ES2899826T3 - Kit para detectar conjuntamente múltiples ácidos nucleicos diana que difieren entre sí y procedimiento de detección usando el mismo - Google Patents

Kit para detectar conjuntamente múltiples ácidos nucleicos diana que difieren entre sí y procedimiento de detección usando el mismo Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para detectar conjuntamente múltiples ácidos nucleicos diana que difieren entre sí, incluyendo los múltiples ácidos nucleicos diana un primer ácido nucleico diana y un segundo ácido nucleico diana, usando el procedimiento: una solución que puede contener el primer ácido nucleico diana y el segundo ácido nucleico diana en la misma, a una temperatura de desnaturalización TO, escindiéndose un primer enlace de hidrógeno bicatenario del primer ácido nucleico diana que se va a disociar en las dos primeras hebras individuales, escindiéndose un segundo enlace de hidrógeno bicatenario del segundo ácido nucleico diana que se va a disociar en las dos segundas hebras individuales, respectivamente, la solución conteniendo además en la misma: un cebador de la primera diana a una temperatura de hibridación T1 que se enlaza específicamente con cualquiera de las dos primeras hebras individuales en las que se ha disociado el primer ácido nucleico diana; un cebador de la segunda diana a la temperatura de hibridación T1 que se enlaza específicamente con cualquiera de las dos segundas hebras individuales en las que se ha disociado el segundo ácido nucleico diana; una sonda de la primera diana a la temperatura de hibridación T1 que se enlaza específicamente con cualquiera de las dos primeras hebras individuales en las que se ha disociado el primer ácido nucleico diana, incluyendo la sonda de la primera diana una primera sustancia de marcado que cambia las primeras señales fluorescentes de la misma cuando la sonda de la primera diana se enlaza específicamente con cualquiera de las dos primeras hebras individuales; ADN polimerasa; desoxirribonucleósido trifosfato a una temperatura de alargamiento T2 que se enlaza por acción de la ADN polimerasa tanto con las dos primeras hebras individuales en las que se ha disociado el primer ácido nucleico diana como con las dos segundas hebras individuales en las que se ha disociado el segundo ácido nucleico diana; y una sonda de la segunda diana a la temperatura de hibridación T1 que no se enlaza con ninguna de las dos primeras hebras individuales en las que se ha disociado el primer ácido nucleico diana ni con las dos segundas hebras individuales en las que se ha disociado el segundo ácido nucleico diana, enlazándose la sonda de la segunda diana a una temperatura de detección de la segunda diana T3 con las dos segundas hebras individuales en las que se ha disociado el segundo ácido nucleico diana, incluyendo la sonda de la segunda diana una segunda sustancia de marcado que cambia las segundas señales fluorescentes de la misma cuando la sonda de la segunda diana se enlaza específicamente con cualquiera de las dos segundas hebras individuales, en el que T0 se define como la temperatura de desnaturalización; T1 se define como la temperatura de hibridación; T2 se define como la temperatura de alargamiento; T3 se define como la temperatura de detección de la segunda diana, y se establece de T0 a T3 de modo que una condición de que: T0>T2>=T1>T3 se satisface; y la primera sustancia de marcado y la segunda sustancia de marcado son idénticas; en el que se capta una diferencia provocada por los cambios de las primera y segunda señales fluorescentes de acuerdo con la segunda sustancia de marcado para evaluar la existencia o inexistencia del segundo ácido nucleico diana.

Description

DESCRIPCIÓN
Kit para detectar conjuntamente múltiples ácidos nucleicos diana que difieren entre sí y procedimiento de detección usando el mismo
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento de detección para mejorar el procedimiento de PCR y además para medir múltiples ácidos nucleicos diana, y la técnica relacionada con el mismo.
2. Descripción de la técnica relacionada
En el cribado genético, es necesario medir múltiples ácidos nucleicos diana en muchos casos.
Por ejemplo, los múltiples ácidos nucleicos diana pueden ser: un primer par de virus de la gripe A y virus de la gripe B; un segundo par de gripe y VSR/metaneumovirus humano; un tercer par de Chlamydia trachomatis y Nisseria gonorrhoeae, que puede provocar enfermedades de transmisión sexual; un cuarto par de Mycoplasma pneumoniae y plásmido de resistencia del mismo; y así sucesivamente.
Con respecto a los múltiples ácidos nucleicos diana en algunos pares de los anteriores, las afecciones de los pacientes son similares entre sí y también la infección de los mismos se expande simultáneamente. Así que es concebible distinguir los múltiples ácidos nucleicos diana entre sí para hacer un diagnóstico, decidiendo, de este modo, una tanda del tratamiento.
La consideración del plásmido de resistencia es eficaz para seleccionar/evaluar el medicamento frente al mismo, o similares.
En cuanto a un solo elemento de medición, también es útil establecer la composición de control interno como medio para confirmar si la propia medición se ha realizado bien o no.
Esto se realiza: preparando de antemano una secuencia de ácido nucleico que se va a amplificar, sin que la secuencia se refiera a un gen diana de un objeto de detección; y posibilitar confirmar si la reacción se ha procesado bien o no a pesar de la existencia o no existencia del gen nucleico diana.
De esta manera, se puede verificar dentro del sistema de medición si el reactivo y el dispositivo para la medición han actuado eficazmente o no.
Como se menciona anteriormente, para detectar los múltiples ácidos nucleicos diana, se pueden concebir un primer procedimiento para realizar una medición independiente para cada uno de los múltiples ácidos nucleicos diana, respectivamente, y un segundo procedimiento para distinguir los múltiples ácidos nucleicos diana entre sí por medio de diferentes tintes piloto o similares, respectivamente.
De forma alternativa, también es posible llevar a cabo el procedimiento de análisis de la curva de fusión después de haber procesado simultáneamente la reacción de amplificación. En este procedimiento, después de la reacción de amplificación, la temperatura se incrementa/disminuye gradualmente para hacer una distinción y evaluación con respecto a los múltiples ácidos nucleicos diana en base tanto a la primera temperatura en la que una tasa de cambio de señales fluorescentes muestra un máximo como a una segunda temperatura en la que el ácido nucleico diana se funde (el procedimiento de análisis de la curva de fusión).
El primer procedimiento para realizar la medición independiente requiere mucho tiempo y altos costes. El segundo procedimiento para distinguir diferentes sustancias de marcado entre sí es demasiado costoso porque el segundo procedimiento necesita no solo preparar varios tipos de reactivos marcados, sino también un complicado ajuste de la longitud de onda en un analizador.
Un caso por medio del procedimiento de análisis de la curva de fusión es menos costoso que el anterior. Sin embargo, puesto que la temperatura se debe cambiar gradualmente, es necesario tomar aproximadamente de 5 a 10 minutos para cambiar la temperatura para llevar a cabo un análisis preciso.
La referencia 1 (solicitud japonesa abierta n.° 2002-136300) divulga: preparar una pluralidad de recipientes de reacción que contienen diferentes soluciones de reacción entre sí; y realizar la amplificación y detección con la pluralidad de recipientes de reacción, respectivamente.
Así que las operaciones de preparación y distribución de reactivos se deben llevar a cabo para cada elemento de la pluralidad de recipientes de reacción. Existe un problema de que requiere mucho tiempo.
La referencia 2 (solicitud japonesa abierta n.° 2004-203) divulga la amplificación simultánea de múltiples genes por medio de un recipiente de reacción que contiene un tipo de solución de reacción.
La distinción se lleva a cabo usando diferentes tintes piloto para cada uno de los múltiples genes. Así que se necesita una pluralidad de sistemas ópticos instalados en un analizador, tantos como los tintes piloto usados. En otras palabras, el analizador es demasiado costoso. Este es un problema grave.
La referencia 3 (solicitud japonesa abierta n.° 2008-173127) divulga la amplificación simultánea de múltiples genes por medio de un recipiente de reacción que contiene un tipo de solución de reacción.
La temperatura de disociación de los productos de PCR y las sondas marcadas se deben cambiar para cada gen. Después de la amplificación, mientras que la temperatura se incrementa gradualmente desde un lado de temperatura menor a un lado de temperatura mayor, se lleva a cabo el análisis de la curva de disociación, que es sinónimo de "análisis de la curva de fusión", para vigilar los valores de fluorescencia. La distinción se lleva a cabo vigilando la existencia o inexistencia de un máximo dependiendo de la secuencia de base a la temperatura de disociación respectiva.
Si la temperatura se cambia rápidamente tras el análisis de la curva de fusión, resulta difícil identificar la temperatura de fusión para cada gen. En consecuencia, existe un problema de que se requiere un tiempo adicional de aproximadamente de 5 a 10 minutos después de la PCR.
La referencia 4 (publicación de solicitud de patente japonesa no examinada <traducción de la solicitud de PCT> n.° 2012-513215) divulga la amplificación simultánea de múltiples genes por medio de un recipiente de reacción.
La temperatura de disociación de los productos de PCR y la temperatura de fusión de los cebadores se cambian para cada gen. La distinción se lleva a cabo vigilando la fluorescencia a la temperatura de fusión respectiva.
En un perfil de PCR común, un ciclo incluye: una etapa de desnaturalización; y una etapa de hibridación y alargamiento. En la referencia 4, se cambia la temperatura de fusión de los productos de PCR para cada gen. En consecuencia, se deben tener en cuenta demasiadas condiciones, el diseño del perfil también es difícil y el tiempo para la medición debe ser demasiado largo.
Además, existe otro problema de que la temperatura se debe cambiar drásticamente para que funcione el dispositivo.
La referencia 6 (solicitud de patente europea publicada n.° EP 2787077 A1) divulga un procedimiento y un kit para detectar un ácido nucleico diana, en los que un cebador/sonda marcado con fluoróforo y una sonda marcada con un extintor que tienen complementariedad entre sí, tienen diferentes temperaturas de fusión (Tf) de modo que el cebador marcado con fluoróforo se puede hibridar preferentemente con el ácido nucleico diana, y el cebador marcado con fluoróforo que no está unido al ácido nucleico diana se une a una sonda de extinción para no emitir fluorescencia. En la referencia 6, se deben realizar una pluralidad de detecciones para diferentes marcadores en diferentes longitudes de onda.
La referencia 7 (solicitud de patente europea publicada n.° EP 2116614 A1) divulga un procedimiento para amplificar y detectar simultáneamente secuencias de ácido nucleico en una reacción que comprende proporcionar una muestra que comprende al menos una molécula de ácido nucleico, proporcionando reactivos para realizar una reacción de amplificación, en el que los reactivos comprenden al menos tres conjuntos de sondas, en los que (a) cada conjunto de sondas consiste en al menos tres sondas, (b) cada una de las sondas es específica para una secuencia de ácido nucleico, (c) cada una de las sondas en un conjunto de sondas dado lleva un marcador diferente, (d) todas las sondas en un conjunto de sondas dado tienen una temperatura de fusión (Tf) similar, preferentemente idéntica cuando se disocian de su secuencia de ácido nucleico diana por calentamiento, amplificar las secuencias de ácido nucleico en la reacción, detectar los ácidos nucleicos amplificados determinando si la sonda marcada se ha unido a su secuencia de ácido nucleico, y detectar la temperatura a la que cada sonda marcada dada se disocia de la secuencia de ácido nucleico a la que se ha unido.
[Lista de referencias citadas]
Referencia 1: solicitud japonesa abierta n.° 2002-136300;
Referencia 2: solicitud japonesa abierta n.° 2004-203;
Referencia 3: solicitud japonesa abierta n.° 2008-173127;
Referencia 4: publicación de solicitud de patente japonesa no examinada (traducción de la solicitud de PCT) n.° 2012-513215;
Referencia 5: patente japonesa registrada n.° 4724380;
Referencia 6: solicitud de patente europea publicada n.° EP 2787077 A1; y
Referencia 7: solicitud de patente europea publicada n.° EP 2116614 A1.
OBJETIVOS Y SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En vista de lo anterior, un objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para detectar múltiples ácidos nucleicos diana que puede amplificar y detectar simultáneamente múltiples genes por medio de un recipiente de reacción que contiene un tipo de solución de reacción y un marcador.
Un primer aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para detectar conjuntamente múltiples ácidos nucleicos diana que se diferencian entre sí, incluyendo los múltiples ácidos nucleicos diana un primer ácido nucleico diana y un segundo ácido nucleico diana, usando el procedimiento una solución que puede contener el primer ácido nucleico diana y el segundo ácido nucleico diana en la misma, a una temperatura de desnaturalización TO, escindiéndose el primer enlace de hidrógeno bicatenario del primer ácido nucleico diana que se va a disociar en las dos primeras hebras individuales, escindiéndose el segundo enlace de hidrógeno bicatenario del segundo ácido nucleico diana que se va a disociar en las dos segundas hebras individuales, respectivamente, la solución conteniendo además en la misma: un cebador de la primera diana a una temperatura de hibridación T1 que se enlaza específicamente con cualquiera de las dos primeras hebras individuales en las que se ha disociado el primer ácido nucleico diana; un cebador de la segunda diana a la temperatura de hibridación T1 que se enlaza específicamente con cualquiera de las dos segundas hebras individuales en las que se ha disociado el segundo ácido nucleico diana; una sonda de la primera diana a la temperatura de hibridación T1 que se enlaza específicamente con cualquiera de las dos primeras hebras individuales en las que se ha disociado el primer ácido nucleico diana, incluyendo la sonda de la primera diana una primera sustancia de marcado que cambia las primeras señales fluorescentes de la misma cuando la sonda de la primera diana se enlaza específicamente con cualquiera de las dos primeras hebras individuales; ADN polimerasa; desoxirribonucleósido trifosfato a una temperatura de alargamiento T2 que se enlaza por acción de la ADN polimerasa con ambas de las dos primeras hebras individuales en las que se ha disociado el primer ácido nucleico diana y con las dos segundas hebras individuales en las que se ha disociado el segundo ácido nucleico diana; y una sonda de la segunda diana a la temperatura de hibridación T1 que no se enlaza con ninguna de las dos primeras hebras individuales en las que se ha disociado el primer ácido nucleico diana ni con las dos segundas hebras individuales en las que se ha disociado el segundo ácido nucleico diana, enlazándose la sonda de la segunda diana a una temperatura de detección de la segunda diana T3 con las dos segundas hebras individuales en las que se ha disociado el segundo ácido nucleico diana, incluyendo la sonda de la segunda diana una segunda sustancia de marcado que cambia las segundas señales fluorescentes de la misma cuando la sonda de la segunda diana se enlaza específicamente con cualquiera de las dos segundas hebras individuales, en el que T0 se define como la temperatura de desnaturalización; T1 se define como la temperatura de hibridación; T2 se define como la temperatura de alargamiento; T3 se define como la temperatura de detección de la segunda diana, estableciéndose de T0 a T3 de modo que una condición de que: T0>T2>T1>T3 se satisface, y la primera sustancia de marcado y la segunda sustancia de marcado son idénticas, en el que se capta una diferencia provocada por cambios de la primera y segunda señales fluorescentes de acuerdo con la segunda sustancia de marcado para evaluar la existencia o inexistencia del segundo ácido nucleico diana.
La primera sustancia de marcado y la segunda sustancia de marcado se pueden seleccionar de un grupo que consiste en: una sonda QProbe (marca registrada); una sonda Eprobe (marca registrada); y una sonda TaqMan (marca registrada).
Las señales fluorescentes se pueden mostrar al extinguir luz cuando se produce la hibridación. De forma alternativa, las señales fluorescentes se pueden mostrar al emitir luz cuando se produce la hibridación.
Es preferente que el primer ácido nucleico diana sea al menos uno de un gen P1 de Mycoplasma pneumoniae y un gen de plásmido endógeno de Chlamydia trachomatis, y el segundo ácido nucleico diana es al menos uno de la composición de control interno y un gen de CMT de Nisseria gonorrhoeae, respectivamente.
Efecto de la invención
Como se menciona anteriormente, de acuerdo con la presente invención, se pueden detectar múltiples ácidos nucleicos diana por medio de un tipo de solución mixta y un tipo de sustancias de marcado.
La distinción de los múltiples ácidos nucleicos diana se puede llevar a cabo sin análisis de la curva de fusión. En consecuencia, el tiempo de medición se puede acortar extraordinariamente, proporcionando, de este modo, un excelente rendimiento práctico.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LOS MODOS DE REALIZACIÓN PREFERENTES
Los autores de la presente invención han desarrollado un procedimiento para detectar ácidos nucleicos por medio de un tipo de marcadores fluorescentes y un recipiente de reacción que contiene un tipo de solución de reacción. El ajuste de condiciones con respecto a la temperatura de hibridación de las sondas y los perfiles de cambio de temperatura en el procedimiento de PCR se han incorporado en el presente kit.
Como se muestra en la fig. 35, el presente kit usa cuatro tipos de temperatura que incluyen: temperatura de desnaturalización T0 (95 grados centígrados); temperatura de hibridación T1 (70 grados centígrados); temperatura de alargamiento T2 (72 grados centígrados); y temperatura de detección de la segunda diana T3 (55 grados centígrados).
Los cuatro tipos de temperatura se configuran de modo que se satisface una condición de que T0 > T2 > = T1 > T3.
Por supuesto, los valores de temperatura anteriores son simples ejemplos y se pueden cambiarse de diversas formas como se menciona más adelante.
En el presente documento, los múltiples ácidos nucleicos diana son un primer ácido nucleico diana y un segundo ácido nucleico diana. Sin embargo, si es necesario, se puede añadir un tercer ácido nucleico diana o más a los mismos añadiendo otro ajuste tal como la temperatura de detección de la tercera diana T4 (T3 > T4) o similares.
En referencia ahora a la fig. 36, se explicarán ahora los elementos del presente kit.
En primer lugar, en el presente kit, se supone que un primer ácido nucleico diana 10 y un segundo ácido nucleico diana 20 son dianas que se van a detectar.
A continuación, en el presente documento, para simplificar la explicación, solo se explicará a continuación un caso donde tanto el primer ácido nucleico diana 10 como el segundo ácido nucleico diana 20 están contenidos en la solución 2 dentro de un recipiente 1, es decir, un caso de positivo y positivo. Los detalles de la solución 2 se mencionarán más adelante.
Huelga decir que en otro caso donde al menos una diana sea negativa, la solución 2 no contiene el al menos uno del primer ácido nucleico diana 10 y el segundo ácido nucleico diana 20. Por lo tanto, las señales fluorescentes y la amplificación con respecto al ácido nucleico diana no contenido no se llevarán a cabo en la siguiente explicación.
Como se muestra en la fig. 37 (a), cuando se incrementa la temperatura de la solución 2 para alcanzar la temperatura de desnaturalización TO, los enlaces de hidrógeno de las dobles hebras del primer ácido nucleico diana 10 y el segundo ácido nucleico diana 20 se escinden respectivamente para disociarse en las respectivas dos primera y segunda hebras individuales (del primer ácido nucleico diana 10 a una primera hebra individual 11 y una segunda hebra individual 12, del segundo ácido nucleico diana 20 a una primera hebra individual 21 y una segunda hebra individual 22).
Como se muestra en la fig. 37 (b), la temperatura disminuye desde la temperatura de desnaturalización T0 para alcanzar la temperatura de hibridación T1, con respecto al primer ácido nucleico diana 10, un cebador F de la primera diana 13 se enlaza específicamente con una secuencia complementaria de la primera la hebra individual 11, y un cebador R de la primera diana 14 se enlaza específicamente con otra secuencia complementaria de la segunda hebra individual 12, respectivamente.
Además, de manera similar a lo anterior, con respecto al segundo ácido nucleico diana 20, un cebador F de la segunda diana 23 se enlaza específicamente con una secuencia complementaria de la primera hebra individual 21, y un cebador R de la segunda diana 24 se enlaza específicamente con otra secuencia complementaria de la segunda hebra individual 22, respectivamente.
A la temperatura de hibridación mostrada en la fig. 37 (b), la sonda de la primera diana 15 marcada por medio de la primera sustancia de marcado 16 se enlaza específicamente con una parte específica de la primera hebra individual 11 derivada del primer ácido nucleico diana 10, de este modo, la primera sustancia de marcado 16 emite las primeras señales de fluorescencia.
Por otra parte, la temperatura de hibridación es mayor que la temperatura de detección de la segunda diana T3. Por este motivo, la sonda de la segunda diana 25 marcada por medio de la segunda sustancia de marcado 26 no se enlaza con la primera hebra individual 21 derivada del segundo ácido nucleico diana 20, de este modo, la segunda sustancia de marcado 26 no emite ninguna señal de fluorescencia en este momento.
Como se muestra en la fig. 37 (c), cuando se incrementa la temperatura desde la temperatura de hibridación hasta la temperatura de alargamiento T2, la reacción de amplificación avanza como sigue. Esto se debe a que la solución 2 contiene una cantidad suficiente para repetir los ciclos de PCR de la ADN polimerasa 30 y el desoxirribonucleósido trifosfato 31.
Con respecto al primer ácido nucleico diana 10, desde el cebador F de la primera diana 13 que se enlaza con la primera hebra individual 11, y desde el cebador R de la primera diana 14 que se enlaza con la segunda hebra individual 12, el desoxirribonucleósido trifosfato 31 se enlaza con los mismos para alargarlos, respectivamente.
Con respecto al segundo ácido nucleico diana 20, desde el cebador F de la segunda diana 23 que se enlaza con la primera hebra individual 21, y desde el cebador R de la segunda diana 24 que se enlaza con la segunda hebra individual 22, el desoxirribonucleósido trifosfato 31 se enlaza con los mismos para alargarlos, respectivamente.
Como es evidente al comparar la fig. 37 (d) con la fig. 36, una vez que se ha completado la reacción de amplificación, tanto el primer ácido nucleico diana 10 como el segundo ácido nucleico diana 20 se han duplicado.
Volver a una etapa mostrada en la fig. 37 (a) de nuevo para repetir las etapas anteriores de la fig. 37 (a) a la fig. 37 (d) posibilita repetir la reacción de amplificación y cambia las señales fluorescentes por medio de la primera sustancia de marcado 16.
Seguidamente, en referencia ahora a la fig. 38, se explicará ahora un caso donde la temperatura disminuye desde la temperatura de desnaturalización T0 hasta la temperatura de detección de la segunda diana T3.
Como se muestra en la fig. 38 (a), a la temperatura de desnaturalización T0, la situación es la misma que la de la fig.
37 (a).
Sin embargo, una vez que la temperatura disminuye para alcanzar la temperatura de detección de la temperatura de la segunda diana T3, la situación es como se muestra en la fig. 38 (b) y difiere de la fig. 37 (b).
A saber, como se muestra en la fig. 38 (b), la sonda de la primera diana 15 marcada por la primera sustancia de marcado 16 se enlaza específicamente con una parte específica de la primera hebra individual 11 derivada del primer ácido nucleico diana 10, y las primeras señales fluorescentes de la primera sustancia de marcado 16 cambian. Esta es la misma que la de la fig. 37 (b).
Sin embargo, la temperatura es la temperatura de detección de la segunda diana T3. En consecuencia, también la sonda de la segunda diana 25 marcada por la segunda sustancia de marcado 26 se enlaza con la primera hebra individual 21 derivada del segundo ácido nucleico diana 20, y las segundas señales fluorescentes de la segunda sustancia de marcado 26 también cambian.
En el presente documento, la primera sustancia de marcado 16 y la segunda sustancia de marcado 26 son idénticas. Como resultado, captar la diferencia provocada por los cambios de las primera y segunda señales fluorescentes de acuerdo con la segunda sustancia de marcado 26 posibilita evaluar la existencia o inexistencia (positividad/negatividad) del segundo ácido nucleico diana 20.
Además, como es evidente de lo mencionado anteriormente, se puede entender que los múltiples ácidos nucleicos diana se pueden detectar respectivamente durante una serie de etapas continuas por medio del recipiente de reacción que contiene un tipo de solución de reacción.
A continuación, en el presente documento, se explicarán ahora más concretamente los modos de realización de detección de múltiples ácidos nucleicos por medio de tres tipos de sondas. En los modos de realización, se han usado el procedimiento de QProbe (marca registrada), el procedimiento de Eprobe (marca registrada) y el procedimiento de TaqMan (marca registrada).
Incluyendo la información necesaria para el funcionamiento: también se mostrarán las secuencias de cebadores; las secuencias de base de las respectivas sondas; y el material de las muestras de ácido nucleico.
(Modo de realización 1)
<Detección de los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae y de la composición de control interno de acuerdo con el procedimiento de QProbe>
La detección de los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae y de la composición de control interno se ha realizado de acuerdo con el procedimiento de QProbe.
(Cebador)
En la tabla 1 se muestran un par de cebadores usados para el procedimiento de PCR en el modo de realización 1.
(Tabla 1)
Cebadores usados para PCR en este modo de realización
Denominación Secuencia (5 '^3 ') Longitud (pb)
del cebador
MYC F GCCACCCTCGGGGGCAGTCAG (SEQ ID No. 1) 21
MYC R GAGTCGGGATTCCCCGCGGAGG (SEQ ID No. 2) 22
Como secuencia n.° 1 y secuencia n.° 2, se han usado las secuencias (par de cebadores para el gen de adhesina P1) enumeradas en el informe (The Journal Of Infectious Diseases, 1996; 173; 1445-52) de leven et al.
(Muestra de ácido nucleico)
Las muestras de ácido nucleico usadas para el procedimiento de PCR en el modo de realización 1 se muestran a continuación.
(pMYC)
Mycoplasma pneumoniae es un organismo patógeno de Mycoplasma pneumoniae. La proteína P1 es una proteína de membrana derivada de Mycoplasma pneumoniae. Los fragmentos de genes (secuencias amplificadas por un par de cebadores de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) codifican la proteína P1. pMYC es un ADN plasmídico producido por síntesis artificial de los fragmentos de genes que se van a incorporar en un vector pMD20T. La producción del ADN plasmídico se ha realizado solicitando una síntesis personalizada a Takara Bio Inc.
(pICM5)
Para poder amplificar el plásmido pICM5 por medio de cebadores comunes del par de cebadores de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, pICM5 es un ADN plasmídico producido por síntesis artificial de una secuencia que incluye una secuencia complementaria al par de los cebadores que se van a incorporar en un vector pMD20T. La producción del ADN plasmídico se ha realizado solicitando una síntesis personalizada a Takara Bio Inc.
(Preparación de muestra de ácido nucleico)
La primera longitud del plásmido pMYC es de 2942 [pb] y la segunda longitud del plásmido pICM5 es de 2886 [pb].
En base a la primera y segunda longitud y la concentración [pg/pl] de solución de plásmido, se ha calculado el número de copias por 1 [pl]. Después de eso, por medio de solución de tampón TE (Tris-HCl 10 [mM], EDTA 1,0 [mM] pH: 8,0), se ha diluido el plásmido pMYC para dar 1*105 [copias/pl], y se ha diluido el plásmido pICM5 para dar 1*103 [copias/pl], respectivamente.
(sonda)
En la tabla 2 se muestra la información de la sonda usada para el procedimiento de PCR en el modo de realización 1.
(Tabla 2)
Sondas usadas para PCR en este modo de realización
Denominación de Secuencia (5 '^3 ') Longitud (pb) la sonda
MYC QP CCCTCGACCAAGCCAACCTCCAGCTC (SEQ ID No. 3) 26
IC QP AGTGGGACTCACCAACC (SEQ ID No. 4) 17
En base a una secuencia básica de productos de PCR que se pueden amplificar por medio del par de cebadores de la tabla 1, se ha seleccionado una región específica para SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 que se refiere a los valores de Tf calculados con una herramienta de soporte de diseño de sonda QProbe en las páginas de inicio del Centro J-Bio21.
"MYC QP" es una sonda QProbe que hibrida específicamente el plásmido pMYC, e "IC QP" es otra sonda QProbe que hibrida específicamente el plásmido pICM5. Como tinte fluorescente tanto para "MYC QP" como para "IC QP", se ha usado "BODIPY FL" (marca registrada) para marcar "C" en los extremos 3', respectivamente. La producción de sondas QProbe se ha realizado solicitando una síntesis personalizada a NIPPON STEEL & SUMIKIN Eco-Tech Corporation.
(Condiciones de PCR y medición de fluorescencia)
En el modo de realización 1, entre dos tipos de ácidos nucleicos diana que se van a amplificar dentro de un recipiente que contiene un tipo de líquido de reacción, se establece un primer valor de Tf para "MYC QP" que es la sonda QProbe que hibrida específicamente el plásmido pMYC de la primera diana para que sea mayor que otro valor de Tf para que los cebadores realicen la primera detección durante la reacción de amplificación.
Además, se establece un segundo valor de Tf para "IC QP" que es la sonda QProbe que hibrida específicamente el plásmido pICM5 de la segunda diana para que sea menor que los cambios (de 70 grados centígrados a 95 grados centígrados) de temperatura durante la reacción de amplificación para realizar la segunda detección después de la reacción de amplificación.
La tabla 3 y la tabla 4 muestran la composición de la solución de reacción de PCR y las condiciones de reacción, respectivamente, y la fig. 1 muestra un gráfico de los cambios de temperatura de la solución mixta.
(Tabla 3)
Composición de la solución de PCR en el procedimiento de QProbe
Composición de la solución Concentración final
Agua MilliQ (TM) -Tampón de PCR x 1
Mezcla de dNTP 150 pM
MYC F 0,20 pM
MYC R 0,60 pM
MYC QP 0,15 pM
IC QP 0,15 pM
KOD exo (-) ADN polimerasa 0,0125 U/pl
Ácido nucleico diana -
Las anteriores se han preparado para dar 20 pl
(Tabla 4)
Condiciones de reacción en el procedimiento de QProbe
Etapas de reacción Temperatura (°C) Tiempo (s)
Desnaturalización inicial 95 T0 120
Amplificación (1-44 ciclos) 95 T0 10 (medición de FL)
70 T1 10
72 T 2 10 (medición de FL)
Detección del segundo AN diana 95 T0 10 (medición de FL)
55 T 3 10 (medición de FL)
Para la PCR y la medición de fluorescencia se ha usado el "sistema nano de LightCycler" (marca registrada de Roche Diagnostics K.K.).
Se ha seleccionado la combinación de 510 a 528 [nm] para la longitud de onda de excitación y la longitud de onda fluorescente tras la medición de fluorescencia. Se han medido los valores de fluorescencia en la etapa de desnaturalización (95 grados centígrados) y la etapa de alargamiento (72 grados centígrados) para cada ciclo. Además, después de que se ha completado la reacción de amplificación, en una etapa para detectar la segunda diana (95 grados centígrados y 55 grados centígrados), se ha realizado la medición de fluorescencia.
La fig. 2 muestra las condiciones de medición fluorescente en el ciclo final de la reacción de amplificación y en la etapa de detección de la segunda diana.
(Cómo procesar los datos)
El programa informático de análisis proporcionado con el sistema nano de LightCycler no admite un procedimiento de análisis de uso de las sondas QProbe. En consecuencia, el cálculo de corrección se ha realizado sobre los datos brutos obtenidos como sigue, en referencia a un procedimiento divulgado en la referencia 5 (patente japonesa registrada n.° 4724380).
Para cada ciclo de la reacción de amplificación y la etapa de detección de la segunda diana, el cálculo se ha llevado a cabo de acuerdo con las siguientes fórmulas.
Figure imgf000009_0001
en el presente documento,
fn: valor de intensidad de fluorescencia en n ciclos calculado de acuerdo con la fórmula 1;
fhib.n: valor de intensidad de fluorescencia en la etapa de alargamiento en el ciclo enésimo;
fdes.n: valor de intensidad de fluorescencia en la etapa de desnaturalización en el ciclo enésimo;
fe: valor de intensidad de fluorescencia en la etapa de detección de la segunda diana calculado de acuerdo con la fórmula 1';
fhib.e: valor de intensidad de fluorescencia (55 grados centígrados) en la etapa de detección de la segunda diana; y fdes.e: valor de intensidad de fluorescencia (95 grados centígrados) en la etapa de detección de la segunda diana.
Seguidamente, para cada ciclo de la reacción de amplificación y la etapa de detección de la segunda diana, el cálculo se ha llevado a cabo de acuerdo con las siguientes fórmulas.
Fn = fn / f10 (Fórmula 2)
Fe = fe /f10 (Fórmula 2 ’)
en el presente documento,
Fn: valor relativo en el enésimo ciclo suponiendo que el valor de intensidad de fluorescencia en el décimo ciclo obtenido de acuerdo con la fórmula 1 es igual a un valor de "1"; y
Fe: valor relativo en la etapa de detección de la segunda diana suponiendo que el valor de intensidad de fluorescencia en el décimo ciclo obtenido de acuerdo con la fórmula 1' es igual a un valor de "1".
F44, que es un valor de Fn en el ciclo final de la reacción de amplificación, se ha usado para evaluar la existencia o inexistencia del primer ácido nucleico diana.
Se ha llevado a cabo un cálculo adicional de acuerdo con la siguiente fórmula.
F s = F e - F 44 (Fórmula 3)
en el presente documento,
Fs: valor medido con respecto a la segunda diana.
El valor de Fs se ha usado para la determinación de la existencia o inexistencia del segundo ácido nucleico diana.
La determinación de acuerdo con el procedimiento de QProbe se ha realizado usando el procedimiento mostrado a continuación.
El valor de F44 de la muestra de medición se ha comparado con el umbral 1. Y, cuando el valor de F44 de la muestra de medición es menor que el umbral 1, se ha determinado que el primer ácido nucleico diana es positivo (existencia), de otro modo, negativo (inexistencia).
Como umbral 1, se ha usado un promedio de valores de F44 de la referencia negativa (tampón TE de reactivo añadido a la misma en lugar de ADN) menos tres veces la desviación estándar (a continuación, en el presente documento, llamada "media - 3DE").
A pesar de que el primer ácido nucleico diana es positivo o negativo, el valor de Fs se ha comparado con el umbral 2, y cuando el valor de Fs es menor que el umbral 2 se ha determinado que el segundo ácido nucleico diana es positivo (existencia), de otro modo, negativo (inexistencia).
Como umbral 2, se ha usado el valor de "media - 3DE" de una muestra a la que sólo se le añade el plásmido pMYC. La fig. 3 muestra un diagrama de flujo del procedimiento de determinación relacionado con el mismo.
Como muestras de ácido nucleico, se ha usado el plásmido pMYC para los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae, se ha usado el plásmido pICM5 para la composición de control interno y se ha realizado la PCR en las mismas.
Se ha establecido un primer valor de Tf de 72,5 grados centígrados para una secuencia de MYC QP, y se ha establecido un segundo valor de Tf de 57,5 grados centígrados para una secuencia de IC QP. Por este motivo, se ha estimado que las sondas hibridan solo MYC QP durante el intervalo de temperatura (de 70 grados centígrados a 95 grados centígrados) en la PCR.
Puesto que la medición de fluorescencia con respecto a la etapa de detección de la segunda diana se ha llevado a cabo a 95 grados centígrados y 55 grados centígrados, que es menor que el valor de Tf de IC QP, se ha estimado que la extinción tanto de MYC QP como de IC QP se ha detectado simultáneamente de acuerdo con los valores medidos en la etapa de detección de la segunda diana.
Con respecto a una curva de amplificación de la referencia negativa, no se ha observado extinción hasta 44 ciclos cuando finaliza la PCR. Esto se debe a que un valor de 0,998 de F44 no es menor que un valor de 0,997 del umbral 1. En este momento, la "media - 3DE" es igual a 0,997 que se va a considerar el umbral 1 para la detección de la primera diana en el modo de realización 1, mostrándose de este modo en la tabla 5. La curva de amplificación relacionada con la misma también se muestra en la fig. 4.
Con respecto a otra curva de amplificación del plásmido pMYC del primer ácido nucleico diana, se ha observado una extinción provocada por la hibridación de MYC QP desde aproximadamente 28 ciclos.
Se ha revelado que un valor de 0,913 de F44 ha sido menor que el umbral 1 y, además, que se ha amplificado una primera región objetivo del plásmido pMYC. En este momento, la "media - 3DE" de Fs ha sido igual a -0,056 que se va a considerar el umbral 2 para la detección de la segunda diana, mostrándose de este modo en la tabla 5. La curva de amplificación relacionada con la misma también se muestra en la fig. 5.
Con respecto a una curva de amplificación del plásmido pICM5 del segundo ácido nucleico diana, no se ha observado extinción durante la reacción de amplificación. Esto se debe a que un valor de 0,997 de F44 no es menor que un valor de 0,997 del umbral 1. Un valor de -0,118 de Fs ha sido menor que el umbral 2.
Los resultados mencionados anteriormente han revelado que la región objetivo del plásmido pMYC no se ha amplificado, además, que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pICM5.
La tabla 5 muestra el valor de Fs. La curva de amplificación se muestra en la fig.6.
(Tabla 5)
Valores usados para la determinación en el procedimiento de QProbe
TE pMYC pICM5 pMYC pICM5
F44 0,998 0,913 0,997 0,912
F44 (promedio - 3DE) 0,997 * 1 - - -Fe 0,971 0,862 0,879 0,796
Fs - 0,027 -0,051 -0,118 -0,116
Fs (promedio - 3DE) - -0,056 * 2 - -^ 1 umbral 1 ^ 2 umbral 2
Con respecto a una curva de amplificación una vez que se han añadido tanto el plásmido pMYC del primer ácido nucleico diana como el plásmido pICM5 del segundo ácido nucleico diana a la solución, se ha observado una extinción provocada por hibridación de MYC QP desde aproximadamente 28 ciclos al igual que para la curva de amplificación mencionada anteriormente del plásmido pMYC. Un valor de 0,912 de F44 ha sido menor que el umbral 1 y se ha revelado que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pMYC.
El valor de -0,116 de Fs es menor que el umbral 2 y se ha revelado que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pICM5. La tabla 5 muestra el valor de Fs. La curva de amplificación relacionada con la misma se muestra en la fig. 7.
Después de que se ha completado la PCR, se ha realizado una electroforesis en agarosa en estos productos de PCR. Los productos de PCR del primer objetivo con respecto a la muestra con plásmido pMYC añadido se han confirmado en cerca de 206 [pb], y los productos de PCR del segundo objetivo con respecto a la muestra con plásmido pICM5 añadido se han confirmado en cerca de 150 [pb].
De acuerdo con los resultados mencionados anteriormente, se ha revelado que los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae y la composición de control interno se pueden detectar por medio de un recipiente de reacción que contiene un tipo de solución de reacción y un tipo de marcadores fluorescentes cuando el procedimiento de diseño de sondas y perfiles de temperatura se incorporan con el procedimiento de QProbe.
(Modo de realización 2)
<Detección de los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae y de la composición de control interno en base al procedimiento de QProbe mientras cambia el perfil en la segunda etapa de detección>
De acuerdo con un procedimiento para cambiar los perfiles en la segunda etapa de detección en el modo de realización 1, se han detectado los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae y la composición de control interno en base al procedimiento de QProbe.
Los cebadores, las sondas, la composición de la solución de reacción y los ácidos nucleicos se han usado para el procedimiento de PCR al igual que en el modo de realización 1. La tabla 6 muestra las condiciones de reacción en el modo de realización 2.
(Tabla 6)
Se cambian las condiciones de reacción después del perfil en la etapa de detección del segundo
AN diana
Etapas de reacción Temperatura (°C) Tiempo (s) Desnaturalización inicial 95 T0 120
Amplificación (1-44 ciclos) 95 T0 10 (medición de FL)
70 Ti 10
72 T 2 10 (medición de FL) Detección del segundo AN diana 55 T 3 10 (medición de FL) En la etapa de detección de la segunda diana en el modo de realización 2, se ha llevado a cabo la medición de fluorescencia a 55 grados centígrados. La fig. 8 muestra las condiciones de medición fluorescente en el ciclo final de la reacción de amplificación y en la etapa de detección de la segunda diana.
En el modo de realización 2, se ha calculado fe como sigue. El cálculo distinto de fe se ha llevado a cabo al igual que en el modo de realización 1.
Figure imgf000011_0001
en el presente documento
fe: valor de intensidad de fluorescencia en la etapa de detección de la segunda diana;
fhib.e: valor de intensidad de fluorescencia (55 grados centígrados) en la etapa de detección de la segunda diana; fdes.44: valor de intensidad de fluorescencia (95 grados centígrados) en el ciclo final de la reacción de amplificación. La determinación en el modo de realización 2 se ha realizado como a continuación.
El valor de F44 de la muestra de medición se ha comparado con el umbral 3. Y, cuando el valor de F44 de la muestra de medición es menor que el umbral 3, se ha determinado que el primer ácido nucleico diana es positivo (existencia), de otro modo, negativo (inexistencia).
Como umbral 3, se ha usado un promedio de valores de F44 de la referencia negativa menos tres veces la desviación estándar (a continuación, en el presente documento, llamada "media - 3DE").
A pesar de que el primer ácido nucleico diana es positivo o negativo, el valor de Fs se ha comparado con el umbral 4, y cuando el valor de Fs es menor que el umbral 4 se ha determinado que el segundo ácido nucleico diana es positivo (existencia), de otro modo, negativo (inexistencia).
Como umbral 4, se ha usado el valor de "media - 3DE" de una muestra a la que sólo se le añade el plásmido pMYC. Con respecto a una curva de amplificación de la referencia negativa, no se ha observado extinción hasta 44 ciclos cuando finaliza la PCR. Esto se debe a que un valor de 0,998 de F44 no es menor que un valor de 0,997 del umbral 3. En este momento, la "media - 3DE" es igual a 0,997 que se va a considerar el umbral 3 para la detección de la primera diana en este modo de realización, mostrándose de este modo en la tabla 7. La curva de amplificación relacionada con la misma también se muestra en la fig. 9.
Con respecto a otra curva de amplificación del plásmido pMYC del primer ácido nucleico diana, se ha observado una extinción provocada por la hibridación de MYC QP desde aproximadamente 28 ciclos. Se ha revelado que un valor de 0,912 de F44 ha sido menor que el umbral 3 y, además, que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pMYC. En este momento, la "media - 3DE" de Fs ha sido igual a -0,052 que se va a considerar el umbral 4 para la detección de la segunda diana, mostrándose de este modo en la tabla 7. La curva de amplificación relacionada con la misma también se muestra en la fig. 10.
Con respecto a una curva de amplificación del plásmido pICM5, no se ha observado extinción durante la reacción de amplificación. Esto se debe a que un valor de 0,997 de f44 no es menor que un valor de 0,997 del umbral 3. Un valor de -0,170 de Fs ha sido menor que el umbral 4.
Los resultados mencionados anteriormente han revelado que la región objetivo del plásmido pMYC no se ha amplificado, además, que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pICM5. La tabla 7 muestra el valor de Fs. La curva de amplificación se muestra en la fig. 11.
(Tabla 7)
Valores usados para la determinación en el procedimiento de QProbe después de que se cambia el perfil en la etapa de detección del segundo AN diana
TE pMYC pICM5 pMYC pICM5 F44 0,998 0,912 0,997 0,911 F44 (promedio - 3DE) 0, 997 * 1 - - -Fe 0,961 0,869 0,827 0,797 Fs -0,037 -0,043 -0,170 -0,114 Fs (promedio - 3DE) - -0,052 * 2 - -^ 1 umbral 3 ® 2 umbral 4
Con respecto a una curva de amplificación una vez que se han añadido el plásmido pMYC del primer ácido nucleico diana y el plásmido pICM5 del segundo ácido nucleico diana a la solución como la curva de amplificación mencionada anteriormente del plásmido pMYC, se ha observado una extinción provocada por hibridación de MYC QP desde aproximadamente 28 ciclos. Un valor de 0,911 de F44 ha sido menor que el umbral 3 y se ha revelado que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pMYC.
El valor de -0,114 de Fs es menor que el umbral 4 y se ha revelado que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pICM5. La tabla 7 muestra el valor de Fs. La curva de amplificación relacionada con la misma se muestra en la fig. 12.
De acuerdo con los resultados anteriores, se ha revelado que tras el uso del valor de intensidad de fluorescencia (95 grados centígrados) en el ciclo final de la reacción de amplificación (fdes.44) se puede detectar la segunda diana. (Modo de realización 3)
<Detección de los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae y de la composición de control interno en base al procedimiento de Eprobe>
Se han detectado los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae y la composición de control interno en base al procedimiento de Eprobe.
Se han usado los mismos cebadores y muestras de ácido nucleico para PCR que en el modo de realización 1. La tabla 8 muestra la información de sonda usada para la PCR en el modo de realización 3.
(Tabla 8)
Sondas usadas para PCR en este modo de realización
Denominación Secuencia (5 '^3 ') Longitud (pb) de la sonda
MYC EP CCCTCGACCAAGCCAACCTCCAGCTC (SEQ ID No. 3) 26
IC EP AGTGGGACTCACCAAC (SEQ ID No.5) 16
Se ha seleccionado una región específica para la sonda Eprobe que se refiere a los valores de Tf calculados por medio del programa informático "Edesign" producido por K.K. Dnaform.
"MYC EP" es una sonda Eprobe que hibrida específicamente el plásmido pMYC, e "IC EP" es otra sonda Eprobe que hibrida específicamente el plásmido pICM5. Como tinte fluorescente tanto para "MYC EP" como para "IC EP", se ha usado "D514". Se han marcado la decimonovena "T" del extremo 5' de "MYC EP" y la novena "T" del extremo 5' de "IC EP", respectivamente.
La producción de las sondas Eprobe se ha realizado solicitando una síntesis personalizada a Eurofins Genomics K.K.
La composición de la solución de reacción de PCR y las condiciones de reacción se muestran en la tabla 9 y la tabla 10.
(Tabla 9)
Composición de la solución de PCR en el procedimiento de EProbe
Composición de la solución Concentración final
Agua MilliQ (TM) -Tampón de PCR x 1
Mezcla de dNTP 150 jM
MYC F 0,20 jM
MYC R 0,80 jM
MYC EP 0,40 jM
IC EP 0,40 jM
KOD exo (-) ADN polimerasa 0,0125 U /jl
Ácido nucleico diana -Las anteriores se han preparado para dar 20 j l
(Tabla 10)
Condiciones de reacción en el procedimiento de EProbe
Etapas de reacción Temperatura (°C) Tiempo (s)
Desnaturalización inicial 95 T0 120
Amplificación (1-40 ciclos) 95 T0 10 (medición de FL)
70 T1 10
72 T 2 10 (medición de FL)
Detección del segundo AN diana 95 T0 10 (medición de FL)
55 T 3 10 (medición de FL)
Se ha seleccionado la combinación de 530 a 548 [nm]para la longitud de onda de excitación y la longitud de onda fluorescente tras la medición de la fluorescencia.
Se ha calculado Fs en el modo de realización 3 con la siguiente fórmula. Los otros cálculos se han llevado a cabo al igual que en el modo de realización 1.
Fs = Fe - F40
La determinación en el modo de realización 3 se ha realizado usando el procedimiento mostrado a continuación. El valor de F40 de la muestra de medición se ha comparado con el umbral 5. Y, cuando el valor de F40 de la muestra de medición es mayor que el umbral 5, se ha determinado que el primer ácido nucleico diana es positivo (existencia), de otro modo, negativo (inexistencia).
Como umbral 5, se ha usado un promedio de valores de F40 de la referencia negativa más tres veces la desviación estándar (a continuación, en el presente documento, llamada "media 3DE").
A pesar de que el primer ácido nucleico diana es positivo o negativo, el valor de Fs se ha comparado con el umbral 6, y cuando el valor de Fs es mayor que el umbral 6, se ha determinado que el segundo ácido nucleico diana es positivo (existencia), de otro modo, negativo (inexistencia).
Como umbral 6, se ha usado el valor de "media 3DE" de una muestra a la que sólo se le añade el plásmido pMYC. La fig. 13 muestra un diagrama de flujo del procedimiento de determinación relacionado con el mismo.
Se ha establecido un primer valor de Tf de 76,4 grados centígrados para una secuencia de MYC EP, y se ha establecido un segundo valor de Tf de 59,8 grados centígrados para una secuencia de IC EP. Por este motivo, se ha estimado que las sondas hibridan solo MYC EP durante el intervalo de temperatura (de 70 grados centígrados a 95 grados centígrados) en la PCR.
Puesto que la medición de fluorescencia con respecto a la etapa de detección de la segunda diana se ha llevado a cabo a 95 grados centígrados y 55 grados centígrados, que es menor que el valor de Tf de IC EP, se ha estimado que la emisión tanto de MYC EP como de IC EP se ha detectado simultáneamente de acuerdo con los valores medidos en la etapa de detección de la segunda diana.
Con respecto a una curva de amplificación de la referencia negativa, no se ha observado emisión hasta 40 ciclos cuando finaliza la PCR. Esto se debe a que un valor de 1,007 de F40 no es mayor que un valor de 1,013 del umbral 5. En este momento, la "media 3DE" es igual a 1,013 que se va a considerar el umbral 5 para la detección de la primera diana, mostrándose de este modo en la tabla 11. La curva de amplificación relacionada con la misma también se muestra en la fig. 14.
Con respecto a otra curva de amplificación del plásmido pMYC del primer ácido nucleico diana, se ha observado una emisión provocada por la hibridación de MYC EP desde aproximadamente 29 ciclos. Se ha revelado que un valor de 2,314 de F40 ha sido mayor que el umbral 5 y, además, que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pMYC. En este momento, la "media 3DE" de Fs ha sido igual a 3,695 que se va a considerar el umbral 6 para la detección de la segunda diana, mostrándose de este modo en la tabla 11. La curva de amplificación relacionada con la misma también se muestra en la fig. 15.
Con respecto a una curva de amplificación del plásmido pICM5 del segundo ácido nucleico diana, no se ha observado emisión durante la reacción de amplificación. Esto se debe a que un valor de 1,012 de F40 no es mayor que un valor de 1,013 del umbral 5. Un valor de 4,012 de Fs ha sido mayor que el umbral 6.
Los resultados mencionados anteriormente han revelado que la región objetivo del plásmido pMYC no se ha amplificado, además, que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pICM5. En la tabla 11 se muestra el valor de Fs, y en la fig. 16 también se muestra la curva de amplificación relacionada con el mismo.
_____________________________________(Tabla 11)_____________
Valores usados para la determinación en el procedimiento de EProbe
TE pMYC pICM5 pMYC pICM5
F40 1,007 2,314 1,012 2,355
F40 (promedio+3DE) 1,013 * 1 - - -Fe 3,149 5,837 5,024 6,609
Fs 2,142 3,523 4,012 4,254
Fs (promedio+3DE) - 3,695 * 2 - -^ 1 umbral 5 ^ 2 umbral 6
Con respecto a una curva de amplificación una vez que se han añadido tanto el plásmido pMYC del primer ácido nucleico diana como el plásmido pICM5 del segundo ácido nucleico diana a la solución, se ha observado una emisión provocada por hibridación de MYC EP desde aproximadamente 29 ciclos al igual que para la curva de amplificación mencionada anteriormente del plásmido pMYC. Un valor de 2,355 de F40 ha sido mayor que el umbral 5 y se ha revelado que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pMYC.
Un valor de 4,254 de Fs es mayor que el umbral 6 y se ha revelado que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pICM5. La tabla 11 muestra el valor de Fs. La curva de amplificación relacionada con la misma se muestra en la fig. 17.
De acuerdo con los resultados mencionados anteriormente, se ha revelado que los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae y la composición de control interno se pueden detectar por medio de un recipiente de reacción que contiene un tipo de solución de reacción y un tipo de marcadores fluorescentes cuando el procedimiento de diseño de sondas y perfiles de temperatura se combinan incluso con el procedimiento de EProbe.
(Modo de realización 4)
<Detección de los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae y de la composición de control interno en base al procedimiento de sonda TaqMan>
De acuerdo con el procedimiento de sonda TaqMan, se han detectado los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae y la composición de control interno. Se han usado los cebadores y las muestras de ácido nucleico para el procedimiento de PCR al igual que para el modo de realización 1.
La tabla 12 muestra información de las sondas usadas para el procedimiento de PCR en el modo de realización 4. _____________________________________(Tabla 12)_____________________________________ Sondas usadas para PCR en este modo de realización
Denominación Secuencia (5 '^3 ') Longitud (pb) de la sonda
MYC Taq CCCTCGACCAAGCCAACCTCCAGCTC SEQ ,D No 3 26
IC Taq AGTGGGACTCACCAACC SEQ ID No. 4 17
Se ha seleccionado una región específica para la sonda TaqMan que se refiere a los valores de Tf calculados de acuerdo con el procedimiento del vecino más cercano.
"MYC Taq" es una sonda TaqMan que hibrida específicamente el plásmido pMYC, e "IC Taq" es otra sonda TaqMan que hibrida específicamente el plásmido pICM5. Como tinte fluorescente tanto para "MYC Taq" como para "IC Taq", se ha usado "FAM" (marca registrada) para marcarse en el extremo 5' y se ha usado "TAMRA" (marca registrada) para marcarse en el extremo 3', respectivamente.
La producción de las sondas TaqMan se ha realizado solicitando una síntesis personalizada a Takara Bio Inc. La tabla 13 y la tabla 14 muestran la composición de la solución de PCR y las condiciones de reacción relacionadas con la misma, respectivamente.
Tabla 13
Figure imgf000015_0002
Las anteriores se han preparado para dar 20 pl
Tabla 14
Figure imgf000015_0001
Se ha seleccionado la combinación de 530 a 548 [nm]para la longitud de onda de excitación y la longitud de onda fluorescente tras la medición de la fluorescencia.
En una etapa para detectar la segunda diana (95 grados centígrados y 50 grados centígrados) después de la reacción de amplificación, se ha realizado la medición de fluorescencia.
En el modo de realización 4, fhib.e se ha definido como un valor de intensidad de fluorescencia (50 grados centígrados), y se ha llevado a cabo el mismo cálculo que en el modo de realización 1 excepto en este punto.
La determinación en el modo de realización 4 se ha realizado como a continuación.
El valor de F44 de la muestra de medición se ha comparado con el umbral 7. Y, cuando el valor de F44 de la muestra de medición es mayor que el umbral 7, se ha determinado que el primer ácido nucleico diana es positivo (existencia), de otro modo, negativo (inexistencia).
Como umbral 7, se ha usado un promedio de valores de F44 de la referencia negativa más tres veces la desviación estándar (a continuación, en el presente documento, llamada "media 3DE").
A pesar de que el primer ácido nucleico diana es positivo o negativo, el valor de Fs se ha comparado con el umbral 8, y cuando el valor de Fs es mayor que el umbral 8, se ha determinado que el segundo ácido nucleico diana es positivo (existencia), de otro modo, negativo (inexistencia).
Como umbral 8, se ha usado el valor de "media 3DE" de una muestra a la que sólo se le añade el plásmido pMYC.
Se ha establecido un primer valor de Tf de 75,8 grados centígrados para una secuencia de MYC Taq y un segundo valor de Tf de 53,7 grados centígrados para una secuencia de IC Taq. Por este motivo, se ha estimado que las sondas hibridan solo MYC Taq durante el intervalo de temperatura (de 70 grados centígrados a 95 grados centígrados) en la PCR.
Puesto que la medición de fluorescencia con respecto a la etapa de detección de la segunda diana se ha llevado a cabo a 95 grados centígrados y 50 grados centígrados, que es menor que el valor de Tf de IC Taq, se ha estimado que la emisión tanto de MYC Taq como de IC Taq se ha detectado simultáneamente de acuerdo con los valores medidos en la etapa de detección de la segunda diana.
Con respecto a una curva de amplificación de la referencia negativa, no se ha observado emisión hasta 44 ciclos cuando finaliza la PCR. Esto se debe a que un valor de 1,028 de F44 no es mayor que un valor de 1,028 del umbral 7. En este momento, la "media 3DE" es igual a 1,028 que se va a considerar el umbral 7 para la detección de la primera diana, mostrándose de este modo en la tabla 15. La curva de amplificación relacionada con la misma también se muestra en la fig. 18.
Con respecto a otra curva de amplificación del plásmido pMYC del primer ácido nucleico diana, se ha observado la emisión provocada por la hibridación de MYC Taq desde aproximadamente 28 ciclos. Se ha revelado que un valor de 1,427 de F44 ha sido mayor que el umbral 7 y, además, que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pMYC.
En este momento, la "media 3DE" de Fs ha sido igual a 0,110 que se va a considerar el umbral 8 para la detección de la segunda diana, mostrándose de este modo en la tabla 15. La curva de amplificación relacionada con la misma también se muestra en la fig. 19.
(Tabla 15)
Valores usados para la determinación en el procedimiento de sonda TaqMan
TE pMYC pICM5 pMYC pICM5
F44 1,028 1,427 1,028 1,348
F44 (promedio 3DE) 1,028 * 1 - - -Fe 1,060 1,536 1,158 1,525
Fs 0,032 0,109 0,130 0,177
Fs (promedio 3DE) - 0,110 * 2 - -^ 1 umbral 7 * 2 umbral 8
Con respecto a una curva de amplificación del plásmido pICM5 del segundo ácido nucleico diana, no se ha observado emisión durante la reacción de amplificación. Esto se debe a que un valor de 1,028 de F44 no es mayor que un valor de 1,028 del umbral 7. Un valor de 0,130 de Fs ha sido mayor que el umbral 8.
Los resultados mencionados anteriormente han revelado que la región objetivo del plásmido pMYC no se ha amplificado, además, que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pICM5.
La tabla 15 muestra el valor de Fs. La curva de amplificación se muestra en la fig. 20.
Con respecto a una curva de amplificación una vez que se han añadido tanto el plásmido pMYC del primer ácido nucleico diana como el plásmido pICM5 del segundo ácido nucleico diana a la solución, se ha observado una emisión provocada por hibridación de MYC EP desde aproximadamente 29 ciclos al igual que para la curva de amplificación mencionada anteriormente del plásmido pMYC. Un valor de 1,348 de F40 ha sido mayor que el umbral 7 y se ha revelado que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pMYC.
Un valor de 0,177 de Fs es mayor que el umbral 8 y se ha revelado que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pICM5. La tabla 15 muestra el valor de Fs. La curva de amplificación relacionada con la misma se muestra en la fig. 21.
De acuerdo con los resultados mencionados anteriormente, se ha revelado que los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae y la composición de control interno se pueden detectar por medio de un recipiente de reacción que contiene un tipo de solución de reacción y un tipo de marcadores fluorescentes cuando el procedimiento de diseño de sondas y perfiles de temperatura se incorporan incluso con el procedimiento de sonda TaqMan.
(Modo de realización 5)
<Detección de los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae y de la composición de control interno en base al procedimiento de QProbe con muestra real>
De acuerdo con el procedimiento de QProbe, se han detectado los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae y la composición de control interno por medio de muestras reales.
Se ha usado el primer ADN total como genes P1 de Mycoplasma pneumoniae, extrayéndose el primer ADN total del primer líquido de limpieza de faringe del que se ha determinado que Mycoplasma pneumoniae es positivo (sometido a prueba por BML, Inc.) de acuerdo con el procedimiento LAMP (patente japonesa registrada n.° 3313358) por medio de un mini kit de ADN "QlAamp" (marca registrada de QIAGEN).
Como muestras negativas, se ha usado el segundo ADN total, extrayéndose el segundo ADN total del segundo líquido de limpieza de faringe del que se ha determinado que Mycoplasma pneumoniae es negativo de acuerdo con el procedimiento LAMP por medio del mini kit de ADN "QlAamp". La PCR se ha llevado a cabo en las mismas condiciones aparte de este punto que las del modo de realización 1.
Se ha realizado el mismo cálculo que en el modo de realización 1 en los datos brutos obtenidos relacionados con la misma.
La determinación en el modo de realización 5 se ha realizado como a continuación.
El valor de F44 de la muestra de medición se ha comparado con el umbral 9. Y, cuando el valor de F44 de la muestra de medición es menor que el umbral 9, se ha determinado que el primer ácido nucleico diana es positivo (existencia), de otro modo, negativo (inexistencia).
Como umbral 9, se ha usado un promedio de valores de F44 de la referencia negativa menos tres veces la desviación estándar (a continuación, en el presente documento, llamada "media - 3DE").
A pesar de que el primer ácido nucleico diana es positivo o negativo, el valor de Fs se ha comparado con el umbral 10, y cuando el valor de Fs es menor que el umbral 10, se ha determinado que el segundo ácido nucleico diana es positivo (existencia), de otro modo, negativo (inexistencia). Como umbral 10, se ha usado el valor de "media - 3DE" con respecto a Fs de la muestra positiva.
Con respecto a una curva de amplificación de la referencia negativa, no se ha observado extinción hasta 44 ciclos cuando finaliza la PCR. Esto se debe a que un valor de 0,997 de F44 no es menor que un valor de 0,997 del umbral 9. En este momento, la "media - 3DE" es igual a 0,997 que se va a considerar el umbral 9 para la detección de la primera diana en este modo de realización, mostrándose de este modo en la tabla 16. La curva de amplificación relacionada con la misma también se muestra en la fig. 22.
Con respecto a otra curva de amplificación de la referencia positiva del primer ácido nucleico diana, se ha observado una extinción provocada por la hibridación de MYC QP desde aproximadamente 35 ciclos. Se ha revelado que un valor de 0,951 de F44 ha sido menor que el umbral 9 y, además, que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pMYC.
En este momento, la "media - 3DE" de Fs ha sido igual a -0,132 que se va a considerar el umbral 10 para la detección de la segunda diana, mostrándose de este modo en la tabla 16. La curva de amplificación relacionada con la misma también se muestra en la fig. 23.
Con respecto a una curva de amplificación del plásmido pICM5 del segundo ácido nucleico diana, no se ha observado extinción durante la reacción de amplificación. Esto se debe a que un valor de 0,998 de F44 no es menor que un valor de 0,997 del umbral 9. Un valor de -0,227 de Fs ha sido menor que el umbral 10.
Los resultados mencionados anteriormente han revelado que la región objetivo del plásmido pMYC no se ha amplificado, además, que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pICM5. En la tabla 16 se muestra un valor de Fs, y en la fig. 24 también se muestra la curva de amplificación relacionada con el mismo.
Con respecto a una curva de amplificación, tras la referencia positiva del primer ácido nucleico diana que se ha añadido al plásmido pICM5 del segundo ácido nucleico diana, se ha observado una extinción provocada por hibridación de MYC QP desde aproximadamente 35 ciclos al igual que para la curva de amplificación de la referencia positiva. Un valor de 0,953 de F44 ha sido menor que el umbral 9 y se ha revelado que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pMYC.
Un valor -0,235 de Fs es menor que el umbral 10 y se ha revelado que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pICM5. La tabla 16 muestra el valor de Fs. La curva de amplificación relacionada con la misma se muestra en la fig.
25.
(Tabla 16)
Valores usados para la determinación en el procedimiento de QProbe con muestra real
muestra negativa muestra positiva pICM5 muestra positiva para pICM5 F44 0,997 0,951 0,998 0,953
F44 (promedio - 3DE) 0,997 * 1 - - -Fe 0,920 0,824 0,771 0,718
Fs - 0,077 - 0,127 - 0,227 - 0,235
Fs (promedio - 3DE) - - 0,132 * 2 - -^ 1 umbral 9 * 2 umbral 10
De acuerdo con los resultados mencionados anteriormente, se ha revelado que los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae y la composición de control interno se pueden detectar por medio de un recipiente de reacción que contiene un tipo de solución de reacción y un tipo de marcadores fluorescentes cuando el procedimiento de diseño de sondas y perfiles de temperatura se incorporan con las muestras clínicas reales.
La presente invención también es aplicable para identificar subtipos y/o polimorfismos mononucleotídicos de organismos patógenos que provocan enfermedades infecciosas.
(Modo de realización 6)
<Detección del gen de plásmido endógeno de Chlamydia trachomatis y del gen de CMT de Neisseria gonorrhoeae en base al procedimiento de QProbe>
De acuerdo con el procedimiento de QProbe, se ha llevado a cabo la detección de los genes de plásmidos endógenos de Chlamydia trachomatis y de los genes de CMT de Neisseria gonorrhoeae.
(pCT)
Se ha realizado la producción de plásmidos pCT solicitando una síntesis personalizada a Hokkaido System Science Co., Ltd. Los fragmentos génicos de plásmidos endógenos comunes (pLGV440) de Chlamydia trachomatis que son organismos patógenos que provocan infección por clamidia, se han sintetizado artificialmente en ADN plasmídico para incorporarse a un vector pUC57, preparándose, de este modo, los plásmidos pCT.
(pNG)
Se ha realizado la producción de plásmidos pNG también solicitando una síntesis personalizada a Hokkaido System Science Co., Ltd. Los fragmentos génicos de citosina ADN metiltransferasa (CMT) de Neisseria gonorrhoeae que es un organismo patógeno que provoca la gonorrea, se han sintetizado artificialmente en ADN plasmídico para incorporarse a un vector pUC57, preparándose, de este modo, los plásmidos pNG.
La primera longitud del plásmido pCT es de 3064 [pb] y la segunda longitud del plásmido pNG es de 3059 [pb]. En base a la primera y segunda longitud y la concentración (pg/pl) de solución de plásmido, se ha calculado el número de copias por 1 [pl]. Después de eso, por medio de solución de tampón TE (Tris-HCl 10 [mM], EDTA 1,0 [mM] pH: 8,0), tanto los plásmidos pCT como los plásmidos pNG se han diluido para dar 1*105 [copias/pl].
Los pares de cebadores usados en el procedimiento de PCR en el modo de realización 6 son como se muestra en la tabla 17.
Tabla 17
Figure imgf000018_0001
La información de las sondas usadas en el procedimiento de PCR en el modo de realización 6 es como se muestra en la tabla 18.
Tabla 18
Figure imgf000019_0001
En base a una secuencia básica de productos de PCR que se pueden amplificar por medio del par de cebadores de SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, se ha seleccionado una región específica para CT QP que se refiere a los valores de Tf calculados con una herramienta de soporte de diseño de sonda QProbe en las páginas de inicio del Centro J-Bio21.
En base a una secuencia básica de productos de PCR que se pueden amplificar por medio del par de cebadores de SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9, se ha seleccionado una región específica para NG QP que se refiere a los valores de Tf calculados con la herramienta de soporte de diseño de sonda QProbe en las páginas de inicio del Centro J-Bio21.
"CT QP" es una sonda QProbe que hibrida específicamente el plásmido pCT, y "NG QP" es otra sonda QProbe que hibrida específicamente el plásmido pNG. Como tinte fluorescente tanto para "CT QP" como para "NG QP", se ha usado "BODIPY FL" (marca registrada) para marcar "C" en los extremos 3', respectivamente.
La producción de sondas QProbe se ha realizado solicitando una síntesis personalizada a NIPPON STEEL & SUMIKIN Eco-Tech Corporation. La tabla 19 y la tabla 20 muestran la composición de la solución de PCR y las condiciones de reacción relacionadas con la misma, respectivamente.
(Tabla 19)
Composición de la solución de PCR
Composición de la solución Concentración final
Agua MilliQ (TM) —
Tampón de PCR X 1
Mezcla de dNTP 150 pM
CT F 0,20 pM
CT R 0,60 pM
CT QP 0,15 pM
NG F 0,20 pM
NG R 0,60 pM
NG QP 0,15 pM
KOD exo (-) ADN polimerasa 0,0125 U/pl
Ácido nucleico diana —
Las anteriores se han preparado para dar 20 pl
(Tabla 20)
Condiciones de reacción de CT NG en el procedimiento de QProbe
Etapas de reacción Temperatura (°C) Tiempo (s)
Desnaturalización inicial 95 T0 120
Amplificación (1-44 ciclos) 95 T0 5 (medición de FL)
68 T1, T2 15 (medición de FL)
Detección del segundo AN diana 95 T0 5 (medición de FL)
55 T 3 15 (medición de FL)
Se ha seleccionado la combinación de 510 a 528 [nm] para la longitud de onda de excitación y la longitud de onda fluorescente tras la medición de fluorescencia.
Se han medido los valores de fluorescencia en la etapa de desnaturalización (95 grados centígrados) y la etapa de alargamiento (68 grados centígrados) para cada ciclo. Además, después de que se ha completado la reacción de amplificación, en una etapa para detectar la segunda diana (95 grados centígrados y 55 grados centígrados), se ha realizado la medición de fluorescencia.
Se ha realizado el mismo cálculo que el del modo de realización 1 en los datos brutos obtenidos relacionados con la misma.
La determinación de acuerdo con el procedimiento de QProbe se ha realizado usando el procedimiento mostrado a continuación.
El valor de F44 de la muestra de medición se ha comparado con el umbral 11. Y, cuando el valor de F44 de la muestra de medición es menor que el umbral 11, se ha determinado que el primer ácido nucleico diana es positivo (existencia), de otro modo, negativo (inexistencia).
Como umbral 11, se ha usado un promedio de valores de F44 de la referencia negativa menos tres veces la desviación estándar (a continuación, en el presente documento, llamada "media - 3DE").
A pesar de que el primer ácido nucleico diana es positivo o negativo, el valor de Fs se ha comparado con el umbral 12, y cuando el valor de Fs es menor que el umbral 12, se ha determinado que el segundo ácido nucleico diana es positivo (existencia), de otro modo, negativo (inexistencia).
Como umbral 12, se ha usado el valor de "media - 3DE" de una muestra a la que sólo se añade el plásmido pNG. Se ha establecido un primer valor de Tf de 73,4 grados centígrados para una secuencia de CT QP, y se ha establecido un segundo valor de Tf de 62,5 grados centígrados para una secuencia de NG QP. Por este motivo, se ha estimado que las sondas hibridan solo CT QP durante el intervalo de temperatura (de 68 grados centígrados a 95 grados centígrados) en la PCR.
Puesto que la medición de fluorescencia con respecto a la etapa de detección de la segunda diana se ha llevado a cabo a 95 grados centígrados y 55 grados centígrados, que es menor que el valor de Tf de NG QP, se ha estimado que la extinción tanto de CT Qp como de NG QP se ha detectado simultáneamente de acuerdo con los valores medidos en la etapa de detección de la segunda diana.
Con respecto a una curva de amplificación de la referencia negativa, no se ha observado extinción hasta 44 ciclos cuando finaliza la PCR. Esto se debe a que un valor de 0,998 de F44 no es menor que un valor de 0,996 del umbral 11. En este momento, la "media - 3DE" es igual a 0,996 que se va a considerar el umbral 11 para la detección de la primera diana en este modo de realización, mostrándose de este modo en la tabla 21. La curva de amplificación relacionada con la misma también se muestra en la fig. 26.
Con respecto a otra curva de amplificación del plásmido pCT del primer ácido nucleico diana, se ha observado una extinción provocada por la hibridación de CT Qp desde aproximadamente 28 ciclos. Se ha revelado que un valor de 0,720 de F44 ha sido menor que el umbral 11 y, además, que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pCT. En este momento, la "media - 3DE" de Fs ha sido igual a -0,039 que se va a considerar el umbral 12 para la detección de la segunda diana, mostrándose de este modo en la tabla 21. La curva de amplificación relacionada con la misma también se muestra en la fig. 27.
Con respecto a una curva de amplificación del plásmido pNG del segundo ácido nucleico diana, no se ha observado extinción durante la reacción de amplificación. Esto se debe a que un valor de 0,998 de F44 no es menor que un valor de 0,996 del umbral 11. Un valor de -0,065 de Fs ha sido menor que el umbral 12.
Los resultados mencionados anteriormente han revelado que la región objetivo del plásmido pCT no se ha amplificado, además de que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pNG. La tabla 21 muestra el valor de Fs. La curva de amplificación se muestra en la fig. 28.
(Tabla 21)
Valores usados para la determinación del segundo elemento en el procedimiento de QProbe
TE pCT pNG pCT pNG
F44 0,998 0,720 0,998 0,729
F44 (promedio - 3DE) 0, 996 * 1 - - -Fe 1,009 0,681 0,933 0,618
Fs 0,011 - 0,039 - 0,065 - 0,111
Fs (promedio - 3DE) - 0,039 * 2 - -^ 1 umbral 11 ^ 2 umbral 12
Con respecto a una curva de amplificación una vez que se han añadido tanto el plásmido pCT del primer ácido nucleico diana como el plásmido pNG del segundo ácido nucleico diana a la solución, se ha observado una extinción provocada por hibridación de CT QP desde aproximadamente 28 ciclos al igual que para la curva de amplificación mencionada anteriormente del plásmido pCT. Un valor de 0,729 de F44 ha sido menor que el umbral 11 y se ha revelado que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pCT.
Un valor -0,111 de Fs es menor que el umbral 12 y se ha revelado que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pNG. La tabla 21 muestra el valor de Fs. La curva de amplificación relacionada con la misma se muestra en la fig. 29.
De acuerdo con los resultados mencionados anteriormente, se ha revelado que los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae y la composición de control interno se pueden detectar por medio de un recipiente de reacción que contiene un tipo de solución de reacción y un tipo de marcadores fluorescentes cuando el procedimiento de diseño de sondas y perfiles de temperatura se incorporan con dos elementos de genes.
(Modo de realización 7)
<Detección de los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae y de la composición de control interno en base al procedimiento de QProbe para detectar múltiples veces la segunda diana en una reacción de amplificación>
No solo después del ciclo final sino también durante la reacción de amplificación, se ha llevado a cabo la etapa de detección de la segunda diana de manera insertada, y se ha realizado la detección de los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae y de la composición de control interno en base al procedimiento de QProbe.
Los cebadores, las sondas, la composición de la solución de reacción y los ácidos nucleicos se han usado para el procedimiento de PCR al igual que en el modo de realización 1. La tabla 22 muestra las condiciones de reacción de la misma.
(Tabla 22)
Condiciones de reacción de la etapa de detección de la segunda diana en el procedimiento de QProbe en el modo de realización 7
Etapas de reacción Temperatura (°C) Tiempo (s) Desnaturalización inicial 95 Te 120
Amplificación (1-20 ciclos) 95 Te 10 (medición de FL)
70 T1 10
72 T 2 10 (medición de FL) Detección una primera vez del segundo AN diana 95 Te 10 (medición de FL)
55 T 3 10 (medición de FL) Amplificación (21-27 ciclos) 95 Te 10 (medición de FL)
7 0 T1 10
72 T 2 10 (medición de FL) Detección una segunda vez del segundo AN diana 95 Te 10 (medición de FL)
55 T 3 10 (medición de FL) Amplificación (28-34 ciclos) 95 Te 10 (medición de FL)
70 T1 10
72 T 2 10 (medición de FL) Detección una tercera vez del segundo AN diana 95 Te 10 (medición de FL)
55 T 3 10 (medición de FL) Amplificación (35-41 ciclos) 95 Te 10 (medición de FL)
70 T1 10
72 T 2 10 (medición de FL) Detección una cuarta vez del segundo AN diana 95 Te 10 (medición de FL)
55 T 3 10 (medición de FL)
La figura 30 es un gráfico de cambios de temperatura en la reacción de amplificación.
En el análisis del modo de realización 7, se han llevado a cabo las mismas etapas que en el modo de realización 1 excepto el siguiente cálculo.
fen =fhib.en / fdes.en (Fórmula 4)
en el presente documento,
fen: valor de intensidad de fluorescencia en n veces la etapa de detección de la segunda diana calculado de acuerdo con la fórmula 4;
fhib.en: valor de intensidad de fluorescencia (55 grados centígrados) en n veces la etapa de detección de la segunda diana; y
fdes.en: valor de intensidad de fluorescencia (95 grados centígrados) en n veces la etapa de detección de la segunda diana.
Fen = fe n / f10 (Fórmula 5)
en el presente documento,
Fen: valor relativo en n veces la etapa de detección de la segunda diana suponiendo que el valor de intensidad de fluorescencia en el décimo ciclo obtenido de acuerdo con la fórmula 4 es igual a un valor de "1".
Fs1 = Fe1 - F20 (Fórmula 6)
Fs2 = Fe2 - F27 (Fórmula 6')
Fs3 = Fe3 - F34 (Fórmula 6")
Fs4 - Fe4 - F41 (Fórmula 6"')
en el presente documento,
Fs1: valor de medición en la etapa de detección de la segunda diana una primera vez;
Fs2: valor de medición en la etapa de detección de la segunda diana una segunda vez;
Fs3: valor de medición en la etapa de detección de la segunda diana una tercera vez; y
Fs4: valor de medición en la etapa de detección de la segunda diana una cuarta vez.
La determinación se ha realizado usando el procedimiento mostrado a continuación.
El valor de F41 de la muestra de medición se ha comparado con el umbral 13. Y, cuando el valor de F41 de la muestra de medición es menor que el umbral 13, se ha determinado que el primer ácido nucleico diana es positivo (existencia), de otro modo, negativo (inexistencia).
Como umbral 13, se ha usado un promedio de valores de F41 de la referencia negativa menos tres veces la desviación estándar (a continuación, en el presente documento, llamada "media - 3DE").
En la etapa de detección de la segunda diana una primera vez, el valor de Fs1 se ha comparado con el umbral 14, y cuando el valor de Fs1 es menor que el umbral 14, se ha determinado que el segundo ácido nucleico diana es positivo (existencia), de otro modo, negativo (inexistencia).
Como umbral 14, se ha usado el valor de "media - 3DE" con respecto al valor de Fs1 de una muestra a la que sólo se le añade el plásmido pMYC.
En la etapa de detección de la segunda diana una segunda vez, el valor de Fs2 se ha comparado con el umbral 15, y cuando el valor de Fs2 es menor que el umbral 15, se ha determinado que el segundo ácido nucleico diana es positivo (existencia), de otro modo, negativo (inexistencia).
Como umbral 15, se ha usado el valor de "media - 3DE" con respecto al valor de Fs2 de una muestra a la que sólo se le añade el plásmido pMYC.
En la etapa de detección de la segunda diana una tercera vez, el valor de Fs3 se ha comparado con el umbral 16, y cuando el valor de Fs3 es menor que el umbral 16, se ha determinado que el segundo ácido nucleico diana es positivo (existencia), de otro modo, negativo (inexistencia).
Como umbral 16, se ha usado el valor de "media - 3DE" con respecto al valor de Fs3 de una muestra a la que sólo se le añade el plásmido pMYC.
En la etapa de detección de la segunda diana una cuarta vez, el valor de Fs4 se ha comparado con el umbral 17, y cuando el valor de Fs4 es menor que el umbral 17, se ha determinado que el segundo ácido nucleico diana es positivo (existencia), de otro modo, negativo (inexistencia).
Como umbral 17, se ha usado el valor de "media - 3DE" con respecto al valor de Fs4 de una muestra a la que sólo se le añade el plásmido pMYC.
Con respecto a una curva de amplificación de la referencia negativa, no se ha observado extinción hasta 41 ciclos cuando finaliza la PCR. Esto se debe a que un valor de 0,999 de F41 no es menor que un valor de 0,998 del umbral 13. En este momento, la "media - 3DE" es igual a 0,998 que se va a considerar el umbral 13 para la detección de la primera diana en este modo de realización, mostrándose de este modo en la tabla 23. La curva de amplificación relacionada con la misma también se muestra en la fig. 31.
Con respecto a otra curva de amplificación del plásmido pMYC del primer ácido nucleico diana, se ha observado una extinción provocada por la hibridación de MYC QP desde aproximadamente 30 ciclos. Se ha revelado que un valor de 0,892 de F41 ha sido menor que el umbral 13 y, además, que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pMYC.
En este momento, la "media - 3DE" de Fs1 ha sido igual a -0,058, la "media - 3DE" de Fs2 ha sido igual a -0,070, la "media - 3DE" de Fs3 ha sido igual a -0,080 y la "media - 3DE" de Fs4 ha sido igual a -0,087 que se van a considerar el umbral 14, umbral 15, umbral 16 y umbral 17 para la detección de la segunda diana, respectivamente, mostrándose de este modo en la tabla 23. La curva de amplificación relacionada con la misma también se muestra en la fig. 32.
(Tabla 23)
Valores usados para la determinación en la etapa de detección de la segunda diana en el procedimiento de QProbe en el modo de realización 7
Figure imgf000023_0001
Fe1 0,941 0,941 0,941 0,941
Fs1 -0,058 -0,058 -0,058 -0,058
Fs1 (promedio - 3DE) - -0,058 * 2 - -
F27 0,999 0,999 1,000 0,999
Fe2 0,941 0,930 0,943 0,930
Fs2 -0,058 -0,068 -0,057 - 0,068
Fs2 (promedio - 3DE) - -0,070 * 3 - -
F34 0,999 0,949 1,000 0,951
Fe3 0,941 0,870 0,916 0,842
Fs3 -0,058 -0,079 -0,084 - 0,109
Fs3 (promedio - 3DE) -0,080 * 4 - -
F41 0,999 0,892 0,999 0,897
F41 (promedio - 3DE) 0,998 * 1 - - -Fe4 0,940 0,812 0,805 0,743
Fs4 -0,058 -0,080 -0,192 - 0,154
Fs4 (promedio - 3DE) - -0,087 * 5 - -* 1 umbral 13 ® 2 umbral 14 5 s 3 umbral 15
^ 4 umbral 16 * 5 umbral 17
Con respecto a una curva de amplificación del plásmido pICM5 del segundo ácido nucleico diana, no se ha observado extinción durante la reacción de amplificación excepto en las respectivas etapas de detección de la segunda diana. Esto se debe a que un valor de 0,999 de F41 no es menor que un valor de 0,998 del umbral 13. Un valor de -0,058 de Fs1 ha sido mayor que el umbral 14, y se ha revelado que no se ha amplificado la región objetivo del plásmido pICM5 hasta un límite de identificación hasta la etapa de detección de la segunda diana una primera vez.
Un valor de -0,057 de Fs2 ha sido mayor que el umbral 15, y se ha revelado que no se ha amplificado la región objetivo del plásmido pICM5 hasta un límite de identificación hasta la etapa de detección de la segunda diana una segunda vez.
Un valor de -0,084 de Fs3 ha sido menor que el umbral 16, y se ha revelado que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pICM5 más allá del límite de identificación hasta la etapa de detección de la segunda diana una tercera vez.
Un valor de -0,192 de Fs4 también ha sido menor que el umbral 17. La tabla 23 muestra los valores de Fs1, Fs2, Fs3 y Fs4. Los resultados se muestran en la fig. 33.
Con respecto a una curva de amplificación una vez que se han añadido tanto el plásmido pMYC del primer ácido nucleico diana como el plásmido pICM5 del segundo ácido nucleico diana a la solución, se ha observado una extinción provocada por hibridación de MYC QP desde aproximadamente 30 ciclos al igual que para la curva de amplificación del plásmido pMYC. Un valor de 0,897 de F41 ha sido menor que el umbral 13 y se ha revelado que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pMYC.
Un valor de -0,058 de Fs1 ha sido mayor que el umbral 14, y se ha revelado que no se ha amplificado la región objetivo del plásmido pICM5 más allá del límite de identificación hasta la etapa de detección de la segunda diana una primera vez.
Un valor de -0,068 de Fs2 también ha sido mayor que el umbral 15, y se ha revelado que no se ha amplificado la región objetivo del plásmido pICM5 más allá del límite de identificación hasta la etapa de detección de la segunda diana una segunda vez.
Un valor de -0,109 de Fs3 ha sido menor que el umbral 16, y se ha revelado que se ha amplificado la región objetivo del plásmido pICM5 más allá del límite de identificación hasta la etapa de detección de la segunda diana una tercera vez.
Un valor de -0,154 de Fs4 también ha sido menor que el umbral 17. La tabla 23 muestra los valores de Fs1, Fs2, Fs3 y Fs4. Los resultados se muestran en la fig. 34.
De acuerdo con los resultados mencionados anteriormente, también en un caso donde se ha llevado a cabo la etapa de detección de la segunda diana de la manera insertada no solo después del ciclo final sino también dentro de la reacción de amplificación, se ha revelado que se pueden detectar los genes P1 de Mycoplasma pneumoniae y la composición de control interno.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La fig. 1 es un gráfico que muestra los cambios de temperatura dentro de la solución mixta en el modo de realización 1 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 2 es un diagrama explicativo de tiempos de fluorimetría en el modo de realización 1 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 3 es un diagrama de flujo que muestra un procedimiento de determinación en el modo de realización 1 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 4 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a una referencia negativa en el modo de realización 1 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 5 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a un primer ácido nucleico diana en el modo de realización 1 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 6 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a un segundo ácido nucleico diana en el modo de realización 1 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 7 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto al primer ácido nucleico diana y al segundo ácido nucleico diana en el modo de realización 1 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 8 es un diagrama explicativo de tiempos de fluorimetría en el modo de realización 2 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 9 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a una referencia negativa en el modo de realización 2 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 10 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a un primer ácido nucleico diana en el modo de realización 2 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 11 es un gráfico que muestra los cambios en intensidad de fluorescencia con respecto a un segundo ácido nucleico diana en el modo de realización 2 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 12 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto al primer ácido nucleico diana y al segundo ácido nucleico diana en el modo de realización 2 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 13 es un diagrama de flujo que muestra un procedimiento de determinación en el modo de realización 3 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 14 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a una referencia negativa en el modo de realización 3 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 15 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a un primer ácido nucleico diana en el modo de realización 3 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 16 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a un segundo ácido nucleico diana en el modo de realización 3 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 17 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto al primer ácido nucleico diana y al segundo ácido nucleico diana en el modo de realización 3 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 18 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a una referencia negativa en el modo de realización 4 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 19 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a un primer ácido nucleico diana en el modo de realización 4 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 20 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a un segundo ácido nucleico diana en el modo de realización 4 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 21 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto al primer ácido nucleico diana y al segundo ácido nucleico diana en el modo de realización 4 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 22 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a una referencia negativa en el modo de realización 5 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 23 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a un primer ácido nucleico diana en el modo de realización 5 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 24 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a un segundo ácido nucleico diana en el modo de realización 5 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 25 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto al primer ácido nucleico diana y al segundo ácido nucleico diana en el modo de realización 5 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 26 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a una referencia negativa en el modo de realización 6 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 27 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a un primer ácido nucleico diana en el modo de realización 6 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 28 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a un segundo ácido nucleico diana en el modo de realización 6 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 29 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto al primer ácido nucleico diana y al segundo ácido nucleico diana en el modo de realización 6 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 30 es un gráfico que muestra cambios de temperatura dentro de la solución mixta en el modo de realización 7 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 31 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a una referencia negativa en el modo de realización 7 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 32 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a un primer ácido nucleico diana en el modo de realización 7 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 33 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto a un segundo ácido nucleico diana en el modo de realización 7 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 34 es un gráfico que muestra los cambios de intensidad de fluorescencia con respecto al primer ácido nucleico diana y al segundo ácido nucleico diana en el modo de realización 7 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 35 es una vista ampliada de los cambios de temperatura en el modo de realización 1 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 36 es un diagrama explicativo de la composición de solución mixta en el modo de realización 1 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 37(a) es un diagrama explicativo de una etapa de desnaturalización en el modo de realización 1 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 37(b) es un diagrama explicativo de una etapa de hibridación en el modo de realización 1 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 37(c) es un diagrama explicativo de una etapa de alargamiento en el modo de realización 1 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 37(d) es un diagrama explicativo de una etapa de alargamiento completado en el modo de realización 1 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 38(a) es un diagrama explicativo de la etapa de desnaturalización en el modo de realización 1 de acuerdo con la presente invención; y
la fig. 38(b) es un diagrama explicativo de la etapa de hibridación en el modo de realización 1 de acuerdo con la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE SÍMBOLOS
1: recipiente
2: solución
10: primer ácido nucleico diana
13: cebador F de la primera diana
14: cebador R de la primera diana
15: sonda de la primera diana
16: primera sustancia de marcado
20: segundo ácido nucleico diana
23: cebador F de la segunda diana

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para detectar conjuntamente múltiples ácidos nucleicos diana que difieren entre sí, incluyendo los múltiples ácidos nucleicos diana un primer ácido nucleico diana y un segundo ácido nucleico diana, usando el procedimiento:
una solución que puede contener el primer ácido nucleico diana y el segundo ácido nucleico diana en la misma, a una temperatura de desnaturalización TO, escindiéndose un primer enlace de hidrógeno bicatenario del primer ácido nucleico diana que se va a disociar en las dos primeras hebras individuales, escindiéndose un segundo enlace de hidrógeno bicatenario del segundo ácido nucleico diana que se va a disociar en las dos segundas hebras individuales, respectivamente,
la solución conteniendo además en la misma:
un cebador de la primera diana a una temperatura de hibridación T1 que se enlaza específicamente con cualquiera de las dos primeras hebras individuales en las que se ha disociado el primer ácido nucleico diana;
un cebador de la segunda diana a la temperatura de hibridación T1 que se enlaza específicamente con cualquiera de las dos segundas hebras individuales en las que se ha disociado el segundo ácido nucleico diana;
una sonda de la primera diana a la temperatura de hibridación T1 que se enlaza específicamente con cualquiera de las dos primeras hebras individuales en las que se ha disociado el primer ácido nucleico diana, incluyendo la sonda de la primera diana una primera sustancia de marcado que cambia las primeras señales fluorescentes de la misma cuando la sonda de la primera diana se enlaza específicamente con cualquiera de las dos primeras hebras individuales;
ADN polimerasa;
desoxirribonucleósido trifosfato a una temperatura de alargamiento T2 que se enlaza por acción de la ADN polimerasa tanto con las dos primeras hebras individuales en las que se ha disociado el primer ácido nucleico diana como con las dos segundas hebras individuales en las que se ha disociado el segundo ácido nucleico diana; y
una sonda de la segunda diana a la temperatura de hibridación T1 que no se enlaza con ninguna de las dos primeras hebras individuales en las que se ha disociado el primer ácido nucleico diana ni con las dos segundas hebras individuales en las que se ha disociado el segundo ácido nucleico diana, enlazándose la sonda de la segunda diana a una temperatura de detección de la segunda diana T3 con las dos segundas hebras individuales en las que se ha disociado el segundo ácido nucleico diana, incluyendo la sonda de la segunda diana una segunda sustancia de marcado que cambia las segundas señales fluorescentes de la misma cuando la sonda de la segunda diana se enlaza específicamente con cualquiera de las dos segundas hebras individuales,
en el que
T0 se define como la temperatura de desnaturalización; T1 se define como la temperatura de hibridación; T2 se define como la temperatura de alargamiento; T3 se define como la temperatura de detección de la segunda diana, y se establece de T0 a T3 de modo que una condición de que: T0>T2>Tl>T3 se satisface; y
la primera sustancia de marcado y la segunda sustancia de marcado son idénticas;
en el que se capta una diferencia provocada por los cambios de las primera y segunda señales fluorescentes de acuerdo con la segunda sustancia de marcado para evaluar la existencia o inexistencia del segundo ácido nucleico diana.
2. El procedimiento para detectar conjuntamente múltiples ácidos nucleicos diana que difieren entre sí como se define en la reivindicación 1, en el que las señales fluorescentes se muestran al extinguir luz cuando se produce la hibridación.
3. El procedimiento para detectar conjuntamente múltiples ácidos nucleicos diana que difieren entre sí como se define en la reivindicación 1, en el que las señales fluorescentes se muestran al emitir luz cuando se produce la hibridación.
4. El procedimiento para detectar conjuntamente múltiples ácidos nucleicos diana que difieren entre sí como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el primer ácido nucleico diana es un gen P1 de Mycoplasma pneumoniae y el segundo ácido nucleico diana es la composición de control interno.
5. El procedimiento para detectar conjuntamente múltiples ácidos nucleicos diana que difieren entre sí como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el primer ácido nucleico diana es un gen de plásmido endógeno de Chlamydia trachomatis y el segundo ácido nucleico diana es un gen de CMT de Nisseria gonorrhoeae.
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