CN107849617A - 复数个标的核酸的检测套组及使用其的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种复数个标的核酸的检测套组，其可使用置入有1种反应液的1个反应容器以及单一标记，来同时扩增、检测复数个基因。疑似含有会在变性温度T0下进行解离的第1标的核酸及第2标的核酸的溶液是含有下述组分而成：DNA聚合酶；第1标的用引物，其在退火(annealing)温度T1下，结合到源自第1标的核酸的单链；第2标的用引物，其在退火温度T1下，结合到源自第2标的核酸的单链；第1标的用探针，其在退火温度T1下，结合到源自第1标的核酸的单链；第2标的用探针，其在低于退火温度T1及延长温度T2的第2标的检测温度T3下，结合到源自第2标的核酸的单链；且满足T0>T2≧T1>T3。

Description

复数个标的核酸的检测套组及使用其的检测方法
技术领域
本发明有关于改善PCR法，来测定复数个标的核酸的检测套组及其关联技术。
背景技术
在基因检查中，有许多需要测定复数个标的基因。例如，流行性感冒的A型与B型、流行性感冒与RSV、更甚者人类间质肺炎病毒(human metapn eumovirus)、性感染症的披衣菌(chlamydia)与淋病球菌(gonococcus)、霉浆菌(mycoplasma)及其抗性因子(resistancefactor)等。
在病征相似之下且在同时期同时扩大感染情况等之下，亦要鉴别并诊断它们，并确立治疗方针。又，抗性因子的存在亦可用于投药的选定判断等。
另一方面，在单独的测定项目当中，作为确认该测定是否真的顺利进行的手段，设定内部控制(internal control)亦是有用的。此是预先准备用以扩增之与检测目标的标的基因无关系的核酸序列，且不论标的基因的有无，是可确认反应是否顺利进行。藉此，可在测定之中确认测定试剂或装置是否有效作用。
如此，在检测复数个标的核酸时，可认为是有实施各别的测定，或者，对检测的各个标的核酸使用不同的标记色素等来识别的手段。
或者，亦可在同时进行扩增反应后，缓慢的使温度上升(或下降)，并从显示出荧光讯号的变化率的波锋的温度与标的核酸的熔解温度来识别判断(热熔解曲线分析法)。
然而，各别测定会花费时间或成本，识别不同的标记物亦不仅要准备复数个标记试剂，分析装置的波长设定等亦会花费成本。
使用热熔解曲线分析法时，成本虽低，然需要缓慢的使温度变化，因此为了进行正确的分析，不得不花费5～10分钟左右的时间来进行温度变化。
在专利文献1(日本特开2002-136300号公报)，是准备置入有不同反应液的复数个反应容器，并分别进行扩增检测。具有在每一项目要调制试剂、分注作业而麻烦的问题点。
在专利文献2(日本特开2004-203号公报)，是在置入有1种反应液的1个反应容器中同时扩增复数个基因。其是透过先改变标记色素来识别每个基因。由于光是使用的标记色素的数量，检测装置的光学系统便需要复数个，因此具有装置成本变高的问题点。
在专利文献3(日本特开2008-173127号公报)，是在置入有1种反应液的1个反应容器中同时扩增复数个基因。在每一项目改变PCR产物或标记探针的解离温度，且在扩增后，使温度从低温侧慢慢上升至高温侧并监测荧光值以进行解离曲线分析(与「热熔解曲线分析」同义。)，再透过监测在取决于碱基序列的各个解离温度下是否有波锋来识别。
若提升熔解曲线分析时温度变化的速度，则识别各项目的熔解温度会变困难，因此会有在PCR反应后还要额外花费5～10分钟左右的时间的问题点。
在专利文献4(日本特表2012-513215号公报)，是在1个反应液容器中同时扩增复数个基因。针对每一个基因改变PCR产物的解离温度与引物的熔解温度，并在各自的熔解温度下监测荧光并识别。
通常的PCR程序(PCR profile)在1循环中，设置有变性、退火、延长步骤，然在专利文献4是在每一项目改变PCR产物的熔解温度，因此需要考虑的条件多，程序的设计困难，且测定时间亦变长。由于温度变化激烈，有装置的负担亦大的问题点。
专利文献1：日本特开2002-136300号公报
专利文献2：日本特开2004-203号公报
专利文献3：日本特开2008-173127号公报
专利文献4：日本特表2012-513215号公报
专利文献5：日本特许第4724380号公报
发明内容
发明欲解决的课题
就此，本发明的目的在于提供一种复数个标的核酸的检测套组，其可使用置入有1种反应液的1个反应容器以及单一标记，来同时扩增、检测复数个基因。
用以解决课题的手段
第1发明的复数个标的核酸的检测套组，是令变性温度为T0、退火温度为T1、延长温度为T2、第2标的检测温度为T3时，设定温度满足T0＞T2≧T1＞T3，并且于可含有在变性温度T0下，双链的氢键被切断而分别解离成2条单链的第1标的核酸及第2标的核酸的溶液中，含有下述组分：
第1标的用引物，其在退火温度T1下，对第1标的核酸解离成的2条单链的任一者专一结合；第2标的用引物，其在退火温度T1下，对第2标的核酸解离成的2条单链的任一者专一结合；第1标的用探针，其在退火温度T1下，对第1标的核酸解离成的2条单链的任一者专一结合，且具有荧光讯号因结合而变化的第1标记物；DNA聚合酶；脱氧核糖核苷三磷酸，其在延长温度T2下，透过DNA聚合酶的作用，结合至第1标的核酸解离成的2条单链及第2标的核酸解离成的2条单链；第2标的用探针，其在退火温度T1下，不结合至第1标的核酸解离成的2条单链及第2标的核酸解离成的2条单链的任一者，且在第2标的检测温度T3下，对第2标的核酸解离成的2条单链的任一者专一结合，并且具有荧光讯号因结合而变化的第2标记物。
第1、第2标记物宜选自于由QProbe(注册商标)探针、Eprobe(注册商标)探针及TaqMan(注册商标)探针所构成的群组。
荧光讯号可为退火和消光讯号，亦可为退火和发光讯号的任一者。
第1标的核酸及第2标的核酸宜为霉浆菌P1基因与内部控制，或者披衣菌内生性质粒基因与淋病球菌CMT基因。
发明效果
如上所述，若通过本发明，将可使用1种标记物并以1种混合液来检测复数个标的核酸。由于不需热熔解曲线分析而可识别复数个标的核酸，故可大幅缩短测定时间，而实用效果高。
实施发明的最佳方式
本案发明人开发出一种检测复数核酸的套组，其是在PCR法中，组合了探针退火温度的条件设定与温度变化程序，且在置入有1种反应液的1个反应容器中使用了单一荧光标记。
在本套组，如图35所示，使用4个温度，亦即，变性温度T0(95℃)、退火温度T1(70℃)、延长温度T2(72℃)及第2标的检测温度T3(55℃)。所述温度是将温度设定成满足T0>T2≧T1>T3。当然，所述温度数值仅不过是例示，如后述，可进行种种变更。
所谓复数个标的核酸是指第1标的核酸及第2标的核酸，然若需要，亦可通过增加第3标的检测温度T4(T3>T4)等的设定温度来追加第3标的核酸等其他标的核酸。
边参照图36，边针对本套组的内容进行说明。首先，在本套组是令第1标的核酸10与第2标的核酸20为检测对象。为便于以下的说明，仅说明在容器1内的溶液2(详如后述。)含有第1标的核酸10与第2标的核酸20两者的情况(亦即，阳性与阳性的情况)。
当然，在一者或两者为阴性的情况时，会变成溶液2不含有第1标的核酸10与第2标的核酸20的至少一者或两者，在以下的说明中，关于不含有的标的核酸，将不会进行荧光讯号及扩增。
如图37(a)所示，若使溶液2的温度上升成为变性温度T0，则第1标的核酸10及第2标的核酸20其双链的氢键皆会被切断，分别解离成2条单链(第1标的核酸10解离成第1单链11与第2单链12，第2标的核酸20解离成第1单链21与第2单链22)。
如图37(b)所示，若从变性温度T0降温变成退火温度T1，则就第1标的核酸10而言，第1标的用F引物13会专一结合到互补的第1单链11序列上，第1标的用R引物14会专一结合到互补的第2单链12序列上。同样的，就第2标的核酸20而言，第2标的用F引物23会专一结合到互补的第1单链21序列上，第2标的用R引物24会专一结合到互补的第2单链22序列上。
又，经第1标记物16标记的第1标的用探针15，在图37(b)所示的退火温度T1下，专一结合至源自第1标的核酸10的第1单链11的特定部位，而第1标记物16产生荧光信号。然而，经第2标记物26标记的第2标的用探针25，由于退火温度T1较第2标的检测温度T3还要高温，因此不会结合至源自第2标的核酸20的第1单链21，第2标记物26不会产生荧光信号。
如图37(c)所示，若将温度从退火温度T1提升至延长温度T2，则在溶液2，由于含有用以反复PCR循环的充分量的DNA聚合酶30与脱氧核糖核苷三磷酸31，而会如下进行扩增反应。
亦即，就第1标的核酸10而言，会从结合至第1单链11的第1标的用F引物13，又，从结合至第2单链12的第1标的用R引物14，分别结合脱氧核糖核苷三磷酸31并渐渐延长。
又，就第2标的核酸20而言，会从结合至第1单链21的第2标的用F引物23，又，从结合至第2单链22的第2标的用R引物24，分别结合脱氧核糖核苷三磷酸31并渐渐延长。
然后，一但扩增反应结束，则如将图37(d)与图36进行比较所知，第1标的核酸10及第2标的核酸20两者会增加变成2倍。
再一次，返回图37(a)所示的步骤，若反复以上的步骤(图37(a)～图37(d))，则可反复第1标的物16所致的荧光讯号的变化与扩增反应。
接着，边参照图38，边针对从变性温度T0降温至第2标的温度检测温度T3的情况进行说明。
在变性温度T0，如图38(a)所示，会成为与图37(a)同样的状态。然而，若将温度降至第2标的温度检测温度T3，则与图37(b)相异，会变成如图38(b)所示的状态。
亦即，如图38(b)所示，针对经第1标记物16标记的第1标的用探针15会专一结合至源自第1标的核酸10的第1单链11的特定部位，而第1标记物16的荧光讯号会变化这一点而言，与图37(b)相同，然而，经第2标记物26标记的第2标的用探针25，由于是在第2标的检测温度T3，故会结合至源自第2标的核酸20的第1单链21，而第2标记物26的荧光讯号会变化。再者，第1标记物16与第2标记物26宜相同。
结果便是，若掌握起因于第2标记物26所致荧光讯号变化的差异，则可判定第2标记物20的有无(阳性/阴性)。
而且，如自以上说明所阐明，当可理解为使用置入有1种反应液的1个反应容器且在连贯不间断的步骤中，可检测复数个标的核酸。
以下将更具体显示透过QProbe(注册商标)法、Eprobe(注册商标)法、Taq Man(注册商标)法的使用了3种探针的检测复数核酸的实施方式。于实施所需的引物序列及各探针的碱基序列、核酸试料的情报亦一并显示。
(实施方式1)
<于QProbe法检测霉浆菌P1基因与内部控制>
进行于QProbe法的霉浆菌P1基因与内部控制的检测。
<材料及方法>
(引物)
在实施方式1的PCR法所使用的引物对是如(表1)所示。
[表1]
本实施例中PCR所使用的引物对
序列编号1、序列编号2是使用记载于Ieven等人的報告(The Journal O fInfectious Diseases,1996；173；1445-52)的(针对P1粘附蛋白(P1 adhesin)基因的引物对)序列。
(核酸试料)
将在实施方式1中PCR法所使用的核酸试料显示于下。
(pMYC)
是将编码源自霉浆菌肺炎病原体的肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia e)的膜蛋白质，即P1蛋白质，的基因片段(可以序列编号1与2的引物对扩增的序列)人工合成后，插入至pMD20T载体的质粒DNA。此质粒DNA是委托Takara Bio股份有限公司制作合成。
(pICM5)
是一为了可将序列编号1与2的引物对做成共通引物扩增，而将含有与引物对互补的碱基序列的序列人工合成后，插入至pMD20T载体而成的质粒DNA。此质粒DNA是委托Takara Bio股份有限公司制作合成。
(调制核酸试料)
上述质粒的长度，pMYC是2942bp、pICM5是2886bp。
从各质粒的长度与质粒溶液的浓度(μg/μl)计算每1μL的复制数后，使用TE缓冲溶液(10mM Tris-HCl、1.0mM EDTA pH8.0)，将pMYC稀释成1×10^5拷贝/μl、将pICM5稀释成1×10^3拷贝/μl。
(探针)
于实施方式1的PCR法所使用的探针情报是如(表2)所示。
[表2]
本实施例中PCR所使用的探针
序列编号3及序列编号4，是从可藉(表1)的引物对扩增的PCR产物的碱基序列，并参考使用了J-Bio21中心的首页上的QProbe设计支持工具计算的Tm值，选择出特定区域。
专一退火pMYC的QProbe，亦即MYC QP，与专一退火pICM5的QP robe，亦即IC QP，的荧光色素是使用BODIPY(注册商标)FL，并将各个3’末端的C进行标记。QProbe是委托日铁住金环境股份有限公司制作合成。
(PCR、荧光测定条件)
在实施方式1，针对在置入有1种反应液的1个反应容器中扩增的2个标的核酸而言，是将专一退火第1标的的pMYC的QProbe(MYC QP)的Tm值设定成较引物的Tm值还要高温，并在扩增反应中检测。
接着，将专一退火第2标的的pICM5的QProbe(IC QP)的Tm值设定成较扩增反应中的变化温度(70℃―95℃)还要低温，并在扩增反应后检测。
将PCR反应液组成、反应条件显示于(表3)与(表4)，又，将混合液的温度变化图表化显示于图1。
[表3]
QProbe法的反应液组成
※将上述调制成20μl
[表4]
QProbe法的反应条件
PCR及荧光测定是使用LightCycler(注册商标)nano(Roche Diagnostics股份有限公司)。
荧光测定时的激发波长与荧光波长的组合是选择510-528nm。在各循环的变性步骤(95℃)与延长步骤(72℃)测定荧光值，进一步，在扩增反应后，在用以检测第2标的的步骤(95℃与55℃)中进行荧光测定。
将扩增反应的最终循环，与在第2标的检测步骤中的荧光测定条件显示于图2。
(数据的处理方法)
随LightCycler nano所附的分析软件并不支持使用QProbe时的分析方法，因此是参考专利文献5(日本国特许第4724380号公报)所记载的方法，并对所得原始数据进行修正演算处理。
在全部每一个循环的扩增反应与第2标的检测步骤进行根据以下数学式的演算。
fn＝fhyb.n/fden.n(数1)
fe＝fhyb.e/fden.e(数1’)
fn：根据(数1)算出的在n循环中的荧光强度值
fhyb.n：第n循环的延长步骤的荧光强度值
fden.n：第n循环的变性步骤的荧光强度值
fe：根据(数1’)算出的在第2标的检测步骤中的荧光强度值
fhyb.e：第2标的检测步骤55℃的荧光强度值
fden.e：第2标的检测步骤95℃的荧光强度值
接着，针对全部循环的扩增反应，与第2标的检测步骤，透过以下的数学式进行演算。
Fn＝fn/f10(数2)
Fe＝fe/f10(数2’)
Fn：将第10循环的根据(数1)所得荧光强度值设定成1时的第n循环的相对值
Fe：将第10循环的根据(数1’)所得荧光强度值设定成1时的第2标的检测步骤的相对值
将扩增反应最终循环的Fn值，即F44，用于判定第1标的核酸的有无。
进一步，根据以下的数学式进行演算。
Fs＝Fe-F44(数3)
Fs：第2标的的测定值
将Fs的值用于判定第2标的核酸的有无。
于QProbe法的判定是以下述所示方法进行。
第1标的核酸的有无是将测定试料的F44值与阈值1进行比较，并将[测定试料的F44<阈值1]判定为阳性。
阈值1是使用将阴性对照(添加了TE取代DNA的试剂)的F44的平均值-标准偏差的3倍(以下mean-3SD)的值。
不论第1标的核酸为阳性、阴性，第2标的核酸的有无是将Fs的值与阈值2进行比较，将[Fs<阈值2]判定为阳性。
阈值2是使用仅添加了pMYC的试料的Fs的mean-3SD的值。判定方法的流程图是如图3所示。
在核酸试料中霉浆菌P1基因是使用pMYC、内部控制是使用pICM5，并实施PCR。
MYC QP的序列是将Tm值设定成72.5℃、IC QP的序列是将Tm值设定成57.5℃。因此，可推测在PCR中的温度范围(从70℃至95℃)，探针是仅有MYC QP会退火。
由于第2标的检测步骤的荧光测定是在95℃与较IC QP的Tm值还要低的55℃下进行，因此可推测第2标的检测步骤的测定值是会同时检测到MYCQP与IC QP的消光。
阴性对照的扩增曲线是直到PCR结束的第44循环都未见消光(因F44的值0.998并不低于阈值1的值0.997)，此时的mean-3SD会是0.997，并设为用以检测实施方式1的第1标的的阈值1，且显示于(表5)。将扩增曲线显示于图4。
第1标的核酸的pMYC的扩增曲线是从28循环附近有观察到伴随MYCQP的退火的消光。
F44的值0.913是较阈值1还要低，显示出pMYC的目的区域有扩增。此时的Fs的mean-3SD是-0.056，并设为用以检测第2标的的阈值2，且显示于(表5)。将扩增曲线显示于图5。
第2标的核酸的pICM5的扩增曲线是在扩增反应中完全未见消光(因F44的值0.997并不低于阈值1的值0.997)，Fs的值-0.118是较阈值2还要低。
根据此结果显示出，pMYC的目的区域没有扩增，与pICM5的目的区域有扩增。
将Fs的值显示于(表5)。将扩增曲线显示于图6。
[表5]
QProbe法的判定方法所使用的数值
※阈值1
※阈值2
添加有第1标的核酸的pMYC与第2标的核酸的pICM5两者时的扩增曲线，与pMYC的扩增曲线相同，从28循环附近可观察到伴随MYC QP的退火的消光，且F44的值0.912是较阈值1还要低，显示出pMYC的目的区域有扩增。
Fs的值-0.116是较阈值2还要低，显示出pICM5的目的区域有扩增。Fs的值显示于(表5)。扩增曲线显示于图7。
所述PCR产物在PCR结束后进行琼脂糖电泳，添加有pMYC的试料在206bp附近、添加有pICM5的试料在150bp附近可确认到目的PCR产物。
根据以上结果显示出，于QProbe法，组合探针的设计方法与温度变化程序，且在置入有1种反应液的1个反应容器使用单一荧光标记，可检测霉浆菌P1基因与内部控制。
(实施方式2)
<于变更了第2检测步骤的程序的QProbe法检测霉浆菌P1基因与内部控制>
以变更实施方式1的第2标的检测步骤的程序的方法来进行于QProbe法的霉浆菌P1基因与内部控制的检测。
于PCR使用的引物、探针、反应液组成与核酸试料是使用与实施方式1相同者。本方式的反应条件是如(表6)所示。
[表6]
第2标的检测步骤程序变更后的反应条件
在实施方式2，是在第2标的检测步骤且于55℃下进行荧光测定。将在扩增反应的最终循环，与在第2标的检测步骤时的荧光测定条件显示于图8。
在实施方式2中，fe是使用以下的演算，其他是进行与实施方式1相同的演算处理。
fe＝fhyb.e/fden.44
fe:第2标的检测步骤中的荧光强度值
fhyb.e：第2标的检测步骤55℃的荧光强度值
fden.44：最终循环的扩增反应的95℃的荧光强度值
以下显示实施方式2的判定方法。第1标的核酸的有无是将测定试料的F44的值与阈值3进行比较，将[测定试料的F44<阈值3]判定为阳性。
阈值3是使用将阴性对照的F44的平均值-标准偏差的3倍(以下mean-3SD)的值。
不论第1标的核酸为阳性、阴性，第2标的核酸的有无是将Fs的值与阈值4进行比较，将[Fs<阈值4]判定为阳性。
阈值4是使用仅添加了pMYC的试料的Fs的mean-3SD的值。
阴性对照的扩增曲线是直到扩增反应结束的第44循环都未见消光(因F44的值0.998并不低于阈值3的值0.997)，此时的mean-3SD会是0.997，并设为用以检测本例的第1标的的阈值3，且显示于(表7)。扩增曲线是如图9所示。
第1标的核酸的pMYC的扩增曲线是从28循环附近可观察到伴随MYCQP的退火的消光，且F44的值0.912是较阈值3还要低，显示出pMYC的目的区域有扩增。
又，此时的Fs的mean-3SD为-0.052，并设为用以检测第2标的的阈值4，且显示于(表7)。扩增曲线是如图10所示。
第2标的核酸的pICM5的扩增曲线是在扩增反应中完全未见消光(因F44的值0.997并不低于阈值3的值0.997)，Fs的值-0.170是较阈值4还要低。
根据此结果显示出，pMYC的目的区域没有扩增，与pICM5的目的区域有扩增。将Fs的值显示于(表7)。将扩增曲线显示于图11。
[表7]
第2标的检测步骤程序变更后的QProbe法判定方法所使用的数值
※1阈值3
※2阈值4
添加有第1标的核酸的pMYC与第2标的核酸的pICM5两者时的扩增曲线，与pMYC的扩增曲线相同，从28循环附近可观察到伴随MYC QP的退火的消光，且F44的值0.911是较阈值3还要低，显示出pMYC的目的区域有扩增。
Fs的值-0.114是较阈值4还要低，显示出pICM5的目的区域有扩增。将Fs的值显示于(表7)。将扩增曲线显示于图12。
根据以上结果显示出，即便在fe的算出使用最终循环的扩增反应的95℃的荧光强度值(fden.44)，仍可检测第2标的。
(实施方式3)
<于Eprobe法检测霉浆菌P1基因与内部控制>
进行于Eprobe法的霉浆菌P1基因与内部控制的检测。
于PCR使用的引物与核酸试料是使用与实施方式1相同者。于实施方式3的PCR法使用的探针情报是如(表8)所示。
[表8]
本实施例中PCR所使用的探针
Eprobe是参考使用了股份有限公司DNAFORM制作的软件「Edesign」计算的Tm值，选择出特定区域。
专一退火pMYC的Eprobe，即MYC EP，与专一退火pICM5的Eprobe，即IC EP，的荧光色素是使用D514，且MYC EP是将5’末端起第19个的T进行标记，IC EP是将5’末端起第9个的T进行标记。
Eprobe是委托Eurofins Genomics股份有限公司制作合成。将PCR反应液組成、反应条件显示于(表9)与(表10)。
[表9]
EProbe法的反应液组成
※将上述调制成20μl
[表10]
EProbe法的反应条件
荧光测定时的激发波长与荧光波长的组合是选择530-548nm。
于实施方式3的Fs是使用以下的演算，其他是进行与实施方式1相同的演算处理。
Fs＝Fe-F40
于实施方式3的判定是依以下所示方法进行。第1标的核酸的有无是将测定试料的F40的值与阈值5进行比较，将[测定试料的F40>阈值5]判定为阳性。
阈值5是使用将阴性对照的F40的平均值+标准偏差的3倍(以下mean+3SD)的值。
不论第1标的核酸为阳性、阴性，第2标的核酸的有无是将Fs的值与阈值6进行比较，将[Fs>阈值6]判定为阳性。
阈值6是使用仅添加了pMYC的试料的Fs的mean+3SD的值。判定方法的流程图是如图13所示。
MYC EP的序列是将Tm值设定成76.4℃，IC EP的序列是将Tm值设定成59.8℃。因此，可推测在PCR中的温度范围(从70℃至95℃)，探针是仅有MYC EP会退火。
又，由于第2标的检测步骤的荧光测定是在95℃与较IC EP的Tm值还要低的55℃下进行，因此可推测第2标的检测步骤的测定值是会同时检测到MYC EP与IC EP的发光。
阴性对照的扩增曲线是直到PCR结束的第40循环都未见发光(因F40的值1.007并不高于阈值5的值1.013)，此时的mean+3SD会是1.013，并设为用以检测第1标的核酸的阈值5，且显示于(表11)。将扩增曲线显示于图14。
第1标的核酸的pMYC的扩增曲线是从29循环附近可观察到伴随MYCEP的退火的发光，且F40的值2.314是较阈值5还要高，显示出pMYC的目的区域有扩增。
又，此时的Fs的mean+3SD为3.695，并设为用以检测第2标的的阈值6，且显示于(表11)。将扩增曲线显示于图15。
第2标的核酸的pICM5的扩增曲线是在扩增反应中完全未见发光(因F40的值1.012并不高于阈值5的值1.013)，Fs的值4.012是较阈值6还要高。
根据此结果显示出，pMYC的目的区域没有扩增，与pICM5的目的区域有扩增。将Fs的值显示于(表11)。将扩增曲线显示于图16。
[表11]
EProbe法的判定方法所使用的数值
※1阈值5
※2阈值6
添加有第1标的核酸的pMYC与第2标的核酸的pICM5两者时的扩增曲线，与pMYC的扩增曲线相同，从29循环附近可观察到伴随MYC EP的退火的发光，且F40的值2.355是较阈值5还要高，显示出pMYC的目的区域有扩增。
Fs的值4.254是较阈值6还要高，显示出pICM5的目的区域有扩增。将Fs的值显示于(表11)。将扩增曲线显示于图17。
根据以上结果显示出，于Eprobe法组合探针的设计方法与温度变化程序，并在置入有1种反应液的1个反应容器使用单一荧光标记，亦可检测霉浆菌P1基因与内部控制。
(实施方式4)
<于TaqMan探针法检测霉浆菌P1基因与内部控制>
进行于TaqMan探针法的霉浆菌P1基因与内部控制的检测。用于PCR的引物与核酸试料是使用与实施方式1相同者。
于实施方式4的PCR法所使用的探针情报是如(表12)所示。
[表12]
本实施例中PCR所使用的探针
TaqMan探针是参考使用了nearest neighbor法计算的Tm值，并选择出特定区域。
在专一退火pMYC的TaqMan探针，即MYC Taq，与专一退火pICM5的TaqMan探针，即ICTaq，的荧光色素，是分别在5’末端标记FAM(注册商标)、在3’末端标记TAMRA(注册商标)。
TaqMan探针是委托Takara Bio股份有限公司制作合成。将PCR反应液组成、反应条件显示于(表13)与(表14)。
[表13]
TaqMan探针法的反应液组成
※将上述调制成20μl
[表14]
TaqMan探针法的反应条件
荧光测定时的激发波长与荧光波长的组合是选择530-548nm。
在扩增反应后的用以检测第2标的的步骤，是在95℃与50℃下进行荧光测定。
在实施方式4，设fhyb.e：第2标的检测步骤50℃的荧光强度值，其他是进行与实施方式1相同的演算步骤。
实施方式4中的判定方法是进行如下所示方法。第1标的核酸的有无是将测定试料的F44的值与阈值7进行比较，将[测定试料的F44＞阈值7]判定为阳性。
阈值7是使用将阴性对照的F44的平均值+标准偏差的3倍(以下mean+3SD)的值。
不论第1标的核酸为阳性、阴性，第2标的核酸的有无是将Fs的值与阈值8进行比较，将[Fs＞阈值8]判定为阳性。
阈值8是使用仅添加了pMYC的试料的Fs的mean+3SD值。
MYC Taq的序列是将Tm值设定成75.8℃，IC Taq的序列是将Tm值设定成53.7℃。因此，可推测在PCR中的温度范围(从70℃至95℃)，探针是仅有MYC Taq会退火。
又，由于第2标的检测步骤的荧光测定是在95℃与较IC Taq的Tm值还要低的50℃下进行，因此可推测第2标的检测步骤的测定值是会同时检测到MYC Taq与IC Taq的发光。
阴性对照的扩增曲线是直到PCR结束的第44循环都未见发光(因F44的值1.028并不高于阈值7的值1.028)，此时的mean+3SD会是1.028，并设为用以检测第1标的核酸的阈值7，且显示于(表15)。将扩增曲线显示于图18。
第1标的核酸的pMYC的扩增曲线是从28循环附近可观察到伴随MYCTaq的退火的发光，且F44的值1.427较是阈值7还要高，显示出pMYC的目的区域有扩增。
又，此时的Fs的mean+3SD为0.110，并设为用以检测第2标的的阈值8，且显示于(表15)。将扩增曲线显示于图19。
[表15]
TaqMan探针法的判定方法所使用的数值
※1阈值7
※2阈值8
第2标的核酸的pICM5的扩增曲线是在扩增反应中完全未见发光(因F44的值1.028并不高于阈值7的值1.028)，Fs的值0.130是较阈值8还要高。
根据此结果显示出，pMYC的目的区域没有扩增，与pICM5的目的区域有扩增。
将Fs的值显示于(表15)。将扩增曲线显示于图20。
添加有第1标的核酸的pMYC与第2标的核酸的pICM5两者时的扩增曲线，与pMYC的扩增曲线相同，从29循环附近可观察到伴随MYC EP的退火的发光，且F40的值1.348是较阈值7还要高，显示出pMYC的目的区域有扩增。
Fs的值0.177是较阈值8还要高，显示出pICM5的目的区域有扩增。将Fs的值显示于(表15)。将扩增曲线显示于图21。
根据以上结果显示出，于TaqMan探针法组合探针的设计方法与温度变化程序，并在置入有1种反应液的1个反应容器使用单一荧光标记，亦可检测霉浆菌P1基因与内部控制。
(实施方式5)
<于使用了实际检体的QProbe法检测霉浆菌P1基因与内部控制>
进行使用了实际检体的于QProbe法的霉浆菌P1基因与内部控制的检测。
霉浆菌P1基因是使用了来自利用LAMP法(日本国特许第3313358号)而肺炎支原体被判定为阳性的(检查是委托股份有限公司BML)咽喉擦拭液，并使用QIAamp(注册商标)DNAmini Kit(QIAGEN公司)萃取的总DNA。
又，阴性试料方面，是使用了来自利用LAMP法而肺炎支原体被判定为阴性的咽喉擦拭液，并使用QIAamp DNA mini Kit萃取的总DNA。其他条件是与实施方式1相同来实施PCR。
对获得的原始数据进行与实施方式1相同的演算处理。
以下显示实施方式5的判定方法。第1标的核酸的有无是将测定试料的F44的值与阈值9进行比较，将[测定试料的F44<阈值9]判定为阳性。
阈值9是使用将阴性试料的F44的平均值-标准偏差的3倍(以下mean-3SD)的值。
不论第1标的核酸为阳性、阴性，第2标的核酸的有无是将Fs的值与阈值10进行比较，将[Fs<阈值10]判定为阳性。阈值10是使用阳性试料的Fs的mean-3SD值。
阴性试料的扩增曲线是直到PCR结束的第44循环都未见消光(因F44的值0.997并不低于阈值9的值0.997)，此时的mean-3SD会是0.997，并设为用以检测本例的第1标的的阈值9，且显示于(表16)。将扩增曲线显示于图22。
第1标的核酸的阳性试料的扩增曲线是从35循环附近可观察到伴随MYC QP的退火的消光，且F44的值0.951是较阈值9还要低，显示出pMYC的目的区域有扩增。
又，此时的Fs的mean-3SD为-0.132，并设为用以检测第2标的的阈值10，且显示于(表16)。将扩增曲线显示于图23。
第2标的核酸的pICM5的扩增曲线是在扩增反应中完全未见消光(因F44的值0.998并不低于阈值9的值0.997)，Fs的值-0.227是较阈值10还要低。
根据此结果显示出，pMYC的目的区域没有扩增，而pICM5的目的区域有扩增。将Fs的值显示于(表16)。将扩增曲线显示于图24。
于第1标的核酸的阳性试料添加有第2标的核酸的pICM5时的扩增曲线，与阳性试料的扩增曲线相同，从35循环附近可观察到伴随MYC QP的退火的消光，且F44的值0.953是较阈值9还要低，显示出pMYC的目的区域有扩增。
Fs的值-0.235是较阈值10还要低，显示出pICM5的目的区域有扩增。将Fs的值显示于(表16)。将扩增曲线显示于图25。
[表16]
使用了实际检体的QProbe法的判定方法所使用的数值
※1阈值9
※2阈值10
根据以上结果显示出，即便在实际的临床检体，组合探针的设计方法与温度变化程序，并在置入有1种反应液的1个反应容器使用单一荧光色素，亦可检测霉浆菌P1基因与内部控制。
本发明亦可应用在识别感染症的病原体的亚型或识别单碱基多型。
(实施方式6)
<于QProbe法检测披衣菌内生性质粒基因与淋病球菌CMT基因>
进行于QProbe法的披衣菌内生性质粒基因与淋病球菌CMT基因的检测。
(pCT)
将披衣菌感染症病原体的沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)共通的内生性质粒(pLGV440)基因片段人工合成后，插入至pUC57载体的质粒DNA，是委託北海道SystemScience股份有限公司制作合成。
(pNG)
将淋病病原体的奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)的胞嘧啶DNA甲基转移酶(cytosine DNA methyltransferase,CMT)基因片段人工合成后，插入至pUC57载体的质粒DNA，是委托北海道System Science股份有限公司制作合成。
上述质粒的长度，pCT是3064bp、pNG是3059bp。
从各质粒的长度与质粒溶液的浓度(μg/μl)计算每1μL的复制数后，使用TE缓冲溶液(10mM Tris-HCl、1.0mM EDTA pH8.0)，将pCT、pNG皆稀释成1×10^5拷贝/μl。
于实施方式6的PCR法所使用的引物对是如(表17)所示。
[表17]
本实施例中PCR所使用的引物对
于实施方式6的PCR法所使用的探针情报是如(表18)所示。
[表18]
本实施例中PCR所使用的探针
CT QP是从可藉序列编号6与序列编号7的引物对扩增的PCR产物的碱基序列，并参考使用日铁住金环境股份有限公司J-Bio21中心的首页上的QProbe设计支持工具计算的Tm值，选择出特定区域。
NG QP是从可藉序列编号8与序列编号9的引物对扩增的PCR产物的碱基序列，并参考使用J-Bio21中心的首页上的QProbe设计支持工具计算的Tm值，选择出特定区域。
专一退火pCT的QProbe，即CT QP，与专一退火pNG的QProbe，即NG QP，的荧光色素是分别使用BODIPY(注册商标)FL，并分别将3’末端的C进行标记。
QProbe是委托日铁住金环境股份有限公司制作合成。将PCR反应液组成、反应条件显示于(表19)与(表20)。
[表19]
反应液组成
※将上述调制成20μl
[表20]
2项目(CT NG)的QProbe法的反应条件
荧光测定时的激发波长与荧光波长的组合是选择510-528nm。
在各循环的变性步骤(95℃)与延长步骤(68℃)测定荧光值，进一步，在扩增反应后，在用以检测第2标的的步骤(95℃与55℃)中进行荧光测定。
对获得的原始数据进行与实施方式1相同的演算处理。
以下将显示本实施方式的判定方法。第1标的核酸的有无是将测定试料的F44值与阈值11进行比较，并将[测定试料的F44＜阈值11]判定为阳性。
阈值11是使用将阴性对照的F44的平均值-标准偏差的3倍(以下mean-3SD)的值。
不论第1标的核酸为阳性、阴性，第2标的核酸的有无是将Fs的值与阈值12进行比较，并将[Fs＜阈值12]判定为阳性。
阈值12是使用仅添加了pNG的试料的Fs的mean-3SD的值。
CT QP的序列是将Tm值设定成73.4℃，NG QP的序列是将Tm值设定成62.5℃。因此，可推测在PCR中的温度范围(从68℃至95℃)，探针是仅有CT QP会退火。
又，由于第2标的检测步骤的荧光测定是在95℃与较NG QP的Tm值还要低的55℃下进行，因此可推测第2标的检测步骤的测定值是会同时检测到CT QP与NG QP的发光。
阴性对照的扩增曲线是直到PCR结束的第44循环都未见消光(因F44的值0.998并不低于阈值11的值0.996)，此时的mean-3SD会是0.996，并设为用以检测本例的第1标的的阈值11，且显示于(表21)。将扩增曲线显示于图26。
第1标的核酸的pCT的扩增曲线是从28循环附近可观察到伴随CT QP的退火的消光，且F44的值0.720是较阈值11还要低，显示出pCT的目的区域有扩增。
又，此时的Fs的mean-3SD为-0.039，并设为用以检测第2标的的阈值12，且显示于(表21)。将扩增曲线显示于图27。
第2标的核酸的pNG的扩增曲线是在扩增反应中完全未见消光(因F44的值0.998并不低于阈值11的值0.996)，Fs的值-0.065是较阈值12还要低。
根据此结果显示出，pCT的目的区域没有扩增，与pNG的目的区域有扩增。将Fs的值显于(表21)。将扩增曲线显示于图28。
[表21]
2项目的QProbe法的判定方法所使用的数值
※1阈值11
※2阈值12
添加有第1标的核酸的pCT与第2标的核酸的pNG两者时的扩增曲线，与pCT的扩增曲线相同，从28循环附近可观察到伴随CT QP的退火的消光，且F44的值0.729是较阈值11还要低，显示出pCT的目的区域有扩增。
Fs的值-0.111是较阈值12还要低，显示出pNG的目的区域有扩增。将Fs的值显示于(表21)。将扩增曲线显示于图29。
根据以上结果显示出，即便于2项目的基因中，组合探针的设计方法与温度变化程序，并在置入有1种反应液的1个反应容器使用单一荧光色素，亦可检测霉浆菌P1基因与内部控制。
(实施方式7)
<在扩增反应中检测复数次第2标的的于QProbe法检测霉浆菌P1基因与内部控制>
不仅将第2标的检测步骤在最终循环之后进行，亦以插入于扩增反应中的方法进行于QProbe法的霉浆菌P1基因与内部控制的检测。
于PCR使用的引物、探针、反应液组成与核酸试料是使用与实施方式1相同者。反应条件是如(表22)所示。
[表22]
实施例7的第2标的检测步骤的QProbe法的反应条件
又，将扩增反应的温度变化图表化显示于图30。
在实施方式7的分析中是进行以下的演算，其他则进行与实施方式1相同的步骤。
fen＝fhyb.en/fden.en(数4)
fen：根据(数4)算出的在第n次第2标的检测步骤中的荧光强度值
fhyb.en：第n次第2标的检测步骤55℃的荧光强度值
fden.en：第n回次第2标的检测步骤95℃的荧光强度值
Fen＝fen/f10(数5)
Fen：将第10循环的根据(数4)所得荧光强度值设定成1时的第n次第2标的检测步骤的相对值
Fs1＝Fe1-F20(数6)
Fs2＝Fe2-F27(数6’)
Fs3＝Fe3-F34(数6”)
Fs4＝Fe4-F41(数6”’)
Fs1：第1次第2标的检测步骤的测定值
Fs2：第2次第2标的检测步骤的测定值
Fs3：第3次第2标的检测步骤的测定值
Fs4：第4次第2标的检测步骤的测定值
判定是以下述所示方法进行。第1标的核酸的有无是将测定试料的F41值与阈值13进行比较，并将[测定试料的F41<阈值13]判定为阳性。
阈值13是使用将阴性对照的F41的平均值-标准偏差的3倍(以下mean-3SD)的值。
第2标的核酸的有无，在第1次第2标的检测步骤是将[Fs1<阈值14]判定为阳性。
阈值14是使用仅添加有pMYC的试料的Fs1的mean-3SD值。
在第2次第2标的检测步骤是将[Fs2<阈值15]判定为阳性。
阈值15是使用仅添加有pMYC的试料的Fs2的mean-3SD值。
在第3次第2标的检测步骤是将[Fs3<阈值16]判的为阳性。
阈值16是使用仅添加有pMYC的试料的Fs3的mean-3SD值。
在第4次第2标的检测步骤是将[Fs4<阈值17]判定为阳性。
阈值17是使用仅添加有pMYC的试料的Fs4的mean-3SD值。
阴性对照的扩增曲线，在各第2标的检测步骤之外，是直到PCR结束的第41循环都未见消光(因F41的值0.999并不低于阈值13的值0.998)，此时的mean-3SD会是0.998，并设为用以检测本例的第1标的检测的阈值13，且显示于(表23)。将扩增曲线显示于图31。
第1标的核酸的pMYC的扩增曲线是从30循环附近可观察到伴随MYCQP的退火的消光，且F41的值0.892是较阈值13还要低，显示出pMYC的目的区域有扩增。
又，此时的Fs1的mean-3SD为-0.058、Fs2的mean-3SD为-0.070、Fs3的mean-3SD为-0.080、Fs4的mean-3SD为-0.087，且分别设为用以检测第2标的的阈值14、15、16、17，并显示于(表23)。将扩增曲线显示于图32。
[表23]
实施例7的第2标的检测步骤的QProbe法的判定方法所使用的数值
※1阈值13
※2阈值14
※3阈值15
※4阈值16
※5阈值17
第2标的核酸的pICM5的扩增曲线，在各第2标的检测步骤之外，在扩增反应中是完全未见消光(因F41的值0.999并不低于阈值13的值0.998)，Fs1的值-0.058是较阈值14还要高，显示出pICM5的目的区域直到第1次第2标的检测步骤并未扩增到检测界限以上。
Fs2的值-0.057亦较阈值15还要高，显示出pICM5的目的区域直到第2次第2标的检测步骤并未扩增到检测界限以上。
Fs3的值-0.084是较阈值16还要低，显示出pICM5的目的区域直到第3次第2标的检测步骤扩增到检测界限以上。
Fs4的值-0.192亦较阈值17还要低。将Fs1、Fs2、Fs3、Fs4的值显示于(表23)。将扩增曲线显示于图33。
添加有第1标的核酸的pMYC与第2标的核酸的pICM5两者时的扩增曲线，与pMYC的扩增曲线相同，从30循环附近可观察到伴随MYC QP的退火的消光，且F41的值0.897是较阈值13还要低，显示出pMYC的目的区域有扩增。
Fs1的值-0.058是较阈值14还要高，显示出pICM5的目的区域直到第1次第2标的检测步骤并未扩增到检测界限以上。
Fs2的值-0.068亦较阈值15还要高，显示出pICM5的目的区域直到第2次第2标的检测步骤并未扩增到检测界限以上。
Fs3的值-0.109是较阈值16还要低，显示出pICM5的目的区域直到第3次第2标的检测步骤扩增到检测界限以上。
Fs4的值-0.154亦较阈值17还要低。Fs1、Fs2、Fs3、Fs4的值是如(表23)所示。将扩增曲线显示于图34。
根据以上结果显示出，不仅将第2标的检测步骤在最终循环之后，于插入至扩增反应中的方法亦可检测霉浆菌P1基因与内部控制。
附图简单说明
图1是显示本发明实施方式1中混合液的温度变化的图表。
图2是本发明实施方式1中荧光测定的时间说明图。
图3是显示本发明实施方式1中判定方法的流程图。
图4是显示本发明实施方式1中阴性对照的荧光强度变化的图表。
图5是显示本发明实施方式1中第1标的核酸的荧光强度变化的图表。
图6是显示本发明实施方式1中第2标的核酸的荧光强度变化的图表。
图7是显示本发明实施方式1中第1、第2标的核酸的荧光强度变化的图表。
图8是本发明实施方式2中荧光测定的时间说明图。
图9是显示本发明实施方式2中阴性对照的荧光强度变化的图表。
图10是显示本发明实施方式2中第1标的核酸的荧光强度变化的图表。
图11是显示本发明实施方式2中第2标的核酸的荧光强度变化的图表。
图12是显示本发明实施方式2中第1、第2标的核酸的荧光强度变化的图表。
图13是显示本发明实施方式3中判定方法的流程图。
图14是显示本发明实施方式3中阴性对照的荧光强度变化的图表。
图15是显示本发明实施方式3中第1标的核酸的荧光强度变化的图表。
图16是显示本发明实施方式3中第2标的核酸的荧光强度变化的图表。
图17是显示本发明实施方式3中第1、第2标的核酸的荧光强度变化的图表。
图18是显示本发明实施方式4中阴性对照的荧光强度变化的图表。
图19是显示本发明实施方式4中第1标的核酸的荧光强度变化的图表。
图20是显示本发明实施方式4中第2标的核酸的荧光强度变化的图表。
图21是显示本发明实施方式4中第1、第2标的核酸的荧光强度变化的图表。
图22是显示本发明实施方式5中阴性对照的荧光强度变化的图表。
图23是显示本发明实施方式5中第1标的核酸的荧光强度变化的图表。
图24是显示本发明实施方式5中第2标的核酸的荧光强度变化的图表。
图25是显示本发明实施方式5中第1、第2标的核酸的荧光强度变化的图表。
图26是显示本发明实施方式6中阴性对照的荧光强度变化的图表。
图27是显示本发明实施方式6中第1标的核酸的荧光强度变化的图表。
图28是显示本发明实施方式6中第2标的核酸的荧光强度变化的图表。
图29是显示本发明实施方式6中第1、第2标的核酸的荧光强度变化的图表。
图30是显示本发明实施方式7中混合液的温度变化的图表。
图31是显示本发明实施方式7中阴性对照的荧光强度变化的图表。
图32是显示本发明实施方式7中第1标的核酸的荧光强度变化的图表。
图33是显示本发明实施方式7中第2标的核酸的荧光强度变化的图表。
图34是显示本发明实施方式7中第1、第2标的核酸的荧光强度变化的图表。
图35是本发明实施方式1中温度变化的扩大图。
图36是显示本发明实施方式1中混合液成分的说明图。
图37(a)本发明实施方式1中变性步骤的说明图，图37(b)是本发明实施方式1中退火步骤的说明图，图37(c)是本发明实施方式1中延长步骤的说明图，图37(d)是本发明实施方式1中延长结束步骤的说明图。
图38(a)是本发明实施方式1中变性步骤的说明图，图38(b)是本发明实施方式1中退火步骤的说明图。
符号说明
1 容器
2 溶液
10 第1标的核酸
13 第1标的用F引物
14 第1标的用R引物
15 第1标的用探针
16 第1标记物
20 第2标的核酸
23 第2标的用F引物
24 第2标的用R引物
25 第2标的用探针
26 第2标记物
30 DNA聚合酶
31 脱氧核糖核苷三磷酸
T0 变性温度
T1 退火温度
T2 延长温度
T3 第2标的检测温度

Claims (7)

1.一种复数个标的核酸的检测套组，其特征在于，令变性温度为T0、退火温度为T1、延长温度为T2、第2标的检测温度为T3时，设定温度满足T0>T2≧T1>T3，
于可含有在前述变性温度T0下，双链的氢键被切断而分别解离成2条单链的第1标的核酸及第2标的核酸的溶液中，含有下述组分：
第1标的用引物，其在前述退火温度T1下，对前述第1标的核酸解离成的2条单链的任一者专一结合；
第2标的用引物，其在前述退火温度T1下，对前述第2标的核酸解离成的2条单链的任一者专一结合；
第1标的用探针，其在前述退火温度T1下，对前述第1标的核酸解离成的2条单链的任一者专一结合，且具有荧光讯号因结合而变化的第1标记物；
DNA聚合酶；
脱氧核糖核苷三磷酸，其在前述延长温度T2下，透过前述DNA聚合酶的作用，结合至前述第1标的核酸解离成的2条单链及前述第2标的核酸解离成的2条单链；
第2标的用探针，其在前述退火温度T1下，不结合至前述第1标的核酸解离成的2条单链及前述第2标的核酸解离成的2条单链的任一者，且在前述第2标的检测温度T3下，对前述第2标的核酸解离成的2条单链的任一者专一结合，并且具有荧光讯号因结合而变化的第2标记物。
2.如权利要求1的复数个标的核酸的检测套组，其中，前述第1标记物及前述第2标记物是选自于由QProbe(注册商标)探针、Eprobe(注册商标)探针及TaqMan(注册商标)探针构成的群组。
3.如权利要求1或2的复数个标的核酸的检测套组，其中前述荧光讯号是退火和消光讯号。
4.如权利要求1或2的复数个标的核酸的检测套组，其中前述荧光讯号是退火和发光讯号。
5.如权利要求1至4中任一项的复数个标的核酸的检测套组，其中前述第1标的核酸为霉浆菌P1基因，前述第2标的核酸为内部控制。
6.如权利要求1至4中任一项的复数个标的核酸的检测套组，其中前述第1标的核酸为披衣菌内生性质粒基因，前述第2标的核酸为淋病球菌CMT基因。
7.一种使用如权利要求1至6中任一项的测定复数个标的核酸的检测套组的检测方法，其含有下述步骤：
解离步骤，其是将前述溶液的温度提升至前述变性温度T0，使疑似含有的前述第1标的核酸及前述第2标的核酸分别解离成2条单链；
第1标的核酸检测步骤，其是将前述溶液的温度降至前述退火温度T1，并基于源自前述第1标的用探针的荧光讯号，检测第1标的核酸的存在与否；
扩增步骤，其是将前述溶液的温度调整成前述延长温度T2后，将疑似含有的前述第1标的核酸及前述第2标的核酸解离，并将各个2条单链扩增成双链的第1标的核酸及第2标的核酸；
第2标的核酸检测步骤，其是将前述溶液的温度降至前述第2标的检测温度T3，并基于源自前述第2标的用探针的荧光讯号，检测第2标的核酸的存在与否。
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