CN104312999A

CN104312999A - 一种从金针菇栽培废料中分离纯化木聚糖酶的方法

Info

Publication number: CN104312999A
Application number: CN201410524533.XA
Authority: CN
Inventors: 杨云龙; 胡开辉; 黄彩梅; 万春和
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2014-10-09
Filing date: 2014-10-09
Publication date: 2015-01-28

Abstract

本发明提供一种从金针菇栽培废料中分离纯化木聚糖酶的方法，主要对真姬菇栽培废料中残留的木聚糖酶进行浸提条件的优化，通过硫酸铵沉淀、透析、SephadexG-100葡聚糖凝胶层析和DEAEC-52离子交换层析等方法对纤维素酶进行分离纯化，SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，已达到电泳纯。从金针菇栽培废料浸提液中提取木聚糖酶，对其进行有效的分离纯化，深入地研究木聚糖酶的结构和功能，为木聚糖酶的生产应用提供科学的参考依据。

Description

一种从金针菇栽培废料中分离纯化木聚糖酶的方法

技术领域

本发明属于真菌栽培废料生产技术领域，具体涉及一种从金针菇栽培废料中分离纯化木聚糖酶的方法。

背景技术

目前，我国食用菌栽培废料资源巨大，长期以来没有得到有效的利用，造成了恶劣的环境影响和有机资源的巨大浪费。食用菌栽培废料中含有大量残余的胞外酶，这些胞外酶具有非常广阔的工业利用价值和应用前景，真姬菇、金针菇是目前工厂化生产主要品种，废菌袋来源稳定，为工厂化提取纤维素酶、木聚糖酶提供了稳定原料来源，通过科学有效的方法利用这些资源，对解决我国能源短缺和环境污染问题具有重要的意义。

金针菇含有木聚糖酶等多种胞外酶，而金针菇是目前工厂化生产主要品种之一，废菌袋来源稳定，为工厂化提取木聚糖酶提供了稳定原料来源。金针菇栽培废料浸提液中残留有木聚糖酶等多种胞外酶，需对其进行有效的分离纯化，才能更深入地研究木聚糖酶的结构和功能，为木聚糖酶的生产应用提供科学的参考依据。

据研究表明，食用菌栽培废料中含有大量残余的胞外酶，这些残留的胞外酶在造纸业、饲料业等工业上有非常广阔的利用价值和应用前景，利用食用菌采收后的废菌袋提取木聚糖酶，在工艺上可节省微生物培养工序，节省酶制剂厂的办厂投入，降低生产成本，拓宽食用菌产业链的延伸，提高生产附加值，变废为宝。如何科学有效地开发利用这些资源，对于解决我国的能源短缺和环境污染及食用菌可持续发展等问题都具有极为重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从金针菇栽培废料中分离纯化木聚糖酶的方法，从金针菇栽培废料浸提液中提取木聚糖酶等多种胞外酶，对其进行有效的分离纯化，深入地研究木聚糖酶的结构和功能，为木聚糖酶的生产应用提供科学的参考依据。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种从金针菇栽培废料中分离纯化木聚糖酶的方法，通过硫酸铵沉淀、透析除盐、冷冻干燥、凝胶层析和离子交换层析方法对木聚糖酶进行分离纯化，SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，最终获得木聚糖酶。

其具体方法包括以下步骤：

（1）粗酶液的制备：金针菇栽培废料粉碎混匀，按1:3加入缓冲液，混匀，室温静置3h；纱布过滤，4℃下10000r/min离心20min，取上清即为粗酶液；

（2）硫酸铵沉淀：取粗酶液10mL，20wt.%硫酸铵进行一次硫酸铵沉淀，80wt.%硫酸铵进行二次硫酸铵沉淀，4℃盐析10-15h，4℃，10000r/min离心20min，分别收集上清和沉淀，沉淀用缓冲液溶解至原体积，540nm波长处测定酶活；

（3）透析：粗酶液经硫酸铵沉淀后，10ml缓冲液至完全溶解，在同样的缓冲液，4℃，磁力搅拌器上透析；每隔2h更换一次透析液，直至向透析液中加入0.1 mol/L BaCl₂溶液，检测无白色沉淀产生为止；收集酶液，4℃，10000r/min离心20min，取上清；冷冻干燥，1-2mL缓冲液将可溶蛋白溶解，4℃，10000r/min离心20min，取上清；

（4）凝胶层析：缓冲液平衡Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析，流速为1.5mL/min，直至记录仪上的基准线值恒定，停止平衡；取2ml的透析纯化后酶液上柱，用缓冲液洗脱，收集各洗脱峰，检测各管酶活，合并有酶活管，冷冻浓缩；

（5）离子交换层析：用Tris-HCl缓冲液平衡DEAE C-52，取2ml用Tris-HCl平衡缓冲液溶解的经Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析后的酶液上柱，采用含有NaCl浓度分别为0M、0.2M和0.8M的平衡缓冲液进行盐离子梯度洗脱，收集各洗脱峰；检测各洗脱峰的酶活，收集，冷冻干燥；

（6）酶纯度的鉴定：分离胶的浓度采用浓度为12%的聚丙烯酰胺，pH8.8Tris-HCl缓冲液，用考马斯亮蓝R-250进行染色。

步骤（1）-（4）中的缓冲液为0.02M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；步骤（5）所述的Tris-HCl缓冲液为0.02M pH7.0 Tris-HCl平衡缓冲液。

本发明的优点在于：（1）对金针菇栽培废料浸提条件进行单因素实验和正交试验，结果表明：金针菇栽培废料中木聚糖酶的最佳浸提条件为pH6.0、0.02 M pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，浸提温度25℃、浸提时间为3h、料液比为1g/3mL。金针菇栽培废料中木聚糖酶浸提液最终酶活达到69.6U，酶活有了显著的提高，达到了优化的效果。

（2）金针菇栽培废料经硫酸铵分级沉淀盐析、透析除盐、Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析、DEAE C-52离子交换层析分离纯化后，SDS-PAGE鉴定已达到电泳纯。纯化后的木聚糖酶比活达到946.67U/mg，纯化倍数为12.74，回收率为3.08%。

（3）分离获得的纯化木聚糖酶，蛋白分子大小约为37.8kDa。此木聚糖酶的最适反应温度为50℃，温度上升到80℃及以上时，酶活力仍有74%，具有较广的耐高温域。该酶的最适pH值为pH6.0，pH值在3.0~8.0的范围内相对稳定，具有较广的酸碱稳定性。

（4）不同金属离子对木聚糖酶的影响中，Na⁺在低浓度下对此木聚糖酶有轻微的促进作用，随着离子浓度的提高，表现出轻微的抑制作用；Fe²⁺、Zn²⁺对其具有激活作用；Ca²⁺、Mn²⁺、K⁺对其具有促进作用；Mg²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺对其具有强烈抑制作用。

（5）以Xylanase作为底物进行此木聚糖酶的动力学研究表明，酶促反应符合米氏方程。Vmax为15.43μg/mL/min，Km为9.61 mg/mL，Vmax/Km为1.61。说明此底物具有较高的亲和力。

附图说明

图1 木聚糖酶的Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析色谱图。图中1、2表示色谱峰。

图2 木聚糖酶的DEAE C-52阴离子交换层析色谱图。图中1、2、3表示色谱峰。

图3 SDS-PAGE 电泳图谱，其中M：Marker；Ⅰ：硫酸铵透析液；Ⅱ：Sephadex G-100凝胶层析浓缩酶液；Ⅲ：DEAE C-52离子交换层析浓缩酶液。

具体实施方式

实施例1

1木聚糖酶的浸提优化

1.1单因素优化

（1）浸提液pH值的优化

木聚糖酶浸提液pH值的优化，选择pH值在4.0~10.0范围，每0.4设一个梯度，共设16个梯度。每组加入相同质量的碾碎后搅拌均匀的栽培废料，分别加入不同pH值浸提液，混匀并常温静置，每个梯度作3个平行。纱布过滤，4℃，10000r/min离心20min，取上清。测定各组浸提液的木聚糖酶活大小，结果表明：从pH4.0开始，木聚糖酶活逐渐上升，当浸提液的pH值为6.0时，木聚糖酶活达到最高，约有61.77U。之后，木聚糖酶活随pH值的增大而逐渐减小。说明木聚糖酶在pH6.0时具有最高的酶活，因此采用pH6.0作为金针菇栽培废料中木聚糖酶的最佳浸提pH值。

（2）浸提缓冲液的优化

浸提缓冲液选用四组溶液：去离子水、0.02 M pH6.0乙酸-乙酸钠缓冲液、0.02 M pH6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、0.02 M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。用适当的料液比浸泡，混匀，常温静置。纱布过滤，4℃，10000r/min离心20min,取上清，测定各浸提液的木聚糖酶活。结果表明（，浸提缓冲液选用去离子水时，酶活最小，选用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液可达到最大的酶活，说明木聚糖酶在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中具有最高的酶活力，因此采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液作为金针菇栽培废料中木聚糖酶的最佳浸提缓冲液。

正交试验优化

木聚糖酶浸提条件优化的L16(44)正交试验。经Minitab 16.0软件分析，结果表明：以测定的木聚糖酶活为指标，浸提温度的极差最大，表明浸提温度对酶活力大小影响最大。各因素对木聚糖酶活的影响程度依次为A（浸提温度）>C（料液比）>B（浸提时间）且A（浸提温度）因素对木聚糖酶活力的影响达到了极显著差异（p<0.01）(表3-2)。由此分析，此优化反应的最佳组合为A3B2C2，即浸提温度25℃、浸提时间为3h、料液比为1g/3mL。

按照选取的木聚糖酶浸提条件优化工艺条件（A3B2C2）制备3批样品，实验结果表明浸提液木聚糖酶活达到69.6U，明显优于正交试验的其他组，可以验证正交试验的结果，木聚糖酶活有了显著的提高，达到预期的效果。

硫酸铵沉淀

分别取粗酶液10mL，加入硫酸铵至饱和度为20%、25%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%，4℃，盐析；540nm波长处分别测定上清和沉淀的酶活，结果可以看出，硫酸铵浓度在20%时，上清酶活最大，硫酸铵的浓度从25%起，上清酶活逐渐减小，至硫酸铵浓度为80%时，上清酶活最小。硫酸铵浓度在20%时，沉淀酶活最小，硫酸铵的浓度从25%开始，沉淀酶活逐渐增高，至硫酸铵浓度为80%时，沉淀酶活最大。因此采用20%硫酸铵进行一次硫酸铵沉淀，80%硫酸铵进行二次硫酸铵沉淀。

葡聚糖凝胶层析

用0.02M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液平衡Sephadex G-100，取适量的透析纯化后酶液上柱，用缓冲液洗脱，收集各洗脱峰。结果如图2，有两个洗脱峰，检测各管酶活，发现第二个洗脱峰含有较高木聚糖酶活，将这些管收集冷冻干燥后用于下一步分离纯化。

离子交换层析

4.1 DEAE C-52阴离子交换层析缓冲液pH的确定

取8支小试管，分别装入DEAE C-52 200mg，进行不同的pH值下（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）DEAE C-52阴离子交换层析对木聚糖酶的最佳吸附量实验。每组做三个平行，结果显示，木聚糖酶活随着pH值增大而逐渐增大，至pH7.0后酶活开始逐渐下降。因此，确定pH7.0 Tris-HCl为DEAE C-52阴离子交换最适层析缓冲液。

阴离子交换层析洗脱盐浓度的确定

用0.02M pH7.0 Tris-HCl缓冲液平衡DEAE C-52，取适量的用0.02M pH7.0 Tris-HCl平衡缓冲液溶解的经Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析后的酶液上柱，采用含有NaCl浓度分别为0M、0.2M、0.4M、0.6M、0.8M和1.0M的平衡缓冲液进行盐离子梯度洗脱，收集各洗脱峰。检测洗脱管酶活，不同NaCl浓度的缓冲液进行梯度洗脱，不同的蛋白质组分在不同的阶段被洗脱出来。经检测，含有木聚糖酶活蛋白主要集中在第五个峰，即约在NaCl浓度为0.8mol/L洗脱时的色谱峰。

阴离子交换层析结果

取与3.3.4.2中同样体积的上样酶液，采用含有NaCl浓度分别为0M、0.2M和0.8M的缓冲液梯度洗脱，对目标蛋白所在的峰（0.8mol/LNaCl洗脱的蛋白峰）进行分管收集，结果如图2。

检测各管酶活，发现第三个洗脱峰含有较高的木聚糖酶活，将这些管合并为一管，进行冷冻干燥。

木聚糖酶纯度的鉴定

将分离纯化后的酶液进行SDS-PAGE电泳，电泳结果见图3。通过SDS-PAGE电泳鉴定，纯化后酶液的蛋白是单一条带，则说明该纯化后的木聚糖酶溶液已达到电泳纯。

6分离纯化结果汇总

粗酶液经离心、收集上清、硫酸铵沉淀透析、Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析、DEAE C-52离子交换层析，各步骤分离纯化结果如表1。

表1 木聚糖酶的分离纯化汇总

7酶学性质及其动力学研究

7.1木聚糖酶的分子量测定

SDS-PAGE电泳（见图3）鉴定纯化酶液达到电泳纯。以蛋白质条带相对迁移率值Rf为横坐标，蛋白Marker的自然对数为纵坐标，绘制标准曲线。木聚糖酶蛋白条带的Rf值为0.603，根据公式y= -2.0918x+4.8972，因此该木聚糖酶的分子量约为37.8kDa。

7.2木聚糖酶的最适作用温度

在测定木聚糖酶活反应体系中，测定不同温度（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃）下木聚糖酶催化反应的酶活，以50℃作用温度酶液为对照，

结果表明，当温度小于50℃时，此木聚糖酶活随温度的上升而增大，温度大于50℃时，酶活力随温度的升高逐渐下降，说明此木聚糖酶的最适反应温度为50℃。

7.3木聚糖酶的温度稳定性

酶液在不同温度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃）处理30min，迅速冷却至室温。在最适测定酶活力反应体系（50℃，pH6.0）下测定残余酶活，以没有进行热处理的酶液为对照，结果表明，此木聚糖酶在20~50℃时稳定性较好，50℃达到最大的酶活力。当温度大于50℃相对酶活逐渐下降，至90℃时，相对酶活还剩下55%。说明此分离纯化的木聚糖酶的耐受温度域较广。

7.4木聚糖酶的最适反应pH

在最适测定酶活力反应体系温度（50℃）下，改变酸碱缓冲体系，测定不同pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）下酶促反应的酶活，结果表明，在pH值小于6.0时，木聚糖酶活随pH值的升高逐渐增大，在pH大于6.0时，所测得的酶活随着pH值的升高而降低。说明此木聚糖酶的最适反应pH值为6.0。

7.5木聚糖酶的酸碱稳定性

配制不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)缓冲液适量，取一定量的酶液，与相应的缓冲液以1:1比例体积混匀，4℃，放置24h，在最适测定酶活力反应体系（50℃，pH6.0）测定残余酶活，结果表明，该木聚糖酶在pH3.0~8.0内相对稳定的，说明此木聚糖酶具有很好的酸碱稳定性。

7.6金属离子对木聚糖酶活的影响

在测木聚糖酶活力体系中（0.02M pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，50℃），酶液中加入含1mM、10 mM（金属离子终浓度）的Na⁺、K⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺，以未加入金属离子的酶液为对照组，探究不同价位的金属离子对木聚糖酶活的影响，结果表明，Na⁺在低浓度下对此木聚糖酶有轻微的促进作用，随着离子浓度的提高，表现出轻微的抑制作用；Fe²⁺、Zn²⁺对此木聚糖酶激活作用；Ca²⁺、Mn²⁺、K⁺对此木聚糖酶具有促进作用；Mg²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺这三种离子在低浓度下对木聚糖酶就表现出了较强的抑制作用。

7.7木聚糖酶的动力学研究

在最适测定酶活力反应体系（50℃，pH6.0）中，以木聚糖为底物，配制不同底物浓度[S]，测定酶促反应动力学的反应初始速度v，绘制米氏双曲线图形和Lineweaver-Burk图形，实验表明，以酶促反应初速度与底物木聚糖浓度作图，呈典型双曲线关系。说明此木聚糖酶催化底物木聚糖的水解反应，遵循Michaelis-Menten方程式。其酶解反应的Lineweaver-Burk双倒数图，表明1/v与1/[S]两者基本呈直线。求得以木聚糖为底物的酶促反应的Km和Vmax分别为9.61 mg/mL、15.43μg/mL/min，Vmax/Km为1.61。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种从金针菇栽培废料中分离纯化木聚糖酶的方法，其特征在于：通过硫酸铵沉淀、透析除盐、冷冻干燥、凝胶层析和离子交换层析方法对木聚糖酶进行分离纯化，SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，最终获得木聚糖酶。

2.根据权利要求1所述的一种从金针菇栽培废料中分离纯化木聚糖酶的方法，其特征在于：其具体方法包括以下步骤：

3.根据权利要求1所述的一种从金针菇栽培废料中分离纯化木聚糖酶的方法，其特征在于：步骤（1）-（4）中的缓冲液为0.02M pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；步骤（5）所述的Tris-HCl缓冲液为0.02M pH7.0 Tris-HCl平衡缓冲液。