の選択された領域が、請求項１に記載のプライマーセットを用いて増幅され、前記増幅の方法がＬＡＭＰ法である、前記方法。
  5. 前記増幅が温度プロファイル：
    －ＨＰＶ１６ ６５℃、３０分
    －ＨＰＶ１８ ６４℃、４０分
    で行われる、請求項４に記載の方法。
  6. 終点反応が８０℃、５分間の温度プロファイルで行われる、請求項４に記載の方法。
  7. 請求項１に記載の検出方法をさらに含む、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の感染を検出する方法。
  8. 請求項１に記載のプライマーセットを含む、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８の感染を検出するためのキット。
  9. １２．５μｌのＷａｒｍＳｔａｒｔ ＬＡＭＰ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを含む、請求項８に記載の感染を検出するためのキット。
  10. 請求項１に記載の増幅プライマーを含み、前記プライマーが以下の濃度：ＨＰＶ１６：０．１２μＭ Ｆ３、０．１２μＭ Ｂ３、０．９６μＭ ＦＩＰ、０．９６μＭ ＢＩＰ、０．２４μＭ ＬｏｏｐＦ、０．２４μＭ ＬｏｏｐＢ；およびＨＰＶ１８：０．１５μＭ Ｆ３、０．１５μＭ Ｂ３、１．２０μＭ ＦＩＰ、１．２０μＭ ＢＩＰ、０．３０μＭ ＬｏｏｐＦ、０．３０μＭ ＬｏｏｐＢ；ＢＳＡ－０．２５ｍｇ／ｍｌ；Ｄ－（＋）－トレハロース二水和物－６％；二本鎖ＤＮＡと相互作用する蛍光マーカー－ＥｖａＧｒｅｅｎ≦１Ｘまたは蛍光色素≦０．５μｌまたはＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｅｎｔ Ｄｙｅ≦１μｌまたはＳｙｔｏ－１３≦１６μＭまたはＳＹＴＯ－８２≦１６μＭまたは増幅反応を阻害しない濃度の二本鎖ＤＮＡと相互作用するその他の蛍光色素
    である、請求項８または９に記載の感染を検出するためのキット。
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