PL240016B1 - Zestaw starterów do wykrywania wirusa brodawczaka ludzkiego typ 16 (HPV16 Human papillomavirus type 16), sposób wykrywania infekcji HPV16, zastosowanie zestawu starterów do wykrywania infekcji HPV16 - Google Patents
Zestaw starterów do wykrywania wirusa brodawczaka ludzkiego typ 16 (HPV16 Human papillomavirus type 16), sposób wykrywania infekcji HPV16, zastosowanie zestawu starterów do wykrywania infekcji HPV16 Download PDFInfo
- Publication number
- PL240016B1 PL240016B1 PL431073A PL43107319A PL240016B1 PL 240016 B1 PL240016 B1 PL 240016B1 PL 431073 A PL431073 A PL 431073A PL 43107319 A PL43107319 A PL 43107319A PL 240016 B1 PL240016 B1 PL 240016B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- hpv16
- hpv18
- sequence
- human papillomavirus
- papillomavirus type
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/119—Strand displacement amplification [SDA]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
PL 240 016 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są zestawy starterów do wykrywania wirusów należących do rodziny wirusów brodawczaka ludzkiego, genotypy 16 (Human papillomavirus type 16), sposób wykrywania wirusów z rodziny wirusów brodawczaka ludzkiego z wykorzystaniem zestawu starterów oraz zastosowanie zestawu starterów do wykrywania wirusów należących do rodziny wirusów brodawczaka ludzkiego, genotypy 16. Wynalazek ma zastosowanie w diagnostyce medycznej.
Wirusy brodawczaka ludzkiego są sferycznymi wirusami, których materiał genetyczny stanowi podwójna nić DNA. Do grupy wirusów brodawczaka ludzkiego zalicza się ponad 200 różnych genotypów, sklasyfikowanych na podstawie różnicy w sekwencji DNA, z czego około 40 przenoszonych jest drogą płciową. Z tej grupy wyodrębniono 14 genotypów onkogennych, o wysokim ryzyku rozwoju nowotworów, w tym raka szyjki macicy, raka odbytu oraz nowotworów głowy i szyi, z czego genotyp 16 oraz genotyp 18 są najpowszechniej diagnozowane. Według WHO, HPV16 jest odpowiedzialny za 55% przypadków raka szyjki macicy, HVP18 stanowi przyczynę kolejnych 15%, pozostałe przypadki nowotworów szyjki macicy spowodowane są infekcją pozostałych onkogennych genotypów wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) w tym: 31,33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 68, 73, 82.
Z dotychczas opublikowanych zgłoszeń patentowych: CN102952894A; CN103114033A;
CN104805218; CN106939359A; CN10755492A; CN106148571A; EP2192199A1; US2009035750A1; WO2014092647 znane jest wykorzystanie starterów w metodzie LAMP do diagnozy wirusów HPV16 i/lub HPV18. Metoda LAMP została przykładowo ujawniona w opisach patentowych WO0028082, WO0224902. Wspomniane zgłoszenia patentową nie opisują natomiast jaka jest czułość i limit detekcji wirusów HPV16 oraz HPV18. Metoda detekcji w wymienionych zgłoszeniach patentowych nie pozwala na ich ilościowy pomiar, a detekcja jest rodzaju end-point, z wykorzystaniem żelu agarozowego lub innych znaczników bazujących na zmianie barwy mieszaniny reakcyjnej w przypadku dodatniego wyniku reakcji amplifikacji (Hydroxy-Naphthol-Blue, Calceine).
Nadal więc istnieje potrzeba zapewnienia takiego zestawu starterów wykorzystywanych w metodzie diagnostycznej w podstawowej opiece medycznej do wykrywania i genotypowania wirusów brodawczaka ludzkiego z wykorzystaniem metody LAMP, który umożliwia detekcję wirusa o bardzo niskim limicie detekcji (> 5 GEq/μl) w krótkim czasie (< 15 min). Nieoczekiwanie powyższy problem rozwiązał prezentowany wynalazek.
Pierwszym przedmiotem wynalazku są zestawy starterów do powielania sekwencji nukleotydowej genów L2 wirusa brodawczaka ludzkiego typ 16 charakteryzujących się tym, że zawierają zestawy starterów wewnętrznych o następujących sekwencjach nukleotydowych a) i b) dla HPV16 a także zestawy starterów zewnętrznych zawierający następujące sekwencje nukleotydowe c) i d) dla wirusa HPV16:
a) 5' CATGCAAACAGGCAGGTA 3' (sekwencja nukleinowa SEQ ID nO: 3 lub sekwencja do odwrotna i komplementarna) połączona lub nie połączona mostkiem TTTT z sekwencją 5' ATTTGATCAGCAATAGTTTTGCCTT 3' - (sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 5 lub sekwencja odwrotna i komplementarna)
b) 5' ATATACCCAGTGCGTCCG 3' - (sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 4 lub sekwencja odwrotna i komplementarna) połączona lub nie mostkiem TTTT z sekwencją 5' GGAAGTATGGGTGTATTTTTTGGTG 3' - (sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 6 lub sekwencja odwrotna i komplementarna)
c) 5' AAAACGTGCATCGGCTAC 3' sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 1 lub sekwencja odwrotna i komplementarna oraz
d) 5' GAGGCCTTGTTCCCAATG 3' sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 2 lub sekwencja odwrotna i komplementarna. Korzystnie zestaw wg. pierwszego przedmiotu wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera zestaw sekwencji starterów loop zawierający sekwencje nukleinowe zawierające się albo komplementarne do genu L2 wirusa HPV16 o numerach SEQ ID NO: 13 - 5' CCTTAGGTATAATGTCAGGTGGACA 3' i SEQ ID NO: 14: 5' GGTTAGGAATTGGAACAGGGTC 3' albo sekwencje odwrotne i komplementarne.
Drugim przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania wirusów brodawczaka ludzkiego (Human papillomavirus) typ 16, charakteryzujący się tym, że powiela się wybrany region sekwencji nukleinowej HPV16 z wykorzystaniem zestawu starterów jak zdefiniowano w pierwszym przedmiocie wynalazku, przy czym metodą powielania jest metoda LAMP. Równie korzystnie sposób wg wynalazku charakteryzuje się tym, że w powielanie prowadzi się przy profilu temperaturowym: HPV16: 65°C, 30 min.
PL 240 016 B1
Korzystniej sposób wg. wynalazku charakteryzuje się tym, że reakcję typu end-point prowadzi się przy profilu temperaturowym 80°C, 5 min zachodzącym po zasadniczym etapie powielania.
Trzecim przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania infekcji HPV16 charakteryzujący się tym, że obejmuje sposób wykrywania jak zdefiniowano w drugim przedmiocie wynalazku.
Czwartym przedmiotem wynalazku jest zestaw do wykrywania infekcji HPV16 charakteryzujący się tym, że zawiera zestaw starterów jak zdefiniowano w pierwszym przedmiocie wynalazku. Korzystniej zestaw do wykrywania infekcji wg. wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera 12,5 μl WarmStart LAMP Master Mix. Korzystniej zestaw do wykrywania infekcji wg. piątego przedmiotu wynalazku charakteryzuje się tym, zawiera startery do powielania, jak zdefiniowano w pierwszym przedmiocie wynalazku, przy czym startery mają następujące stężenia: HPV16: 0,12 μM F3, 0,12 μM B3, 0.96 μM FIP, 0,96 μM BIP, 0,24 μM LoopF, 0,24 μM LoopB; oraz; BSA - 0,25 mg/ml; D-(+)-Trehalose dihydrate - 6%; znacznik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA - EvaGreen < 1X albo Fluorescent Dye w ilości < 0,5 μl albo GreenFluorescent Dye w ilości < 1 μl albo Syto-13 < 16 μM lub SYTO-82 <16 μM albo inny barwnik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA w stężeniu niewykazującym inhibicji reakcji amplifikacji.
Zaletą zestawów starterów, według wynalazku, w do detekcji HPV16, a także metody detekcji infekcji HPV16 i sposobu detekcji produktów amplifikacji jest możliwość ich użycia w diagnostyce medycznej w miejscu opieki nad pacjentem (POC) w docelowym zastosowaniu na przenośnym analizatorze genetycznym. Liofilizacja mieszanin reakcyjnych według wynalazku umożliwia przechowywanie zestawów diagnostycznych w temperaturze pokojowej, nie zmniejszając parametrów diagnostycznych testów. Z kolei użycie barwnika fluorescencyjnego do detekcji produktu amplifikacji zwiększa czułość metody, pozwala na obniżenie limitu detekcji (do 5 GEq/μl), a także umożliwia ilościowy pomiar wirusa w próbce badanej.
Przykładowe realizacje wynalazku przedstawiono na rysunkach, na których fig. 1 i 3 (odpowiednio dla HPV16 i HPV18) przedstawiają charakterystykę czułości metody, gdzie specyficzny sygnał uzyskano z matrycami:
- HPV16: Human Papillomavirus (HPV) Type 16 DNA, 1st WHO International Standard) -
06/202, NIBSC
- HPV18: Human Papillomavirus (HPV) Type 18 DNA (1st WHO International Standard) -
06/206, NIBSC w zakresie 10 000 - 5 GEq (Genomic Equivalent) HPV16 oraz HPV18, brak natomiast produktu w NTC; Fig. 1: Linia 1.: marker mas (Quick-Load® Purple 100 bp DNALadder, NewEngland Biolabs) ; linia 2. : 5 GEq HPV16; linia 3. : 10 GEq HPV16; linia 4.:20 GEq HPV16; linia 5.: 25 GEq HPV16; linia 6.: 50 GEq HPV16; Linia 7.: 100 GEq HPV16; linia 8.: 1 000 GEq HPV16; linia 9.: 10 000 GEq HPV16; linia 10.: NTC.
Fig. 3: Linia 1.: marker mas (Quick-Load® Purple 100 bp DNA Ladder, NewEngland Biolabs);
linia 2.: 10 000 GEq HPV18; linia 3.: 1 0000 GEq HPV18; linia 4.: 100 GEq HPV18; linia 5.: 50 GEq HPV18; linia 6.: 25 GEq HPV18; Linia 7.: 20 GEq HPV18; linia 8.: 10 GEq HPV18; linia 9.: 5 GEq HPV18; linia 10.: NTC.
Fig. 2 oraz fig. 4 ilustrują czułość metody wg wynalazku mierzonej przez nastawienie serii rozcieńczeń standardów
- HPV16: Human Papillomavirus (HPV) Type 16 DNA, 1st WHO International Standard) -
06/202, NIBSC
- HPV18: Human Papillomavirus (HPV) Type 18 DNA (1st WHO International Standard) -
06/206, NIBSC z minimalną ilością bakterii 5 GEq HPV16 i HPV18, gdzie przyrost produktu mierzono w czasie rzeczywistym. Wyniki detekcji HPV16 i HPV18 w czasie rzeczywistym przedstawiono w tabeli nr 1 oraz tabeli nr 2.
Fig. 5 oraz fig. 6 ilustrują specyficzność metody według wynalazku ze standardowymi matrycami patogenów potencjalnie obecnych w badanym materiale biologicznym jako naturalna flora fizjologiczna, mogących być wynikiem ko-infekcji lub które posiadają zbliżone sekwencje genomowe. Fig 5: Linia 1: marker mas (Quick-Load® Purple 100 bp DNA Ladder, NewEngland Biolabs); Linia 2: HPV16; Linia 3: HPV18; Linia 4: Streptococcus agalactia; Linia 5: Streptococcus pyogenes; Linia 6: Streptococcus mutant; Linia 7: Staphylococcus epidermidis; Linia 8: Staphylococcus aureus; Linia 9: Campylobacter jejuni; Linia 10: Trepanoma pallidium; Linia 11: HSV1; Linia 12: HSV2; Linia 13: Candida albicans; Linia 14: Borrelia afzeli; Linia 15: Borrelia burgdorferi sensu stricto; Linia 16: Homo sapiens; Linia 17: NTC. Fig 6: Linia 1: marker mas (Quick-Load® Purple 100 bp DNA Ladder, NewEngland Biolabs); Linia 2: HPV16; Linia 3: HPV18; Linia 4: Streptococcus agalactia; Linia 5: Streptococcus pyogenes; Linia 6: Streptococcus mutant; Linia 7: Staphylococcus epidermidis; Linia 8: Staphylococcus aureus; Linia 9: Campylobacter jejuni; Linia 10: Trepanoma pallidium; Linia 11: HSV1; Linia 12: HSV2; Linia 13: Candida
PL 240 016 B1 albicans; Linia 14: Borrelia afzeli; Linia 15: Borrelia burgdorferi sensu stricto; Linia 16: Homo sapiens; Linia 17: NTC.
P r z y k ł a d 1 Sekwencje starterów
Sekwencje specyficznych oligonukleotydów wykorzystywanych do detekcji materiału genetycznego HPV16 z wykorzystaniem technologii LAMP przedstawiono i scharakteryzowano poniżej.
1. Sekwencja oligonukleotydu HPV16 L2F3: 5' AAAACGTGCATCGGCTAC 3' stanowi sekwencję identyczną z genem L2 HPV16 (nić 5'-3'), który od strony 3' końca sąsiaduje ze starterem HPV16 L2F2. ‘
2. Sekwencja oligonukleotydu HPV16 L2B3: 5' GAGGCCTTGTTCCCAATG 3' stanowi komplementarny fragment genu L2 HPV16 (nić 5'-3') oddalona o 174 nukleotydów od końca 3' oligonukleotydu 1.
3. Sekwencja oligonukleotydu HPV16 L2F2: 5' CATGCAAACAGGCAGGTA 3' stanowi sekwencję identyczną z genem L2 HPV16 (nić 5'-3') oddalona o 15 nukleotydów od końca 3' oligonukleotydu 1.
4. Sekwencja oligonukleotydu HPV16 L2B2: 5' ATATACCCAGTGCGTCCG 3' stanowi komplementarny fragment genu L2 HPV16 (nić 5'-3') oddalona o 154 nukleotydy od końca 3' oligonukleotydu 1.
5. Sekwencja oligonukleotydu HPV16 L2F1c: 5' ATTTGATCAGCAATAGTTTTGCCTT 3' stanowi komplementarny fragment genu L2 HPV16 (nić 5'-3') oddalona o 63 nukleotydów od końca 3' oligonukleotydu 1.
6. Sekwencja oligonukleotydu HPV16 L2Blc: 5' GGAAGTATGGGTGTATTTTTTGGTG 3' stanowi sekwencję identyczną z genem L2 HPV16 (nić 5'-3') oddalona o 98 nukleotydów od końca 3' oligonukleotydu 1.
7. Sekwencja HPV16 L2LoopF: 5' CCTTAGGTATAATGTCAGGTGGACA 3'.
8. Sekwencja oligonukleotydu GGTTAGGAATTGGAACAGGGTC 3'
Sekwencje oligonukleotydów F1c i F2 zostały korzystnie połączone mostkiem TTTT i wykorzystane w postaci FIP.
Sekwencje oligonukleotydów B1c i B2 zostały korzystnie połączone mostkiem TTTT i wykorzystane w postaci BIP
P r z y k ł a d 2 Sekwencje starterów
Sekwencje specyficznych oligonukleotydów wykorzystywanych do detekcji materiału genetycznego HPV18 z wykorzystaniem technologii LAMP przedstawiono i scharakteryzowano poniżej.
1. Sekwencja oligonukleotydu HPV18 L1F3: 5' CCTAAGAAACGTAAACGTGTT 3' stanowi sekwencję identyczną z genem L1 HPV18 (nić 5'-3'), który od strony 3' końca sąsiaduje ze starterem HPV18 L1F2.
2. Sekwencja oligonukleotydu HPV18 L1B3: 5' CAGGAACCCTAAAATATGGATT 3' stanowi komplementarny fragment genu Li HPV18 (nić 5'-3') oddalona o 155 nukleotydów od końca 3' oligonukleotydu 1, który od strony 5' sąsiaduje ze starterem B2.
3. Sekwencja oligonukleotydu HPV18 L1F2: 5' CCCTATTTTTTTGCAGATGGC 3' stanowi sekwencję identyczną z genem L1 HPV18 (nić 5'-3') położony bezpośrednio do końca 3' oligonukleotydu 1.
4. Sekwencja oligonukleotydu HPV18 L1B2: 5’ CCAACAGTTAATAATCTAGAGCT 3' stanowi komplementarny fragment genu L1 HPV18 (nić 5'-3') oddalona o 131 nukleotydów od końca 3' oligonukleotydu 1.
5. Sekwencja oligonukleotydu HPV18 L1F1c: 5’ AGGAGGTGGAAGATATACGGTATT 3' stanowi komplementarny fragment genu L1 HPV18 (nić 5'-3') oddalona o 41 nukleotydów od końca 3' oligonukleotydu 1.
6. Sekwencja oligonukleotydu HPV18 L1B1c: 5’ GGCAAGAGTTGTAAATACCGATGA 3’ stanowi sekwencję identyczną z genem L1 HPV18 (nic 5’-3’) oddalona o 70 nukleotydów od końca 3’ oligonukleotydu 1.
7. Sekwencja HPV18 L1 LoopF: 5; GTCACTAGGCCGCCACAA 3'
8. Sekwencja oligonukleotydu HPV18 L1 LoopB: 5' CTCCCACAAGCATATTTTATCATGC 3'
Sekwencje oligonukleotydów F1c i F2 zostały korzystnie połączone mostkiem TTTT i wykorzystane w postaci FIP. Sekwencje oligonukleotydów B1c i B2 zostały korzystnie połączone mostkiem TTTT i wykorzystane w postaci BIP.
PL 240 016 B1
P r z y k ł a d 3
Metoda amplifikacji genów L2 HPV18 oraz L1 HPV18 z wykorzystaniem oligonukleotydów scharakteryzowanych w przykładzie 1 i przykładzie 2 w technologii LAMP o następującym składzie mieszaniny reakcyjnej.
HPV16
12,5 μl WarmStart LAMP 2X Master Mix
0,12 μM F3
0,12 μM B3
0,96 μM FIP
0,96 μM BIP
0,24 μM LoopF
0,24 μM LoopB
BSA - 0,25 mg/ml
D-(+)-Trehalose dihydrate - 6%
Znacznik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA - EvaGreen <1X lub Fluorescent dye 50X (New England Biolabs) w ilości 0,5 μl lub GreenFluorescent Dye (Lucigen) w ilości < 1 μl lub Syto-13 <16 μM lub SYTO-82 <16 μΜ lub inny barwnik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA w stężeniu niewykazującym inhibicji reakcji amplifikacji.
Matryca DNA > 5 kopia/reakcję
Całkowita objętość reakcyjna dopełniona do 25 μl wodą wolną od DNaz i RNaz.
HPV18
12,5 μl WarmStart LAMP 2X Master Mix
0,15 μM F3
0,15 μM B3
1,20 μM FIP
1,20 μM BIP
0,30 μM LoopF
0,30 μM LoopB
BSA - 0,25 mg/ml
D-(+)-Trehalose dihydrate - 6%
Znacznik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA - EvaGreen <1X lub Fluorescent dye 50X (New England Biolabs) w ilości 0,5 μl lub GreenFluorescent Dye (Lucigen) w ilości <1 μl lub Syto-13 <16 μM lub SYTO-82 <16 μM lub inny barwnik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA w stężeniu niewykazującym inhibicji reakcji amplifikacji.
Matryca DNA > 5 kopia/reakcję
Całkowita objętość reakcyjna dopełniona do 25 μl wodą wolną od DNaz i RNaz.
P r z y k ł a d 4
Metoda amplifikacji genów L2 HPV16 lub L1 HPV18 z wykorzystaniem oligonukleotydów scharakteryzowanych w przykładzie 1 i przykładzie 2 w technologii LAMP o składzie mieszaniny reakcyjnej scharakteryzowanej w przykładzie 3 o następującym profilu temperaturowym:
1) HPV16: 65°C, 30 min
2) HPV18: 64°C, 40 min.
3) korzystnie przy reakcjach typu end-point 80°C, 5 min.
P r z y k ł a d 5
Metoda amplifikacji i detekcji genów L2 HPV16 lub L1 HPV18 z wykorzystaniem oligonukleotydów scharakteryzowanych w przykładzie 1 i przykładzie o przykładzie 2 w technologii LAMP o składzie mieszaniny reakcyjnej scharakteryzowanej w przykładzie 3 o profilu temperaturowym scharakteryzowanym w przykładzie 4 i sposobie detekcji opisanym poniżej.
Użyty barwnik fluorescencyjny wykazujący zdolność odziaływania z dwuniciowym DNA dodany do mieszaniny reakcyjnej w ilości 1,25 μl EvaGreen 20X; 0,5 μl lub stężeniu <1X; <16 μM odpowiednio dla barwnika GreenFluorescent Dye (Lucigen); SYTO-13 i SYTO-82 przed rozpoczęciem reakcji, pomiar w czasie rzeczywistym i/lub typu end-point. Długość fali wzbudzenia w zakresie zbliżonym do barwnika FAM - 490-500 nm (optymalnie 494 nm) dla barwników EvaGreen; Fluorescent dye 50X (New England Biolabs), GreenFluorescent Dye (Lucigen); SYTO-13 oraz dla barwnika SYTO-82 535 nm (optymalnie 541 nm) długość fali emisji w zakresie 509-530 nm (optymalnie 518 nm) dla barwników EvaGreen; GreenFluorescent Dye (Lucigen); SYTO-13 oraz dla barwnika SYTO-82 556 nm (optymalnie 560 nm) ,
PL 240 016 B1 sposób detekcji, czas rejestracji zmian począwszy od 8 minuty od rozpoczęcia reakcji dla HPV16 i HPV18 oraz kontroli negatywnej.
P r z y k ł a d 6
Metoda przygotowania i liofilizacji odczynników do detekcji amplifikacji i detekcji genów L2 HPV16 oraz LI HPV18 z wykorzystaniem oligonukleotydów scharakteryzowanych w przykładzie 1 i przykładzie 2 w technologii LAMP o składzie mieszaniny reakcyjnej scharakteryzowanej w przykładzie 3 o profilu temperaturowym scharakteryzowanym w przykładzie 4 i sposobie detekcji opisanym w przykładzie 5.
P r z y k ł a d 6 Opis procesu liofilizacji
Komponenty reakcji mieszano zgodnie ze składem opisanym w przykładzie 3, poza matrycą DNA, do całkowitej objętości 25 μl. Mieszaninę przeniesiono do probówek o pojemności 0,2 ml i poddano procesowi liofilizacji zgodnie z poniższymi parametrami.
Mieszanina umieszczona w probówkach została wstępnie schłodzona do -20°C przez 8 godzin. Następnie prowadzono proces liofilizacji w temperaturze -50°C przez 3,5 godzin pod ciśnieniem 5-2 mBar.
P r z y k ł a d 7 Czułość metody
Czułość określono przez nastawienie serii rozcieńczeń standardów HPV16 i HPV18 (HPV16: Human Papillomavirus (HPV) Type 16 DNA, 1st WHO International Standard), 06/202, NIBSC; HPV18: Human Papillomavirus (HPV) Type 18 DNA (1st WHO International Standard), 06/206, NIBSC) z minimalną ilością wirusa 5 GEq, gdzie przyrost produktu mierzono w czasie rzeczywistym - Figura 2 i Figura 4 (RealTime-LAMP dla serii rozcieńczeń HPV16 (Fig. 2) i HPV18 (Fig. 4)).
Czas, po którym możliwa jest detekcja emitowanej fluorescencji dla poszczególnych próbek przedstawiono w tabeli 1 (HPV16) i tabeli 2 (HPV18)
Scharakteryzowane startery umożliwiają detekcję dla genotypów wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV16 i HPV18) minimalnej ilości 5 GEq/μl.
T a b e l a 1 Czas niezbędny do detekcji fluorescencji poszczególnych GEq HPV16
| Próbka | Czas przekroczenia linii bazowej fluorescencji (min) |
| HPV16 NTC | Nieokreślony |
| HPV16 5 GEq | 12,963261 |
| HPV1610 GEq | 11,581083 |
| HPV16 20 GEq | 14,098101 |
| HPV16 25 GEq | 15,726467 |
| HPV16 50 GEq | 15,248527 |
| HPV16 100 GEq | 11,441005 |
| HPV16 1 000 GEq | 8,652453 |
| HPV16 10 000GEq | 7,857287 |
T a b e l a 2 Czas niezbędny do detekcji fluorescencji poszczególnych GEq HPV18
| Próbka | Czas przekroczenia linii bazowej fluorescencji (min) |
| HPV18 NTC | Nieokreślony |
| HPV18 5 GEq | 34,238747 |
| HPV18 10 GEq | 20,652435 |
| HPV18 20 GEq | 28,449081 |
| HPV18 25 GEq | 18,165846 |
| HPV18 50 GEq | 26,238985 |
| HPV18 100 GEq | 17,889755 |
| HPV18 1 000 GEq | 16,71521 |
| HPV18 10 000GEq | 14,166594 |
PL 240 016 Β1
Wyższość metody amplifikacji oraz oligonukleotydów scharakteryzowanych w niniejszym opisie patentowym nad testami bazującymi na technologii RealTime-LAMP polega na znacznie wyższej czułości, którą przedstawiono na figurze 1 i figurze 3 oraz skróceniu czasu analiz przedstawionego na figurze 2 i figurze 4 oraz tabeli 1 i tabeli 2.
Lista sekwencji <110> Genomtec S.A.
<120> Zestawy starterów do wykrywania HPV16 i HPV18, sposób wykrywania HPV16 i HPV18 z wykorzystaniem zestawów starterów oraz zestawy do wykrywania HPV16 i HPV18 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 HPV16 L2F3 <211> 24 <212> DNA <213> artificiai <223> primer <400> 1
AAAACGTGCATCGGCTAC 18
| <210> | 2 HPV16 L2B3 |
| <211> | 24 |
| <212> | DNA |
| <213> | artificiai |
| <223> | primer |
| <400> | 2 |
| GAGGCCTTGTTCCCAATG | |
| <210> | 3 HPV16 L2F2 |
| <211> | 24 |
| <212> | DNA |
| <213> | artif icial |
| <223> | primer |
PL 240 016 Β1 < 400> 3
CATGCAAACAGGCAGGTA 18 < 210> 4 HPV16 L2B2 < 211> 24 < 212> DNA < 213> artificial < 223> primer < 400> 4
ATATACCCAGTGCGTCCG 18 < 210> 5 HPV16 L2Flc < 211>24 < 212> DNA < 213> artificial < 223> primer < 400>5
ATTTGATCAGCAATAGTTTTGCCTT 25 < 210> 6 HPV16 L2B1C < 211>24 < 212> DNA < 213> artificial < 223> primer < 400>6
GGAAGTATGGGTGTATTTTTTGGTG 25
PL 240 016 Β1 < 210> 7 HPV18 L1F3 < 211>24 < 212> DNA < 213> artificial < 223> primer < 400>7
CCTAAGAAACGTAAACGTGTT 21 < 210> 8 HPV18 L1B3 < 211>24 < 212> DNA < 213> artificial < 223> primer < 400>8
CAGGAACCCTAAAATATGGATT 22 < 210> 9 HPV18 L1F2:
< 211>24 < 212> DNA < 213> artificial < 223> primer < 400>9
CCCTATTTTTTTGCAGATGGC 21 < 210> 10 HPV18 L1B2 < 211>24 < 212> DNA < 213> artificial
PL 240 016 Β1 < 223> primer <400 10
CCAACAGTTAATAATCTAGAGCT 23 < 210 11 HPV18 LlFlc < 211> 24 < 212> DNA < 213> artificial < 223> primer <400 11
AGGAGGTGGAAGATATACGGTATT 24 < 210 12 HPV18 LlBlc < 211> 24 < 212> DNA < 213> artificial < 223> primer < 40 012
GGCAAGAGTTGTAAATACCGATGA 24 < 210 13 HPV16 L2LoopF < 211>24 < 212> DNA < 213> artificial < 223> primer <40 013
PL 240 016 Β1
CCTTAGGTATAATGTCAGGTGGACA 25 < 210> 14 HPV16 L2LoopB < 211> 24 < 212> DNA < 213> artificial < 223> primer < 400>14
GGTTAGGAATTGGAACAGGGTC 22 < 210> 15 HPV18 LILoopF < 211>24 < 212> DNA < 213> artificial < 223> primer < 400>15
GTCACTAGGCCGCCACAA 18 < 210> 16 HPV18 LILoopB < 211>24 < 212> DNA < 213> artificial < 223> primer < 400>16
CTCCCACAAGCATATTTTATCATGC 25
PL 240 016 Β1 <210> 17 Gen L2 HPV1 6 <211> 24 <212> DNA <213>
<223> gen <400> 17
Gen L2 1
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381 atgcgacaca acatgcaaac attgctgatc ggaacagggt acagctacag tctgatcctt acatctgtac accacacctg cccactttca tttacacttt tttattgtta ccagtggcac gcttttgtaa gatgtggata cctgactttt attaggtaca ggtgctaagg ttacaaacta attaataatg ccggtaccat ccttttggtg actgaccaag gctgatgcag cgtttaccat aacgttctgc aggcaggtac aaatattaca cgggtacagg atacacttgc ctatagtttc cttccattcc ctatattaga ctgacccatc catcatccac gcacaaaccc gcctaggatt ccactcccac atacattata cggatatagt gtagaattgg racattatta caacaccttc gattatatga ctgtaccctc gtgcatacaa ctccttcatt gtgactttta attttttttc aaaacgcaca atgtccacct atatggaagt cggacgcact ccctgtaaga rttagtggaa cccagatgta tattaataat cgtattgcag zattagtaca caacacagta atatagtcgc raaacttatt rttttctagt cgctttacat caataaacaa ttatgattta cacatatact catttatgca tacatcttta cattccttta aattcctata cttacatcct agatgtctct aaacgtgcat gacattatac atgggtgtat gggtatattc ccccctttaa gaaactagtt tcaggattta actgttacta cctccaacac cataattatg actagtagca acaacacaac acatatgata aatgataata aggccagcat acactacgta agtactattg accacttcac gatgacttta tcaggttata gtatcaggtc gttccagggt agttattaca ttggctgcct cggctaccca ctaaggttga tttttggtgg cattgggaac cagtagatcc ttattgatgc gtattactac ctgt tactac ctgcagaaac aagaaattcc cacccatacc aggttaaagt atcctgcata gtattaatat taacctctag ctcgtagtgg atcctgcaga atgcagcctc ttacagatac ttcctgcaaa ctgatatacc ctccacaata cgttacgaaa ag actttataaa aggcaaaact gttaggaatt aaggcctccc tgtgggccct tggtgcacca ttcaactgat acataataat tggagggcat tatggataca agggtctcgc tgtagaccct tgaaggtata agctccagat gcgtactggc aaaatctata agaaatagaa acctacttct ttctacaacc tacaacaatt cattaatata tacaattatt acgacgtaaa
PL 240 016 Β1 <210> 18 Gen LI HPV18 <211> 24 <212> DNA <213>
<223> gen <400> 18
Gene LI
121
181
241
3C1
361
421
481
541
6C1
661
721
781
1
901
961
1021
1081
114 1
1201
1261
1321
1381
144 1
501
1561
1621
1681
HPV18 atgtgcctgt ttgtatcacc atttgtggcc cagatggctt agagttgtaa tctagattat caggatattc ccaaataaat tgggcctgtg catccatttt tctgaggacg ggctgtgccc ttatcacagg atggtagata gtaccattgg gatccttatg ttttggaata acaggtatgc gttacctctg aacaatggtg accaatttaa aaatttaagc tgtactatta tCagaggatt cgttttgtac gatccctatg ttagatcaat accataggcc cgtgtgcgtg atacacgggt cacggcccct attatattat rgtggcggcc ataccgatga taactgttgg CtaaggtttC ttggtttacc ctggagtgga ataataaatt -tagggacaa ctgctattgg gcgattgccc ctggatatgg atatttgtca gggattccat gagcaggt ac ctgcttcacc actcccagtt ^ttgctggca caatatgtgc agtatagcag ctttaactgc ggaactttgg aatctgttgc ataagttaaa atccccttgg ctcgcaaacg Lacgtgccag cctgatatta gcctctacac tttattccta tagtgacaat ttatgtgact taatccatat tgcataccaa tgatactagt aattggccgt agatgacact cgtgtctgta ggaacactgg ccctttagaa ^gccatggac gtctatttgt gtttttttgc tatgggtgac -ggcagctgt gtttaataaa taatcaatta rtctacacag acatgttgag agatgttatg rgttcccccc tattacctgt gt.tttggaat acgtaaattt 7tctgctcca gaagtaa cattaccatc agtatattgg agaaacgt aa accgtatatc cccacaagca tttagggttc tatagagtat atttataatc ggtcagcctt gaaagttccc gattataagc gctaaaggca cttaaaaaca tttagtacat aaatatcctg ttacggcgtg actgtgcctc gtgtattctc ccatattggt tttgttactg tctcctgtac gaatatgatt tcctatattc cccccaacta caaaaggatg gtggatttaa ttggttcagg tctgccacta tactacctct tatacatggt acgtgttccc ttccacctcc tattttatca ctgcaggtgg ttagggtgca ctgaaacaca taggtgttgg atgccgccac agacacagtt ctgcttgtaa cagttttgga tgcaagatac attatttaca agcagctttt aatccttat a cctctccaag tacataaggc tggtagatac ctgggcaata zgcagtttat atagtatgaa ctagtttggt ctgcaccggc aggaaaagtt ctggattgcg cgtcttctaa gtatggccca acacattatt tatttttttg ttctgtggca tgctggcagc tggcaataag gttacctgac acgtttagtg ccttagtggg gtctaatgtt atgtattttg atcgcgtcct agatggtgat taaatgtgag aatgtctgca tgctaggcat tattaaaggc tggctctatt acagggtcat cactcccagt tgatgctacc ttttcagttg tagcagtatt ggatacatat tgaaaataag ttctttagac tcgcaagccc acctgccaag
Claims (9)
- PL 240 016 B1Zastrzeżenia patentowe1. Zestawy starterów do powielania sekwencji nukleotydowej genów L2 wirusa brodawczaka ludzkiego typ 16, znamienne tym, że zawierają zestawy starterów wewnętrznych o następujących sekwencjach nukleotydowych a) i b) dla HPV16 a także zestawy starterów zewnętrznych zawierający następujące sekwencje nukleotydowe c) i d) dla wirusa HPV16:a) 5' CATGCAAACAGGCAGGTA 3'(sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 3 lub sekwencja odwrotna i komplementarna) połączona lub nie połączona mostkiem TTTT z sekwencją 5' ATTTGATCAGCAATAGTTTTGCCTT 3'-(sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 5 lub Sekwencja odwrotna i komplementarna)b) 5' ATATACCCAGTGCGTCCG 3'- (sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 4 lub sekwencja odwrotna i komplementarna) połączona lub nie połączona mostkiem TTTT z sekwencją 5' GGAAGTATGGGTGTATTTTTTGGTG 3'- (sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 6 lub sekwencja odwrotna i komplementarna)c) 5' AAAACGTGCATCGGCTAC 3' sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 1 lub sekwencja odwrotna i komplementarna orazd) 5' GAGGCCTTGTTCCCAATG 3' sekwencja nukleinowa SEQ ID NO: 2 lub sekwencja odwrotna i komplementarna.
- 2. Zestaw starterów wg zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera zestaw sekwencji starterów Loop zawierający sekwencje nukleinowe zawierające się albo komplementarne do genu L2 wirusa HPV16 o numerach SEQ ID NO: 13-5’ CCTTAGGTATAATGTCAGGTGGACA 3’ i SEQ ID NO: 14: 5’ GGTTAGGAATTGGAACAGGGTC 3' albo sekwencje odwrotne i komplementarne.
- 3. Sposób wykrywania wirusów brodawczaka ludzkiego (Human papillomavirus) typ 16, znamiennym tym, że powiela się wybrany region sekwencji nukleinowej HPV16 z wykorzystaniem zestawu starterów jak zdefiniowano w zastrz. 1, przy czym metodą powielania jest metoda LAMP.
- 4. Sposób wykrywania wirusów wg. zastrz. 3, znamienny tym, że w powielanie prowadzi się przy profilu temperaturowym:- HPV16: 65°C, 30 min
- 5. Sposób wg. zastrz. 3, znamienny tym, że reakcję typu end-point prowadzi się przy profilu temperaturowym 80°C, 5 min zachodzącym po zasadniczym etapie powielania.
- 6. Sposób wykrywania infekcji HPV16 zamienny tym, że obejmuje sposób wykrywania jak zdefiniowano w zastrz. 3.
- 7. Zestaw do wykrywania infekcji HPV16 znamienny tym, że zawiera zestaw starterów jak zdefiniowano w zastrz. 1.
- 8. Zestaw do wykrywania infekcji wg. zastrz. 7, znamienny tym, że zawiera 12,5 μl WarmStart LAMP Master Mix.
- 9. Zestaw do wykrywania infekcji wg. zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, zawiera startery do powielania, jak zdefiniowano w zastrz. 1, przy czym startery mają następujące stężenia: HPV16: 0,12 μM F3, 0,12 μM B3, 0,96 μM FIP, 0,96 μM BIP, 0,24 μM LoopF, 0,24 μM LoopB; oraz; BSA - 0,25 mg/ml; D-(+)-Trehalose dihydrate - 6%; znacznik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA - EvaGreen ś 1X albo Fluorescent Dye w ilości ś 0,5 μl albo GreenFluorescent Dye w ilości ś 1 μl albo Syto-13 ś 16 μM lub SYTO-82 ś 16 μM albo inny barwnik fluorescencyjny oddziałujący z dwuniciowym DNA w stężeniu niewykazującym inhibicji reakcji amplifikacji.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL431073A PL240016B1 (pl) | 2019-09-09 | 2019-09-09 | Zestaw starterów do wykrywania wirusa brodawczaka ludzkiego typ 16 (HPV16 Human papillomavirus type 16), sposób wykrywania infekcji HPV16, zastosowanie zestawu starterów do wykrywania infekcji HPV16 |
| JP2022515551A JP2022547940A (ja) | 2019-09-09 | 2020-09-08 | １６型ヒトパピローマウイルス（ｈｐｖ１６）および１８型ヒトパピローマウイルス（ｈｐｖ１８）を検出するためのプライマーセット、ｈｐｖ１６およびｈｐｖ１８の感染を検出する方法、ｈｐｖ１６およびｈｐｖ１８の感染を検出するためのプライマーセットの使用 |
| EP20862091.4A EP4028560A4 (en) | 2019-09-09 | 2020-09-08 | Primerset for the detection of the human papilloma virus type 16 (HPV16) and the human papilloma virus type 18 (HPV18), procedure for detection of HPV16 and HPV18 infections, use of a primary set to detect HPV16 and HPV18 infections |
| US17/636,291 US20230002839A1 (en) | 2019-09-09 | 2020-09-08 | Primer sets for the detection of human papillomavirus type 16 (hpv16) and human papillomavirus type 18 (hpv18), the method of detecting hpv16 and hpv18 infections, the use of a primer set for the detection of hpv16 and hpv18 infections |
| PCT/PL2020/050064 WO2021049962A1 (en) | 2019-09-09 | 2020-09-08 | Primer sets for the detection of human papillomavirus type 16 (hpv16) and human papillomavirus type 18 (hpv18), the method of detecting hpv16 and hpv18 infections, the use of a primer set for the detection of hpv16 and hpv18 infections |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL431073A PL240016B1 (pl) | 2019-09-09 | 2019-09-09 | Zestaw starterów do wykrywania wirusa brodawczaka ludzkiego typ 16 (HPV16 Human papillomavirus type 16), sposób wykrywania infekcji HPV16, zastosowanie zestawu starterów do wykrywania infekcji HPV16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL431073A1 PL431073A1 (pl) | 2021-03-22 |
| PL240016B1 true PL240016B1 (pl) | 2022-02-07 |
Family
ID=74866347
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL431073A PL240016B1 (pl) | 2019-09-09 | 2019-09-09 | Zestaw starterów do wykrywania wirusa brodawczaka ludzkiego typ 16 (HPV16 Human papillomavirus type 16), sposób wykrywania infekcji HPV16, zastosowanie zestawu starterów do wykrywania infekcji HPV16 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230002839A1 (pl) |
| EP (1) | EP4028560A4 (pl) |
| JP (1) | JP2022547940A (pl) |
| PL (1) | PL240016B1 (pl) |
| WO (1) | WO2021049962A1 (pl) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114107560A (zh) * | 2021-11-03 | 2022-03-01 | 广州朗坤生物科技有限公司 | 检测16型和18型hpv的lamp引物组合、反应体系和方法 |
| CN116769975B (zh) * | 2023-08-15 | 2023-11-24 | 江苏美克医学技术有限公司 | Hpv检测引物组、试剂盒及其应用 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001526045A (ja) * | 1997-12-12 | 2001-12-18 | ダイジーン・コーポレーション | ヒトパピローマウイルス関連疾患の評価 |
| WO2016005789A1 (en) * | 2014-07-07 | 2016-01-14 | Institut Pasteur | Broad range gene and genotype papillomavirus transcriptome as a biomarker of papillomavirus- associated cancer stages |
| CN104805218B (zh) * | 2015-04-02 | 2017-06-06 | 赣南医学院第一附属医院 | 基于lamp和分子信标检测hpv16和18的反应体系和方法 |
| CN106148571A (zh) * | 2016-09-06 | 2016-11-23 | 清华大学 | 检测人乳头瘤病毒hpv16和hpv18的成套试剂 |
| CN106939359A (zh) * | 2017-05-17 | 2017-07-11 | 上海市第十人民医院 | 一种lamp法检测hpv常见亚型的引物组及检测体系 |
| CN107557492A (zh) * | 2017-09-14 | 2018-01-09 | 温州美众医学检验所 | Lamp检测用引物组合及其反应体系 |
| CN110093459A (zh) * | 2019-06-05 | 2019-08-06 | 中国人民解放军总医院第五医学中心 | 用于快速检测13种高危型hpv的lamp引物组合及应用 |
-
2019
- 2019-09-09 PL PL431073A patent/PL240016B1/pl unknown
-
2020
- 2020-09-08 JP JP2022515551A patent/JP2022547940A/ja active Pending
- 2020-09-08 EP EP20862091.4A patent/EP4028560A4/en active Pending
- 2020-09-08 US US17/636,291 patent/US20230002839A1/en active Pending
- 2020-09-08 WO PCT/PL2020/050064 patent/WO2021049962A1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021049962A1 (en) | 2021-03-18 |
| US20230002839A1 (en) | 2023-01-05 |
| EP4028560A1 (en) | 2022-07-20 |
| EP4028560A4 (en) | 2023-10-25 |
| JP2022547940A (ja) | 2022-11-16 |
| PL431073A1 (pl) | 2021-03-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2595031T5 (es) | Composiciones y métodos para la detección de aberraciones cromosómicas con tampones de hibridación novedosos | |
| JP2021508238A (ja) | ｓｓＤＮＡの切断及び標的ＤＮＡの検出ためのＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質 | |
| JP2002516667A (ja) | 修飾バックボーンを有するアンチセンスプローブと核酸の液中ハイブリッド形成 | |
| PT713921E (pt) | Metodos para extinguir numa solucao a fluorescencia de sondas oligonucleotidicasmarcadas com um fluoroforo | |
| DE102010049607A1 (de) | Konjugate von Nukleotiden und Methoden zu deren Anwendung | |
| PL240016B1 (pl) | Zestaw starterów do wykrywania wirusa brodawczaka ludzkiego typ 16 (HPV16 Human papillomavirus type 16), sposób wykrywania infekcji HPV16, zastosowanie zestawu starterów do wykrywania infekcji HPV16 | |
| US10161005B2 (en) | Method for detecting telomerase via washing-free anchored-extension and telomeric-binding amplification, and kit | |
| Renz et al. | Differentiation between pathogenic serotype 1 isolates of Marek's disease virus and the Rispens CVI988 vaccine in Australia using real-time PCR and high resolution melt curve analysis | |
| EP1220954B1 (en) | Nucleic acid primers and probes for detecting tumor cells | |
| KR20180132603A (ko) | 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트 및 이것을 사용한 클라미디아 트라코마티스 검출 방법, 그리고 그것을 위한 시약 키트 | |
| CN110453010B (zh) | 一种用于检测非洲猪瘟病毒asfv的lamp引物组、试剂和试剂盒 | |
| JP2017532030A (ja) | 診断方法及び組成物 | |
| ES2899826T3 (es) | Kit para detectar conjuntamente múltiples ácidos nucleicos diana que difieren entre sí y procedimiento de detección usando el mismo | |
| Timm Jr et al. | Amplification and detection of a Y‐chromosome DNA sequence by fluorescence in situ polymerase chain reaction and flow cytometry using cells in suspension | |
| KR20200031615A (ko) | 변이 유전자 검출 방법 | |
| KR20210073220A (ko) | 중증열성혈소판감소증후군 및 쯔쯔가무시증 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트 | |
| RU2481403C1 (ru) | Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления днк вируса инфекционной анемии цыплят с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| US20230125922A1 (en) | Primer sets for detection of mycoplasma pneumoniae bacteria, method for detection of mycoplasma pneumoaniae infection, use of a primer set for detection of mycoplasma pneumoniae infection | |
| AU2008206309A1 (en) | Human erythrovirus | |
| KR20210012553A (ko) | 표적 물질의 검출용 키트 및 이를 이용하여 표적 물질을 검출하는 방법 | |
| KR20150066859A (ko) | 에볼라 및 마버그 바이러스 검출용 프로브 및 프라이머 세트를 이용한 원 스텝 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 방법 | |
| PL237232B1 (pl) | Zestaw starterów do powielania sekwencji nukleotydowej Borrelia burgdorferi, sposób wykrywania Borrelia burgdorferi, sposób diagnostyki boreliozy i zestaw do diagnostyki boreliozy | |
| JP2023552797A (ja) | プライマーセット、試薬の組成物および非定型細菌を検出する方法 | |
| RU2782315C1 (ru) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas и препарат для выявления гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus в ультранизких концентрациях | |
| CN115287371B (zh) | 一种检测产黄青霉菌基因组dna的方法 |