WO2013035856A1 - 加水分解酵素の反応効率を高める酵素反応方法 - Google Patents

加水分解酵素の反応効率を高める酵素反応方法 Download PDF

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WO2013035856A1
WO2013035856A1 PCT/JP2012/072957 JP2012072957W WO2013035856A1 WO 2013035856 A1 WO2013035856 A1 WO 2013035856A1 JP 2012072957 W JP2012072957 W JP 2012072957W WO 2013035856 A1 WO2013035856 A1 WO 2013035856A1
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betaine
general formula
hydrolase
enzyme reaction
glucosidase
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PCT/JP2012/072957
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甲元　一也
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学校法人甲南学園
株式会社ケミクレア
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    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates

Definitions

  • the present invention relates to a technique for improving enzyme reaction efficiency in an enzyme reaction using a hydrolase such as glucosidase, alkaline phosphatase, sulfatase, lipase, or protease.
  • a hydrolase such as glucosidase, alkaline phosphatase, sulfatase, lipase, or protease.
  • Glucosidase is an enzyme that catalyzes a reaction that hydrolyzes a glucoside bond, and is used industrially in various fields. Glucosidases are broadly classified into ⁇ -glucosidases that hydrolyze ⁇ -glucoside bonds of sugars and ⁇ -glucosidases that hydrolyze ⁇ -glucoside bonds of sugars. ⁇ -Glucosidase is used in processing of starch liquefaction and saccharification, starch modification, detergents, textile desizing, and the like, and is an indispensable enzyme in the industry. In addition, ⁇ -glucosidase is capable of saccharifying cellulose contained in plant-based biomass. Therefore, effective utilization of plant-based biomass has attracted attention and has attracted attention in recent years.
  • Alkaline phosphatase is an enzyme that catalyzes the reaction of hydrolyzing and dephosphorylating a phosphate ester compound, and a substrate such as NBT / BCIP (nitroblue tetrazolium and 5-bromo-4-chloro-2-indolylphosphate). Since it can be hydrolyzed to develop color and emit light, it is widely used as a labeling enzyme used for ELISA, Western blotting, staining of biological tissue fragments, and the like.
  • sulfatase is an enzyme that hydrolyzes sulfate ester compounds, and is used for hydrolysis of sulfate esters in sulfated polysaccharides such as heparin and chondroitin sulfate, and is used in the cosmetics and medical fields.
  • Lipase is an enzyme that hydrolyzes fatty acid ester compounds. It is used for the production of flavors and fragrances for foods, in the food industry such as removal of fats and oils in foods, for the removal of fat (pitch) from raw wood in the papermaking process, and for detergents. Widely used.
  • protease is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of peptide bonds, and is used for protein lowering, protein removal, fiber processing / modification, detergents, etc., in a wide range of fields such as food, pharmaceuticals, and fibers.
  • the improvement of the enzymatic reaction efficiency of alkaline phosphatase can improve the detection sensitivity of the target substance and further reduce the detection time of the target substance in the detection method of the target substance using clinical test reagents, ELISA, Western blotting, etc. Also make it possible.
  • the improvement of the enzyme reaction efficiency of sulfatase, lipase, protease, etc. can contribute to the improvement of production efficiency and quality in various fields where these enzyme reactions are used.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 disclose methods for improving enzyme activity by adding alcohols and polyols containing sugars to an enzyme reaction solution.
  • Non-Patent Documents 3 and 4 disclose that enzyme activity can be improved by adding a protein such as polyethylene glycol or bovine serum albumin to the enzyme reaction solution.
  • Non-Patent Document 5 also discloses that glycine improves enzyme activity.
  • these non-patent literature techniques still do not sufficiently satisfy the effect of improving the reaction efficiency of the enzyme.
  • Patent Document 1 discloses an excellent technique in terms of improving the reaction efficiency of the enzyme.
  • hydrolytic enzymes such as glucosidase, alkaline phosphatase, sulfatase, lipase, and protease.
  • the higher the efficiency of the reaction the greater the above-mentioned advantages. Therefore, if it is possible to further increase the reaction efficiency of these enzymes, it is considered that a great technological advance will be brought to the industry using these enzymes.
  • An object of the present invention is to provide a technique for improving enzyme reaction efficiency in an enzyme reaction using a hydrolase such as glucosidase, alkaline phosphatase, sulfatase, lipase, or protease.
  • a hydrolase such as glucosidase, alkaline phosphatase, sulfatase, lipase, or protease.
  • Item 1 An enzyme reaction method, wherein an enzyme reaction with a hydrolase is performed in the presence of a betaine derivative represented by the general formula (1).
  • a betaine derivative represented by the general formula (1).
  • R1 to R3 are the same or different and each represents a linear or branched alkyl group having 5 or 6 carbon atoms, and the rest of R1 to R3 One of the groups represents a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms.
  • n represents an integer of 1 to 5.
  • Item 2. Item 2. The enzymatic reaction method according to Item 1, wherein R1 to R3 are the same or different and are linear alkyl groups having 5 or 6 carbon atoms, and n is 1.
  • Item 3 Among R1 to R3, at least two groups are the same or different and are a linear alkyl group having 5 or 6 carbon atoms, and the remaining one group is a linear alkyl group having 5 to 8 carbon atoms.
  • Item 2. The enzymatic reaction method according to Item 1, wherein n is 1 and n is 1.
  • Item 4. Item 4. The enzymatic reaction method according to any one of Items 1 to 3, wherein the enzymatic reaction is performed in the presence of the betaine derivative represented by the general formula (1) and the betaine derivative represented by the following general formula (2).
  • R 4 to R 6 are the same or different and each represents a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a hydrogen atom, and n represents an integer of 1 to 5.
  • Item 5. The enzymatic reaction method according to any one of Items 1 to 4, wherein the betaine derivative represented by the general formula (1) is present at a concentration of 0.00001 to 0.04M.
  • Item 6. The enzyme reaction method according to any one of Items 1 to 5, wherein the hydrolase is at least one selected from the group consisting of glucosidase, alkaline phosphatase, sulfatase, lipase, and protease.
  • Item 7. Item 6.
  • Item 8 An agent for improving the reaction efficiency of a hydrolase, comprising a betaine derivative represented by the general formula (1) as an active ingredient. [In the general formula (1), R1 to R3 and n are the same as described above. ] Item 9. Item 9. The improver according to Item 8, wherein the betaine derivative represented by the general formula (1) is used at a concentration of 0.00001 to 0.04M. Item 10. Furthermore, the improvement agent of claim
  • any one of Items 8 to 10 wherein the hydrolase is at least one selected from the group consisting of glucosidase, alkaline phosphatase, sulfatase, lipase and protease.
  • Item 12. Item 8. A kit for performing the enzyme reaction method according to any one of Items 1 to 7, comprising a betaine derivative represented by the following general formula (1) and a hydrolase. [In the general formula (1), R1 to R3 and n are the same as described above. ] Item 13. Item 13. The kit according to Item 12, comprising an experimental protocol indicating that the betaine derivative represented by the general formula (1) is used at a concentration of 0.00001 to 0.04M. Item 14. Item 14. The kit according to Item 12 or 13, wherein the hydrolase is at least one selected from the group consisting of glucosidase, alkaline phosphatase, sulfatase, lipase, and protease.
  • the enzyme reaction efficiency can be remarkably improved in an enzyme reaction using a hydrolase such as glucosidase, alkaline phosphatase, sulfatase, lipase, or protease.
  • a hydrolase such as glucosidase, alkaline phosphatase, sulfatase, lipase, or protease.
  • the reaction efficiency of the hydrolase can be remarkably improved even if a specific betaine derivative is present at a low concentration in the enzyme reaction solution.
  • Example 1 in the enzyme reaction using ⁇ -glucosidase, the result of evaluating the enzyme reaction efficiency by adding a betaine derivative is shown.
  • Example 2 in the enzyme reaction using ⁇ -glucosidase, the result of evaluating the enzyme reaction efficiency by adding a betaine derivative is shown.
  • Example 3 the result of evaluating the enzyme reaction efficiency by adding a mixture of betaine derivatives in the enzyme reaction using ⁇ -glucosidase is shown.
  • Example 4 the result of having evaluated the enzyme reaction efficiency by addition of a betaine derivative in the enzyme reaction using alkaline phosphatase is shown.
  • Example 5 in the enzyme reaction using sulfatase, the result of having evaluated the enzyme reaction efficiency by addition of a betaine derivative is shown.
  • Example 6 the result of having evaluated the enzyme reaction efficiency by addition of a betaine derivative in the enzyme reaction using lipase is shown.
  • Example 7 the result of having evaluated the enzyme reaction efficiency by addition of a betaine derivative in the enzyme reaction using protease is shown.
  • Enzyme Reaction Method The present invention is characterized in that an enzyme reaction with a hydrolase is performed in the presence of a betaine derivative represented by the general formula (1).
  • a betaine derivative represented by the general formula (1).
  • Betaine derivative used in the present invention has a structure represented by the following general formula (1).
  • R1 to R3 are the same or different and represent a linear or branched alkyl group having 5 or 6 carbon atoms, and the rest of R1 to R3 One group represents a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms.
  • R1 to R3 are preferably the same or different and a linear or branched alkyl group having 5 or 6 carbon atoms; or at least two groups are the same or different and have 5 carbon atoms Or a linear or branched alkyl group having 6 carbon atoms, and the remaining one group is a linear or branched alkyl group having 5 to 8 carbon atoms.
  • R1 to R3 are linear alkyl groups having 5 or 6 carbon atoms; or at least two groups are the same or different and are linear or branched alkyl groups having 5 or 6 carbon atoms. The remaining one group is a linear alkyl group having 5 to 8 carbon atoms.
  • n represents an integer of 1 to 5, preferably 1 to 3, and more preferably 1.
  • R1 to R3 are the same or different and are linear or branched alkyl groups having 5 or 6 carbon atoms, and n is An integer of 1 to 3; more preferably R1 to R3 are the same or different and are straight or branched alkyl groups having 5 or 6 carbon atoms and n is 1 or 2; particularly preferably R1 to R3 Is a linear alkyl group having 5 carbon atoms and n is 1, or particularly preferably R1 to R3 are linear alkyl groups having 6 carbon atoms and n is 1. Is exemplified.
  • one type can be selected from these betaine derivatives and used alone, or two or more types can be used in combination.
  • the betaine derivative represented by the general formula (1) can be produced, for example, by a method described in JP-A-2009-96766, and a known organic synthesis method is described with reference to Synthesis Example 1-2 described later. It can also be manufactured.
  • betaine derivative represented by the general formula (1) and the betaine derivative represented by the following general formula (2) may be combined, and the enzyme reaction may be performed in the presence of these betaine derivatives.
  • R4 to R6 are the same or different and each represents a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a hydrogen atom.
  • at least one of R4 to R6, more preferably 2, and even more preferably all of R4 to R6 represent a linear alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • R4 to R6 are particularly preferably a linear alkyl group having 4 carbon atoms.
  • n represents an integer of 1 to 5, preferably 1 to 3, and more preferably 1.
  • the compound represented by the general formula (2) can be produced, for example, using a known organic synthesis method with reference to the method described in JP-A-2009-96766 and the description of Reference Synthesis Example 1 described later. it can.
  • the combination of the betaine derivative represented by the general formula (1) and the betaine derivative represented by the general formula (2) is not particularly limited as long as each general formula is satisfied.
  • R1 to R3 in the general formula (1) are linear alkyl groups having 5 carbon atoms and n is 1, and in the general formula (2), R4 to R6 are 4 carbon atoms.
  • a betaine derivative which is a linear alkyl group and n is 1 is exemplified. Even when these betaine derivatives are used in combination, they can be applied to an enzyme reaction in which at least one of the enzymes described below is used. In the examples described later, there are exemplified results in which the reaction efficiency is remarkably improved by performing an enzyme reaction with ⁇ -glucosidase in the presence of these betaine derivatives.
  • the enzyme used in the enzyme reaction method of the present invention is a hydrolase.
  • specific examples of the hydrolase used in the present invention include glucosidases, amylases, glucoamylases, cellulases, chitinases, cellobinases, xylanases, galactosidases, mannosidases, mannases, chitinases and other sugar hydrolases; alkaline phosphatases, phosphorus Ester hydrolases such as acid phosphatase, sulfatase, nucleotidase, ribonuclease, lipase, phospholipase; ether hydrolase; peptide (amide) hydrolase such as peptidase, subtilin, pectinase, trypsin, chymotrypsin, plasmin, carboxypeptidase, thermolysin Etc.
  • one of these hydrolases may be selected and used alone, or two or more may be used in combination.
  • the origin of the hydrolase used in the present invention is not particularly limited, and may be any origin such as a microorganism, a plant, or an animal.
  • glucosidase alkaline phosphatase, sulfatase, lipase, and protease are preferable, and glucosidase is more preferable, from the viewpoint of further improving the enzyme reaction efficiency.
  • the glucosidase used in the present invention may be either ⁇ -glucosidase or ⁇ -glucosidase, and ⁇ -glucosidase is a more preferable hydrolase.
  • the origin of the glucosidase used in the present invention is not particularly limited, and may be any origin such as a microorganism, a plant, or an animal.
  • glucosidase used in the present invention include ⁇ -glucosidase derived from Bacillus stearothermophilus and ⁇ -glucosidase derived from almonds.
  • the origin of the alkaline phosphatase used in the present invention is not particularly limited, and any origin such as a microorganism or a plant may be used.
  • any origin such as a microorganism or a plant may be used.
  • the alkaline phosphatase used in the present invention one derived from Escherichia coli is exemplified.
  • the sulfatase used in the present invention is not particularly limited in its origin, and may be of any origin such as a microorganism or a plant.
  • a suitable example of the sulfatase used in the present invention is one derived from Helix Pomatia.
  • the lipase used in the present invention is not particularly limited as to its origin, and may be any origin such as a microorganism, plant, animal tissue or the like.
  • a suitable example of the lipase used in the present invention one derived from Candida is exemplified.
  • any protease may be used, and examples thereof include plasmin, trypsin, chymotrypsin, subtilin, pectinase, carboxypeptidase, thermolysin, etc.
  • plasmin is preferable as a protease.
  • trypsin is preferable as a protease.
  • trypsin is preferable as a protease.
  • trypsin is not particularly limited, and may be any of microorganisms, plants, and animals.
  • Preferable examples of the protease used in the present invention include human plasma-derived plasmin, animal-derived trypsin and the like.
  • Substrate used in the enzyme reaction of the present invention may be appropriately set according to the type of hydrolase employed, the purpose of the enzyme reaction, and the like.
  • the substrate when ⁇ -glucosidase is used, the substrate may be a compound having an ⁇ -glucoside bond, and specifically, starch, amylopectin, maltose, maltooligosaccharide, alkyl or aryl- ⁇ -glucoside.
  • starch amylopectin
  • maltose maltooligosaccharide
  • alkyl or aryl- ⁇ -glucoside for example, methyl- ⁇ -D-glucopyranoside, ⁇ -p-nitrophenyl-D-glucopyranoside
  • the substrate may be a compound having a ⁇ -glucoside bond.
  • cellulose cellooligosaccharide, cellobiose, gentiobiose, alkyl or aryl- ⁇ -glucoside (for example, Methyl- ⁇ -D-glucopyranoside, ⁇ -p-nitrophenyl-D-glucopyranoside) and the like.
  • the substrate may be a chromogenic substrate such as NBT / BCIP (nitroblue tetrazolium and. 5-bromo-4-chloro-2-indolyl phosphate) (Roche) or Fast Red (Sigma); Fluorescent luminescent substrates such as (trademark) (manufactured by Roche) and HNPP (hydroxy-3-naphthoic acid-2′-phenylanilidephosphate); and chemiluminescent substrates such as dioxetane.
  • NBT / BCIP nitroblue tetrazolium and. 5-bromo-4-chloro-2-indolyl phosphate
  • Fluorescent luminescent substrates such as (trademark) (manufactured by Roche) and HNPP (hydroxy-3-naphthoic acid-2′-phenylanilidephosphate)
  • chemiluminescent substrates such as dioxetane.
  • the substrate may be a sulfate ester compound, and examples thereof include glycosaminoglycans such as hyaluronic acid, chondroitin 4-sulfate, chondroitin 6-sulfate, and nitrophenol sulfate. . More specifically, p-nitrophenyl sulfate potassium salt is exemplified as a substrate for sulfatase.
  • the substrate may be an ester compound of fatty acid and glycerol, and examples thereof include triglyceride, diglyceride, monoglyceride and the like.
  • fatty acids aromatic acids, alcohols, and esters of phenols may be used, and examples thereof include p-nitrophenyl esters.
  • More specific examples of the lipase substrate include 4-nitrophenyl butyrate.
  • the substrate may be a compound having a peptide bond, and examples thereof include proteins and peptides. More specific examples of protease substrates include Z-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilide.
  • the enzymatic reaction of the present invention is carried out by adding a betaine derivative represented by the general formula (1) to a conventional enzymatic reaction system in which the hydrolase is allowed to act on the substrate.
  • the concentrations of hydrolase and substrate are not particularly limited, and are appropriately set according to the type of hydrolase and substrate used, the purpose of the enzyme reaction, and the like.
  • the concentration of hydrolase is usually 0.0001 to 50000 ng / mL
  • the concentration of the substrate is usually 0.000001 to 1M.
  • the concentration of the betaine derivative represented by the general formula (1) used in the enzyme reaction solution is, for example, about 0.000001 to 1M, preferably about 0.00001 to 1M. .
  • the concentration of the betaine derivative represented by the general formula (1) is as low as 0.00001 to 0.04M, particularly 0.00001 to 0.02M, the enzyme reaction efficiency is remarkably remarkable. Can be improved.
  • the use concentration of the betaine derivative represented by the general formula (1) in the enzyme reaction of the present invention is preferably 0.00001 to 0.04M, more preferably 0.00001 to 0.00. 02M.
  • the betaine derivative represented by the general formula (1) is a compound in which R1 to R3 are linear alkyl groups having 5 carbon atoms and n is 1, it is preferably 0. 0.0001 to 0.04M, more preferably 0.001 to 0.04M.
  • the betaine derivative represented by the general formula (1) is a compound in which R1 to R3 are linear alkyl groups having 6 carbon atoms and n is 1, it is preferably 0.00001 to 0. 0.04M, more preferably 0.00001 to 0.01M.
  • R1 and R2 are linear alkyl groups having 6 carbon atoms
  • R3 is a linear alkyl group having 4 carbon atoms
  • n is 1.
  • R1 and R2 are linear alkyl groups having 6 carbon atoms
  • R3 is a linear alkyl group having 8 carbon atoms
  • n is 1.
  • 0.000001 to 0.001M is preferable, and 0.00001 to 0.0005M is more preferable.
  • each betaine derivative When two or more betaine derivatives are used in combination, the use concentration of each betaine derivative can be appropriately set based on the above concentration range in consideration of the effect of improving the reaction efficiency by each betaine derivative.
  • the concentration of each betaine derivative used is, for example, the general formula (1).
  • the betaine derivatives shown in the general formula (2) are 0.001 to 0.2M with respect to the betaine derivatives 0.000001M to 0.04M shown.
  • betaine derivative represented by general formula (1) is a straight-chain alkyl group having 5 carbon atoms and n is 1, use of the betaine derivative
  • the concentration is preferably 0.0001 to 0.02M, more preferably 0.001 to 0.01M.
  • the concentration of the betaine derivative used is preferably 0. Examples include 0.0001 to 0.02M, more preferably 0.0001 to 0.01M, and still more preferably 0.0002 to 0.001M.
  • the betaine derivative represented by the general formula (1) is a compound in which R1 and R2 are linear alkyl groups having 6 carbon atoms, R3 is a linear alkyl group having 4 carbon atoms, and n is 1.
  • the use concentration of the betaine derivative is preferably 0.00001 to 0.04M, more preferably 0.0001 to 0.02M, and still more preferably 0.0005 to 0.005M.
  • the betaine derivative represented by the general formula (1) is a compound in which R1 and R2 are linear alkyl groups having 6 carbon atoms, R3 is a linear alkyl group having 8 carbon atoms, and n is 1.
  • the use concentration of the betaine derivative is preferably 0.00001 to 0.0005M, more preferably 0.00001 to 0.00025M.
  • a betaine derivative represented by the general formula (1) is a compound in which R1 to R3 are linear alkyl groups having 5 carbon atoms and n is 1, and is represented by the general formula (2).
  • betaine derivative is a compound in which R4 to R6 are linear alkyl groups having 4 carbon atoms and n is 1, betaine derivatives represented by the general formula (1) 0.000001M to 0.04M, preferably Is 0.00001M to 0.01M, betaine derivatives represented by the general formula (2) 0.0001 to 0.5M, preferably 0.001M to 0.2M.
  • the betaine derivative represented by the general formula (1) is a straight-chain alkyl group having 5 to 5 carbon atoms and n is 1, use of the betaine derivative
  • the concentration is preferably 0.00001 to 0.04M, more preferably 0.0001 to 0.04M.
  • the concentration of the betaine derivative used is preferably 0. 0001 to 0.04M, more preferably 0.0005 to 0.015M.
  • the concentration of the betaine derivative used Is preferably 0.00001 to 0.01M, more preferably 0.00005 to 0.005M, and still more preferably 0.0002 to 0.0005M.
  • the concentration of the betaine derivative used is preferably 0. Examples include 000001 to 0.01M, more preferably 0.000001 to 0.002M, and still more preferably 0.00001 to 0.0006M.
  • the use concentration of the betaine derivative is as follows: Preferably, 0.00001 to 0.04M, more preferably 0.0001 to 0.02M.
  • the betaine derivative represented by the general formula (1) is a compound in which R1 to R3 are linear alkyl groups having 5 carbon atoms and n is 1, the concentration of the betaine derivative used is Preferably, 0.00001 to 0.04M, more preferably 0.0001 to 0.02M.
  • the betaine derivative represented by the general formula (1) is a compound in which R1 to R3 are linear alkyl groups having 5 carbon atoms and n is 1, the use concentration of the betaine derivative is as follows. Preferably, 0.00001 to 0.04M, more preferably 0.0001 to 0.02M.
  • the enzyme reaction of the present invention is performed in a solvent (for example, a buffer solution) suitable for performing the enzyme reaction based on the hydrolase and substrate to be used, the purpose of the enzyme reaction, and the like.
  • a solvent for example, a buffer solution
  • the reaction temperature of the enzyme reaction of the present invention may be set within a range where the hydrolase used can act, preferably within the optimum temperature range of the enzyme used.
  • the pH of the reaction system (reaction solution) for carrying out the enzyme reaction of the present invention may be set within a range where the hydrolase used can act, preferably within the optimum pH range of the enzyme used.
  • the reaction time in the enzyme reaction of the present invention may be appropriately set in consideration of the type of hydrolase and substrate used, the progress of the enzyme reaction, the purpose of the enzyme reaction, and the like.
  • enzyme reaction of the present invention can be used in various fields depending on the type of enzyme and substrate used.
  • the enzyme reaction of the present invention can be applied to starch liquefaction and saccharification, starch modification, textile resizing, and the like.
  • the enzyme reaction of the present invention can be applied to saccharification of cellulose and the like.
  • alkaline phosphatase when used as a hydrolase, the enzymatic reaction of the present invention can be performed by using alkaline phosphatase as a labeling enzyme to detect chemiluminescence in clinical diagnostic agents, ELISA, Western blotting, staining of biological tissue fragments, etc. Alternatively, it can be used for color detection.
  • the enzyme reaction of the present invention can be applied to the hydrolysis of sulfate esters in sulfated polysaccharides such as heparin and chondroitin sulfate, and is used in the production of cosmetics and pharmaceuticals. can do.
  • the enzyme reaction of the present invention is applied to the production of flavors and fragrances for foods, the removal of fats and oils in foods, the removal of fat (pitch) from raw wood in the papermaking process, etc. be able to.
  • the enzyme reaction of the present invention can also be used for the purpose of cleaning such as removal of oil stains.
  • the enzyme reaction of the present invention can be applied to protein lowering, protein removal, fiber processing / modification, and the like. Further, the enzyme reaction of the present invention can be used for the purpose of washing such as removal of protein stains.
  • Hydrolytic enzyme reaction efficiency improver The present invention also provides a hydrolase reaction efficiency improver comprising a betaine derivative represented by the general formula (1) as an active ingredient.
  • the enhancer may further contain a betaine derivative represented by the general formula (2) in addition to the betaine derivative represented by the general formula (1).
  • the agent is an enzyme reaction system in which a hydrolase acts on a substrate, and is used to improve the reaction efficiency of the enzyme.
  • the use mode is described in the column of “1. Enzyme reaction method” above. As described.
  • Kit The present invention further provides a kit for carrying out the above enzymatic reaction method.
  • the kit of the present invention comprises a betaine derivative represented by the general formula (1) and a hydrolase.
  • the kit of the present invention contains alkaline phosphatase as a hydrolase, it may contain a luminescent substrate or a chromogenic substrate for use in an enzymatic reaction, if necessary. It may be in a state where it is connected to.
  • kit of the present invention may include an experimental procedure manual showing a protocol for the enzyme reaction described above.
  • betaine 1 N, N, N-tri-n-pentylglycinate
  • betaine 1 Yield 19.20 g, 86% yield.
  • the obtained betaine 1 was analyzed by H NMR, ATR-IR, and ESI-MS, and the results are shown in Tables 1 to 3. The structural formula of betaine 1 is shown below.
  • betaine 2 N, N, N-tri-n-hexyl glycinate
  • betaine 2 Yield 12.23 g, Yield 56%
  • H NMR, ATR-IR, and ESI-MS The results are shown in Tables 4-6.
  • the structural formula of betaine 2 is shown below.
  • the obtained precursor was dissolved in 20 ml of distilled water. This solution was passed through a column packed with an anion exchange column (Amberlite: registered trademark IRA-402, manufactured by Rohm and Haas). The eluent was concentrated under reduced pressure using an evaporator, dried under reduced pressure in the presence of diphosphorus pentoxide, and betaine (N, N, -di-n-hexyl-Nn-butylglycinate) (hereinafter referred to as betaine 4). (Yield 1.10 g, Yield 32%) The obtained betaine 4 was analyzed by H NMR, ATR-IR, and ESI-MS. The results are shown in Tables 10-12. The structural formula of betaine 4 is shown below.
  • the obtained precursor was dissolved in 20 ml of distilled water. This solution was passed through a column packed with an anion exchange column (Amberlite: registered trademark IRA-402, manufactured by Rohm and Haas). The eluent was concentrated under reduced pressure using an evaporator, dried under reduced pressure in the presence of diphosphorus pentoxide, and betaine (N, N, -di-n-hexyl-Nn-octyl glycinate) (hereinafter referred to as betaine 5). (Yield 0.34 g, Yield 5%) The obtained betaine 5 was analyzed by H NMR, ATR-IR, and ESI-MS. The results are shown in Tables 13-15. The structural formula of betaine 5 is shown below.
  • Example 1 Effect of Betaine Derivatives on ⁇ -Glucosidase Reaction Rate
  • ⁇ -glucosidase in the presence of betaine derivatives
  • the hydrolysis rate was measured.
  • ⁇ -glucosidase derived from Bacillus stearothermophilus
  • ⁇ -p-nitrophenyl-D-glucopyranoside model number 325-34671, Japanese
  • UV-visible spectroscopy measurement Manufactured by Kojun Pharmaceutical
  • the substrate ⁇ -p-nitrophenyl-D-glucopyranoside has a maximum absorption wavelength at 350 nm, but when it is hydrolyzed to glucose and p-nitrophenol by ⁇ -glucosidase, at pH 7.0, p-nitrophenol is The proton of the hydroxyl group is dissociated to form p-nitrophenolate. As a result, the maximum absorption wavelength shifts to a long wave, and the absorbance at 405 nm increases.
  • 7660 M ⁇ 1 cm ⁇ 1 which is the molar extinction coefficient (pH 7.0, 37 ° C.) of p-nitrophenolate at 405 nm
  • the speed can be calculated.
  • the hydrolysis rate was measured using an enzyme reaction solution (100 mM phosphate buffer solution (pH 7.0), 2 mM ⁇ -p-nitrophenyl-D-glucopyranoside, 2.5 ⁇ 10 ⁇ 5 mg / mL ⁇ -glucosidase). At 37 ° C. Betaine derivatives were added to the enzyme reaction solution to a final concentration of 0 to 1000 mM.
  • the reaction rate of ⁇ -glucosidase was calculated from the initial slope of the change in absorbance at 405 nm with respect to the reaction time, and the molar extinction coefficient (pH 7.0, 37 ° C.) of p-nitrophenol as a hydrolysis product was 7660 M ⁇ 1 cm ⁇ . 1 was used to calculate the hydrolysis rate.
  • the activity ratio refers to the ratio of “enzyme reaction rate in the presence of betaine derivative” to “enzyme reaction rate in the absence of betaine derivative”.
  • betaine derivatives having at least two pentyl or hexyl groups (betaines 1, 2, 4, and 5) are compared to betaine derivatives having three butyl groups (betaine 3).
  • a reaction rate of 6.5 ⁇ 10 ⁇ 7 to 7.8 ⁇ 10 ⁇ 7 M min ⁇ 1 could be achieved at a concentration as low as 14 to 2000 times.
  • Betaine 3 is known to have the maximum activation effect on the enzyme at a concentration of 100 mM (see JP 2010-220607 A).
  • Example 2 Effect of Betaine Derivative on the Reaction Rate of ⁇ -Glucosidase
  • the ⁇ -glucosidase was evaluated using a commercially available ⁇ -glucosidase (Almond-derived (model number 306-50981) manufactured by Wako Pure Chemical Industries), and betaines 1, 2 and 3 were used as betaine derivatives.
  • the reaction rate of ⁇ -glucosidase was calculated from the initial slope of the graph of absorbance change at 405 nm with respect to the reaction time, and the molar extinction coefficient (pH 7.0, 37 ° C.) of the hydrolyzate p-nitrophenol was 7660 M ⁇ 1 cm.
  • the hydrolysis rate was calculated using -1 .
  • Measurement conditions were 37 using an enzyme reaction solution (100 mM phosphate buffer solution (pH 7.0), 2 mM ⁇ -p-nitrophenyl-D-glucopyranoside, 1.3 ⁇ 10 ⁇ 3 mg / mL ⁇ -glucosidase). Performed at ° C. Betaine 1, 2 and 3 were each added to the enzyme reaction solution so as to have a final concentration of 0 to 1000 mM, and the results of measuring the concentration of p-nitrophenol produced over the reaction time (minutes) are shown in FIG. Shown in
  • betaine derivatives having three pentyl groups or hexyl groups (betaines 1 and 2) are more enzymatically reacted with ⁇ -glucosidase than betaine derivatives having three butyl groups (betaine 3).
  • betaine derivatives having three pentyl groups (betaine 1) have a range of 1 to 40 mM
  • betaine derivatives having three hexyl groups (betaine 2) have a range of 0.5 to 15 mM. It became clear that it can be improved.
  • Example 3 Effect of Mixture of Betaine Derivatives on ⁇ -Glucosidase Reaction Rate
  • a mixture of betaine derivatives (betaines 1 and 3)
  • a mixture of betaine 1 and betaine 3 was added and ⁇ -The activity ratio of glucosidase was measured.
  • Measurement conditions were 37 using an enzyme reaction solution (100 mM phosphate buffer solution (pH 7.0), 2 mM ⁇ -p-nitrophenyl-D-glucopyranoside, 2.5 ⁇ 10 ⁇ 4 mg / mL ⁇ -glucosidase). Performed at ° C. Betaine 1, betaine 3, or a mixture of betaines 1 and 3 was added to the enzyme reaction solution, the concentration of p-nitrophenol produced during the reaction time of 60 minutes was measured, and the activity ratio was calculated. The concentration of p-nitrophenol was measured and the activity ratio was calculated according to the method described in Example 1 above.
  • the concentration of betaine 1 added to the enzyme reaction solution was 3 mM near the maximum activation concentration, and the concentration of betaine 3 was 25 mM. Moreover, about the mixture of betaine 1 and 3, betaine 1 was 3 mM and betaine 3 was 25 mM. The obtained results are shown in FIG.
  • Example 4 Effect of Betaine Derivatives on Reaction Rate of Alkaline Phosphatase
  • alkaline phosphatase which is a phosphate hydrolase.
  • the alkaline phosphatase was evaluated using a commercially available alkaline phosphatase (derived from E. coli (model number 012-10691), manufactured by Wako Pure Chemical Industries), and betaines 1, 2 and 3 were used as betaine derivatives.
  • the reaction rate of alkaline phosphatase was calculated from the initial slope of the graph of absorbance change at 405 nm with respect to the reaction time, and the molar extinction coefficient (pH 7.0, 37 ° C.) of the hydrolyzate p-nitrophenol was 7660 M ⁇ 1 cm ⁇ . 1 was used to calculate the hydrolysis rate.
  • Measurement conditions were performed at 37 ° C. using an enzyme reaction solution (100 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.5), 2 mM p-nitrophenyl phosphate, 1.0 ⁇ 10 ⁇ 3 mg / mL alkaline phosphatase). Betaine 1, 2 and 3 were each added to the enzyme reaction solution so as to have a final concentration of 0 to 50 mM, and the results of measuring the concentration of p-nitrophenol produced with respect to the reaction time (minutes) are shown in FIG. Show.
  • betaine derivatives having three pentyl groups or hexyl groups have an enzymatic reaction by alkaline phosphatase, compared to betaine derivatives having three butyl groups (betaine 3). It was remarkably improved.
  • a betaine derivative having three pentyl groups (betaine 1) has a range of 0.2 to 0.5 mM
  • a betaine derivative having three hexyl groups (betaine 2) has a range of 0.1 to 0.6 mM. It was revealed that the enzyme reaction efficiency by alkaline phosphatase can be remarkably improved.
  • Example 5 Effect of Betaine Derivatives on Reaction Rate of Sulfatase
  • an ester hydrolase in the absence of betaine, betaine 1 (5 mM) and betaine 3 (100 mM) were present.
  • the substrate was hydrolyzed with lipase.
  • sulfatase As the sulfatase, a commercially available sulfatase (derived from Helix Pomatia) (model number S9926-10KU, manufactured by Sigma-Aldrich) was used.
  • p-nitrophenyl which produces the same product as ⁇ -p-nitrophenyl-D-glucopyranoside (ie, p-nitrophenol) by hydrolysis, can be monitored by UV-visible spectroscopy.
  • Sulfate potassium salt (model number P4903-10MG, manufactured by Sigma-Aldrich) was used. Therefore, also in this Example 5, the reaction rate can be calculated by the same method as in Example 1 to obtain the activity ratio.
  • the hydrolysis rate was measured using an enzyme reaction solution (100 mM phosphate buffer solution (pH 7.0), 2.0 mM p-nitrophenyl sulfate potassium salt, 1.25 ⁇ 10 ⁇ 2 mg / mL sulfatase). Performed at ° C. Betaine 1 or betaine 3 was added to the enzyme reaction solution, and the concentration of p-nitrophenol produced in a reaction time of 0 to 60 minutes was measured, and the activity ratio was calculated. The results are shown in FIG.
  • betaine 1 promotes hydrolysis by sulfatase even at a concentration of 1/20 of betaine 3, as with other hydrolases.
  • Example 6 Effect of Betaine Derivatives on Lipase Reaction Rate
  • an ester hydrolase in the absence of betaine, betaine 1 (5 mM) and betaine 3 (100 mM) were present.
  • the substrate was hydrolyzed with lipase.
  • lipase commercially available lipase AYS Amano (model number 329-58371, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
  • a lipase substrate the same product as ⁇ -p-nitrophenyl-D-glucopyranoside (ie, p-nitrophenol) is produced by hydrolysis, and the hydrolysis can be monitored by UV-visible spectroscopy.
  • Nitrophenylbutyrate (model number N9876-1G, manufactured by Sigma-Aldrich) was used. Therefore, also in the present Example 6, the activity ratio can be obtained by calculating the reaction rate by the same method as in Example 1.
  • the hydrolysis rate was measured at 37 ° C. using an enzyme reaction solution (100 mM phosphate buffer solution (pH 7.0), 0.5 mM 4-nitrophenylbutyrate, 5.0 ⁇ 10 ⁇ 3 mg / mL lipase). I went there. Betaine 1 or betaine 3 was added to the enzyme reaction solution, and the concentration of p-nitrophenol produced in a reaction time of 0 to 30 minutes was measured, and the activity ratio was calculated. The results are shown in FIG.
  • betaine 3 slightly activated, but it was revealed that betaine 1 greatly promoted lipase hydrolysis even at a concentration of 1/20 of betaine 3. .
  • Example 7 Effect of Betaine Derivative on Reaction Rate of Protease
  • betaine which is a hydrolase of peptide bond (amide bond)
  • betaine 1 5 mM
  • betaine 3 In the presence of 100 mM
  • hydrolysis reaction with protease was performed.
  • protease As the protease, commercially available plasmin (derived from Human plasma) (model number P1867-150MG, manufactured by Sigma Aldrich) or trypsin (model number 203-11302, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) was used.
  • plasmin derived from Human plasma
  • trypsin model number 203-11302, manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • Z-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilide model number C2276-25MG, manufactured by Sigma-Aldrich
  • the reaction rate of the protease was calculated from the initial slope of the graph of absorbance change at 405 nm with respect to the reaction time, and the molar extinction coefficient (pH 7.0, 37 ° C.) 6123M ⁇ 1 cm ⁇ 1 of p-nitroaniline as a hydrolysis product was calculated. Was used to calculate the hydrolysis rate.
  • the hydrolysis rate was measured using an enzyme reaction solution (100 mM phosphate buffer solution (pH 7.0), 0.4 mM Z-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilide, 1.25 ⁇ 10 ⁇ 3 mg / mL plasmin or 5.0 ⁇ 10 ⁇ 4 mg / mL trypsin) at 37 ° C.
  • the concentration of p-nitrophenol produced in the reaction time of 0 to 60 minutes was measured, and the activity ratio was calculated. The results are shown in FIG.
  • betaine 1 promotes hydrolysis of amide bonds even at a concentration of 1/20 of betaine 3 as with other hydrolases.

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Abstract

【課題】本発明の目的は、グルコシダーゼやアルカリホスファターゼ等の加水分解酵素を用いた酵素反応において、酵素反応効率を向上させる技術を提供することである。 【解決手段】特定のベタイン誘導体には、加水分解酵素の酵素反応効率を格段顕著に向上させる作用があり、当該ベタイン誘導体を低濃度で存在させるだけでも、これらの酵素反応効率を飛躍的に向上させることが可能になる。

Description

加水分解酵素の反応効率を高める酵素反応方法
　本発明は、グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、スルファターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素を用いた酵素反応において、酵素反応効率を向上させる技術に関する。
　グルコシダーゼは、グルコシド結合を加水分解する反応を触媒する酵素であり、様々な分野で産業的に利用されている。グルコシダーゼは、糖のα－グルコシド結合を加水分解するα－グルコシダーゼと、糖のβ－グルコシド結合を加水分解するβ－グルコシダーゼに大別される。α－グルコシダーゼは、デンプンの液化や糖化、デンプンの改変、洗剤、織物の脱サイズ等の処理に使用されており、産業上、不可欠な酵素である。また、β－グルコシダーゼは、植物系バイオマスに含まれるセルロースを糖化できるため、近年、植物系バイオマスの有効利用が注目されると共に脚光を浴びている。
　また、アルカリホスファターゼは、リン酸エステル化合物を加水分解して脱リン酸化させる反応を触媒する酵素であり、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ａｎｄ　５－ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－２－ｉｎｄｏｌｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）等の基質を加水分解して発色・発光させることができるため、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、生体組織片の染色等に使用される標識酵素として汎用されている。
　また、スルファターゼは、硫酸エステル化合物を加水分解する酵素であり、ヘパリンやコンドロイチン硫酸などの硫酸化多糖における硫酸エステルの加水分解等に使用され、化粧品、医療分野において利用されている。
　また、リパーゼは、脂肪酸エステル化合物を加水分解する酵素であり、食品用フレーバーや香料の製造、食品中の油脂の除去等の食品工業分野、製紙工程における原木からの脂肪（ピッチ）の除去、洗剤等に広く利用されている。
　更に、プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素であり、タンパク質の低分子化、タンパク質の除去、繊維の加工・改質、洗剤等に利用され、食品、医薬品、繊維等の幅広い分野で使用される酵素である。
　一方、一般に、グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、スルファターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素を用いた酵素反応では、生成物やエフェクター分子との結合によって反応過程で反応速度が頭打ちになる場合が多い。このような頭打ちとなる現象を改善して酵素反応の効率を高めることができれば、前述の加水分解酵素を利用する様々な技術分野で多大なメリットをもたらすことになる。例えば、グルコシダーゼの酵素反応効率の向上は、植物系バイオマスに含まれるセルロースの糖化率を高め、ひいてはバイオマスエタノールの生成効率の向上に資することになる。また、アルカリホスファターゼの酵素反応効率の向上は、臨床検査薬、ＥＬＩＳＡやウエスタンブロッティング等を利用した目的物質の検出法において、目的物質の検出感度を高め、更には目的物質の検出時間を短縮することも可能にする。また、スルファターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ等の酵素反応効率の向上は、これらの酵素反応が利用される各種分野において製造効率の向上や品質向上に寄与し得ることが期待される。
　従来、酵素反応において、酵素活性を高める技術は報告されている。例えば、非特許文献１及び２には、糖を含むアルコール、ポリオール類を酵素反応溶液に添加することにより酵素活性を向上させる方法が開示されている。また、非特許文献３及び４には、ポリエチレングリコールや牛血清アルブミンのようなタンパク質を酵素反応溶液に添加することによって、酵素活性を向上できることが開示されている。また、非特許文献５には、グリシンが酵素活性を向上させることも開示されている。しかしながら、これらの非特許文献の技術でも、依然として、酵素の反応効率の向上効果を十分に満足させるものではない。
　また、特定構造のベタイン誘導体が酵素反応効率を向上させることが報告されている（特許文献１）。特許文献１の技術は、酵素の反応効率の向上の点で、優れた技術を開示しているが、グルコシダーゼやアルカリホスファターゼ、スルファターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素を使用する技術分野では、酵素反応の効率が高い程、前述する利点も大きくなるため、これらの酵素の反応効率をより一層高めることが実現できれば、これらの酵素を利用する産業に多大なる技術進歩をもたらすと考えられている。
特開２０１０－２２０６０７号公報
Ｓ．　Ｎ．　Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ，Ａｄｖ．　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍ．，　５１，　３５５　（１９９８） Ｍ．　Ｍｅｊｒｉ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．　Ｐｏｌｙｍ．，　４５，　１６１　（２００１） Ｋ．　Ｈａｙａｓｈｉ，　ｅｔａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１４，　７８１７　（１９８６） Ｋ．　Ｔｏｔａｎｉ，　ｅｔａｌ．，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　１３０，　２１０１　（２００８） Ｖ．　Ｖａｔｈｉｐａｄｉｅｋａｌ，ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　３８８，　６１　（２００７）
　本発明は、グルコシダーゼやアルカリホスファターゼ、スルファターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素を用いた酵素反応において、酵素反応効率を向上させる技術を提供することを目的とする。
　本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、特定のベタイン誘導体には、加水分解酵素の酵素反応効率を格段顕著に向上させる作用があり、当該ベタイン誘導体を低濃度で存在させるだけでも、これらの酵素反応効率を飛躍的に向上させ得ることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．一般式（１）に示すベタイン誘導体の存在下で、加水分解酵素による酵素反応を行うことを特徴とする、酵素反応方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［一般式（１）中、Ｒ１～Ｒ３の内、少なくとも２つの基は、同一又は異なって、炭素数５又は６の直鎖又は分岐状のアルキル基を示し、且つＲ１～Ｒ３の内、残りの１つの基は、炭素数１～８の直鎖又は分岐状のアルキル基を示す。ｎは１～５の整数を示す。］
項２．Ｒ１～Ｒ３が同一又は異なって炭素数５又は６の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１である、項１に記載の酵素反応方法。
項３．Ｒ１～Ｒ３の内、少なくとも２つの基は、同一又は異なって、炭素数５又は６の直鎖状のアルキル基であり、残りの１つの基は、炭素数５～８の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１である、項１に記載の酵素反応方法。
項４．一般式（１）に示すベタイン誘導体及び下記一般式（２）に示すベタイン誘導体の存在下で酵素反応を行う、項１～３のいずれかに記載の酵素反応方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［一般式（２）中、Ｒ４～Ｒ６は、同一又は異なって、炭素数１～４の直鎖若しくは分岐状のアルキル基、又は水素原子を示し、ｎは１～５の整数を示す。］
項５．一般式（１）に示すベタイン誘導体が０．００００１～０．０４Ｍの濃度で存在する、項１乃至４のいずれかに記載の酵素反応方法。
項６．加水分解酵素が、グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、スルファターゼ、リパーゼ及びプロテアーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、項１乃至５のいずれかに記載の酵素反応方法。
項７．加水分解酵素がα－グルコシダーゼである項１乃至５のいずれかに記載の酵素反応方法。
項８．一般式（１）に示すベタイン誘導体を有効成分として含む、加水分解酵素の反応効率の向上剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［一般式（１）中、Ｒ１～Ｒ３及びｎは前記と同じ。］
項９．一般式（１）に示すベタイン誘導体が０．００００１～０．０４Ｍの濃度で使用される、項８に記載の向上剤。
項１０．更に、下記一般式（２）に示すベタイン誘導体を含む項８又は９に記載の向上剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ［一般式（２）中、Ｒ４～Ｒ６及びｎは前記と同じ。］
項１１．加水分解酵素が、グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、スルファターゼ、リパーゼ及びプロテアーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、項８乃至１０のいずれかに記載の向上剤。
項１２．項１乃至７のいずれかに記載の酵素反応方法を行うためのキットであって、下記一般式（１）に示すベタイン誘導体と、加水分解酵素と、を含むことを特徴とする、キット。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 ［一般式（１）中、Ｒ１～Ｒ３及びｎは前記と同じ。］
項１３．一般式（１）に示すベタイン誘導体が０．００００１～０．０４Ｍの濃度で使用されることを示す実験手順書を含む、項１２に記載のキット。
項１４．加水分解酵素が、グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、スルファターゼ、リパーゼ及びプロテアーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、項１２又は１３に記載のキット。
　本発明によれば、特定のベタイン誘導体を使用することにより、グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、スルファターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素を用いた酵素反応において、酵素反応効率を格段顕著に向上させることができる。また、本発明では、特定のベタイン誘導体を酵素反応液中に低濃度で存在させるだけでも、加水分解酵素の反応効率を著しく向上させることが可能になっている。
実施例１において、α－グルコシダーゼを用いた酵素反応において、ベタイン誘導体の添加による酵素反応効率を評価した結果を示す。 実施例２において、β－グルコシダーゼを用いた酵素反応において、ベタイン誘導体の添加による酵素反応効率を評価した結果を示す。 実施例３において、α－グルコシダーゼを用いた酵素反応において、ベタイン誘導体の混合物の添加による酵素反応効率を評価した結果を示す。 実施例４において、アルカリホスファターゼを用いた酵素反応において、ベタイン誘導体の添加による酵素反応効率を評価した結果を示す。 実施例５において、スルファターゼを用いた酵素反応において、ベタイン誘導体の添加による酵素反応効率を評価した結果を示す。 実施例６において、リパーゼを用いた酵素反応において、ベタイン誘導体の添加による酵素反応効率を評価した結果を示す。 実施例７において、プロテアーゼを用いた酵素反応において、ベタイン誘導体の添加による酵素反応効率を評価した結果を示す。
１．酵素反応方法
　本発明は、一般式（１）に示すベタイン誘導体の存在下で、加水分解酵素による酵素反応を行うことを特徴とする。以下、本発明について、詳細に説明する。
ベタイン誘導体
　本発明で使用するベタイン誘導体は、以下の一般式（１）に示す構造である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　一般式（１）中、Ｒ１～Ｒ３の内、少なくとも２つの基は、同一又は異なって、炭素数５又は６の直鎖又は分岐状のアルキル基を示し、且つＲ１～Ｒ３の内、残りの１つの基は、炭素数１～８の直鎖又は分岐状のアルキル基を示す。一般式（１）中、Ｒ１～Ｒ３は、好ましくは、同一又は異なって、炭素数５又は６の直鎖又は分岐状のアルキル基；或いは少なくとも２つの基は、同一又は異なって、炭素数５又は６の直鎖又は分岐状のアルキル基であり、残りの１つの基は、炭素数５～８の直鎖又は分岐状のアルキル基である。更に好ましくは、Ｒ１～Ｒ３は、炭素数５又は６の直鎖状のアルキル基；或いは少なくとも２つの基は、同一又は異なって、炭素数５又は６の直鎖又は分岐状のアルキル基であり、残りの１つの基は、炭素数５～８の直鎖状のアルキル基である。
　また、一般式（１）中、ｎは、１～５、好ましくは１～３、更に好ましくは１の整数を示す。
　本発明に使用される一般式（１）に示すベタイン誘導体の好適な具体例として、Ｒ１～Ｒ３が同一又は異なって炭素数５又は６の直鎖又は分岐状のアルキル基であり、且つｎが１～３の整数；更に好ましくはＲ１～Ｒ３が同一又は異なって炭素数５又は６の直鎖又は分岐状のアルキル基であり、且つｎが１又は２であるもの；特に好ましくはＲ１～Ｒ３が炭素数５の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１であるもの、或いは特に好ましくはＲ１～Ｒ３が炭素数６の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１であるものが例示される。
　本発明においては、これらのベタイン誘導体から１種を選択して単独で使用することもでき、２種以上を組み合わせて使用することもできる。
　一般式（１）に示すベタイン誘導体は、例えば、特開２００９－９６７６６号公報等に記載の方法で製造することができ、更に後述する合成例１－２を参照して公知の有機合成法を用いて製造することもできる。
　また、上記一般式（１）に示されるベタイン誘導体と、下記一般式（２）に示すベタイン誘導体とを組み合わせ、これらのベタイン誘導体の存在下で酵素反応を行ってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　一般式（２）中、Ｒ４～Ｒ６は、同一又は異なって、炭素数１～４の直鎖若しくは分岐状のアルキル基、又は水素原子を示す。一般式（２）中、好ましくは、Ｒ４～Ｒ６の少なくとも１つ、より好ましくは２つ、更に好ましくはＲ４～Ｒ６の全てが炭素数１～４の直鎖状のアルキル基を示す。一般式（２）中、特に好ましくはＲ４～Ｒ６は、炭素数４の直鎖状アルキル基である。
　また、一般式（１）中、ｎは、１～５、好ましくは１～３、更に好ましくは１の整数を示す。
　一般式（２）に示される化合物は、例えば、特開２００９－９６７６６号公報等に記載の方法及び後述する参考合成例１の記載を参照して公知の有機合成法を用いて製造することができる。
　上記一般式（１）に示されるベタイン誘導体と一般式（２）に示されるベタイン誘導体の組み合わせは、各一般式を満たしていれば特に制限されるものではない。ここでは、一般式（１）においてＲ１～Ｒ３が炭素数５の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１であるベタイン誘導体と、一般式（２）においてＲ４～Ｒ６が炭素数４の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１であるベタイン誘導体を例示する。これらのベタイン誘導体を組み合わせて用いる場合であっても、後述する酵素の少なくとも１種が使用される酵素反応に適用され得る。後述する実施例においては、これらのベタイン誘導体の存在下でα－グルコシダーゼによる酵素反応を行うことによって反応効率が顕著に向上する結果が例示されている。
酵素
　本発明の酵素反応方法に使用される酵素は、加水分解酵素である。本発明で使用される加水分解酵素としては、具体的には、グルコシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、セロビナーゼ、キシラナーゼ、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、マンナーゼ、キチナーゼ等の糖加水分解酵素；アルカリホスファターゼ、リン酸ホスファターゼ、スルファターゼ、ヌクレオチダーゼ、リボヌクレアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ等のエステル加水分解酵素；エーテル加水分解酵素；ペプチダーゼ、サブチリン、ペクチナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン、カルボキシペプチダーゼ、サーモライシン等のペプチド（アミド）加水分解酵素等が挙げられる。本発明においては、これらの加水分解酵素から１種を選択して単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。本発明で使用される加水分解酵素の由来についても、特に制限されず、微生物、植物、動物等の如何なる由来であってもよい。
　上記加水分解酵素の中でも、酵素反応効率をより一層向上せしめるという観点から、好ましくはグルコシダーセ、アルカリホスファターゼ、スルファターゼ、リパーゼ及プロテアーゼが挙げられ、更に好ましくはグルコシダーゼが挙げられる。
　本発明で使用されるグルコシダーセとしては、α－グルコシダーゼ及びβ－グルコシダーゼのいずれであってもよいが、α－グルコシダーゼがより好適な加水分解酵素として挙げられる。また、本発明で使用されるグルコシダーセの由来についても特に制限されず、微生物、植物、動物等の如何なる由来であってもよい。
　本発明で使用されるグルコシダーセの好適な例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα－グルコシダーゼ、及びアーモンド由来のβ－グルコシダーゼが例示される。
　本発明で使用されるアルカリホスファターゼとしては、その由来については特に制限されず、微生物、植物等の如何なる由来であってもよい。本発明で使用されるアルカリホスファターゼの好適な一例として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来のものが例示される。
　本発明で使用されるスルファターゼは、その由来については特に制限されず、微生物、植物等の如何なる由来であってもよい。本発明で使用されるスルファターゼの好適な一例として、Ｈｅｌｉｘ　Ｐｏｍａｔｉａ由来のものが例示される。
　本発明で使用されるリパーゼとしては、その由来については特に制限されず、微生物、植物、動物組織等の如何なる由来であってもよい。本発明で使用されるリパーゼの好適な一例として、Ｃａｎｄｉｄａ由来のものが例示される。
　本発明で使用されるプロテアーゼとしては、いずれのプロテアーゼを使用してもよく、例えば、プラスミン、トリプシン、キモトリプシン、サブチリン、ペクチナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、サーモライシン等が挙げられ、これらのうちでも好適なプロテアーゼとしてプラスミン、トリプシンが例示される。また、本発明で使用されるプロテアーゼの由来も特に制限されず、微生物、植物、動物由来のいずれであってもよい。本発明で使用されるプロテアーゼの好適な例としては、ヒト血漿由来プラスミン、動物由来トリプシン等が例示される。
基質
　本発明の酵素反応に使用される基質は、採用する加水分解酵素の種類や酵素反応の目的等に応じて適宜設定すればよい。
　例えば、α－グルコシダーゼを使用する場合であれば、基質としては、α－グルコシド結合を有する化合物であればよく、具体的には、澱粉、アミロペクチン、麦芽糖、マルトオリゴ糖、アルキル又はアリール－α－グルコシド（例えば、メチル－α－Ｄ－グルコピラノシド、α－ｐ－ニトロフェニル－Ｄ－グルコピラノシド）等が挙げられる。
　β－グルコシダーゼを使用する場合であれば、基質としては、β－グルコシド結合を有する化合物であればよく、具体的には、セルロース、セロオリゴ糖、セロビオース、ゲンチオビオース、アルキル又はアリール－β－グルコシド（例えば、メチル－β－Ｄ－グルコピラノシド、β－ｐ－ニトロフェニル－Ｄ－グルコピラノシド）等が挙げられる。
　アルカリホスファターゼを使用する場合であれば、基質としては、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ａｎｄ．　５－ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－２－ｉｎｄｏｌｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ロッシュ）やファーストレッド（シグマ）等の発色基質；アトフォス（商標）（ロッシュ社製）やＨＮＰＰ（ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｎａｐｈｔｈｏｉｃ　ａｃｉｄ－２’－ｐｈｅｎｙｌａｎｉｌｉｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ）等の蛍光発光基質；ジオキセタン等の化学発光基質が挙げられる。
　スルファターゼを使用する場合であれば、基質としては、硫酸エステル化合物であればよく、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン４－硫酸、コンドロイチン６－硫酸等のグリコサミノグリカン；ニトロフェノール硫酸塩等が挙げられる。スルファターゼの基質として、より具体的にはｐ－ニトロフェニルサルフェートカリウム塩が例示される。
　リパーゼを使用する場合であれば、基質としては、脂肪酸とグリセロールとのエステル化合物であればよく、例えば、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド等が挙げられる。また、脂肪酸に限らず、芳香族酸やアルコール、フェノール類のエステルでもよく、例えば、ｐ－ニトロフェニルエステル等が挙げられる。リパーゼの基質としてより具体的には、４－ニトロフェニルブチレートが例示される。
　プロテアーゼを使用する場合であれば、基質としては、ペプチド結合を有する化合物であればよく、例えば、タンパク質、ペプチド等が挙げられる。プロテアーゼの基質としてより具体的には、Ｚ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ｐ－ニトロアニリドが例示される。
酵素反応の条件
　本発明の酵素反応では、上記加水分解酵素を上記基質に作用させる従来の酵素反応系に、上記一般式（１）に示すベタイン誘導体を添加することにより行われる。
　本発明の酵素反応において、加水分解酵素及び基質の濃度については、特に制限されず、使用する加水分解酵素や基質の種類、酵素反応の目的等に応じて適宜設定される。一例として、加水分解酵素の濃度として、通常０．０００１～５００００ｎｇ／ｍＬが挙げられ、基質の濃度として、通常０．０００００１～１Ｍが挙げられる。
　また、本発明の酵素反応において、一般式（１）に示すベタイン誘導体の酵素反応溶液中での使用濃度としては、例えば、０．０００００１～１Ｍ程度、好ましくは０．００００１～１Ｍ程度が挙げられる。特に、本発明では、一般式（１）に示すベタイン誘導体の使用濃度が、０．００００１～０．０４Ｍ、特に０．００００１～０．０２Ｍという低濃度であっても、格段顕著に酵素反応効率を向上させることができる。このような本発明の利点に鑑みれば、本発明の酵素反応における一般式（１）に示すベタイン誘導体の使用濃度として、好ましくは０．００００１～０．０４Ｍ、更に好ましくは０．００００１～０．０２Ｍが挙げられる。より具体的には、一般式（１）に示すベタイン誘導体が、Ｒ１～Ｒ３が炭素数５の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１の化合物である場合であれば、好ましくは０．０００１～０．０４Ｍ、更に好ましくは０．００１～０．０４Ｍが挙げられる。また、一般式（１）に示すベタイン誘導体が、Ｒ１～Ｒ３が炭素数６の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１の化合物である場合であれば、好ましくは０．００００１～０．０４Ｍ、更に好ましくは０．００００１～０．０１Ｍが挙げられる。また、一般式（１）に示すベタイン誘導体が、Ｒ１及びＲ２が炭素数６の直鎖状のアルキル基であり、Ｒ３が炭素数４の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１の化合物である場合であれば、好ましくは０．０００１～０．０４Ｍ、更に好ましくは０．０００５～０．０１Ｍが挙げられる。また、一般式（１）に示すベタイン誘導体が、Ｒ１及びＲ２が炭素数６の直鎖状のアルキル基であり、Ｒ３が炭素数８の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１の化合物である場合であれば、好ましくは０．０００００１～０．００１Ｍ、更に好ましくは０．００００１～０．０００５Ｍが挙げられる。
　ベタイン誘導体を２種以上組み合わせて使用する場合、各ベタイン誘導体の使用濃度は、各ベタイン誘導体による反応効率の向上効果を考慮して、上記の濃度範囲に基づいて適宜設定することができる。
　また、前記一般式（１）に示されるベタイン誘導体と、前記一般式（２）に示されるベタイン誘導体とを組み合わせて使用する場合の各ベタイン誘導体の使用濃度は、例えば、一般式（１）に示されるベタイン誘導体０．０００００１Ｍ～０．０４Ｍに対し、一般式（２）に示されるベタイン誘導体０．００１～０．２Ｍが挙げられる。
　本発明の酵素反応において、加水分解酵素と一般式（１）に示すベタイン誘導体の種類に応じた当該ベタイン誘導体の特に好適な使用濃度として、下記の範囲が挙げられる。
α－グルコシダーゼを使用する場合
　一般式（１）に示すベタイン誘導体が、Ｒ１～Ｒ３が炭素数５の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１の化合物である場合、当該ベタイン誘導体の使用濃度として、好ましくは０．０００１～０．０２Ｍ、更に好ましくは０．００１～０．０１Ｍが挙げられる。
　一般式（１）に示すベタイン誘導体が、Ｒ１～Ｒ３が炭素数６の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１の化合物である場合、当該ベタイン誘導体の使用濃度として、好ましくは０．００００１～０．０２Ｍ、より好ましくは０．０００１～０．０１Ｍ、更に好ましくは０．０００２～０．００１Ｍが挙げられる。
　一般式（１）に示すベタイン誘導体が、Ｒ１及びＲ２が炭素数６の直鎖状のアルキル基であり、Ｒ３が炭素数４の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１の化合物である場合、当該ベタイン誘導体の使用濃度として、好ましくは０．００００１～０．０４Ｍ、より好ましくは０．０００１～０．０２Ｍ、更に好ましくは０．０００５～０．００５Ｍが挙げられる。
　一般式（１）に示すベタイン誘導体が、Ｒ１及びＲ２が炭素数６の直鎖状のアルキル基であり、Ｒ３が炭素数８の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１の化合物である場合、当該ベタイン誘導体の使用濃度として、好ましくは０．００００１～０．０００５Ｍ、更に好ましくは０．００００１～０．０００２５Ｍが挙げられる。
　また、αグルコシダーゼを用いた加水分解反応において、前記一般式（１）に示されるベタイン誘導体と、前記一般式（２）に示されるベタイン誘導体とを組み合わせて使用する場合の各ベタイン誘導体の使用濃度は、例えば、一般式（１）に示されるベタイン誘導体が、Ｒ１～Ｒ３が炭素数５の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１の化合物であり、一般式（２）に示されるベタイン誘導体がＲ４～Ｒ６が炭素数４の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１である化合物であるとき、一般式（１）に示されるベタイン誘導体０．０００００１Ｍ～０．０４Ｍ、好ましくは０．００００１Ｍ～０．０１Ｍに対し、一般式（２）に示されるベタイン誘導体０．０００１～０．５Ｍ、好ましくは０．００１Ｍ～０．２Ｍが挙げられる。
β－グルコシダーゼを使用する場合
　一般式（１）に示すベタイン誘導体が、Ｒ１～Ｒ３が炭素数５の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１の化合物である場合、当該ベタイン誘導体の使用濃度として、好ましくは０．００００１～０．０４Ｍ、更に好ましくは０．０００１～０．０４Ｍが挙げられる。
　一般式（１）に示すベタイン誘導体が、Ｒ１～Ｒ３が炭素数６の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１の化合物である場合、当該ベタイン誘導体の使用濃度として、好ましくは０．０００１～０．０４Ｍ、更に好ましくは０．０００５～０．０１５Ｍが挙げられる。
アルカリホスファターゼを使用する場合
　一般式（１）に示すベタイン誘導体が、Ｒ１～Ｒ３が炭素数５の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１の化合物である場合、当該ベタイン誘導体の使用濃度として、好ましくは０．００００１～０．０１Ｍ、より好ましくは０．００００５～０．００５Ｍ、更に好ましくは０．０００２～０．０００５Ｍが挙げられる。
　一般式（１）に示すベタイン誘導体が、Ｒ１～Ｒ３が炭素数６の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１の化合物である場合、当該ベタイン誘導体の使用濃度として、好ましくは０．０００００１～０．０１Ｍ、より好ましくは０．０００００１～０．００２Ｍ、更に好ましくは０．００００１～０．０００６Ｍが挙げられる。
スルファターゼを使用する場合
　一般式（１）に示すベタイン誘導体が、Ｒ１～Ｒ３が炭素数５の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１の化合物である場合、当該ベタイン誘導体の使用濃度として、好ましくは０．００００１～０．０４Ｍ、更に好ましくは０．０００１～０．０２Ｍが挙げられる。
リパーゼを使用する場合
　一般式（１）に示すベタイン誘導体が、Ｒ１～Ｒ３が炭素数５の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１の化合物である場合、当該ベタイン誘導体の使用濃度として、好ましくは０．００００１～０．０４Ｍ、更に好ましくは０．０００１～０．０２Ｍが挙げられる。
プロテアーゼを使用する場合
　一般式（１）に示すベタイン誘導体が、Ｒ１～Ｒ３が炭素数５の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１の化合物である場合、当該ベタイン誘導体の使用濃度として、好ましくは０．００００１～０．０４Ｍ、更に好ましくは０．０００１～０．０２Ｍが挙げられる。
　本発明の酵素反応は、使用する加水分解酵素や基質、酵素反応の目的等を踏まえて、酵素反応を行うのに適した溶媒（例えば、緩衝液）中で行われる。
　本発明の酵素反応の反応温度については、使用する加水分解酵素が作用できる範囲、好ましくは使用する酵素の至適温度範囲に設定すればよい。
　また、本発明の酵素反応を行う反応系（反応液）のｐＨについても、使用する加水分解酵素が作用できる範囲、好ましくは使用する酵素の至適ｐＨ範囲に設定すればよい。
　本発明の酵素反応における反応時間については、使用する加水分解酵素や基質の種類、酵素反応の進行具合、酵素反応の目的等を踏まえて、適宜設定すればよい。
酵素反応の適用対象
　本発明の酵素反応は、使用する酵素や基質の種類に応じて、様々な分野で使用することができる。
　例えば、加水分解酵素としてα－グルコシダーゼを使用する場合、本発明の酵素反応は、デンプンの液化や糖化、デンプンの改変、織物の脱サイズ等に適用することができる。
　また、加水分解酵素としてβ－グルコシダーゼを使用する場合、本発明の酵素反応は、セルロースの糖化等に適用することができる。
　また、加水分解酵素として、アルカリホスファターゼを使用する場合、アルカリホスファターゼを標識酵素として用いることにより、本発明の酵素反応は、臨床検査薬、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、生体組織片の染色等における化学発光検出又は発色検出のために使用することができる。
　また、加水分解酵素としてスルファターゼを使用する場合、本発明の酵素反応は、ヘパリンやコンドロイチン硫酸などの硫酸化多糖における硫酸エステルの加水分解等に適用することができ、化粧料や医薬品の製造において利用することができる。
　また、加水分解酵素としてリパーゼを使用する場合、本発明の酵素反応は、食品用フレーバーや香料の製造、食品中の油脂の除去、製紙工程における原木からの脂肪（ピッチ）の除去等に適用することができる。また、本発明の酵素反応を油汚れの除去等の洗浄の目的に利用することもできる。
　また、加水分解酵素としてプロテアーゼを使用する場合、本発明の酵素反応は、タンパク質の低分子化、タンパク質の除去、繊維の加工・改質等に適用することができる。また、本発明の酵素反応を、タンパク質汚れ除去等の洗浄の目的に利用することができる。
２．加水分解酵素の反応効率の向上剤
　また、本発明は、一般式（１）に示すベタイン誘導体を有効成分として含む、加水分解酵素の反応効率の向上剤を提供する。当該向上剤は、前記一般式（１）に示されるベタイン誘導体に加え、前記一般式（２）に示されるベタイン誘導体を更に含んでいてもよい。
　当該剤は、加水分解酵素を基質に作用させる酵素反応系で、当該酵素の反応効率を向上させるために使用されるものであり、その使用態様は、前記「１．酵素反応方法」の欄に記載の通りである。
３．キット
　更に、本発明は、上記酵素反応方法を行うためのキットをも提供する。本発明のキットは、一般式（１）に示すベタイン誘導体、及び加水分解酵素を含むものである。
　本発明のキットは、加水分解酵素としてアルカリホスファターゼを含む場合には、必要に応じて、酵素反応に供される発光基質又は発色基質を含んでいてもよく、また、アルカリホスファターゼは、抗体やタンパク質に連結された状態であってもよい。
　また、本発明のキットは、前述する酵素反応についてのプロトコールを示した実験手順書が含まれていてもよい。
　以下、実施例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
合成例１　Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリ－ｎ－ペンチルグリシネート（ベタイン１）の合成（同定）
　３００ｍｌの三ツ口フラスコにトリペンチルアミン２５ｍｌを加え、酢酸エチル２５０ｍｌに溶解させた。窒素気流下、ブロモ酢酸エチル８．６４ｍＬを６分間かけてゆっくりと滴下した。滴下終了後、反応溶液を室温で５日間攪拌した。５日後、反応を止め、溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム：メタノール＝１０：１）で精製し、褐色油状物の前駆体を得た。
　得られた前駆体を蒸留水５０ｍｌに溶解した。この溶液を陰イオン交換カラム（アンバーライト：登録商標ＩＲＡ－４０２、ローム　アンド　ハース社製）を充填したカラムに通した。溶離液をエバポレーターで減圧濃縮し、五酸化二リンの共存下、減圧乾燥し、ベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリ－ｎ－ペンチルグリシネート）（以下、ベタイン１と表記する）を得た（収量１９．２０ｇ、収率８６％）。得られたベタイン１について、Ｈ　ＮＭＲ、ＡＴＲ－ＩＲ、及びＥＳＩ－ＭＳにより分析した結果を表１～３に示す。また、ベタイン１の構造式を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
合成例２　Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリ－ｎ－ヘキシルグリシネート（ベタイン２）の合成（同定）
　３００ｍｌの三ツ口フラスコにトリヘキシルアミン２５ｍｌを加え、酢酸エチル１００ｍｌに溶解させた。窒素気流下、ブロモ酢酸エチル７．４ｍＬを３分間かけてゆっくりと滴下した。滴下終了後、反応溶液を室温で５日間攪拌した。５日後、反応を止め、溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム：メタノール＝１０：１）で精製し、褐色油状物の前駆体を得た。
　得られた前駆体を蒸留水５０ｍｌに溶解した。この溶液を陰イオン交換カラム（アンバーライト：登録商標ＩＲＡ－４０２、ローム　アンド　ハース社製）を充填したカラムに通した。溶離液をエバポレーターで減圧濃縮し、五酸化二リンの共存下、減圧乾燥し、ベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリ－ｎ－ヘキシルグリシネート）（以下、ベタイン２と表記する）を得た（収量１２．２３ｇ、収率５６％）得られたベタイン２について、Ｈ　ＮＭＲ、ＡＴＲ－ＩＲ、及びＥＳＩ－ＭＳにより分析した結果を表４～６に示す。また、ベタイン２の構造式を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
参考合成例１　Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリ－ｎ－ブチルグリシネート（ベタイン３）の合成（同定）
　トリペンチルアミンの代わりにトリブチルアミンを使用し、合成時の諸条件を適宜変更した以外は、上記実施例１と同様の方法によってベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリ－ｎ－ブチルグリシネート）（以下、ベタイン３と表記する）を得た。得られたベタイン３について、Ｈ　ＮＭＲ、ＡＴＲ－ＩＲ、及びＥＳＩ－ＭＳにより分析した結果を表７～９に示す。また、ベタイン３の構造式を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
合成例３　Ｎ，Ｎ，－ジ－ｎ－ヘキシル－Ｎ－ｎ－ブチルグリシネート（ベタイン４）の合成（同定）
　１００ｍｌの三ツ口フラスコにＮ，Ｎ，－ジ－ｎ－ヘキシル－Ｎ－ｎ－ブチルアミン３．０７ｇを加え、酢酸エチル３０ｍｌに溶解させた。窒素気流下、ブロモ酢酸エチル１．２６ｍＬを３分間かけてゆっくりと滴下した。滴下終了後、反応溶液を室温で５日間攪拌した。２日後、反応を止め、溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン：酢酸エチル＝５０：１→クロロホルム→クロロホルム：メタノール＝２０：１）で精製し、淡黄色油状物の前駆体を得た。
　得られた前駆体を蒸留水２０ｍｌに溶解した。この溶液を陰イオン交換カラム（アンバーライト：登録商標ＩＲＡ－４０２、ローム　アンド　ハース社製）を充填したカラムに通した。溶離液をエバポレーターで減圧濃縮し、五酸化二リンの共存下、減圧乾燥し、ベタイン（Ｎ，Ｎ，－ジ－ｎ－ヘキシル－Ｎ－ｎ－ブチルグリシネート）（以下、ベタイン４と表記する）を得た（収量１．１０ｇ、収率３２％）得られたベタイン４について、Ｈ　ＮＭＲ、ＡＴＲ－ＩＲ、及びＥＳＩ－ＭＳにより分析した結果を表１０～１２に示す。また、ベタイン４の構造式を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
合成例５　Ｎ，Ｎ，－ジ－ｎ－ヘキシル－Ｎ－ｎ－オクチルグリシネート（ベタイン５）の合成（同定）
　３００ｍｌの三ツ口フラスコにＮ，Ｎ，－ジ－ｎ－ヘキシル－Ｎ－ｎ－オクチルアミン６．７９ｇを加え、酢酸エチル６８ｍｌに溶解させた。窒素気流下、ブロモ酢酸エチル２．２４ｍＬを５分間かけてゆっくりと滴下した。滴下終了後、反応溶液を室温で５日間攪拌した。７日後、反応を止め、溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン：酢酸エチル＝５０：１→クロロホルム→クロロホルム：メタノール＝２０：１）で精製し、褐色油状物の前駆体を得た。
　得られた前駆体を蒸留水２０ｍｌに溶解した。この溶液を陰イオン交換カラム（アンバーライト：登録商標ＩＲＡ－４０２、ローム　アンド　ハース社製）を充填したカラムに通した。溶離液をエバポレーターで減圧濃縮し、五酸化二リンの共存下、減圧乾燥し、ベタイン（Ｎ，Ｎ，－ジ－ｎ－ヘキシル－Ｎ－ｎ－オクチルグリシネート）（以下、ベタイン５と表記する）を得た（収量０．３４ｇ、収率５％）得られたベタイン５について、Ｈ　ＮＭＲ、ＡＴＲ－ＩＲ、及びＥＳＩ－ＭＳにより分析した結果を表１３～１５に示す。また、ベタイン５の構造式を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
実施例１　α－グルコシダーゼの反応速度に及ぼすベタイン誘導体の効果
　得られたベタイン誘導体（ベタイン１～５）の添加による酵素活性向上効果を評価、検討するため、ベタイン誘導体存在下でのα－グルコシダーゼの加水分解速度を測定した。α－グルコシダーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来）（型番Ｇ３６５１－２５０ｕｎ、シグマアルドリッチ製）の基質としては、紫外可視分光測定から加水分解をモニターできるα－ｐ－ニトロフェニル－Ｄ－グルコピラノシド（型番３２５－３４６７１、和光純薬製）を用いた。
　基質であるα－ｐ－ニトロフェニル－Ｄ－グルコピラノシドは３５０ｎｍに極大吸収波長を持つが、α－グルコシダーゼによってグルコースとｐ－ニトロフェノールに加水分解されると、ｐＨ７．０においてはｐ－ニトロフェノールは水酸基のプロトンが解離してｐ－ニトロフェノラートとなる。結果として、極大吸収波長は長波へシフトし、４０５ｎｍの吸光度が上昇する。４０５ｎｍのｐ－ニトロフェノラートのモル吸光係数（ｐＨ７．０、３７℃）である７６６０Ｍ-1ｃｍ-1を利用すれば、加水分解によって生成するｐ－ニトロフェノールの濃度を見積もることができ、反応速度を算出することができる。
　加水分解速度の測定は、酵素反応溶液（１００ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０），２ｍＭ　α－ｐ－ニトロフェニル－Ｄ－グルコピラノシド，２．５×１０-5ｍｇ／ｍＬ　α－グルコシダーゼ）を用いて、３７℃で行った。ベタイン誘導体は、最終濃度０～１０００ｍＭとなるように上記酵素反応溶液に添加した。
　α－グルコシダーゼの反応速度は反応時間に対する４０５ｎｍの吸光度変化のグラフの初期の傾きから算出し、加水分解産物であるｐ－ニトロフェノールのモル吸光係数（ｐＨ７．０、３７℃）７６６０Ｍ-1ｃｍ-1を用いて加水分解速度を算出した。
　また、酵素活性の誤差を最小限とするため、ベタイン誘導体添加による効果を活性比で表した。当該「活性比」とは、「ベタイン誘導体の非存在下での酵素の反応速度」に対する「ベタイン誘導体の存在下での酵素の反応速度」の比を指す。
　得られた結果を図１及び表１６に示す。なお、図１には、低濃度のベタイン誘導体での本発明の効果を明らかにするために、ベタイン１、２、４及び５が５ｍＭまでの濃度範囲での測定結果を示す。３つのブチル基を有するベタイン３では、１００ｍＭ付近に活性比の極大が存在するが、３つのペンチル基を有するベタイン１では７ｍＭ付近に、３つのヘキシル基を有するベタイン２では、０．５ｍＭ付近にシフトし、活性化に必要となるベタイン誘導体濃度が有意に低下することが示された。特に、表１６から明らかなように、少なくとも２つのペンチル基又はヘキシル基を有するベタイン誘導体（ベタイン１、２、４、及び５）は、３つのブチル基を有するベタイン誘導体（ベタイン３）に比して、１４～２０００倍も低濃度で反応速度６．５×１０-7～７．８×１０-7Ｍ　ｍｉｎ-1程度を達成することができていた。なお、ベタイン３は、１００ｍＭの濃度で酵素に対する活性化効果が最大になることが知られている（特開２０１０－２２０６０７号公報参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
実施例２　β－グルコシダーゼの反応速度に及ぼすベタイン誘導体の効果
　β－グルコシダーゼに与えるベタイン誘導体の添加効果を比較した。β－グルコシダーゼとしては、市販のβ－グルコシダーゼ（Ａｌｍｏｎｄ由来（型番３０６－５０９８１）和光純薬製）を用いて評価し、ベタイン誘導体としてはベタイン１、２及び３を用いた。β－グルコシダーゼの反応速度は、反応時間に対する４０５ｎｍの吸光度変化のグラフの初期の傾きから算出し、加水分解物であるｐ－ニトロフェノールのモル吸光係数（ｐＨ７．０，　３７℃）７６６０Ｍ-1ｃｍ-1を用いて加水分解速度を算出した。
　測定条件は、酵素反応溶液（１００ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０），　２ｍＭ　β－ｐ－ニトロフェニル－Ｄ－グルコピラノシド，　１．３×１０-3ｍｇ／ｍＬ　β－グルコシダーゼ）を用いて、３７℃で行った。ベタイン１、２及び３はそれぞれ、最終濃度０～１０００ｍＭとなるように上記酵素反応溶液に添加し、反応時間（分）に対して産生されたｐ－ニトロフェノールの濃度を測定した結果を図２に示す。
　図２から明らかなように、３つのペンチル基又はヘキシル基を有するベタイン誘導体（ベタイン１及び２）は、３つのブチル基を有するベタイン誘導体（ベタイン３）に比して、β－グルコシダーゼによる酵素反応を顕著に向上させていた。とりわけ、３つのペンチル基を有するベタイン誘導体（ベタイン１）では１～４０ｍＭの範囲で、また３つのヘキシル基を有するベタイン誘導体（ベタイン２）は０．５～１５ｍＭの範囲で、酵素反応効率を顕著に向上できることが明らかになった。
実施例３　α－グルコシダーゼの反応速度に及ぼすベタイン誘導体の混合物による効果
　ベタイン誘導体（ベタイン１及び３）の混合物の反応速度に対する効果について検討するため、ベタイン１とベタイン３の混合物を添加して、α－グルコシダーゼの活性比測定を行った。
　測定条件は、酵素反応溶液（１００ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０），２ｍＭ　α－ｐ－ニトロフェニル－Ｄ－グルコピラノシド，２．５×１０-4ｍｇ／ｍＬ　α－グルコシダーゼ）を用いて、３７℃で行った。ベタイン１、ベタイン３又はベタイン１及び３の混合物を酵素反応溶液に添加して反応時間６０分の間に産生されたｐ－ニトロフェノールの濃度を測定し、活性比を算出した。ｐ－ニトロフェノールの濃度の測定及び活性比の算出は、前記実施例１に記載の方法に従って行った。
　ここで、酵素反応溶液に添加するベタイン１の濃度は、極大活性化濃度付近の３ｍＭとし、ベタイン３の濃度を２５ｍＭとした。また、ベタイン１及び３の混合物については、ベタイン１を３ｍＭ、ベタイン３を２５ｍＭとした。得られた結果を図３に示す。
　ベタイン誘導体を混合物として添加すると、ベタイン誘導体が相互作用し合うことによって、酵素反応に対する活性化効果が互いに干渉して活性比はほとんどかわらない、もしくは、低下することが予想された。また、前記試験例１の結果からも明らかなように、ベタイン３は、他のベタイン誘導体に比して酵素に対する活性化効果は劣ることが示されている。しかし、本発明のベタイン誘導体（ベタイン１及び３）を混合して使用すると、図３から明らかなように、ベタイン１又はベタイン３単独の場合と比較して活性比が顕著に上昇することが示された。
実施例４　アルカリフォスファターゼの反応速度に及ぼすベタイン誘導体の効果
　グルコシダーゼ以外の加水分解酵素に与えるベタイン誘導体の添加効果を調べるため、リン酸エスエル加水分解酵素であるアルカリホスファターゼを用いて実験を行った。アルカリホスファターゼとしては、市販のアルカリホスファターゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来（型番０１２－１０６９１）、和光純薬製）を用いて評価し、ベタイン誘導体としてはベタイン１、２及び３を用いた。アルカリホスファターゼの反応速度は、反応時間に対する４０５ｎｍの吸光度変化のグラフの初期の傾きから算出し、加水分解物であるｐ－ニトロフェノールのモル吸光係数（ｐＨ７．０，　３７℃）７６６０Ｍ-1ｃｍ-1を用いて加水分解速
度を算出した。
　測定条件は、酵素反応溶液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．５），　２ｍＭ　ｐ－ニトロフェニルホスフェート，　１．０×１０-3ｍｇ／ｍＬ　アルカリホスファターゼ）を用いて、３７℃で行った。ベタイン１、２及び３はそれぞれ、最終濃度０～５０ｍＭとなるように上記酵素反応溶液に添加し、反応時間（分）に対して産生されたｐ－ニトロフェノールの濃度を測定した結果を図４示す。
　図４から明らかなように、３つのペンチル基又はヘキシル基を有するベタイン誘導体（ベタイン１及び２）は、３つのブチル基を有するベタイン誘導体（ベタイン３）に比して、アルカリホスファターゼによる酵素反応を顕著に向上させていた。とりわけ、３つのペンチル基を有するベタイン誘導体（ベタイン１）では０．２～０．５ｍＭの範囲で、また３つのヘキシル基を有するベタイン誘導体（ベタイン２）は０．１～０．６ｍＭの範囲で、アルカリホスファターゼによる酵素反応効率を顕著に向上できることが明らかになった。
実施例５　スルファターゼの反応速度に及ぼすベタイン誘導体の効果
　エステル加水分解酵素であるスルファターゼに対するベタインの添加効果を検討するため、ベタイン非存在下、ベタイン１（５ｍＭ）、ベタイン３（１００ｍＭ）の存在下においてリパーゼによる基質の加水分解反応を行った。
　スルファターゼとしては、市販のスルファターゼ（Ｈｅｌｉｘ　Ｐｏｍａｔｉａ由来）（型番Ｓ９９２６－１０ＫＵ、シグマアルドリッチ製）を使用した。また、基質としては、加水分解によってα－ｐ－ニトロフェニル－Ｄ－グルコピラノシドと同じ生成物（即ち、ｐ－ニトロフェノ－ル）を生成し、紫外可視分光測定から加水分解をモニターできるｐ－ニトロフェニルサルフェートカリウム塩（型番Ｐ４９０３－１０ＭＧ、シグマアルドリッチ製）を使用した。従って、本実施例５においても、実施例１と同様の方法により反応速度を算出して活性比を求めることができる。
　加水分解速度の測定は、酵素反応溶液（１００ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０），２．０ｍＭ　ｐ－ニトロフェニルサルフェートカリウム塩，１．２５×１０-2ｍｇ／ｍＬ　スルファターゼ）を用いて、３７℃で行った。前記酵素反応溶液にベタイン１又はベタイン３を添加して応時間０～６０分間で産生されたｐ－ニトロフェノールの濃度を測定し、活性比を算出した。結果を図５に示す。
　図５から明らかなように、他の加水分解酵素と同様に、ベタイン１はベタイン３の２０分の１の濃度でもスルファターゼによる加水分解を促進していることが明らかとなった。
実施例６　リパーゼの反応速度に及ぼすベタイン誘導体の効果
　エステル加水分解酵素であるリパーゼに対するベタインの添加効果を検討するため、ベタイン非存在下、ベタイン１（５ｍＭ）、ベタイン３（１００ｍＭ）の存在下においてリパーゼによる基質の加水分解反応を行った。
　リパーゼとしては、市販のリパーゼＡＹＳアマノ（型番３２９－５８３７１、和光純薬製）を使用した。また、リパーゼの基質としては、加水分解によってα－ｐ－ニトロフェニル－Ｄ－グルコピラノシドと同じ生成物（即ち、ｐ－ニトロフェノ－ル）を生成し、紫外可視分光測定から加水分解をモニターできる４－ニトロフェニルブチレート（型番Ｎ９８７６－１Ｇ、シグマアルドリッチ製）を用いた。従って、本実施例６においても、実施例１と同様の方法により反応速度を算出して活性比を求めることができる。
　加水分解速度の測定は、酵素反応溶液（１００ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０），０．５ｍＭ　４－ニトロフェニルブチレート，５．０×１０-3ｍｇ／ｍＬリパーゼ）を用いて、３７℃で行った。前記酵素反応溶液にベタイン１又はベタイン３を添加して反応時間０～３０分間で産生されたｐ－ニトロフェノールの濃度を測定し、活性比を算出した。結果を図６に示す。
　図６から明らかなように、ベタイン３はわずかに活性化をもたらしたが、ベタイン１はベタイン３の２０分の１の濃度でもリパーゼによる加水分解を大幅に促進していることが明らかとなった。
実施例７　プロテアーゼの反応速度に及ぼすベタイン誘導体の効果
　ペプチド結合（アミド結合）の加水分解酵素であるプロテアーゼに対するベタインの添加効果を検討するため、ベタイン非存在下、ベタイン１（５ｍＭ）、ベタイン３（１００ｍＭ）の存在下においてプロテアーゼによる加水分解反応を行った。
　プロテアーゼとしては、市販のプラスミン（Ｈｕｍａｎ　ｐｌａｓｍａ由来）（型番Ｐ１８６７－１５０ＭＧ、シグマアルドリッチ製）又はトリプシン（型番２０３－１１３０２、和光純薬製）を用いた。また、基質としては、加水分解によってｐ－ニトロアニリンを生成し、紫外可視分光測定から加水分解をモニターできるＺ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ｐ－ニトロアニリド（型番Ｃ２２７６－２５ＭＧ、シグマアルドリッチ製）を用いた。
　プロテアーゼの反応速度は反応時間に対する４０５ｎｍの吸光度変化のグラフの初期の傾きから算出し、加水分解産物であるｐ－ニトロアニリンのモル吸光係数（ｐＨ７．０、３７℃）６１２３Ｍ-1ｃｍ-1を用いて加水分解速度を算出した。
　加水分解速度の測定は、酵素反応溶液（１００ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０），０．４ｍＭ　Ｚ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ｐ－ニトロアニリド，１．２５×１０-3ｍｇ／ｍＬプラスミン又は５．０×１０-4ｍｇ／ｍＬトリプシン）を用いて、３７℃で行った。反応時間０～６０分間で産生されたｐ－ニトロフェノールの濃度を測定し、活性比を算出した。結果を図７に示す。
　図７から明らかなように、他の加水分解酵素と同様に、ベタイン１はベタイン３の２０分の１の濃度でもアミド結合の加水分解を促進していることが示された。

Claims (14)

  1. 　一般式（１）に示すベタイン誘導体の存在下で、加水分解酵素による酵素反応を行うことを特徴とする、酵素反応方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［一般式（１）中、Ｒ１～Ｒ３の内、少なくとも２つの基は、同一又は異なって、炭素数５又は６の直鎖又は分岐状のアルキル基を示し、且つＲ１～Ｒ３の内、残りの１つの基は、炭素数１～８の直鎖又は分岐状のアルキル基を示す。ｎは１～５の整数を示す。］
  2. 　Ｒ１～Ｒ３が同一又は異なって炭素数５又は６の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１である、請求項１に記載の酵素反応方法。
  3. 　Ｒ１～Ｒ３の内、少なくとも２つの基は、同一又は異なって、炭素数５又は６の直鎖状のアルキル基であり、残りの１つの基は、炭素数５～８の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１である、請求項１に記載の酵素反応方法。
  4. 　一般式（１）に示すベタイン誘導体及び下記一般式（２）に示すベタイン誘導体の存在下で酵素反応を行う、請求項１～３のいずれかに記載の酵素反応方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［一般式（２）中、Ｒ４～Ｒ６は、同一又は異なって、炭素数１～４の直鎖若しくは分岐状のアルキル基、又は水素原子を示し、ｎは１～５の整数を示す。］
  5. 　一般式（１）に示すベタイン誘導体が０．００００１～０．０４Ｍの濃度で存在する、請求項１乃至４のいずれかに記載の酵素反応方法。
  6. 　加水分解酵素が、グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、スルファターゼ、リパーゼ及びプロテアーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１乃至５のいずれかに記載の酵素反応方法。
  7. 　加水分解酵素がα－グルコシダーゼである請求項１乃至５のいずれかに記載の酵素反応方法。
  8. 　一般式（１）に示すベタイン誘導体を有効成分として含む、加水分解酵素の反応効率の向上剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［一般式（１）中、Ｒ１～Ｒ３及びｎは前記と同じ。］
  9. 　一般式（１）に示すベタイン誘導体が０．００００１～０．０４Ｍの濃度で使用される、請求項８に記載の向上剤。
  10. 　更に、下記一般式（２）に示すベタイン誘導体を含む請求項８又は９に記載の向上剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［一般式（２）中、Ｒ４～Ｒ６及びｎは前記と同じ。］
  11. 　加水分解酵素が、グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、スルファターゼ、リパーゼ及びプロテアーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８乃至１０のいずれかに記載の向上剤。
  12. 　請求項１乃至７のいずれかに記載の酵素反応方法を行うためのキットであって、下記一般式（１）に示すベタイン誘導体と、加水分解酵素と、を含むことを特徴とする、キット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ［一般式（１）中、Ｒ１～Ｒ３及びｎは前記と同じ。］
  13. 　一般式（１）に示すベタイン誘導体が０．００００１～０．０４Ｍの濃度で使用されることを示す実験手順書を含む、請求項１２に記載のキット。
  14. 　加水分解酵素が、グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、スルファターゼ、リパーゼ及びプロテアーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１２又は１３に記載のキット。
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