CN109576258A - 一种mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化及催化油脂脱胶方法 - Google Patents
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Abstract
一种mPEG‑HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化及催化油脂脱胶方法,包括以下步骤:制备磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物、制备生物印迹磷脂酶、制备磁性固定化生物印迹磷脂酶、磁性固定化生物印迹磷脂酶催化油脂脱胶反应。本发明的磁性固定化生物印迹磷脂酶可以回收与重复使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化及催化油脂脱胶方法,属于生物化工技术领域。
背景技术
以油料种子为原料,利用压榨工艺或浸出工艺制备出的油脂统称为毛油,其主要成分是游离脂肪酸和甘油三酯,此外还存在一定量的胶质,如磷脂化合物。磷脂是一种表面活性剂,通常条件下与蛋白质、黏液质及微量金属结合在一起,形成1~100nm的微粒呈胶溶态分散于毛油中。这些杂质会对油脂品质、贮存稳定性、下游深加工的催化剂和产品质量造成非常大的影响,因此高效毛油脱胶技术的开发和应用已成为产品高质化的关键。
毛油中胶质的主要成分是磷脂,所以工业上常把脱胶称为脱磷。磷脂溶于氯仿、乙醚、石油醚和苯等脂肪烃和芳香烃溶剂,但不溶于丙酮和水等极性物质, 是一种极有价值的营养物质,已在食品工业和保健品中广泛使用。根据与磷脂酸羟基相连的官能团不同,磷脂通常分为水化磷脂和非水化磷脂。水化磷脂含有极性较强的亲水基团,这些基团易与水结合,从油相中分离出来,从而达到脱磷的目的。水化磷脂包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰丝氨酸(PS)。
脱胶方法主要有水化脱胶、酸法脱胶、膜法脱胶和酶法脱胶。酶法脱胶是一种新型的脱胶工艺,常用酶包括磷脂酶PLA1、PLA2和PLC。其中磷脂酶PLA1和磷脂酶PLA2可以特异水解磷脂甘油Sn-1或Sn-2上的酯键,生成亲水性好的溶血磷脂和游离脂肪酸,从而达到脱磷的目的。而PLC主要作用于甘油磷脂C3位上甘油磷酸酯键,水解产物为甘油二酯(DAG)及有机磷酸酯(磷酸胆碱、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸以及磷酸肌醇等)。酶法脱胶是一种绿色环保的油脂脱胶方法,但在全国的各大油脂厂中很少应用此法进行脱胶。主要是由于游离酶的成本较高,而且难以回收再利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化及催化油脂脱胶方法。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明提供的技术方案是:一种mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化方法,包括下列步骤:
第一步:将磷脂乳液、柠檬酸盐缓冲液、磷脂酶和蒸馏水混合均匀得到酶-底物混合物,然后在23-27℃温度条件下震荡5-8min以完成修饰操作,接着对修饰操作后的混合溶液进行冷冻干燥,得到的干粉物质即为生物印迹磷脂酶;
第二步:将20mM的磷酸缓冲溶液加入到装有转子、冷凝管、温度计的三角烧瓶中,加热至33-37℃后加入第一步制得的生物印迹磷脂酶,待其溶解后加入所述生物印迹磷脂酶的质量的1.8-2.2倍的碳二亚胺,反应0.8-1.2 h后加入所述生物印迹磷脂酶的质量的1-1.5倍的修饰剂单甲氧基聚乙二醇酰肼,修饰反应完成后将修饰操作后的混合溶液在20mM磷酸缓冲液中透析,透析结束后得到纯化的修饰酶液;
第三步:在一反应容器中加入纯化的修饰酶液、磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物和20mM的柠檬酸缓冲液,然后将所述反应容器放入水浴摇床,在28-32℃条件下固定化反应1.8-2.2 h,然后加入体积分数为4.5-5.5%的戊二醛作为交联剂,在28-32℃条件下反应1~5h后得到固定化酶,再用20mM柠檬酸缓冲液对所述固定化酶进行洗涤后得到磁性固定化磷脂酶;
所述磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物的制备方法包括下列步骤:
S1、将壳聚糖溶解于水中,然后调节pH值至4-5得到壳聚糖溶液;通过超声处理将油酸分散于乙醇中,然后加入碳二亚胺并磁力搅拌,0.8-1.2h后,加入N-羟基琥珀酰亚胺得到混合溶液,接着将所述混合溶液滴加到壳聚糖溶液中,并在85-95℃反应10-14h完成改性,然后使用3KDa中空纤维束膜超滤去除水溶性的副产物,再对超滤后的溶液进行冷冻干燥,得到的冻干粉用乙醇分散后用0.22μm的尼龙滤纸过滤,重复两次以上,得到的滤渣再经真空冷冻干燥后即为油酸改性的壳聚糖;壳聚糖与水的质量比例为4.5~5.5:1;所述油酸的摩尔量与壳聚糖单体摩尔量之比为0.18~0.22:1;碳二亚胺的摩尔量与油酸的摩尔量之比为4.5~5.5:1;N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔量与油酸摩尔量之比为4.5~5.5:1;
S2、将碳二亚胺加入到磁性氧化石墨烯悬浮液中,并用2(N-吗啉)乙磺酸调pH值到5.5-5.7,超声处理10~20min后加入N-羟基琥珀酰亚胺,并用磷酸缓冲盐溶液调节pH值到7.1-7.3,得到活化的磁性氧化石墨烯溶液;通过超声处理,将油酸改性的壳聚糖分散于乙酸水溶液中得到油酸改性的壳聚糖溶液,然后将油酸改性的壳聚糖溶液滴加到所述活化的磁性氧化石墨烯溶液中,在室温条件下超声处理5-7h,接下来在室温条件下,震荡7-9h,反应结束后得到磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物;碳二亚胺与磁性氧化石墨烯悬浮液的质量比为3-5:1。
优选的技术方案为:在第一步中,将质量浓度为4.5~5.5%的磷脂乳液、柠檬酸盐缓冲液、磷脂酶和蒸馏水按照4.8~5.2:0.8~1.2:4.7~5.3:0.8~1.2的体积比混合均匀,得到酶-底物混合物;所述柠檬酸盐缓冲液为0.1M柠檬酸盐缓冲液,pH值为 4.5-6.5。
优选的技术方案为:所述磷脂酶为磷脂酶A1和磷脂酶A2中的至少一种。
优选的技术方案为:在第一步中,先在-85~-75℃温度环境中对修饰操作后的混合溶液冷冻30-35min,然后在真空干燥机中以真空表压-0.09~-0.10MPa、温度-50~-40℃的参数,冷冻干燥24-30h。
优选的技术方案为:所述纯化的修饰酶液、20mM的柠檬酸缓冲液和体积分数为4.5-5.5%的戊二醛之间的体积比例为2~10:45~55:0.8~1.2;所述20mM柠檬酸盐缓冲液的pH值为4.5-6.5,所述纯化的修饰酶液与磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物的体积质量比为2~10ml:2g。
优选的技术方案为:所述磁性氧化石墨烯的制备方法包括下列步骤:
步骤一:将石墨烯粉末和NaNO3加入到浓硫酸中,在冰水浴中搅拌13~17 min后加入KMnO4,然后置于38~42℃的水浴,磁力搅拌85~95min,接着加入第一蒸馏水并继续搅拌8~12min后,加入H2O2溶液直到溶胶出现,然后加入第二蒸馏水将其稀释并离心收集沉淀,最后用蒸馏水清洗沉淀直到上清液的pH值为6;对清洗后的沉淀进行真空干燥,得到氧化氧化石墨烯;石墨烯粉末、NaNO3、浓硫酸、KMnO4、第一蒸馏水、体积分数为30%的H2O2溶液和第二蒸馏水之间的质量比例为1:0.8~1.2:20~30:1.5~2.5:20~30:2~4:20~30;
步骤二:将质量体积比5:1将氧化石墨烯粉末加入到磁性混合液中,水浴加热并搅拌,当温度达到75~85℃时,逐滴加入氨水溶液,保持18~22min后完成磁性四氧化三铁与氧化石墨烯的结合;然后用磁铁分离获得黑色的沉淀物,然后用甲醇和蒸馏水对黑色的沉淀物进行清洗,最后在真空干燥箱内对清洗得到的产物进行干燥,得到磁性氧化石墨烯;所述磁性混合液的制备方法包括:首先将30mL的冰乙酸和970mL的蒸馏水混合配制成3%的冰乙酸,然后加入1.29 g的FeCl2和3.51g的FeCl3。
优选的技术方案为:通过超声处理,将0.1-0.3g的油酸改性的壳聚糖分散于体积分数为2%的乙酸水溶液中得到油酸改性的壳聚糖溶液。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明提供的技术方案是:一种催化油脂脱胶方法,包括下列步骤:
第一步:将毛油加热至70~90 ℃,并保温8~12 min,然后向毛油中加入其质量0.15~0.25%的质量分数为40~50%的柠檬酸溶液,用搅拌器或高速剪切机均质15-20min,70-80℃保温30-40min;接着调节酸处理后的毛油的pH值至5.0-6.0,然后再用搅拌器或高速剪切机均质使毛油体系稳定;
第二步:向第一步得到的毛油中加入其质量0.05-0.10%的利用权利要求1-7任一权利要求制得的磁性固定化复合磷脂酶和质量0.4-0.6%的纯化水,在50-55℃下搅拌反应3-5h,得到酶解液;
第三步:对所述酶解液进行分离后得到脱胶油和废弃物。
优选的技术方案为:用磁铁对所述废弃物内的磁性固定化复合磷酸酶进行回收,回收后的磁性固定化复合磷酸酶先用磁性固定化复合磷酸酶专用清洗回收液进行清洗,然后进行真空干燥,得到回收的磁性固定化复合磷酸酶;所述磁性固定化复合磷酸酶专用清洗回收液的制备方法包括:按照无水乙醇与柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液按照3:7的体积比例混合后即得,所述柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液的pH值为5。
由于上述技术方案运用,本发明与现有技术相比具有的优点是:
1、本发明采用磁响应固定化酶进行脱胶,不仅节省了水资源,不产生皂角,而且可以循环利用,从而避免了一些工序并节约了成本。②采用膜法代替离心机脱除胶体,不仅节省能耗,而且可连续性的进行脱胶处理,相比于笨重的离心机要轻巧的多。本发明在达到节能减排的同时,并能实现清洁生产。既符合国家环保政策也符合国家产业政策,可为企业带来巨大的经济效益,提高市场竞争力,并降低对环境的影响,为投资者带来显著的回报,促进产业发展,具有明显的经济效益和社会效益。
2、本发明方法可广泛应用于不同磷含量的植物油,如大豆油、菜籽油、玉米油、棉籽油、米糠油、葵花籽油等。
3、节约用水和能耗。传统脱胶水洗工序需要10~15%的水,酶法脱胶免掉了水洗工序。节省一台水洗离心机以及此工序所产生的能耗。
4、环境友好。避免化学精炼过程中皂脚产生,免去水洗工序,不产生废水,从而避免了处理皂脚及废水所带来的环保问题。
5、固定化酶循环使用节约成本。固定化酶可以重复使用,本发明中两种固定化磷脂酶的重复使用次数可达8次,使磷脂酶的使用率大大得到了提高,从而节约了生产成本。
6、采用复合酶脱胶,脱胶效率比单酶更高,双酶的使用比单独使用磷脂酶A1的成本要低。且磷脂酶A2的不会分解甘三酯产生副产品,因而更安全。此外磷脂酶A1和A2并不会像磷脂酶C那样产生对身体不利的甘油二脂。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式,熟悉此技术的人士可由本实施例所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
本文中使用的术语的目的仅在于说明特别实施例,并不意图对本发明做限制。除非上下文明确显示,否则本文中使用的单数形式“一”、“一个”亦包括复数形式。
在说明较佳实施例时,可能基于清楚的目的而使用特别的术语;然而,本说明书所揭露者并不意图被限制在所选择的该特别术语;并且应当理解,每一个特定元件包括具有相同功能、以相似方式操作并达成相似效果的所有等效技术。
实施例一:一种mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化及催化油脂脱胶方法
一种mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化及催化油脂脱胶方法,包括以下步骤。
(1)制备生物印迹磷脂酶
将大豆磷脂加入到19倍质量的蒸馏水中,以4000rpm转速搅拌75min,得到5m%的磷脂乳液。
生物印迹磷脂酶的制备主要包括修饰和冷冻干燥两个步骤。在修饰过程中,将5份体积的质量浓度为5m%的磷脂乳液、1份体积的0.1M柠檬酸盐缓冲液、5份体积的PLA1、1份体积的蒸馏水混合均匀,得到酶-底物混合物;然后,在25℃温度条件下震荡6.5min,完成修饰操作。将修饰操作后的混合溶液,在-80℃温度环境中冷冻32min,然后在真空表压-0.09MPa、温度-45℃的参数下冷冻干燥27h,得到的干粉物质为生物印迹磷脂酶A1,简称bi-PLA1。生物印迹磷脂酶A1应密闭储藏在0-6℃环境中。按照同样的方法来进行磷脂酶A2的生物印迹酶制备,简称bi-PLA2。
所述的0.1M柠檬酸盐缓冲液,其pH值为 4.5-6.5,其制备方法:精确称取一水柠檬酸21.01g溶解并定容至1L配制成0.1mol/L的柠檬酸溶液,以及称取29.41g溶解并定容至1L配制成0.1mol/L的二水柠檬酸纳溶液。然后按照两种溶液的配比表调制成pH4.5-6.5的缓冲液。本实施例中,所述的0.1M柠檬酸盐缓冲液,其pH值为5。
所述的PLA1,是指诺维信购买的磷脂酶A1。
所述的PLA2,是指英联公司购买的磷脂酶A2。
(2)生物印记磷脂酶的单甲氧基聚乙二醇酰肼(mPEG-HZ)修饰
生物印记磷脂酶的单甲氧基聚乙二醇酰肼(mPEG-HZ)修饰主要包括修饰和纯化两个步骤。在修饰过程中,称取1份体积的20mM的磷酸缓冲溶液加入到装有转子、冷凝管、温度计的三角烧瓶中,在35℃条件下,加入1份质量的生物印迹磷脂酶,待其溶解后加入2份质量的碳二亚胺(EDC),反应1 h后加入4/3份质量的修饰剂(mPEG-HZ),3h后完成修饰反应。将修饰操作后的混合溶液,在20mM的磷酸缓冲液中透析12 h,得到纯化的修饰酶液。体积的单位是ml,质量的单位g。
所述的20mM的磷酸缓冲溶液,其pH值为4.8,制备方法:首先分别精确称取3.12g和7.16g溶解并定容至1L配制成20 mM的 NaH2PO4和20 mM的Na2HPO4,然后两者按一定比例混合即成20 mM的磷酸盐缓冲液。
所述的生物印迹磷脂酶,指的是bi-PLA1和 bi-PLA2其中一种。本实施例具体为bi-PLA1,在其它实施例中具体可以为bi-PLA2,也可以为bi-PLA1和 bi-PLA2组成的混合物。
(3)制备磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物
氧化石墨烯(GO)的制备。
氧化石墨烯(GO)的制备主要包括石墨烯粉末的氧化和真空干燥两个步骤。在石墨烯粉末氧化的步骤中,按照1:1:25的质量比例将石墨烯粉末和NaNO3加入到浓硫酸中,在冰水浴中剧烈搅拌15 min后,缓慢的加入两份质量的KMnO4,并将其40 ℃水浴,磁力搅拌90min。然后25份质量的蒸馏水并继续搅拌10min后,加入3份体积的体积分数为30%的H2O2溶液直到金棕色溶胶出现,完成石墨烯粉末的制备。然后加入25份体积的蒸馏水将其稀释并离心收集沉淀。最后用蒸馏水清洗沉淀直到上清液的pH值为6。将清洗后的沉淀在室温、压力为-3Mpa下真空干燥后贮藏在4℃冰箱中。浓硫酸的质量浓度为95-98%,本发明具体采用95%。体积的单位是ml,质量的单位g。
所述的30%的H2O2溶液,其制备方法:按照体积比3:7将双氧水与蒸馏水混合。
磁性氧化石墨烯(GO)的制备
磁性氧化石墨烯(GO)的制备主要包括氧化石墨烯的磁化和真空干燥两个步骤。在氧化石墨烯磁化的步骤中,将质量体积比5:1将氧化石墨烯粉末加入到FeCl2(1.29 g, 0.0065mol) 和 FeCl3(3.51 g, 0.013 mol)3%的冰乙酸混合液中,并水浴和剧烈搅拌。当温度达到80℃时,逐滴的加入1/5份体积的质量分数为25%的氨水溶液,保持20 min后完成磁性四氧化三铁与氧化石墨烯的结合。然后用磁铁分离获得黑色的沉淀物并用甲醇和蒸馏水清洗几次,然后在室温、压力为-3Mpa下真空干燥箱中干燥一夜。体积的单位是ml,质量的单位g。
所述的FeCl2(1.29 g, 0.0065 mol) 和 FeCl3(3.51 g, 0.013 mol)3%的冰乙酸混合液,制备方法:首先将30mL的冰乙酸和970mL的蒸馏水混合配制成3%的冰乙酸,然后加入FeCl2(1.29 g, 0.0065 mol) 和 FeCl3(3.51 g, 0.013 mol)。
所述的25%氨水溶液,制备方法:将氨水和蒸馏水按照1:4质量比进行混合即可。
壳聚糖(CS)的油酸改性(oleic acid@CS)
壳聚糖的油酸改性主要包括改性和真空干燥两个步骤。在改性步骤中,称取5份质量的壳聚糖溶解在1份体积的水中,用盐酸调节pH值至4.5。将1份摩尔质量的油酸(油酸的摩尔量与壳聚糖单体摩尔量比为0.2)通过超声处理溶解在乙醇中,加入碳二亚胺(碳二亚胺的摩尔量与油酸的摩尔量之比为5)并磁力搅拌。1 h后,加入N-羟基琥珀酰亚胺(N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔量与油酸摩尔量之比为5)。然后将油酸、碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液滴加到壳聚糖溶液中并在90℃反应12h完成改性。然后使用3 KDa中空纤维束膜超滤去除水溶性的副产物,在真空表压-0.09MPa、温度-45℃的参数冷冻干燥超滤后的溶液,并且将冻干粉用乙醇分散后用0.22μm的尼龙滤纸过滤,重复三次,得到的沉淀真空干燥后就为油酸改性的壳聚糖。体积的单位是ml,质量的单位g。
磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物的制备
磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物的制备主要包括磁性氧化石墨烯的活化、与油酸改性壳聚糖结合和真空干燥。在磁性氧化石墨烯的活化步骤中,将4份质量的碳二亚胺缓慢的加入到磁性氧化石墨烯悬浮液中,并用2(N-吗啉)乙磺酸 (0.1 M)调其pH值到5.6。超声15min后加入1份质量的N-羟基琥珀酰亚胺,以及用磷酸缓冲盐溶液 (0.2 M) 调整到7.2完成活化。在与油酸改性可壳聚糖结合的步骤中,先将油酸改性的壳聚糖0.2g 通过超声2h溶解在体积分数为2%的乙酸水溶液中得到油酸改性壳聚糖溶液。然后将油酸改性壳聚糖溶液在20 min内滴加到活化的磁性氧化石墨烯溶液中,并在室温下超声6 h。最后再在室温下温和地震荡8 h。反应得到磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物。最后将清洗后的沉淀在室温、压力为-3Mpa下真空干燥后贮藏在4℃冰箱中。磁性氧化石墨烯悬浮液是将磁性氧化石墨烯(GO)分散于水中制得。体积的单位是ml,质量的单位g。
所述的0.1M的2(N-吗啉)乙磺酸,其制备方法:将19.52g的2(N-吗啉)乙磺酸溶解在少量的蒸馏水中,并定容到1L。
所述的0.2M的磷酸缓冲溶液,其pH值为4.8,制备方法:首先分别精确称取31.2g和71.6g溶解并定容至1L配制成0.2M的 NaH2PO4和0.2M的Na2HPO4,然后两者按一定比例混合即成0.2M的磷酸盐缓冲液。
所述的2%的乙酸,其制备方法:将2份乙酸与98份蒸馏水的混合即可。
(4)制备磁性固定化mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶
mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化的步骤如下:在100ml锥形烧瓶中加入6份体积的酶液,加入2g磁性的磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物颗粒,50份体积20 mM柠檬酸缓冲液,将锥形烧瓶放入水浴摇床,在30℃下固定化2 h,然后加入1份体积的体积分数为5%的戊二醛作交联剂,在30℃下反应3h。用磁体固定酶,用20mM柠檬酸缓冲液(pH=5)将固定化酶洗涤三次以上。最后将固定化酶在冰箱冷藏4℃。体积的单位是ml,质量的单位g。
所述的20mM柠檬酸盐缓冲液,其pH值为4.5-6.5,其制备方法:精确称取一水柠檬酸4.202g溶解并定容至1L配制成20mmol/L的柠檬酸溶液,以及称取5.882g二水柠檬酸纳溶解并定容至1L配制成20mmol/L的柠檬酸纳溶液。然后按照两种溶液的配比表调制成pH4.5-6.5的缓冲液。本实施例具体为:所述的20mM柠檬酸盐缓冲液,其pH值为5。
按磁性固定化磷脂酶A1的制备方法,制备磁性固定化磷脂酶A2。
(5)磁性固定化生物印迹磷脂酶催化油脂脱胶反应
将磁性固定化磷脂酶A1和磁性固定化磷脂酶A2按质量比1:1混合,得到磁性固定化复合磷脂酶。
毛油预处理。
所述的毛油,指菜籽油、大豆油、花生油、玉米油、棉籽油、米糠油、葵花籽油等植物油毛油中的一种或多种,其磷脂含量为(80-400mg/kg)。
所述的毛油预处理,包括毛油预热、酸处理、碱调pH值等步骤。
预热:毛油采用恒温水浴锅或油浴锅或者其他的控温加热装置80 ℃预热10min。
酸处理:向毛油中加入其0.2m%质量的45m%柠檬酸溶液,搅拌器1500rpm或高速剪切机10000rpm均质18min,75℃保温35min
所述的45m%柠檬酸,其制备方法:称取45g一水合柠檬酸溶解在55mL蒸馏水即可。
碱调pH值:向酸处理后的毛油中,逐滴加入4m%NaOH溶液,调节pH值至5.0-6.0,然后搅拌器1500rpm或高速剪切机10000rpm均质,使毛油体系稳定。
所述的4m%NaOH,其制备方法:称取4g的氢氧化钠溶解于100mL的蒸馏水中。
酶解反应:向预处理后的毛油中加入其质量0.05-0.10%的磁性固定化复合磷脂酶和0.5%的纯化水,在52℃下500rpm搅拌反应4h。
酶解后的不同处理方法:(1)进行8000rpm/min离心,获得脱胶油。(2)在常温下进行自然沉降10h。(3)将油脂进行中空纤维素膜0.2Mpa切线过滤。
(6)磁性固定化生物印迹磷脂酶的回收与重复使用
所述的磁性固定化复合磷酸酶,由于其采用了磁性材料Fe3O4,因此具有磁性。酶催化反应后,用磁铁将磁性固定化复合磷酸酶回收。回收后贮藏在4℃冰箱中。
固定化酶的清洗和保存:用柠檬酸磷酸氢二纳缓冲液配制的体积分数为30%酒精溶液清洗三次,真空干燥后储存于4℃冰箱中,若长时间不用放于-20℃℃冰箱中。
所述的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液,其pH值为5,配制方法:精确称取3.501g二水磷酸氢二纳溶解于蒸馏水中定容至1L配制成20mM的磷酸氢二钠溶液,并称取2.101g一水柠檬酸溶解于于蒸馏水中容至1L配制成10mM的柠檬酸溶液。然后按照配比表中的比例配制成pH为5的缓冲液。
30%酒精溶液,其配制方法:将无水乙醇与柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液按照3:7的比例混合即可。
固定化酶的重复次数依据:每次回收经过清洗后,采用同样的添加量再次应用于油脂脱胶中,直到脱胶后的脱胶油的磷含量大于10mg/kg,经测定重复使用次数可以达到10次。
实施例二:一种mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化及催化油脂脱胶方法
一种mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化方法,包括下列步骤:
第一步:将磷脂乳液、柠檬酸盐缓冲液、磷脂酶和蒸馏水混合均匀得到酶-底物混合物,然后在27℃温度条件下震荡8min以完成修饰操作,接着对修饰操作后的混合溶液进行冷冻干燥,得到的干粉物质即为生物印迹磷脂酶;
第二步:将20mM的磷酸缓冲溶液加入到装有转子、冷凝管、温度计的三角烧瓶中,加热至37℃后加入第一步制得的生物印迹磷脂酶,待其溶解后加入所述生物印迹磷脂酶的质量的2.2倍的碳二亚胺,反应1.2 h后加入所述生物印迹磷脂酶的质量的1.5倍的修饰剂单甲氧基聚乙二醇酰肼,修饰反应完成后将修饰操作后的混合溶液在20mM磷酸缓冲液中透析,透析结束后得到纯化的修饰酶液;20mM的磷酸缓冲溶液与生物印迹磷脂酶之比为1ml:1g。
第三步:在一反应容器中加入纯化的修饰酶液、磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物和20mM的柠檬酸缓冲液,然后将所述反应容器放入水浴摇床,在32℃条件下固定化反应2.2 h,然后加入体积分数为5.5%的戊二醛作为交联剂,在32℃条件下反应5h后得到固定化酶,再用20mM柠檬酸缓冲液对所述固定化酶进行洗涤后得到磁性固定化磷脂酶;
所述磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物的制备方法包括下列步骤:
S1、将壳聚糖溶解于水中,然后调节pH值至5得到壳聚糖溶液;通过超声处理将油酸分散于乙醇中,然后加入碳二亚胺并磁力搅拌,1.2h后,加入N-羟基琥珀酰亚胺得到混合溶液,接着将所述混合溶液滴加到壳聚糖溶液中,并在95℃反应114h完成改性,然后使用3KDa中空纤维束膜超滤去除水溶性的副产物,再对超滤后的溶液进行冷冻干燥,得到的冻干粉用乙醇分散后用0.22μm的尼龙滤纸过滤,重复两次以上,得到的滤渣再经真空冷冻干燥后即为油酸改性的壳聚糖;壳聚糖与水的质量比例为5.5:1;所述油酸的摩尔量与壳聚糖单体摩尔量之比为0.22:1;碳二亚胺的摩尔量与油酸的摩尔量之比为5.5:1;N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔量与油酸摩尔量之比为5.5:1;
S2、将碳二亚胺加入到磁性氧化石墨烯悬浮液中,并用2(N-吗啉)乙磺酸调pH值到5.7,超声处理20min后加入N-羟基琥珀酰亚胺,并用磷酸缓冲盐溶液调节pH值到7.3,得到活化的磁性氧化石墨烯溶液;通过超声处理,将油酸改性的壳聚糖分散于乙酸水溶液中得到油酸改性的壳聚糖溶液,然后将油酸改性的壳聚糖溶液滴加到所述活化的磁性氧化石墨烯溶液中,在室温条件下超声处理7h,接下来在室温条件下,震荡9h,反应结束后得到磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物;碳二亚胺与磁性氧化石墨烯悬浮液的质量比为-5:1。
优选的实施方式为:在第一步中,将质量浓度为5.5%的磷脂乳液、柠檬酸盐缓冲液、磷脂酶和蒸馏水按照5.2:1.2: 5.3:1.2的体积比混合均匀,得到酶-底物混合物;所述柠檬酸盐缓冲液为0.1M柠檬酸盐缓冲液,pH值为6.5。
优选的实施方式为:所述磷脂酶为磷脂酶A1和磷脂酶A2中的至少一种。
优选的实施方式为:在第一步中,先在-75℃温度环境中对修饰操作后的混合溶液冷冻35min,然后在真空干燥机中以真空表压-0.10MPa、温度-40℃的参数,冷冻干燥30h。
优选的实施方式为:所述纯化的修饰酶液、20mM的柠檬酸缓冲液和体积分数为5.5%的戊二醛之间的体积比例为10:55:1.2;所述20mM柠檬酸盐缓冲液的pH值为6.5,所述纯化的修饰酶液与磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物的体积质量比为10ml:2g。
优选的实施方式为:所述磁性氧化石墨烯的制备方法包括下列步骤:
步骤一:将石墨烯粉末和NaNO3加入到浓硫酸中,在冰水浴中搅拌17 min后加入KMnO4,然后置于42℃的水浴,磁力搅拌95min,接着加入第一蒸馏水并继续搅拌12min后,加入H2O2溶液直到溶胶出现,然后加入第二蒸馏水将其稀释并离心收集沉淀,最后用蒸馏水清洗沉淀直到上清液的pH值为6;对清洗后的沉淀进行真空干燥,得到氧化氧化石墨烯;石墨烯粉末、NaNO3、浓硫酸、KMnO4、第一蒸馏水、体积分数为30%的H2O2溶液和第二蒸馏水之间的质量比例为1: 1.2: 30:2.5: 30:4:30;
步骤二:将质量体积比5:1将氧化石墨烯粉末加入到磁性混合液中,水浴加热并搅拌,当温度达到75~85℃时,逐滴加入氨水溶液,保持18~22min后完成磁性四氧化三铁与氧化石墨烯的结合;然后用磁铁分离获得黑色的沉淀物,然后用甲醇和蒸馏水对黑色的沉淀物进行清洗,最后在真空干燥箱内对清洗得到的产物进行干燥,得到磁性氧化石墨烯;所述磁性混合液的制备方法包括:首先将30mL的冰乙酸和970mL的蒸馏水混合配制成3%的冰乙酸,然后加入1.29 g的FeCl2和3.51g的FeCl3。
优选的实施方式为:通过超声处理,将0.3g的油酸改性的壳聚糖分散于体积分数为2%的乙酸水溶液中得到油酸改性的壳聚糖溶液。
一种催化油脂脱胶方法,包括下列步骤:
第一步:将毛油加热至90 ℃,并保温12 min,然后向毛油中加入其质量0.25%的质量分数为50%的柠檬酸溶液,用搅拌器或高速剪切机均质20min, 80℃保温40min;接着调节酸处理后的毛油的pH值至6.0,然后再用搅拌器或高速剪切机均质使毛油体系稳定;
第二步:向第一步得到的毛油中加入其质量0.10%本实施例制得的磁性固定化复合磷脂酶和质量0.6%的纯化水,在55℃下搅拌反应5h,得到酶解液;
第三步:对所述酶解液进行分离后得到脱胶油和废弃物。
优选的实施方式为:用磁铁对所述废弃物内的磁性固定化复合磷酸酶进行回收,回收后的磁性固定化复合磷酸酶先用磁性固定化复合磷酸酶专用清洗回收液进行清洗,然后进行真空干燥,得到回收的磁性固定化复合磷酸酶;所述磁性固定化复合磷酸酶专用清洗回收液的制备方法包括:按照无水乙醇与柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液按照3:7的体积比例混合后即得,所述柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液的pH值为5。
实施例三:一种mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化及催化油脂脱胶方法
一种mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化方法,包括下列步骤:
第一步:将磷脂乳液、柠檬酸盐缓冲液、磷脂酶和蒸馏水混合均匀得到酶-底物混合物,然后在23℃温度条件下震荡5min以完成修饰操作,接着对修饰操作后的混合溶液进行冷冻干燥,得到的干粉物质即为生物印迹磷脂酶;
第二步:将20mM的磷酸缓冲溶液加入到装有转子、冷凝管、温度计的三角烧瓶中,加热至33℃后加入第一步制得的生物印迹磷脂酶,待其溶解后加入所述生物印迹磷脂酶的质量的1.8倍的碳二亚胺,反应0.8h后加入所述生物印迹磷脂酶的质量的1倍的修饰剂单甲氧基聚乙二醇酰肼,修饰反应完成后将修饰操作后的混合溶液在20mM磷酸缓冲液中透析,透析结束后得到纯化的修饰酶液;
第三步:在一反应容器中加入纯化的修饰酶液、磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物和20mM的柠檬酸缓冲液,然后将所述反应容器放入水浴摇床,在28℃条件下固定化反应1.8 h,然后加入体积分数为4.5%的戊二醛作为交联剂,在28℃条件下反应1h后得到固定化酶,再用20mM柠檬酸缓冲液对所述固定化酶进行洗涤后得到磁性固定化磷脂酶;
所述磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物的制备方法包括下列步骤:
S1、将壳聚糖溶解于水中,然后调节pH值至4得到壳聚糖溶液;通过超声处理将油酸分散于乙醇中,然后加入碳二亚胺并磁力搅拌,0.8h后,加入N-羟基琥珀酰亚胺得到混合溶液,接着将所述混合溶液滴加到壳聚糖溶液中,并在85℃反应10h完成改性,然后使用3KDa中空纤维束膜超滤去除水溶性的副产物,再对超滤后的溶液进行冷冻干燥,得到的冻干粉用乙醇分散后用0.22μm的尼龙滤纸过滤,重复两次以上,得到的滤渣再经真空冷冻干燥后即为油酸改性的壳聚糖;壳聚糖与水的质量比例为4.5:1;所述油酸的摩尔量与壳聚糖单体摩尔量之比为0.18:1;碳二亚胺的摩尔量与油酸的摩尔量之比为4.5:1;N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔量与油酸摩尔量之比为4.5:1;
S2、将碳二亚胺加入到磁性氧化石墨烯悬浮液中,并用2(N-吗啉)乙磺酸调pH值到5.5,超声处理10min后加入N-羟基琥珀酰亚胺,并用磷酸缓冲盐溶液调节pH值到7.1,得到活化的磁性氧化石墨烯溶液;通过超声处理,将油酸改性的壳聚糖分散于乙酸水溶液中得到油酸改性的壳聚糖溶液,然后将油酸改性的壳聚糖溶液滴加到所述活化的磁性氧化石墨烯溶液中,在室温条件下超声处理5h,接下来在室温条件下,震荡7h,反应结束后得到磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物;碳二亚胺与磁性氧化石墨烯悬浮液的质量比为3:1。
优选的实施方式为:在第一步中,将质量浓度为4.5%的磷脂乳液、柠檬酸盐缓冲液、磷脂酶和蒸馏水按照4.8:0.8~1.2:4.7~5.3:0.8~1.2的体积比混合均匀,得到酶-底物混合物;所述柠檬酸盐缓冲液为0.1M柠檬酸盐缓冲液,pH值为 4.5-6.5。
优选的实施方式为:所述磷脂酶为磷脂酶A1和磷脂酶A2中的至少一种。
优选的实施方式为:在第一步中,先在-85℃温度环境中对修饰操作后的混合溶液冷冻30min,然后在真空干燥机中以真空表压-0.09MPa、温度-50℃的参数,冷冻干燥24h。
优选的实施方式为:所述纯化的修饰酶液、20mM的柠檬酸缓冲液和体积分数为4.5%的戊二醛之间的体积比例为2:45:0.8;所述20mM柠檬酸盐缓冲液的pH值为4.5,所述纯化的修饰酶液与磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物的体积质量比为2ml:2g。
优选的实施方式为:所述磁性氧化石墨烯的制备方法包括下列步骤:
步骤一:将石墨烯粉末和NaNO3加入到浓硫酸中,在冰水浴中搅拌13min后加入KMnO4,然后置于38℃的水浴,磁力搅拌85min,接着加入第一蒸馏水并继续搅拌8min后,加入H2O2溶液直到溶胶出现,然后加入第二蒸馏水将其稀释并离心收集沉淀,最后用蒸馏水清洗沉淀直到上清液的pH值为6;对清洗后的沉淀进行真空干燥,得到氧化氧化石墨烯;石墨烯粉末、NaNO3、浓硫酸、KMnO4、第一蒸馏水、体积分数为30%的H2O2溶液和第二蒸馏水之间的质量比例为1:0.8:20:1.5:20:2:20;
步骤二:将质量体积比5:1将氧化石墨烯粉末加入到磁性混合液中,水浴加热并搅拌,当温度达到75℃时,逐滴加入氨水溶液,保持18min后完成磁性四氧化三铁与氧化石墨烯的结合;然后用磁铁分离获得黑色的沉淀物,然后用甲醇和蒸馏水对黑色的沉淀物进行清洗,最后在真空干燥箱内对清洗得到的产物进行干燥,得到磁性氧化石墨烯;所述磁性混合液的制备方法包括:首先将30mL的冰乙酸和970mL的蒸馏水混合配制成3%的冰乙酸,然后加入1.29 g的FeCl2和3.51g的FeCl3。磁性氧化石墨烯在其它实施方式中采用现有技术制得。
优选的实施方式为:通过超声处理,将0.1g的油酸改性的壳聚糖分散于体积分数为2%的乙酸水溶液中得到油酸改性的壳聚糖溶液。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明提供的技术方案是:一种催化油脂脱胶方法,包括下列步骤:
第一步:将毛油加热至70℃,并保温8 min,然后向毛油中加入其质量0.15%的质量分数为40%的柠檬酸溶液,用搅拌器或高速剪切机均质15min,70℃保温30min;接着调节酸处理后的毛油的pH值至5.0,然后再用搅拌器或高速剪切机均质使毛油体系稳定;
第二步:向第一步得到的毛油中加入其质量0.05%的本实施例制得的磁性固定化复合磷脂酶和质量0.4%的纯化水,在50℃下搅拌反应3h,得到酶解液;
第三步:对所述酶解液进行分离后得到脱胶油和废弃物。
优选的实施方式为:用磁铁对所述废弃物内的磁性固定化复合磷酸酶进行回收,回收后的磁性固定化复合磷酸酶先用磁性固定化复合磷酸酶专用清洗回收液进行清洗,然后进行真空干燥,得到回收的磁性固定化复合磷酸酶;所述磁性固定化复合磷酸酶专用清洗回收液的制备方法包括:按照无水乙醇与柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液按照3:7的体积比例混合后即得,所述柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液的pH值为5。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例,并非企图具以对本发明做任何形式上之限制,是以,凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更,皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
Claims (9)
1.一种mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化方法,其特征在于:包括下列步骤:
第一步:将磷脂乳液、柠檬酸盐缓冲液、磷脂酶和蒸馏水混合均匀得到酶-底物混合物,然后在23-27℃温度条件下震荡5-8min以完成修饰操作,接着对修饰操作后的混合溶液进行冷冻干燥,得到的干粉物质即为生物印迹磷脂酶;
第二步:将20mM的磷酸缓冲溶液加入到装有转子、冷凝管、温度计的三角烧瓶中,加热至33-37℃后加入第一步制得的生物印迹磷脂酶,待其溶解后加入所述生物印迹磷脂酶的质量的1.8-2.2倍的碳二亚胺,反应0.8-1.2 h后加入所述生物印迹磷脂酶的质量的1-1.5倍的修饰剂单甲氧基聚乙二醇酰肼,修饰反应完成后将修饰操作后的混合溶液在20mM磷酸缓冲液中透析,透析结束后得到纯化的修饰酶液;
第三步:在一反应容器中加入纯化的修饰酶液、磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物和20mM的柠檬酸缓冲液,然后将所述反应容器放入水浴摇床,在28-32℃条件下固定化反应1.8-2.2 h,然后加入体积分数为4.5-5.5%的戊二醛作为交联剂,在28-32℃条件下反应1~5h后得到固定化酶,再用20mM柠檬酸缓冲液对所述固定化酶进行洗涤后得到磁性固定化磷脂酶;
所述磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物的制备方法包括下列步骤:
S1、将壳聚糖溶解于水中,然后调节pH值至4-5得到壳聚糖溶液;通过超声处理将油酸分散于乙醇中,然后加入碳二亚胺并磁力搅拌,0.8-1.2h后,加入N-羟基琥珀酰亚胺得到混合溶液,接着将所述混合溶液滴加到壳聚糖溶液中,并在85-95℃反应10-14h完成改性,然后使用3KDa中空纤维束膜超滤去除水溶性的副产物,再对超滤后的溶液进行冷冻干燥,得到的冻干粉用乙醇分散后用0.22μm的尼龙滤纸过滤,重复两次以上,得到的滤渣再经真空冷冻干燥后即为油酸改性的壳聚糖;壳聚糖与水的质量比例为4.5~5.5:1;所述油酸的摩尔量与壳聚糖单体摩尔量之比为0.18~0.22:1;碳二亚胺的摩尔量与油酸的摩尔量之比为4.5~5.5:1;N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔量与油酸摩尔量之比为4.5~5.5:1;
S2、将碳二亚胺加入到磁性氧化石墨烯悬浮液中,并用2(N-吗啉)乙磺酸调pH值到5.5-5.7,超声处理10~20min后加入N-羟基琥珀酰亚胺,并用磷酸缓冲盐溶液调节pH值到7.1-7.3,得到活化的磁性氧化石墨烯溶液;通过超声处理,将油酸改性的壳聚糖分散于乙酸水溶液中得到油酸改性的壳聚糖溶液,然后将油酸改性的壳聚糖溶液滴加到所述活化的磁性氧化石墨烯溶液中,在室温条件下超声处理5-7h,接下来在室温条件下,震荡7-9h,反应结束后得到磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物;碳二亚胺与磁性氧化石墨烯悬浮液的质量比为3-5:1。
2.根据权利要求1所述的mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化方法,其特征在于:在第一步中,将质量浓度为4.5~5.5%的磷脂乳液、柠檬酸盐缓冲液、磷脂酶和蒸馏水按照4.8~5.2:0.8~1.2:4.7~5.3:0.8~1.2的体积比混合均匀,得到酶-底物混合物;所述柠檬酸盐缓冲液为0.1M柠檬酸盐缓冲液,pH值为 4.5-6.5。
3.根据权利要求1所述的mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化方法,其特征在于:所述磷脂酶为磷脂酶A1和磷脂酶A2中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化方法,其特征在于:在第一步中,先在-85~-75℃温度环境中对修饰操作后的混合溶液冷冻30-35min,然后在真空干燥机中以真空表压-0.09~-0.10MPa、温度-50~-40℃的参数,冷冻干燥24-30h。
5.根据权利要求1所述的mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化方法,其特征在于:所述纯化的修饰酶液、20mM的柠檬酸缓冲液和体积分数为4.5-5.5%的戊二醛之间的体积比例为2~10:45~55:0.8~1.2;所述20mM柠檬酸盐缓冲液的pH值为4.5-6.5,所述纯化的修饰酶液与磁性氧化石墨烯油酸改性壳聚糖复合物的体积质量比为2~10ml:2g。
6.根据权利要求1所述的mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化方法,其特征在于:所述磁性氧化石墨烯的制备方法包括下列步骤:
步骤一:将石墨烯粉末和NaNO3加入到浓硫酸中,在冰水浴中搅拌13~17 min后加入KMnO4,然后置于38~42℃的水浴,磁力搅拌85~95min,接着加入第一蒸馏水并继续搅拌8~12min后,加入H2O2溶液直到溶胶出现,然后加入第二蒸馏水将其稀释并离心收集沉淀,最后用蒸馏水清洗沉淀直到上清液的pH值为6;对清洗后的沉淀进行真空干燥,得到氧化氧化石墨烯;石墨烯粉末、NaNO3、浓硫酸、KMnO4、第一蒸馏水、体积分数为30%的H2O2溶液和第二蒸馏水之间的质量比例为1:0.8~1.2:20~30:1.5~2.5:20~30:2~4:20~30;
步骤二:将质量体积比5:1将氧化石墨烯粉末加入到磁性混合液中,水浴加热并搅拌,当温度达到75~85℃时,逐滴加入氨水溶液,保持18~22min后完成磁性四氧化三铁与氧化石墨烯的结合;然后用磁铁分离获得黑色的沉淀物,然后用甲醇和蒸馏水对黑色的沉淀物进行清洗,最后在真空干燥箱内对清洗得到的产物进行干燥,得到磁性氧化石墨烯;所述磁性混合液的制备方法包括:首先将30mL的冰乙酸和970mL的蒸馏水混合配制成3%的冰乙酸,然后加入1.29 g的FeCl2和3.51g的FeCl3。
7.根据权利要求1所述的mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化方法,其特征在于:通过超声处理,将0.1-0.3g的油酸改性的壳聚糖分散于体积分数为2%的乙酸水溶液中得到油酸改性的壳聚糖溶液。
8.一种催化油脂脱胶方法,其特征在于:包括下列步骤:
第一步:将毛油加热至70~90 ℃,并保温8~12 min,然后向毛油中加入其质量0.15~0.25%的质量分数为40~50%的柠檬酸溶液,用搅拌器或高速剪切机均质15-20min,70-80℃保温30-40min;接着调节酸处理后的毛油的pH值至5.0-6.0,然后再用搅拌器或高速剪切机均质使毛油体系稳定;
第二步:向第一步得到的毛油中加入其质量0.05-0.10%的利用权利要求1-7任一权利要求制得的磁性固定化复合磷脂酶和质量0.4-0.6%的纯化水,在50-55℃下搅拌反应3-5h,得到酶解液;
第三步:对所述酶解液进行分离后得到脱胶油和废弃物。
9.根据权利要求8所述的mPEG-HZ修饰生物印迹磷脂酶的固定化方法,其特征在于:用磁铁对所述废弃物内的磁性固定化复合磷酸酶进行回收,回收后的磁性固定化复合磷酸酶先用磁性固定化复合磷酸酶专用清洗回收液进行清洗,然后进行真空干燥,得到回收的磁性固定化复合磷酸酶;所述磁性固定化复合磷酸酶专用清洗回收液的制备方法包括:按照无水乙醇与柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液按照3:7的体积比例混合后即得,所述柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液的pH值为5。
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