KR101605673B1 - 데옥시유리딘을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 udg 표지자로서의 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본원은 형광염료 및 형광소거제로 표지된 하나 이상의 dUMP를 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 핵산 증폭 반응의 오염 방지용 조성물 및 핵산 증폭 반응의 오염 방지 방법을 개시한다. 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드 및 방법은 UDG의 활성을 형광검출장치를 이용하여 신속하고 간편하게 UDG 효소 활성 여부를 실시간으로 모니터링 할 수 있어, 핵산 검출에서 발생할 수 있는 위양성을 방지하여 결과의 신뢰도를 높일 수 있다.

Description

데옥시유리딘을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 UDG 표지자로서의 그 용도 {Polynucleotides comprising deoxyuridine and its use as UDG indicator}
본원은 핵산 증폭과정에서 발생하는 오염을 방지하는 기술에 관한 것이다.
분자생물학의 발전과 더불어 다양한 목적을 위해, 검체에 존재하는 핵산을 검출한다. 가장 널리 사용되는 핵산 검출 방법은 폴리머라제 연쇄반응을 이용한 것으로, 이는 검체에 존재하는 소량의 핵산물질을 증폭하여 사용한다.
핵산 증폭에 있어 가장 심각한 문제는 오염물질로 인한 위양성(false positive)이다. 이는 핵산증폭의 민감성에 기인하기 때문에 일반적으로 반응시약 에 검체의 오염을 방지하기 위해 다양한 방법이 연구되어왔다.
미국 특허 제6,541,204호는 증폭반응물에서 핵산 오염 (carry-over contamination)을 제거하는 방법에 관한 것으로, 내열성을 갖는 DNA 분해효소를 사용하여, 오염된 이중가닥 DNA를 제거하여 위양성을 제거하는 기술에 관하여 개시한다.
미국 공개 특허공보 제2008-0311627호는 핵산 증폭 반응에서 오염제거 방법 및 조성물에 관한 것으로, 선행 반응에서 유래한 오염물의 제거를 위해 오염물에는 완벽한 상보적 염기를 포함하지만, 표적에는 비상보적인 염기를 포함하는 프라이머를 사용한 오염 제거 방법을 개시한다.
미국 공개특허 공보 제2003-0077637호는 UDG를 이용한 핵산 증폭 반응의 오염 조절방법에 관한 것으로 dUTP의 핵산으로의 편입 및 유라실 DNA 글리코실라제 (UDG)를 사용한 유라실 염기의 제거 방법을 개시한다.
그러나 실제로 UDG 가 증폭반응에 적용되어 있다고 해도 해당 실험 결과가 오염에 의한 것인지, 아니면 실제로 검체에 존재하는 핵산에 의한 것인지를 확실히 판별하기 어렵다. 이는 일반적으로 단순히 UDG가 PCR 시약에 포함되어 있기 때문에 오염이 제거되었다고 추측할 뿐, UDG에 의해 오염된 DNA가 제거된다는 것을 나타내는 실험적 증거가 없기 때문이다.
실제로, 일반적인 실시간 PCR에서는 UDG에 의해, 오염된 DNA에 포함된 U 염기가 제거되고 궁극적으로 오염 DNA가 분해되어 증폭의 주형으로 사용되지 않았다는 정보를 얻을 수 없다. 이를 확인하기 위해서는 UDG를 넣은 실험군, UDG를 넣지 않은 실험군, dU 를 포함하고 있는 DNA 증폭 산물, 그리고 dU를 포함하지 않은 DNA 증폭산물 등의 여러 가지 대조군들을 함께 실험하여야 한다. 그러나 이러한 방법은 주로 신속한 확인이 요구되는 핵산 검출에 있어, 비용 증가 및 효율성 저하의 문제를 가져온다. 또한, 시약의 보관 문제에 의해 UDG 효소의 활성이 소실된 경우, 위양성 PCR 증폭이 일어나 결과 판독에 커다란 문제점을 야기할 염려가 있다.
따라서 위양성 증폭 여부를 보다 신속하고 정확하게 확인할 수 있는 기술개발이 요구된다.
본원은 핵산 증폭에서 오염 방지에 사용되는 유라실 DNA 글리코실라제 활성여부를 실시간으로 확인할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
본원은 핵산 증폭에서 오염 방지에 사용되는 유라실 DNA 글리코실라제 활성여부를 실시간으로 확인할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 UDG 활성 표지자용의 연속 또는 비연속적인 하나 이상의 dUMP를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 dUMP를 사이에 두고 5’및 3’의 각 방향의 뉴클레오사이드가 각각 형광염료 및 형광소거제, 또는 각각 형광소거제 및 형광염료로 표지된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 dUMP를 포함하는 한 UDG가 활성을 나타낼 수 있는 다양한 길이를 포함한다. 일 구현예에서는 폴리뉴클레오타이드는 약 3 nt 내지 100 nt의 길이이다. 일 구현예에서는 5’ GCCCTGAGTACAGGGUAGTCGTCAGTG 3'; 5' TACCGCUCACGCACC 3'; 또는 5' TGCTAGUGTGCGGUGTACTC 3'이나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서, dUMP의 갯수는 1개 이상부터 상기 폴리뉴클레오타이드를 이루는 뉴클레오타이드의 100% 까지로 포함될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드 및/또는 UDG를 포함하는 UDG 활성 확인용 키트를 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드 및 UDG를 사용하는 것을 특징으로 하는, 증폭반응의 위양성 여부를 확인하는 방법을 제공한다.
본원에 따른 폴리뉴클레오타이드 및 방법은 UDG의 활성을 형광검출기, 예를 들면 Flourometer, 실시간 PCR 장치를 이용하여 신속하고 간편하게 UDG 효소 활성 여부를 실시간으로 모니터링 할 수 있어 핵산 검출에서 발생할 수 있는 위양성을 방지하여 결과의 신뢰도를 높일 수 있다.
도 1은 본원의 일 구현예에 따른 형광염료 및 소거제로 표지된 유라실 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본원의 일 구현예에 따른 UDG의 양에 따른 형광염료 및 소거제로 표지된 유라실 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에서 방출되는 형광신호 검출 결과이다.
도 3은 본원의 일 구현예에 따른 기질의 길이에 따른 UDG활성 측정 민감도 실험 결과이다.
도 4는 PCR 반응 시약에 형광염료 및 소거제로 표지된 유라실 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 함께 첨가하여 실시간 PCR을 수행한 결과이다. 그래프는 반응주기가 진행됨에 따라 UDG에 의해 dU가 제거되어 나타나는 형광 신호 (청색 라인)와 표적 DNA 가 정상적으로 증폭되어 나타나는 형광신호 (보라색)를 나타낸다.
도 5는 dG 호모폴리머 기질의 길이에 따른 UDG 활성 검출 효율 확인한 결과이다.
도 6은 기질의 양에 따른 UDG 활성에 대한 민감도 변화를 확인한 결과이다.
도 7은 기질에 포함된 U 갯수에 따른 UDG 활성에 대한 민감도 변화를 확인한 결과이다.
본원은 형광신호를 방출할 수 있는 dU를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 표지자 (indicator)를 이용하여 UDG 활성여부를 간편하게 측정할 수 있다는 발견에 기초한 것이다.
PCR과 같은 증폭 반응에서는 실제 주형이 아닌, 이미 한번 증폭된 산물이 검체에 오염되어 증폭되는 경우가 빈번하게 발생하고, 이로 인해 위양성 (false positive)이 초래된다. 이를 방지하기 위해, 통상적으로, 증폭된 DNA는 dUTP를 포함하도록 하고, 새로운 증폭반응에서 증폭된 DNA의 오염물은 반응 초기에 UDG에 의해 제거되고, 그 뒤 UDG는 불활성화된다. 하지만 기존 PCR 등과 같은 증폭반응에서는 PCR 시약에 포함된 오염 제거제인 UDG가 적절히 작용하고 있는지를 확인할 수 없다. 따라서 어떤 이유에 의해 UDG 활성이 소실된 경우 오염에 의한 위양성 증폭이 일어나도 이를 확인할 수 있는 방법이 없었다.
본원에 따른 폴리뉴클레오타이드는 핵산 증폭에서 오염물 방지에 사용되는 유라실 DNA 글리코실라제 활성 여부를 실시간으로 확인할 수 있어, 실제 오염 물질이 제거되고 있는지를 나타내주는 표지자 (indicator)로서 작용한다.
따라서 한 양태에서 본원은 하기 식의 UDG 활성 표지자용 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
X-N-Y
상기 식에서 X 및 Y는 각각 동일 또는 상이하며, dA, dT, dG 또는 dC 중 어느 하나의 뉴클레오타이드이고, 상기 N은 적어도 하나의 U를 포함하는 길이 2 내지 40 폴리뉴클레오타이드이며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 5' 및 3’의 각 방향의 뉴클레오사이드가 각각 형광염료 및 형광소거제, 또는 각각 형광소거제 및 형광염료로 표지되어 있다.
UDG는 ssDNA 또는 dsDNA 모두 작용하기 때문에 헤어핀과 같은 이차구조에도 작용을 한다. 또한 UDG가 접근 가능할 수 있는 한 구조에 큰 영향을 받지 않는다. 또한 dUMP가 포함되기만 하면 활성을 나타내기 때문에 본원의 폴리뉴클레오타이드에 포함되는 dUMP의 갯수 및 위치는 다양할 수 있다. 연속적, 비연속적의 하나 이상의 dUMP가 포함될 수 있으며, dUMP 만으로 구성된 호모폴리머 즉 전체 폴리뉴클레오타이드의 100%까지도 포함될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따른 폴리뉴클레오타이드는 목적하는 표적 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 DNA 프로브로, 검출하고자 하는 표적 서열에 따라, 다양한 서열 및 길이를 가질 수 있다. 즉 본원의 목적을 달성하는 한 다양한 서열 및 길이를 가질 수 있으며, 한 구현예에서 N은 2 내지 30mer이며, 특히 2 내지 8mer이다. 다른 구현예에서 N은 U을 제외한 나머지 폴리뉴클레오타이드가 4개 이상의 dGTP의 호모폴리머를 포함하지 않는다. 또다른 구현예에서는 헤어핀 구조를 형성하지 않는 서열을 포함한다. 본원에 따른 일 구현예에서, 5’-CCC TGA GTA CAG GGU AGT CGT CAG TG-3’; 5’-CAG TTG TAA CUA TAT ACT TA-3’; 5‘-CTT AGT TCG AUC GTA ATG TGA-3; 5’-ATG AGC ACAT UGT GGC GCT A-3’; 5’-TCC AUG UAG GC-3’; 5’-ACA TUT CGT-3’; 5’-CTA UTT C-3’; 5’-AAA UAA A-3’; 5’-TAC CGC UCA CGC ACC-3’; 5’-TGC TAG UGT GCG GUG TAC TC-3' ; 5’-GCC CTG AGT ACA GGG UAG TCG TCA GTG-3’; 5’-ATC AAG ATC ATT GCU CCT CCT GAG CGC-3'; 및 5’-TGA CAA GGG TTT GAC ATU GAG TAG CAA GGC ACT TC-3’을 예로 들 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 위의 예에서 U는 밑줄로 표시되어 있으며 전 명세서에 걸처 동일하게 표시되어 있다.
본원에 따른 폴리뉴클레오타이드는 헤어핀 구조를 형성하지 않는 것이 바람직하나, 형성되는 경우를 배제하는 것은 아니다. 단일 가닥의 핵산 분자내에 상보적 서열이 존재할 경우, 이들 사이에서의 결합에 의해 헤어핀구조가 형성된다. 이는 상보적 서열의 멜팅 포인트 이상의 온도가 되도록 반응물에 열을 가하는 등의 방법에 의해 제거할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 “뉴클레오타이드”는 염기-당-포스페이트가 결합된 것으로 폴리머인 핵산, 즉 DNA 또는 RNA를 이루는 단량체이다. 본 용어는 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트인, rATP, rCTP, rGTP 또는 rUTP 및 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트인 dATP, dCTP, dGTP 또는 dTTP를 포함한다. 뉴클레오사이드는 염기-당이 결합된 것으로 뉴클레오타이드와 혼용되어 상호 교환적으로 사용되기도 한다. 예를 들면 뉴클레오타이드인 데옥시유리딘 트리포스페이트 dUTP는 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트이다. 이는 DNA로 편입이 일어난 후, dUMP 즉 데옥시유리딘 모노포스페이트가 된다. 따라서 dUTP가 DNA가 편입되어 들어가거나 또는 뉴클레오사이드인 데옥시유리딘이 편입되어 들어가는 것과 같이 서로 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 용어“유라실 DNA 글리코실라제 (Uracil DNA glycosylases, UDG)”는 DNA 합성 중에 dUTP가 편입되어 들어가는 경우, 염기 유라실과 당인 데옥시라이보스간의 글라이코스 (glycosidic) 결합을 절단하는 효소를 일컫는 것으로, 다양한 유래일 수 있다. UDG는 자유 dUTP, 자유 데옥시유리딘, 또는 RNA에는 작용하지 않는다. 이러한 UDG는 시중에서 구입할 수 있거나, 공지된 방법을 따라 재조합 방식으로 합성될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 “올리고뉴클레오타이드” 및 “폴리뉴클레오타이드”는 혼용되어 사용되며, 어느 하나는 양자를 모두 포함하는 것이다. 용어 “프로브”도 “올리고뉴클레오타이드” 및 “폴리뉴클레오타이드”는 혼용되어 사용될 수 있으며, 핵산 (RNA 또는 DNA), PNA, 및 앱타머 등을 포함하는 것이다.
본원에서 사용된 용어 “프라이머”는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로 폴리머라제를 이용한 핵산 증폭 또는 합성 반응에서 그 3‘ 말단에 뉴클레오타이드가 공유결합에 의해 추가되어 연장되는 핵산이다.
본원에서 사용된 용어“증폭”은 인비트로(시험관내)에서 뉴클레오타이드 서열의 카피수를 증가시키는 모든 과정을 의미하는 것으로, 이 과정에서 뉴클레오타이드가 DNA 또는 RNA로 편입되어 들어간다. 본원의 일 구현예에 따르면 증폭 반응은 복제과정을 여러 주기(사이클) 반복하는 것으로, 예를 들면 PCR (polymerase chain reaction) 과정을 통해, 변성-복제 과정을 10-100 주기 반복하는 것이다.
본원에서 사용된 용어“표적”은 본원이 폴리뉴클레오타이드 프로브가 결합하는 핵산 서열을 일컫는 것이다.
본원에서 사용된 용어 “형광염료” (fluorophore, fluorochrome)은 특정한 제1 파장의 에너지를 흡수하고 다른 제2 파장의 에너지를 방출할 수 있는 물질을 일컫는 것이다. 예를 들면, 플루오레신 또는 그 유도체 예컨대 플루오레신 아이소티오시아네이트, FAM과 같은 카르복시 플루오레신, 플루오레신 아마디이트, Cy3, Cy5, Cy7과 같은 시아닌 또는 그 유도체, TAMRA (tetramethylrhodamine)과 같은 로다민 또는 그 유도체, 쿠마린 또는 그 유도체 등을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서는 예를 들면 FAM, HEX, Cy3, TMR, ROX, Texas red, LC red 640, Cy5, 또는 LC red 705가 형광염료로 사용되며, 이러한 물질은 Applied Biosystmes사, 또는 Invitrogen 사에서 구입할 수 있다. 예를 들면 하기와 같은 명칭으로 판매된다: FAM, TET, JOE, HEX, TAMRA, ROX, Cy5, Cy3, CalRed, Quasar, VIC, Texas Red.
본원에서 사용된 용어 “소거제” (quencher)는 형광염료에서 발생하는 여기 (excitation) 에너지를 받아들이는 형광소거제 (fluorophore quencher) 또는 비형광 소거제(dark quencher)이다. 전자인 형광소거제는 전달된 에너지가 특정 파장의 빛으로 방출되고, 또는 후자의 경우는 열로 된다. 이들은 형광염료와 근접하여 또는 일정거리 내에 위치할 경우, 형광염료의 에너지 방출 (emission)이 억제되어, 형광 신호가 검출되지 않고, 억제할 수 없을 만큼 충분히 먼거리에 위치하는 경우, 형광신호가 검출된다. 예를 들면 형광물질 중 TAMRA는 FAM이라는 물질의 소거제로 사용될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 올리고뉴클레오타이드는 염기결손부위 (abasic site)에서 잘려서 형광신호가 방출되는 방식이다.
또한 대안적으로 본원에 따른 올리고뉴클레오타이드는 다양한 종류의 형광 검출 방식에 적용될 수 있다. 예를 들면 FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer)에 근거한 근접 프로브 (adjacent probe) 또는 5' 뉴클리아제 프로브 방식, 또는 접촉 소거 (contact quenching)에 근거한 Molecular beacon 프로브 또는 가닥 대체식 프로브 (starnd displacement probe) 방식으로 적용될 수 있다.
이러한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 근접 프로브 방식은 각 각 형광염료와 소거제로 표지된 두 개의 올리고뉴클레오타이드가 근접한 위치에 오면 형광신호가 사라지는 원리이고, 5' 뉴클리아제 프로브 방식은 한 분자의 올리고뉴클레오타이드의 5' 및 3' 각 부분이 형광염료 및 소거제 (또는 그 반대)로 표지되어 있고, 뉴클리아제에 의해 5' 부분이 제거되면서 형광신호가 방출되는 원리이고, 접촉 소거 방식은 수소 결합 등에 의해 형광염료와 소거제가 결합해 있다가, 상보적 서열에의 결합, 또는 가닥 대체 등에 의해 형광신호가 방출되는 원리이다. 사용되는 구체적 방식은 검출장비, 사용되는 구체적인 형광염료 및 소거제, 핵산 서열 등에 따라 달라질 수 있으며, 당업자라면 이러한 것을 고려하여 적절한 방식을 선택할 수 있을 것이다.
소거제의 예로는 Black Hole Quencher® (BHQ; Biosearch Technologies, Novato, Calif.), Dabsyl (dimethylaminoazosulphonic acid), QxlTM quenchers (AnaSpec Inc., San Jose, Calif.), Iowa black FQ®, Iowa black RQ® (Integrated DNA technologies, USA), IRDye QC-1, QYS® quenchers (Life technologies, USA)등을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 형광물질이 함께 사용되는 물질의 종류에 따라 소거제로 사용되는 경우도 있으며 이러한 경우를 제한하는 것은 아니다.
당업자라면 형광염료와 소거제는 상술한 형광에너지 전달 방식, 각 물질의 파장, 검출장비 등을 고려하여 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다.
본원의 일 구현예에 따른 폴리뉴클레오타이드는 DNA로 5‘에 형광염료로, 3’에는 소거제로 표지되어 있으며, 예를 들면 비형광분자 소거제 (dark quencher)로 표지되어 있으며, FRET 또는 접촉방식으로 사용될 수 있으며, 특히 FRET 방식으로 사용된다. FRET의 원리는 사용되는 프로브의 디자인 및 응용분야에 대하여는 Vladimir V. Didenko, Biotechniques. 2001 November; 31(5): 1106-1121을 참조할 수 있다.
다른 양태에서 본원은 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드 및 UDG를 포함하는 핵산 증폭 오염 방지용 조성물 또는 키트를 제공한다. 본원에 따른 조성물 및 키트는 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드에 부가하여 핵산 증폭 예를 들면 PCR에 필요한 다른 성분 예를 들면 dNTP, 및 이가 양이온 등을 포함할 수 있다.
또다른 양태에서 본원은 또한 본원의 폴리뉴클레오타이드 또는 두 개 이상의 상이한 서열의 상기 폴리뉴클레오타이드의 혼합물, 및 UDG를 사용하는 것을 특징으로 하는, 증폭반응의 위양성 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 방법에서 두 개 이상의 상이한 서열의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 특정 폴리뉴클레오타이드가 프라이머 또는 주형에 비특이적으로 혼성화되어 PCR 효율을 저하되는 것을 방지할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 “검체”는 표적 서열의 검출이 필요한 물질로 생물학적 또는 비생물학적 검체를 모두 포함하는 것이다.
본원에서 사용된 용어“증폭 반응”은 역전사 PCR 또는 PCR을 포함하며, 실시간 PCR을 포함하는 개념이다. 본원에서 용어“증폭 반응 시약”은 PCR 같은 증폭 반응을 수행하는데 필요한 물질로, 수행되는 구체적 반응의 종류에 따라 상이할 수 있으나 예를 들면 적절한 농도의 폴리머라제, dNTP 및 적절한 버퍼를 포함한다.
본원에 따른 일 구현예에서 증폭반응은 역전사 PCR로, 상기 역전사 PCR은 하나의 단계에서 역전사 및 PCR이 이루어지는 것으로, 이 경우, 상기 폴리뉴클레오타이드에서 상기 폴리뉴클레오타이드는 20개 이상의 dT 또는 dA의 호모폴리머를 포함하지 않는 것이 바람직하다.
본원에 따른 방법은 형광신호를 검출 및/또는 분석할 수 있는 형광검출기를 구비한 PCR 장치를 이용하여 UDG 효소 활성 여부를 실시간으로 모니터링하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서 본원에 따른 방법은 예를 들면 FRET을 이용한 실시간 PCR에 사용될 수 있으며, 이 경우, 실시간으로 UDG의 활성 여부를 확인할 수 있다.
나아가 본원에 따른 방법은 상기 폴리뉴클레오타이드에 포함된 U의 갯수 또는 상기 폴리뉴클레오타이드와 동일한 서열을 포함하나 표지되지 않은 폴리뉴클레오타이드의 표지된 폴리뉴클레오타이드에 대한 비에 따라 UDG 활성의 민감도의 조절이 가능하다. 예를 들면 U의 갯수를 2배로 늘일 경우 민감도가 최대 2배로 증가되며, 하나의 폴리뉴클레오타이드 내에 U 기질이 증가하는 것이기 때문에 U의 갯수에 비례하게 민감도를 증가시킬 수 있다. 반대로 민감도를 감소시키기 위해서 “형광으로 표지되지 않은 동일 서열의” dU 포함 폴리뉴클레오타이드의 양을 2배씩 증가시키면 민감도를 1/2씩 감소시킬 수 있다.
본원에 따른 폴리뉴클레오타이드, 조성물, 또는 방법은 UDG 효소를 사용한 오염 방지 기술은 PCR에 간단히 첨가하여 사용할 수 있어 편리성이 도모된다. 또한, 실제 표적 검출용으로 사용하는 프로브 예를 들면 TaqMan 프로브의 형광 색상과 겹치지 않는 여러 가지 다양한 파장의 빛을 내는 형광을 자유롭게 이용할 수 있으므로 실시간 PCR 방법에 응용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 형광염료 및 형광소거제로 표지된 유라실 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 제조
5’ FAM-GCC CTG AGT ACA GGG UAG TCG TCA GTG-BHQ1 3’ 서열(dU 폴리뉴클레오타이드 또는 dU 프로브)과 5’ FAM-GCC CTG AGT ACA GGG TAG TCG TCA GTG-BHQ1 3’ 서열(dT 폴리뉴클레오타이드 또는 dT 프로브)은 제노텍(대한민국)에 의뢰하여 합성하였다.
실시예 2. UDG 활성의 실시간 확인
대장균 유래 야생형 UDG를 다음 문헌에 기재된 방법을 적용하여 제작하여 대장균에서 발현하여 정제하였다. (Lee CD, et al., An improved SUMO fusion protein system for effective production of native proteins. Protein Sci. 2008 Jul 17(7):1241-1248.)
UDG (Uracil-DNA glycosylase)의 활성을 측정하기 위하여, 실시예 1에서 제작한 형광 프로브인 dU 프로브와 dT 프로브를 각각 20 pmol 씩 사용하였으며 UDG 는 각각 0, 0.5, 2, 10 fmol 의 단위로 증가시켜 사용하였다. 총 반응 용량은 20 μl로 사용된 완충액의 조성은 다음과 같다: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA. 반응을 수행하기 위해 실시간 정량 PCR 장비 (CFX96, Bio-Rad, USA)를 사용하여 25℃에서 30분 먼저 반응시킨 후 60℃에서 5초, 100℃에서 2분 30초를 1 사이클로 하여 총 10회 반복하였다. 상대적 형광값은 상기 각 사이클의 60℃에서 5초 반응단계에서 측정하였다.
결과는 도 2에 있다. 도 2에 나타난 바와 같이 UDG의 양에 따라 형광염료 및 소거제로 표지된 유라실 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 프로브 (도 2에서 “dN-dU”로 표시)에서 형광신호가 방출되었으며, 이는 UDG의 활성을 실시간으로 측정할 수 있음을 나타내는 것이다. 추가적으로 사각형 표시선은 dT 폴리뉴클레오타이드 (도 2에서는 “dN-dT”로 표시)를 실험에 사용한 결과이며, 이 경우 UDG 에 의해 프로브가 잘려지지 않아서 형광신호가 방출되지 않았다. 이는 즉 dU 가 있는 DNA 만이 UDG 에 의해 잘리고 따라서, UDG 활성의 indicator 로 사용될 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 3. 기질의 길이에 따른 UDG 활성 검출 효율 확인
기질의 길이에 따른 UDG 활성 검출 효율을 비교하기 위하여 다음과 같이 다양한 길이의 임의의 서열로 구성되고, 형광염료와 소거제로 표지된 올리고뉴클레오타이드를 제노텍에 의뢰하여 합성하였다.
5’ HEX-TGA CAA GGG TTT GAC ATU GAG TAG CAA GGC ACT TC-BHQ1 3’(35-nt)
5’ HEX-ATG AGC ACA TUG TGG CGC TA-BHQ1 3’(20-nt)
5’ HEX-CTA UTT C-BHQ1 3’(7-nt)
UDG의 활성을 측정하기 위하여, 상기 dU 프로브를 각각 10 pmol 씩 사용하였으며 UDG 는 60 fmol을 첨가하거나 첨가하지 않았다. 총 반응 용량과 완충액의 조성은 실시예 2와 동일하다. 반응을 수행하기 위해 실시간 정량 PCR 장비 (CFX96, Bio-Rad, USA)를 사용하여 25℃에서 10분 먼저 반응시킨 후 60℃에서 5초, 100℃에서 1분을 1 사이클로 하여 총 30회 반복하였다.
결과는 도 3에 있다. 도 3에 나타난 바와 같이 UDG 가 첨가된 경우 (도 3에서 “+UDG”로 표시) 기질의 길이가 길어짐에 따라 최종 방출된 형광신호의 상대값(RFU)이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며 UDG를 미첨가한 경우 (도 3에서 “-UDG”로 표시) 형광 신호가 나타나지 않는 것을 확인하였다. 이는 기질의 길이가 길어질수록 형광염료와 소거제의 거리가 멀어져서 백그라운드 신호가 증가하기 때문인 것으로 추측된다. 또한, 기질의 길이가 길어질수록 다양한 형태의 이차구조를 형성하거나 프로브간의 비특이적인 결합이 발생할 수 있기 때문에 짧은 기질에 비해 일관성 있는 FRET 현상이 일어나지 못함으로써 형광신호의 증가가 감소하는 것으로 판단된다.
실시예 4. 검체를 포함하는 반응에서 UDG 활성 표지자로의 성능 확인
실제 PCR 반응 중에 UDG의 활성 여부 및 이에 의해 오염 DNA가 제거되는지 여부를 확인하기 위해 실시예 1에서 제작된 dU 올리고뉴클레오타이드를 사용해서 다음과 같이 실시간 PCR 반응으로 확인하였다.
우선 TaqMan® 프로브를 사용한 PCR 반응을 수행하였으며, 이를 위해 TOPrealTM qPCR 2X PreMIX-TaqMan probe (엔지노믹스, 대한민국)를 사용하였으며 1 unit (300 fmol) 의 UDG 와, 2 pmol 의 dU 프로브를 첨가하였다. 표적 DNA는 dNTP 중에 dTTP와 dUTP를 1:1 로 혼합한 PCR 반응을 통해 한번 증폭된 인간 β-actin 유전자의 PCR 산물이며, 따라서 해당 DNA 는 dT 와 dU가 약 1:1의 비율로 구성되어 있다. 표적 DNA를 증폭하기 위해 ACTB-F 5’-CCT GGC ACC CAG CAC AAT-3’(18 nt), ACTB-R 5’-GCT GAT CCA CAT CTG CTG GAA-3’(21 nt) 프라이머 세트와 프로브로 5’-Cy5-ATC AAG ATC ATT GCT CCT CCT GAG CGC-BHQ2-3’를 사용하였다. PCR 반응은 실시간 PCR 장비 (CFX96, Bio-Rad)를 사용하였으며 25℃에서 10분 동안 오염제거반응(UDG 반응)과 95℃에서 2분 전변성단계 후 95℃에서 15초, 55℃에서 35초를 1 사이클로하여 총 45 사이클을 수행하였다. 상대적 형광값은 매 사이클의 55℃, 35초 반응 후에 측정하여 나타내었다.
결과는 도 4에 기재되어 있다. 도 4에 나타난 바와 같이, 반응주기가 진행됨에 따라 UDG 에 의해 dU가 제거되어 나타나는 형광 신호 (청색 라인)가, 표적 DNA 가 정상적으로 증폭되어 나타나는 형광신호 (보라색 라인)와 함께 나타났다. 이는 실제 PCR 과정에서 표적의 증폭과 함께, UDG가 제대로 작동하고 있음을 실시간으로 측정할 수 있으며, 이를 통해 오염이 제거되었음을 나타내는 것이다. 즉 증폭 산물은 실제 표적 DNA의 증폭결과이며, 오염된 표적의 증폭으로 인한 것이 아님을 본원에 따른 올리고큐클레오타이드 표지자를 통해 확인 할 수 있다.
실시예 5. dG 호모폴리머 기질의 길이에 따른 UDG 활성 검출 효율 확인
기질로 사용된 dG 호모폴리머의 길이가 UDG 활성에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 중앙에 dU를 포함하고 양쪽으로 다양한 길이의 dG 호모폴리머 또는 임의의 서열로 구성된 올리고뉴클레오타이드를 제노텍에 의뢰하여 합성하였다.
dN10-dU-dN10 : 5’ CTT AGT TCG AUC GTA ATG TGA 3’(21-nt)
dN10-dT-dN10 : 5’ CTT AGT TCG ATC GTA ATG TGA 3’(21-nt)
dG10-dU-dG10 : 5’ GGG GGG GGG GUG GGG GGG GGG 3’(21-nt)
dG5-dU-dG5 : 5’ GGG GGU GGG GG 3’(11-nt)
dG3-dU-dG3 : 5’ GGG UGG G 3’(7-nt)
dG2-dU-dG2 : 5’ GGU GG 3’(5-nt)
합성된 올리고뉴클레오타이드는 5'에 [32P] 로 표지한 다음 컬럼 크로마토그래피 방법을 이용하여 정제하였다 (PROBERTM Probe DNA purifying system, 인트론바이오테크놀로지, 대한민국). dG 호모폴리머의 길이가 UDG 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 올리고뉴클레오타이드를 각각 15 fmol 씩 사용하였으며 UDG 는 0.05, 0.2, 1 fmol을 첨가하거나 첨가하지 않았다. 총 반응 용량과 완충액의 조성은 실시예 2와 동일하다. 각각의 혼합물은 25℃에서 10분간 반응시킨 후, 100℃에서 20분간 끓여서 U 염기가 제거된 부분에서 절단이 일어나도록 하였다. UDG 효소의 활성은 변성 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동과 자가방사선법을 이용하여 정량적으로 분석하였다.
결과는 도 5에 기재되어 있다. 도 5에 나타난 바와 같이 dU 의 주변이 임의의 서열로 구성된 dN10-dU-dN10 기질의 경우에는 UDG에 의해 잘려진 생성물이 넣어준 UDG의 양에 비례하여 증가하였지만, dU 주변이 dG 호모폴리머로 구성된 경우에는 dU를 제외한 호모폴리머의 양쪽 길이가 20, 10, 6, 4-nt 로 구성된 경우 모두에서 UDG에 의해 잘려진 생성물이 검출되지 않았다. 따라서, 기질이 4-nt 이상의 dG 호모폴리머로 구성된 경우에는 서열의 길이에 관계없이 UDG 활성 검출에 부적합함을 확인할 수 있다.
실시예 6. 기질의 양에 따른 UDG 활성에 대한 민감도 변화 확인
본 기술을 사용한 UDG 활성 측정시에 UDG 활성에 대한 민감도를 조절하기 위한 방법의 한가지로 기질(substrate)의 양을 달리하여 UDG 활성을 확인하였다.
UDG의 활성을 측정하기 위하여, UDG 의 양을 2 fmol 로 고정하고 실시예 3의 7-nt 길이의 dU 프로브를 5 pmol 씩 사용하였다. 기질의 양을 증가시키기 위해 형광 dU 프로브와 동일한 서열을 가지지만 5' 과 3’ 이 형광 염료와 소거제로 표지되지 않은 올리고뉴클레오타이드를 각각 0, 5, 15, 35 pmol 씩 첨가하여 총 기질의 양이 5, 10, 20, 40 pmol (1X, 2X, 4X, 4X) 가 되도록 조절하였다. 총 반응 용량과 완충액의 조성은 실시예 2와 동일하다. 반응을 수행하기 위해 실시간 정량 PCR 장비 (CFX96, Bio-Rad, USA)를 사용하여 25℃에서 5분 먼저 반응시킨 후 60℃에서 5초, 100℃에서 1분을 1 사이클로 하여 총 30회 반복하였다.
결과는 도 6에 기재되어 있다. 측정된 최종 형광신호의 값은 기질의 양이 2배 증가함에 따라 약 1/2로 감소하였으며, 기질 1X 양에 해당하는 형광신호를 민감도 1로 설정 (검정색 막대)하여 2X, 4X, 8X 에 해당하는 민감도 (회색 막대)를 상대적인 그래프로 나타내었다. 따라서 UDG 의 활성을 측정하는 실험에서 기질의 양을 변경함으로써 민감도를 원하는 수치만큼 임의로 조절할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 7. 기질에 포함된 U의 갯수에 따른 UDG 활성에 대한 민감도 변화 확인
본원 발명을 이용한 UDG 활성 측정시에 UDG 활성에 대한 민감도를 조절하기 위한 방법의 또 다른 예로 기질에 포함된 dU의 갯수를 달리하여 UDG 활성을 확인하였다. 이를 위해 아래의 올리고뉴클레오타이드를 제노텍에 의뢰하여 합성하였다.
dT-dU-1 : 5’ TTT TTT TTT TUT TTT TTT TTT 3’ (21-nt)
dT-dU-2 : 5’ TTT TTT UTT TTT TTU TTT TTT 3’ (21-nt)
dT-dU-4 : 5’ TTT TUT TTU TTT UTT TUT TTT 3’ (21-nt)
dT-dU-8 : 5’ TTT UTU TUT UTU TUT UTU TTT 3’ (21-nt)
합성된 올리고뉴클레오타이드는 실시예 5 와 동일한 방법으로 [32P] 로 표지하였다. 단일 기질 내의 dU 갯수가 UDG 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, UDG 의 양을 0.1 fmol 로 고정하고 상기 dU 프로브를 각각 15 fmol 씩 사용하여 반응을 수행하였다. 총 반응 용량과 완충액의 조성, 그리고 생성물의 분석 방법은 실시예 5와 동일하다.
결과는 도 7에 기재되어 있다. dU 가 1개 포함된 기질(dT-dU-1)이 잘려져서 생성된 생성물의 양을 민감도 1로 설정 (검정색 막대)하여 2개, 4개, 8개의 dU를 포함하는 기질 (각각 dT-dU-2, dT-dU-4, dT-dU-8에 해당)에 대한 민감도 (회색 막대)를 상대적인 그래프로 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이 절단된 기질의 양은 기질에 포함된 dU의 갯수가 2배 증가함에 따라 최대 1.6배 증가함을 알 수 있었다. 이론적으로는 올리고뉴클레오타이드의 길이가 충분히 길고 단일 기질내에 포함된 2개 이상의 dU 가 서로 충분히 멀리 떨어져 있을 경우, 즉 UDG 가 기질 사이을 이동하는데 필요한 시간과 단일 기질내에서 dU 사이를 이동하는데 필요한 시간이 동일하도록 이상적인 기질이 디자인된 경우에는 UDG 활성에 대한 민감도가 dU 갯수에 정확히 비례해서 증가할 것으로 예상된다.
결과적으로, UDG 의 활성을 측정하는 실험에서 기질에 포함된 dU 의 갯수를 변경함으로써 민감도를 원하는 수치만큼 임의로 조절할 수 있음을 확인할 수 있다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (14)

  1. 하기 식의 UDG 활성 표지자용 단일가닥 폴리뉴클레오타이드로, 상기 폴리뉴클레오타이드는 5' 및 3' 각 말단이 각각 형광염료 및 형광소거제, 또는 각각 형광소거제 및 형광염료로 표지되어 있는 유라실 DNA 글리코실라제 (Uracil DNA glycosylases, UDG) 활성 표지자용 단일가닥 폴리뉴클레오타이드:
    X-N-Y
    상기 식에서, X 및 Y는 각각 서로 동일 또는 상이하며, dA, dT, dG 또는 dC 중 어느 하나의 뉴클레오타이드이고, 상기 N은 적어도 하나의 dU를 포함하는 길이 2 내지 40 뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드로 상기 dU를 제외한 나머지 폴리뉴클레오타이드는 4개 이상의 dG 호모폴리머를 포함하지 않음.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 N은 2 내지 30 뉴클레오타이드인, UDG 활성 표지자용 단일가닥 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 N은 2 내지 8 뉴클레오타이드인, UDG 활성 표지자용 단일가닥 폴리뉴클레오타이드.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 헤어핀 구조를 형성하지 않는 것인, UDG 활성 표지자용 단일가닥 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 5'-CCC TGA GTA CAG GGU AGT CGT CAG TG-3'; 5'-CAG TTG TAA CUA TAT ACT TA-3; 5'-CTT AGT TCG AUC GTA ATG TGA-3' ; 5'-ATG AGC ACA TUG TGG CGC TA-3'; 5'-TCC AUG UAG GC-3'; 5'-ACA TUT CGT-3'; 5'-CTA UTT C-3'; 5'-AAA UAA A-3'; 5'-TAC CGC UCA CGC ACC-3'; 5'-TGC TAG UGT GCG GUG TAC TC-3' ; 5'-GCC CTG AGT ACA GGG UAG TCG TCA GTG-3'; 5'-ATC AAG ATC ATT GCU CCT CCT GAG CGC-3'; 또는 5'-TGA CAA GGG TTT GAC ATU GAG TAG CAA GGC ACT TC-3'인, UDG 활성 표지자용 단일가닥 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 형광염료는 플루오레신 아이소티오시아네이트, 카르복시 플루오레신, 플루오레신 아마디이트, 헥사클로로플루오레신, 시아닌 또는 그 유도체, 로다민 또는 그 유도체, 쿠마린 또는 그 유도체인, UDG 활성 표지자용 단일가닥 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 형광소거제는 Black Hole Quencher®, Dabsyl, QxlTM quenchers, Iowa black FQ®, Iowa black RQ®, IRDye QC-1, QYS® 또는 TAMRA인, UDG 활성 표지자용 단일가닥 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 또는 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 단일가닥 폴리뉴클레오타이드 및 UDG를 포함하는 UDG 활성 확인용 키트.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
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