JP2021532802A - リアルタイムpcrを実施する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の利点
本発明は、試料核酸および参照核酸を好ましくは別々の反応バッチ中で増幅する、核酸の増幅プロセスを実施する方法を提供する。本発明によると、増幅信号をリアルタイムで観察し、増幅サイクルの数および/または増幅プロセスの持続時間を増幅信号に応じて動的に調整する。増幅信号を観察するために、それ自体が既知の方法で信号を検知することができ、その際、核酸の生じた増幅を検知可能にするために、蛍光プローブを使用することが好ましい。ここで、このシステムを、増幅された産物の量に比例して蛍光が増加するように設定することができ、その際、さまざまな蛍光色素を使用することができる。例えば、シアニン色素(例えば、SYBR(登録商標)GreenまたはPicoGreen(登録商標))などのDNA色素が使用され得て、これらは、二本鎖DNAに埋め込まれる。別の可能性としては、ドナー蛍光色素がアクセプター蛍光色素と相互作用する、いわゆるFRETプローブ(Foerster共鳴エネルギー伝達:Foerster-Resonanzenergietransfer)がある。検知および評価された増幅信号が対照と比べられ、これに基づいて、増幅サイクルの数および/または増幅プロセスの持続時間が、増幅信号に応じて動的に調整される。すなわち、本発明の本質は、試料および参照または対照の増幅信号を、リアルタイムまたはプロセスの過程におけるいくつかの時点で検知および評価し、これに基づいて、特に増幅サイクルの数および/または増幅プロセスの持続時間を動的に調整することにより、予め定義された動作を実施することにある。
図1は、本発明による方法によるリアルタイムPCR10のフローを概略的に示す。PCRプロセスの開始11後に、PCRサイクルが開始され、その際、これらの個々のステップは、サーマルサイクラー内の温度を制御することにより行われる。一定の間隔で、特にPCRサイクル内の定義された時点(または等温増幅プロセスにおける特定の時点に応じて)に、増幅信号が検出され、例えば蛍光画像として撮影されて評価される。それぞれの適切な時点の選択は、例えば、それぞれ使用されるプローブに依存し得る。ここに示される例では、例えば各結合ステップの後に測定が行われる。しかしながら、ほとんどの場合、各伸長ステップの後に測定が行われる。各PCRサイクルは、テンプレートDNAを変性させるステップ12を含む。テンプレートDNAとしては、別々の反応バッチにおいて、試料核酸および参照核酸が使用される。変性ステップ12の後に、各プライマーはステップ13で結合(アニーリング)される。続いて、この例では、増幅信号がステップ14で測定される。測定された信号は、ステップ15で評価され、その際、測定された信号が「増幅」と分類されるかどうかについて特に調べられる。その後、特に参照試料と比較して、さらなるPCRサイクルが実施されるかどうかが決定される。例えば、ステップ15において、測定された信号がバックグラウンドとして分類されること、すなわち「増幅」として分類されないことが確認されたら、PCRサイクルは、伸長ステップ16から続行される。続いて、新しいPCRサイクルが、変性ステップ12から再開される。しかしながら、ステップ15において、測定された信号がバックグラウンド信号として評価されずに、「増幅」と分類されることが確認されたら、PCRプロセスを停止することができ、その際、必要に応じて、形成されたPCR産物のさらなる分析および評価が行われ得る(ステップ17)。
仮説H1:BG1=BG2
仮説H0:BG1≠BG2
部分図Bのように、P(H1)>P(H0)の場合、有意差は存在せず、増幅は起こらなかった。増幅プロセスは続行される。それに対して、現在のデータポイントによりバックグラウンドが有意に変化する場合(P(H1)<P(H0))、部分図Cに図示されるように増幅が想定される。この情報は、増幅プロセスにおけるさらなる過程の基礎であり、プロセスを終了することができる。
Claims (15)
- 試料核酸(31;51;61;71)および参照核酸(32〜35;52〜54;62〜64、72〜73)を別々の反応バッチ中で増幅する、核酸(10)の増幅プロセスを実施する方法において、増幅信号をリアルタイムで観察し、増幅サイクルの数および/または前記増幅プロセスの持続時間を前記増幅信号に応じて動的に調整することを特徴とする、方法。
- 核酸の前記増幅をリアルタイムPCRの領域で実施し、前記増幅サイクルがPCRサイクルであることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 予め設定可能な最小数の前記増幅サイクルおよび/または予め設定可能な最小持続時間の前記増幅プロセスが実施されたら前記増幅信号の観察および/または評価をリアルタイムで開始することを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
- 前記試料核酸の前記増幅の信号強度が前記参照核酸の前記増幅の信号強度に到達しかつ/またはこれを上回ったら前記プロセスを終了することを特徴とする、請求項1から3までのいずれか1項記載の方法。
- 予め設定可能な最大数の前記増幅サイクルおよび/または予め設定可能な最大持続時間の前記増幅プロセスが実施されたら前記プロセスを停止することを特徴とする、請求項1から4までのいずれか1項記載の方法。
- 前記増幅信号を、それぞれ実施される前記増幅サイクルに対して、および/または設定可能な時点に対して観察し、前記信号が有意に増加した場合、各サイクルまたは各時点を「増幅」と分類し、評価に際して、前記試料核酸および前記参照核酸の間の分類比較を用いることを特徴とする、請求項1から5までのいずれか1項記載の方法。
- 前記増幅プロセスの結果を指標ベクトル表記として評価し、その際、「増幅」と分類されたサイクルまたは時点が指標値「1」に割り当てられ、他のサイクルまたは時点が指標値「0」に割り当てられることを特徴とする、請求項6記載の方法。
- 前記方法により、前記試料核酸(31)の初期量を特定および/または制御し、その際、少なくとも2つの比較試料(32〜35)を、定義された初期量の前記参照核酸と並行して一緒に処理することを特徴とする、請求項1から7までのいずれか1項記載の方法。
- 前記方法を感染症検出として使用し、その際、感染症検出の検出下限を表す濃度の検出すべき核酸を有する少なくとも1つの比較試料(52)を並行して一緒に処理することを特徴とする、請求項1から8までのいずれか1項記載の方法。
- 前記方法を変異体検出として使用し、その際、検出すべき変異体100%の割合を含む定義された濃度の核酸を有する比較試料(64)と、検出すべき変異体0%の割合を含む定義された濃度の核酸を有する比較試料(62)とを一緒に処理することを特徴とする、請求項1から9までのいずれか1項記載の方法。
- 前記方法を全ゲノム増幅に使用し、その際、参照ゲノムの核酸濃度が定義された少なくとも1つの第1の比較試料(73)を一緒に処理することを特徴とする、請求項1から10までのいずれか1項記載の方法。
- 増幅すべき核酸なしの第2の比較試料(72)および/または参照ゲノムの核酸量が定義された第3の比較試料(74)を追加的に一緒に処理し、その際、前記第3の比較試料の定義された量が、前記全ゲノム増幅における増幅産物の所望の目標量に相応し、前記第3の比較試料の反応バッチが、増幅酵素を含まず、かつ前記増幅信号が、二本鎖DNAに埋め込まれる蛍光色素の使用に基づくことを特徴とする、請求項11記載の方法。
- 前記方法を前増幅の制御のために使用することを特徴とする、請求項11または12記載の方法。
- 前記増幅プロセスが、第1のマルチプレックスPCRおよび少なくとも1つの第2のシングルプレックスPCRによる入れ子PCRであり、その際、前記方法により、前記第1のマルチプレックスPCRにおいて増幅される核酸の量を制御することを特徴とする、請求項1から13までのいずれか1項記載の方法。
- 核酸の増幅プロセスを制御するコンピュータプログラムにおいて、請求項1から14までのいずれか1項記載の方法を実施するように設定されていることを特徴とする、コンピュータプログラム。
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