CN107557492A - Lamp检测用引物组合及其反应体系 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了LAMP检测用引物组合及其反应体系，包括HPV16的LAMP检测用引物组、18亚型人乳头瘤病毒检测用引物组。本发明具有以下优点和效果：检测时进行环介导等温扩增反应过程中，从反应溶液中的绿色荧光出现，即可通过肉眼观察判定结果，鉴定结果更为直观清晰，采用本发明中的基因诊断方法检测仅需30分钟，与PCR技术进行比较，灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术，达到了检测时间短、鉴定结果直观清晰、灵敏度高、特异性强的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种LAMP检测用引物组合及其反应体系。
背景技术
人乳头瘤病毒(HPV)属于乳多空病毒科的乳头瘤病毒属，是一种小分子的、无被膜包被的、环状双链 DNA病毒，基因组长约8000碱基对(bp)，分为3个功能区。早期转录区(E区)主要控制病毒的复制和转化功能；晚期转录区(L区)编码病毒的衣壳蛋白；长控制区(LCR区)包含复制起始区和复制转录控制元件。20世纪80年代，德国病毒学家Harald zurHausen教授首次提出HPV病毒与宫颈癌发病相关的假说之后，经过20多年的科学研究，国际癌症研究所在1995年正式确认，高危型HPV持续感染是宫颈癌的主要病因。依照WHO国际癌症研究机构(IARC)的研究成果，HPV16、18、31、33、35、39、45、51、 52、56、58、59、66、68、73等15种基因型在2005年的专题讨论会议上被正式认定为高危型。而高危型 HPV中又以16、18型最常见，其中超过2/3的宫颈癌与其感染相关；HPV分型还与宫颈癌病理类型有关， 16型与宫颈鳞癌关系最密切，18型最易导致宫颈腺癌。
因此，检测宫颈细胞样本中人乳头瘤状病毒(HPV)的存在与具体基因型，成为宫颈癌预防及治疗的一种普遍早期诊断方法。目前临床上用于人乳头瘤状病毒(HPV)的提前诊断、治疗预后判断方法主要有细胞学、免疫组化与病理学检查、基因检测等。细胞学检查包括传统巴氏涂片(CV)、液基薄层细胞学检查 (TCT)与自动细胞学检测(LCT)等，其优点是操作简便、价格低廉、适宜初步筛查，但存在灵敏度低、特异性差、易受主观因素影响、假阴性率与假阳性率高等缺点，且不能进行HPV分型。免疫组化检查原理明确、操作也相对简便，但存在无免疫应答者或HPV潜伏感染者易漏检等缺点。组织学检查包括肉眼观察、阴道镜观察与病理组织检查等，其优点也是操作简便、价格低廉、适宜初步筛查，但存在准确率低、人员素质要求高、病人痛苦等缺点。分子水平的检测可辅助子宫颈细胞学检查，以筛查是否有高危型HPV16、 18型感染。基于HPV核酸检测的分子生物学技术主要包括：第二代杂交捕获法(HC2)、酶切信号放大法、 PCR-荧光探针法与PCR-杂交法等。分子水平检测技术具有准确、可减少病人痛苦等优点，在实验室质量严格控制情况下，已越来越广泛应用于HPV临床检测。
现有技术中，已出现利用环介导等温扩增技术来检测人乳头瘤病毒，如申请公布号为CN102952894A 的中国专利《基于颜色的环介导等温扩增技术检测HPV6,11,16,18,52,58》公开了一种基于颜色的环介导等温扩增技术检测HPV16的方法，检测过程中，反应前加入HNB(羟基萘酚篮)染料，在63℃等温环境中扩增1小时，用肉眼观察颜色变化和管底的白色沉淀，来判定检测结果。
但是上述基于颜色的环介导等温扩增技术检测HPV16、HPV18时，检测时间较长，扩增需要1小时，同时在判定过程中用肉眼判定白色沉淀来检测，检测时间长，判定时不是很方便。因此，建立快速简便的16、 18亚型人乳头瘤病毒环介导等温扩增技术具有迫切需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种LAMP检测用引物组合，具有检测人乳头瘤病毒16、18亚型L1基因，检测时间短，鉴定结果直观清晰的效果。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种LAMP检测用引物组合，包括HPV16的L AMP检测用引物组，引物名称和序列信息如下，F3，GCCATATCTACTTCAGAAACTACA；B3，TTGCCTGGGTTACAAA CC；FIP，TGCAGTTAAGGTTATTTTGCACAGT-TACTAACTTTAAGGAGTACCTACG；BIP，TTCCACTATTTTGGAGGACTGGA-AG TATCTTCTAGTGTGCCTC；HPV18的LAMP检测用引物组，引物名称和序列如下，F3，CACTGTGCCTCAATCCTT；B 3，ACTGGGAGTGGTATCTACC；FIP，GGTAACAATAGAGCCACTTGGAGAG-ACAGGTATGCCTGCTTCA；BIP，TGACTCCCAGTT GTTTAATAAACCA-AATAATTGATTATGCCAGCAAAC。
通过采用上述技术方案，F3，上游外引物；B3，下游外引物；FIP，上游内引物；BIP，下游内引物。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication，简称LAMP)，快速检测样品HPV16、1 8亚型的方法是利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎--环DNA混合物。进行环介导等温扩增反应(简称LAMP反应)过程中，从反应溶液中的绿色荧光出现，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(65℃左右)条件下 20至30分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。采用本发明中的基因诊断方法检测仅需30分钟。并且，本发明的反应液中添加了荧光染料，鉴定结果更为直观清晰。
本发明的进一步设置为：HPV16的LAMP检测用引物组还包括LF，CTGTAAATCATATTCCTCCCCATGT；LB， TTGGTCTACAACCTCCCCC。
通过采用上述技术方案，LF，上游环引物；LB，下游环引物。
本发明的进一步设置为：HPV18的LAMP检测用引物组还包括LB，GGTTACATAAGGCACAGGGTC。
通过采用上述技术方案，LB，下游环引物。
本发明的另一个目的在于提供一种包含上述LAMP检测用引物组合的反应体系，每25μL的反应体系包含组分如下，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，8mM MgSO4，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween 20， 0.8M甜菜碱，dNTPs各1.4mM，F3和B3各0.4μM，FIP和BIP各3.2μM，LF和LB各1.6μM，0.3 M钙黄绿素，0.5M MnCl2，8U Bst DNA聚合酶，2.5μL DNA模板。
通过采用上述技术方案，上述反应体系置于反应管内，65℃反应60min，80℃加热5min终止反应，反应过程借助荧光定量PCR仪SYBR通道实时监测，反应结果通过肉眼观察颜色变化和软件生成的荧光曲线进行判断。
综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明创新地兼顾可视化LAMP的快速、便捷、高特异性、高灵敏度等优势，解决了LAMP易开盖污染的方法学基础问题，构建了实时可视化LAMP技术检测HPV病毒的平台，同时对实时LAMP的半定量检测进行了研究，以便更加准确快速地检测样本中病毒的载量，为资源匮乏的边远地区提供了一种临床致病病毒现场快速检测的方法。
附图说明
图1是本发明的HPV16的LAMP检测用引物组灵敏度实验的扩增曲线；
图2是本发明的HPV16的LAMP检测用引物组灵敏度实验的标准曲线；
图3是本发明的HPV16的LAMP检测用引物组特异性实验扩增曲线；
图4是本发明的HPV16的LAMP检测用引物组特异性实验显色图；
图5是本发明的HPV18的LAMP检测用引物组灵敏度实验扩增曲线；
图6是本发明的HPV18的LAMP检测用引物组灵敏度实验标准曲线；
图7是本发明的HPV18的LAMP检测用引物组特异性实验扩增曲线；
图8是本发明的HPV18的LAMP检测用引物组特异性实验显色图。
具体实施方式
LAMP检测用引物组合的反应体系，包括HPV16的LAMP检测用引物组和HPV18的LAMP检测用引物组，序列信息如以下表1所示。其中F3，上游外引物；B3，下游外引物；FIP，上游内引物；BIP，下游内引物； LF，上游环引物；LB，下游环引物。
每25μL的反应体系包含组分如下：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，8mMMgSO4，10mM(NH4)2SO4， 0.1％Tween 20，0.8M甜菜碱(Betaine)，dNTPs各1.4mM，F3和B3各0.4μM，FIP和BIP各3.2μM， LF和LB各1.6μM，0.3M钙黄绿素(Calcein)，0.5M MnCl2，8U BstDNA聚合酶，2.5μL DNA模板。其中，包含HPV16的LAMP检测用引物组的反应体系为HPV16的LAMP检测液，包含HPV18的LAMP检测用引物组的反应体系为HPV18的LAMP检测液，HPV16的检测液和HPV18的检测液分别用不同的试剂管包装。上述荧光定量环介导等温扩增反应体系置于反应管内，65℃反应60min，80℃加热5min终止反应，反应过程借助荧光定量PCR仪SYBR通道实时监测，反应结果通过肉眼观察颜色变化和软件生成的荧光曲线进行判断。
荧光定量环介导等温扩增反应的灵敏度实验：使用灭菌水对16、18亚型的HPV病毒重组标准质粒进行10倍梯度稀释，然后取2.5μL不同浓度梯度的质粒作为模板DNA加入到各反应管中，每个稀释浓度均进行3管重复。根据实时可视化LAMP反应扩增曲线，以模板起始拷贝数的对数值为曲线的x轴，以LAMP 扩增反应的起始时间为y轴，建立并绘制扩增反应的标准曲线。标准曲线方程如表2。
荧光定量环介导等温扩增反应的特异性实验：HPV病毒16、18亚型的DNA基因组10倍稀释后，DNA 浓度在10ng左右，取2.5μL稀释后的模板加入到各反应管中。通过观察分析扩增曲线，判断实时可视化LAMP技术检测不同HPV病毒亚型是否会出现交叉反应。
实验结果：本发明建立了一种半定量的实时可视化LAMP方法，可以检出HPV病毒16、18亚型数量级分别为101与102拷贝数，灵敏度可达到分子诊断市场产品要求的最低检测限，反应温度为65℃、反应时间分别为20分钟与26分钟；同时不存在亚型间的交叉反应，操作简便，结果可靠。
具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
表1
表2
序列表
<110> 温州美众医学检验所
<120> LAMP检测用引物组合及其反应体系
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> 上游外引物
<400> 1
gccatatcta cttcagaaac taca 24
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 下游外引物
<400> 2
ttgcctgggt tacaaacc 18
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(49)
<223> 上游内引物
<400> 3
tgcagttaag gttattttgc acagttacta actttaagga gtacctacg 49
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(43)
<223> 下游内引物
<400> 4
ttccactatt ttggaggact ggaagtatct tctagtgtgc ctc 43
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> 上游环引物
<400> 5
ctgtaaatca tattcctccc catgt 25
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 下游环引物
<400> 6
ttggtctaca acctccccc 19
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 上游外引物
<400> 7
cactgtgcct caatcctt 18
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 下游外引物
<400> 8
actgggagtg gtatctacc 19
<210> 9
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(43)
<223> 上游内引物
<400> 9
ggtaacaata gagccacttg gagagacagg tatgcctgct tca 43
<210> 10
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(48)
<223> 下游内引物
<400> 10
tgactcccag ttgtttaata aaccaaataa ttgattatgc cagcaaac 48
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 下游环引物
<400> 11
ggttacataa ggcacagggt c 21
Claims (4)
1.一种LAMP检测用引物组合，包括
HPV16的LAMP检测用引物组，引物名称和序列信息如下，
HPV18的LAMP检测用引物组，引物名称和序列如下，
2.根据权利要求1所述的LAMP检测用引物组合，其特征在于：HPV16的LAMP检测用引物组还包括
LF CTGTAAATCATATTCCTCCCCATGT
LB TTGGTCTACAACCTCCCCC。
3.根据权利要求2所述的LAMP检测用引物组合，其特征在于：HPV18的LAMP检测用引物组还包括
LB GGTTACATAAGGCACAGGGTC。
4.一种包括权利要求3所述的LAMP检测用引物组合的反应体系，其特征在于：每25μL的反应体系包含组分如下，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，8mM MgSO4，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween 20，0.8M甜菜碱，dNTPs各1.4mM，F3和B3各0.4μM，FIP和BIP各3.2μM，LF和LB各1.6μM，0.3M钙黄绿素，0.5M MnCl2，8U Bst DNA聚合酶，2.5μL DNA模板。
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