CN116615252A - 抗cd48抗体、抗体药物缀合物及其用途 - Google Patents

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C·J·克林特
C·A·蒙特
R·V·纽科姆
T·施维戈夫
K·温克尔巴赫
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Abstract

本文披露了结合人CD48的抗体、其抗原结合片段及其抗体药物缀合物。还披露了包含所述抗体、其抗原结合片段及其抗体药物缀合物的药物组合物；以及制备和使用此类药物组合物用于治疗有需要的患者的癌症的方法。

Description

抗CD48抗体、抗体药物缀合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年11月24日提交的以下美国临时申请号：63/117,817的权益，将其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本披露涉及抗CD48抗体及其抗原结合片段、其抗体药物缀合物、以及它们用于治疗有需要的患者的癌症的用途。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表并且该序列表通过引用以其全文特此并入。所述ASCII副本创建于2021年11月18日，名称为PAT058966_SL.txt，并且大小为79,220字节。
背景技术
CD48(也称为BLAST-1和SLAMF2)是一种粘附和共刺激分子，参与多种先天性和适应性免疫应答，范围从粒细胞活性和过敏至T细胞活化和自身免疫(McArdel等人(2016)Clin Immunol[临床免疫学杂志]164:10-20)。在正常血液组织中，CD48有助于调节淋巴细胞、树突细胞和内皮细胞的活化和分化。在肿瘤学中，已经充分确定在一系列B细胞恶性肿瘤(包括高比例的多发性骨髓瘤患者，弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的子集，以及少部分具有显著未满足的医疗需求的适应症)中，CD48在RNA和蛋白质水平上均显著上调。
CD48是对抗体药物缀合物具有吸引力的靶标，因为它不存在于正常的非造血组织中，表达受限于成熟淋巴细胞和单核细胞，并且在一系列血液恶性肿瘤中显著上调。先前已证明，靶向CD48的抗体和抗体药物缀合物在血液癌症的临床前模型中具有抗肿瘤活性。先前的治疗工作已表明，CD48有可能在抗体接合(engagement)并运送至溶酶体后迅速内化，以及内化后迅速在肿瘤细胞表面再增殖(repopulated)。仍然需要靶向CD48的另外的治疗性化合物。
发明内容
本文披露了结合人CD48的抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR和三个轻链CDR，这些重链CDR和轻链CDR选自：
(i)由SEQ ID NO:1组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:2组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:17组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(ii)由SEQ ID NO:4组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:2组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:17组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(iii)由SEQ ID NO:5组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:19组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:20组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:21组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(iv)由SEQ ID NO:7组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:8组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:9组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:22组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:20组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(v)由SEQ ID NO:27组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:28组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:29组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:42组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:43组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(vi)由SEQ ID NO:30组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:28组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:29组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:42组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:43组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(vii)由SEQ ID NO:31组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:32组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:29组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:45组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:46组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:47组成的轻链CDR3(LCDR3)；或
(viii)由SEQ ID NO:33组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:34组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:35组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:48组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:46组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)。在另一个实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含：
(i)含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链可变区；或
(ii)含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个实施例中，抗CD48抗体包含：
(a)SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:25的轻链氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:25的轻链氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO:63的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:25的轻链氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO:38的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:51的轻链氨基酸序列；
(f)SEQ ID NO:40的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:51的轻链氨基酸序列；或
(g)SEQ ID NO:65的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:51的轻链氨基酸序列。
在又一个实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fd片段、Fv片段、dAb片段、单结构域抗体、大型抗体、微型抗体、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、半抗体、单臂抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、双特异性T细胞接合抗体、多特异性抗体、嵌合抗原受体T细胞或放射免疫缀合物。
还披露了核酸，这些核酸编码如本文披露的抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，核酸包含编码抗体的可变重链(VH)或可变轻链(VL)的序列，该序列选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:50。在其他实施例中，本文披露的核酸编码抗体的重链和轻链并且包含选自SEQ ID NO:13、15、39、41、75、77、26或52的序列。
还披露了包含如本文所提供的任何核酸的载体，包含如本文所提供的任何载体的细胞系，以及使用这些核酸、载体和细胞系制备如本文所提供的抗体或其抗原结合片段的方法。在一个实施例中，制备抗CD48抗体或其抗原结合片段的方法包括在适于表达该抗体或其抗原结合片段的条件下使如本文所提供的任何细胞系生长，然后纯化和分离该抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施例中，本申请还披露了具有式(I)的抗体药物缀合物：
A-(LB-(D)n)y(I)；
其中：
A是特异性结合如本文所披露的人CD48的抗体或其抗体抗原结合片段；
LB是接头；
D是细胞毒性剂；
n是从1至10的整数，并且
y是从1至10的整数，
其中接头-药物部分(LB-(D)n)共价附接至抗体或其抗原结合片段(A)。在一些实施例中，n是1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施例中，y是1、2、3或4。在一个实施例中，LB独立地选自可切割接头或不可切割接头。在一些实施例中，每个LB是可切割接头。在其他实施例中，每个LB是不可切割接头。
在一些实施例中，药物部分是Eg5抑制剂、V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞他汀(auristatin)、多拉司他汀(dolastatin)、类美登素(maytansinoid)、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、核输出蛋白CRM1抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DHFR抑制剂或促凋亡剂，但不包括BCL-2抑制剂、MCL-1抑制剂和BCL-XL抑制剂。在一些实施例中，药物部分是澳瑞他汀。
在一个实施例中，药物部分D是选自具有式(A)的化合物的细胞毒性剂：
其中：
R1是
R2是H，C1-C6烷基，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
或者D是选自具有式(B)的化合物的细胞毒性剂：
其中：
R1是
R2是H，C1-C6烷基，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
本文还披露了包含式(E)的结构的抗体药物缀合物：
其中：
A代表特异性结合如本文所披露的人CD48的抗体或其抗原结合片段；
y是从1至10的整数；
R2是H，C1-C6alkyl，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**或-X2X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**，其中**指示与R114的附接点；
X1是 其中**指示与-NH-或与X2的附接点；
X2是其中**指示与-NH-的附接点；
X3是其中**指示与-NH-的附接点；
X4是 其中*指示附接点朝向R114；
R114是-NR6C(＝O)CH2-*、-NHC(＝O)CH2-*、-S(＝O)2CH2CH2-*、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6C(＝O)CH2CH2-*、-NH-、-C(＝O)-、-NHC(＝O)-*、-CH2NHCH2CH2-*、-NHCH2CH2-*、-S-、 其中*指示与A的附接点；
每个R6独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R10独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、和-OH；
每个R11独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R12独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
每个R15独立地选自H、-CH3和苯基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个p独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
在一些实施例中，抗体药物缀合物选自
其中：
A代表特异性结合如本文所披露的人CD48的抗体或其抗原结合片段，并且
y是从1至10的整数。
在一些实施例中，抗体药物缀合物包含式(G)的结构：
其中：
A代表特异性结合如本文所披露的人CD48的抗体或其抗原结合片段；
y是从1至10的整数；
R2是H，C1-C6alkyl，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**或-X2X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**，其中**指示与R114的附接点；
X1是 其中**指示与-NH-或与X2的附接点；
X2是其中**指示与-NH-的附接点；
X3是其中**指示与-NH-的附接点；
X4是 其中*指示附接点朝向R114；
R114是-NR6C(＝O)CH2-*、-NHC(＝O)CH2-*、-S(＝O)2CH2CH2-*、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6C(＝O)CH2CH2-*、-NH-、-C(＝O)-、-NHC(＝O)-*、-CH2NHCH2CH2-*、-NHCH2CH2-*、-S-、 其中*指示与A的附接点；
每个R6独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R10独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、和-OH；
每个R11独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R12独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
每个R15独立地选自H、-CH3和苯基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个p独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
在一些实施例中，抗体药物缀合物选自
其中：
A代表特异性结合如本文所披露的人CD48的抗体或其抗原结合片段，并且
y是从1至10的整数。
在另一个实施例中，抗体药物缀合物选自
其中：
A代表特异性结合如本文所披露的人CD48的抗体或其抗原结合片段，并且
y是从1至10的整数。
本文还披露了药物组合物，这些药物组合物包含如本文所披露的任何抗CD48抗体、或其抗原结合片段、或抗体药物缀合物，以及药学上可接受的载体。在一些实施例中，药物组合物包含一种或多种另外的治疗剂。在一些实施例中，药物组合物是冻干物。
本申请还披露了治疗受试者的癌症的方法、减少或抑制受试者中肿瘤生长的方法、或减少或减缓受试者中癌细胞群扩增的方法，这些方法包括向该受试者施用治疗有效量的如本文所披露的任何抗CD48抗体或其抗原结合片段、抗体-药物缀合物、或药物组合物。在一些实施例中，该方法使肿瘤的生长减少或抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。在其他实施例中，该方法使癌细胞群减少或使癌细胞群扩增减缓至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。在一些实施例中，癌症、肿瘤或癌细胞群表达CD48。在一些实施例中，癌症是肿瘤或血液癌症，优选地，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T-细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。
本文还披露了与本文所披露任何抗体(包括NY920或NY938)竞争与人CD48的结合的抗体。在一些实施例中，抗体与NY920或NY938结合相同或重叠的人CD48的表位。在一个实施例中，抗体与人CD48(SEQ ID NO:53)的残基54-64或105-121内的一个或多个氨基酸结合。在其他实施例中，抗体与选自人CD48(SEQ ID NO:53)的残基54、58、60、61、62、64、105、107、119、111、114、115、117、119或121的一个或多个氨基酸结合。在一些实施例中，抗体与内的一个或多个氨基酸接触。
本披露还提供了包含如本文所披露的任何抗CD48抗体或其抗原结合片段、或抗体药物缀合物的诊断剂。在一些实施例中，将抗CD48抗体或其抗原结合片段或抗体药物缀合物用放射标记、荧光团、发色团、显像剂或金属离子进行标记或与其缀合。还披露了检测组织或细胞中人CD48的方法，这些方法包括使诊断剂与组织或细胞接触以及检测诊断剂与组织或细胞的结合。
附图说明
图1描绘了三(3)种抗CD48抗体与人CD48蛋白质细胞外结构域的各种构建体结合的曲线。构建体#2248携带在氨基酸50-55处突变的残基(ENYKQ(SEQ ID NO:78)-修饰为GSSKQ(SEQ ID NO:79))。构建体#2249携带在氨基酸70-74处突变的残基(DSRK(SEQ ID NO:80)-修饰为AAGK(SEQ ID NO:81))。构建体#2250携带在氨基酸103-105处突变的残基(KKTGNE(SEQ ID NO:82)修饰为KKDASG(SEQ ID NO:83))。图1A是描绘抗CD48抗体NOV3731(NY920的亲本抗体)与构建体结合的图。图1B是描绘抗CD48抗体NY254(NY938的亲本抗体)与构建体结合的图。图1C是描绘人源化抗CD48A(也称为MEM102)与构建体结合的图。这些图显示，NOV3731和NY920不与CD48a结合相同的CD48细胞外结构域构建体。
图2A是抗CD48抗体针对内源癌细胞系KMS-27在内化和细胞增殖测定中的剂量应答曲线。在此测定中，NY938和NY920抗CD48抗体比抗CD48A抗体更有效。
图2B是抗CD48抗体针对内源癌细胞系NCI-H929在内化和细胞增殖测定中的剂量应答曲线。在此测定中，NY938和NY920抗CD48抗体比抗CD48A抗体更有效。
图2C是抗CD48抗体针对内源癌细胞系KMS-21-BM在内化和细胞增殖测定中的剂量应答曲线。在此测定中，NY938和NY920抗CD48抗体比抗CD48A抗体更有效。
图3是描绘NY920 WT抗体与人CD48抗原的结合动力学的图。进行两个实验轮次(实验序号1和实验序号2)。
图4是描绘NY920 DAPA抗体与人CD48抗原结合动力学的图。进行两个实验轮次(实验序号1和实验序号2)。
图5是描绘NY938 DAPA抗体与人CD48抗原结合动力学的图。进行两个实验轮次(实验序号1和实验序号2)。
图6是描绘NY920 WT抗体与食蟹猴CD48抗原结合动力学的图。进行两个实验轮次(实验序号1和实验序号2)。
图7是描绘NY920 DAPA抗体与食蟹猴CD48抗原结合动力学的图。进行两个实验轮次(实验序号1和实验序号2)。
图8是描绘NY938 DAPA抗体与食蟹猴CD48抗原结合动力学的图。进行两个实验轮次(实验序号1和实验序号2)。
图9A是抗CD48 MMAE ADC针对内源癌细胞系KMS-21-BM在细胞增殖和存活测定中的剂量应答曲线。使用非靶向IgG-VC-MMAE ADC作为阴性对照。
图9B是抗CD48 MMAE ADC针对内源癌细胞系KMS-27在细胞增殖和存活测定中的剂量应答曲线。使用非靶向IgG-VC-MMAE ADC作为阴性对照。
图9C是抗CD48 MMAE ADC针对内源癌细胞系NCI-H929在细胞增殖和存活测定中的剂量应答曲线。使用非靶向IgG-VC-MMAE ADC作为阴性对照。
图9D是抗CD48 MMAE ADC针对内源癌细胞系KMS-20在细胞增殖和存活测定中的剂量应答曲线。使用非靶向IgG-VC-MMAE ADC作为阴性对照。
具体实施方式
本披露提供了特异性结合CD48的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，CD48抗体或其抗原结合片段是抗体药物缀合物的一部分，其中特异性结合人CD48的抗体或抗体片段任选地通过接头与药物部分(例如，细胞毒性剂、靶向抑制剂、免疫调节化合物，但不包括BH3模拟抑制剂)连接。那些抗体药物缀合物可以选择性地递送药物部分至表达CD48的细胞，例如B淋巴母细胞，从而治疗患者(例如B细胞淋巴瘤患者)中的那些细胞。本披露进一步提供了包含如本文所披露的抗体或抗原结合片段、其抗体药物缀合物的药物组合物以及制备和使用此类药物组合物用于治疗有需要患者的方法。
定义
除非另外声明，否则如本文所用以下术语和短语意在具有以下意思：
如本文所用，单数形式“一个/种(a/an)”以及“该/所述(the)”包括复数形式，除非上下文清楚地另外指明。除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“有(being of)”(如在“有化学式”中)、“包括(including)”和“含有(containing)”应被解释为开放式术语(即，是指“包括但不限于”)。另外，每当在实施例中使用“包含”或另一个开放式术语时，应该理解，可以使用中间术语“基本上由……组成”或闭合术语“由……组成”来更狭义地要求保护相同的实施例。
术语“约”或“大约”当在数值和范围的上下文使用时，是指大约或接近所述值或范围的值或范围，使得本实施例可以如预期进行，这对技术人员来说从本文所包含的教导中是显而易见的。在一些实施例中，约意指加上或减去数量的20％、15％、10％、5％、1％、0.5％或0.1％。在一个实施例中，术语“约”是指比指定值大或小10％的值的范围。在另一个实施例中，术语“约”是指比指定值大或小5％的值的范围。在另一个实施例中，术语“约”是指比指定值大或小1％的值的范围。
术语“烷基”是指具有指定碳原子数目的单价饱和烃链。例如，C1-C6烷基是指具有从1至6个碳原子的烷基基团。烷基基团可以是直链的或支链的。代表性的支链烷基基团具有一个、两个或三个分支。烷基基团的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基(正丙基和异丙基)、丁基(正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基)、戊基(正戊基、异戊基和新戊基)以及己基。
如本文所用，术语“抗体”是指源自特异性结合抗原的免疫球蛋白分子的蛋白、或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整免疫球蛋白，并且可以源自天然来源或来自重组来源。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)构成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH区和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间穿插有称为框架区(FR)的较保守区。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。抗体可以是单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、或嵌合抗体。这些抗体可以具有任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
“互补性决定结构域”或“互补性决定区”(“CDR”)可互换地指VL和VH的高变区。CDR是抗体链的靶蛋白结合位点，该结合位点携带针对这种靶蛋白的特异性。每种人VL或VH中存在三个CDR(CDR1-3，从N末端顺序编号)，构成约15％-20％的可变结构域。CDR可以按其区域和顺序提到。例如，“VHCDR1”或“HCDR1”均是指重链可变区的第一CDR。CDR在结构上与靶蛋白的表位互补并因此直接负责结合特异性。剩余的VL或VH区段(所谓的框架区)表现出较少的氨基酸序列变异(Kuby,Immunology[免疫学],第4版,第4章,弗里曼出版公司(W.H.Freeman&Co.),纽约,2000)。
给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任一种来确定，这些方案包括由以下文献描述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”[具有免疫学重要性的蛋白序列]，第5版，美国国立卫生研究院，公共卫生事业部，马里兰州贝塞斯达市(“卡巴特”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB273,927-948(“乔西亚”编号方案)，和ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc,M.-P.,TheImmunologist[免疫学者],7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.[发育免疫学与比较免疫学],27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案)。例如，对于经典形式，根据卡巴特，将重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并将轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia，将VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并将VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过结合卡巴特和乔西亚的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。根据IMGT，将VH中的CDR氨基酸残基编号为约26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，并将VL中的CDR氨基酸残基编号为约27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)(根据“卡巴特”编号)。在IMGT下，可以使用程序IMGT/DomainGapAlign确定抗体的CDR区。
将轻链和重链二者分成结构同源性区和功能同源性区。术语“恒定”和“可变”是在功能上使用。在这点上，应当理解轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域均决定抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3，并且在一些情况下CH4)的恒定结构域赋予重要生物特性如分泌、经胎盘移动性(transplacentalmobility)、Fc受体结合、补体结合、FcRn受体结合、半衰期、药代动力学等。按照惯例，恒定区结构域离抗体的抗原结合位点或者氨基末端越远，它的编号越大。N末端是可变区并且在C末端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端结构域。
如本文所用，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个部分，该一个或多个部分保留与抗原(例如CD48)的表位特异性相互作用的能力(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段，该Fab片段是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；Fab'片段，该Fab'片段是由VL、VH、CL、CH1结构域和铰链区组成的单价片段；F(ab’)2片段，该F(ab’)2片段是包含通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；半抗体，该半抗体包括通过二硫键连接的单条重链和单条轻链；单臂抗体，该单臂抗体包括连接至Fc区的Fab片段；CH2结构域缺失的抗体，其包含与CH3结构域二聚体连接的两个Fab片段(参见Glaser,J Biol Chem.[生物化学杂志]2005；280(50):41494-503)；单链Fv(scFv)；二硫键连接的Fv(sdFv)；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,Nature[自然]341:544-546,1989)；和分离的互补性决定区(CDR)、或抗体的其他表位结合片段。例如，Fab片段可包含抗体重链的氨基酸残基1-222(EU编号)；而Fab’片段可包含抗体重链的氨基酸残基1-236(EU编号)。抗体的Fab或Fab’片段可以重组产生或通过酶消化亲本抗体产生。可以将重组产生的Fab或Fab’工程化，以引入用于位点特异性缀合的氨基酸例如半胱氨酸(Junutula,J.R.等人,Nature biotechnology[自然生物技术]2008,26,925)、吡咯啉-羧基-赖氨酸(Ou,W.等人,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]2011；108(26):10437-42)或非天然氨基酸(例如Tian,F.等人,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]2014,111,1766,Axup,J.Y.等人,Proc Natl Acad Sci USA.[美国国家科学院院刊]2012,109,16101)。类似地，可以添加突变或肽标签以通过磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(Grunewald,J.等人,Bioconjugate chemistry[生物缀合化学]2015,26,2554)、甲酰基甘氨酸形成酶(Drake,P.M.等人,Bioconjugate chemistry[生物缀合化学]2014,25,1331)、转谷氨酰胺酶(Strop,P.等人,Chemistry&biology[化学和生物学]2013,20,161)、分选酶(Beerli,R.R.；Hell,T.；Merkel,A.S.；Grawunder,U.PloS one[公共科学图书馆综合]2015,10,e0131177)或其他酶促缀合策略促进缀合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法将这两个结构域通过能够使它们形成为单条蛋白质链的合成接头来相连，其中VL区和VH区配对形成单价分子(被称为单链Fv(“scFv”)；参见例如，Bird等人,Science[科学]242:423-426,1988；和Huston等人Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]85:5879-5883,1988)。术语“抗原结合片段”也意在涵盖此类单链抗体。这些抗原结合片段是使用本领域的技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用来筛选这些片段。
抗体片段或抗原结合片段还可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、纳米抗体、胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和双-scFv中(参见例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技术]23:1126-1136,2005)。可以将抗原结合片段移植到基于多肽如III型纤连蛋白(Fn3)的支架中(参见美国专利号6,703,199，该专利描述了纤连蛋白多肽单体)。
可以将抗体片段或抗原结合片段掺入到包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人,Protein Eng.[蛋白质工程]8:1057-1062,1995；和美国专利号5,641,870)。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有基本上相同的氨基酸序列或衍生自相同遗传源的多肽，包括抗体和抗原结合片段等。此术语还包括具有单分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
如本文所用，术语“人抗体”包括具有可变区的抗体，其中框架和CDR区均衍生自人源序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自此类人序列，例如人种系序列，或人种系序列的突变形式或含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如如Knappik等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]296:57-86,2000中所述。
本披露的人抗体可以包含不是由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机诱变或位点特异性诱变、或通过在体内体细胞突变、或保守取代来引入突变以促进稳定性或生产)。
如本文所用，术语“识别”是指发现其表位并与之相互作用(例如，结合)的抗体或其抗原结合片段，无论该表位是否为线性或构象的。术语“表位”是指抗原上与本披露的抗体或抗原结合片段特异性结合的位点。表位可以从连续氨基酸或因蛋白质的立体折叠而并置的非连续氨基酸中形成。从连续氨基酸形成的表位一般在暴露于变性溶剂时保留，而因立体折叠形成的表位用变性溶剂处理时一般丧失。表位典型地包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，14、15个或更多处于独特空间构象的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术，例如，x射线结晶学和二维核磁共振(参见，例如Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology[分子生物学中的方法中的表位映射协议],第66卷,G.E.Morris编辑(1996))。“互补位”是识别抗原表位的抗体部分。
在描述抗原(例如，蛋白质)与抗体、抗体片段或抗体衍生的结合剂之间相互作用的语境中使用时，短语“特异性结合”或“选择性结合”是指确定抗原在蛋白质异质群体和其他生物制品中例如在生物样品(例如，血液、血清、血浆或组织样品)中存在的结合反应。因此，在某些指明的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂与特定抗原的结合至少两倍于背景并且这些抗体或结合剂基本上不以显著的量与样品中存在的其他抗原结合。在一个方面，在某些指明的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂与特定抗原的结合至少10倍于背景并且这些抗体或结合剂基本上不以显著的量与样品中存在的其他抗原结合。在此类条件下与抗体或结合剂特异性结合可能需要已经就其针对特定蛋白质的特异性选择的抗体或结合剂。如果需要或适当，可以通过扣除与来自其他物种(例如，小鼠或大鼠)或其他亚型的分子交叉反应的抗体，实现这种选择。可替代地，在一些方面，选择与某些所希望分子交叉反应的抗体或抗体片段。
如本文所用，术语“亲和力”是指抗体与抗原之间在单个抗原位点处相互作用的强度。在每个抗原位点内，抗体“臂”的可变区通过弱非共价力在许多位点处与抗原相互作用；相互作用越多，亲和力越强。
术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。然而，特异性结合一种抗原的分离的抗体可以对其他抗原具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学品。
术语“相应的人种系序列”是指编码人可变区氨基酸序列或子序列的核酸序列，与由人种系免疫球蛋白可变区序列编码的其他全部已知的可变区氨基酸序列相比，该人可变区氨基酸序列或子序列与参考可变区氨基酸序列或子序列共有确定的最高氨基酸序列同一性。相应的人种系序列还可以是指与全部其他评价的可变区氨基酸序列相比，与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高氨基酸序列同一性的人可变区氨基酸序列或子序列。相应的人种系序列可以仅是框架区、仅是互补性决定区、是框架区和互补性决定区、可变区段(如上文所定义)，或包含可变区的序列或子序列的其他组合。可以使用本文所述的方法，例如，使用BLAST、ALIGN或本领域已知的另一种比对算法比对两个序列，确定序列同一性。相应的人种系核酸或氨基酸序列可以与参考可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
多种免疫测定方式可以用来选择与特定蛋白特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常规地用来选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(关于可以用来确定特异免疫反应性的免疫测定方式和条件的描述，参见例如Harlow和Lane,Using Antibodies,ALaboratory Manual[使用抗体：实验室手册](1998))。典型地，特异性或选择性结合反应将产生高于背景信号至少2倍和更典型地高于背景至少10至100倍的信号。
术语“平衡解离常数(KD[M])”是指解离速率常数(kd[s-1])除以缔合速率常数(ka[s-1,M-1])。可以使用本领域的任何已知方法，测量平衡解离常数。本披露的抗体通常将具有小于约10-7或10-8M，例如，小于约10-9M或10-10M，在一些方面，小于约10-11M、10-12M或10-13M的平衡解离常数。
术语“生物利用率”是指施用至患者的给定量的药物的全身性利用率(即，血液/血浆水平)。生物利用率是一个绝对术语，该绝对术语指示从所施用剂型到达总循环的药物时间(速率)和总量(程度)的度量。
如本文所用，短语“基本上由……组成”是指方法或组合物中所包含的活性药剂以及对这些方法或组合物的预期目的而言无活性的任何赋形剂的类属或物种。在一些方面，短语“基本上由……组成”明确地排除了包含除本披露的抗体药物缀合物之外的一种或多种额外活性剂。在一些方面，短语“基本上由……组成”明确地排除了包含除本披露的抗体药物缀合物和第二共同施用的药剂之外的一种或多种额外活性剂。
术语“氨基酸”是指天然存在的、合成的和非天然的氨基酸，以及以类似于天然存在氨基酸的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-邻磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢、羧基基团、氨基基团和R基团结合的α-碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有如下结构的化学化合物，该结构与氨基酸的一般化学结构不同但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用。
术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列二者。对于特定核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置，该密码子可以改变为任何所述的相应密码子而不改变所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，其是经保守修饰变异中的一种。本文编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员应认识到，核酸中的每个密码子(除了通常是甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常是色氨酸的唯一密码子的TGG)均可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此，在每个所述序列中均隐含了编码多肽的核酸的每一种沉默变异。
对于多肽序列，“保守修饰的变体”包括对多肽序列的单独取代、缺失或添加，它们导致某个氨基酸取代为化学上相似的氨基酸。提供在功能上相似的氨基酸的保守取代表在本领域是熟知的。此类保守修饰的变体相对于多态性变体、物种间同源物和等位基因是额外的并且不排除它们。以下8组含有互为保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton,Proteins[蛋白质](1984))。在一些方面，术语“保守性序列修饰”用来指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
如本文所用，术语“优化的”是指已经改变核苷酸序列以使用在生产性细胞或生物体(通常是真核细胞，例如酵母细胞、毕赤酵母属(Pichia)细胞、真菌细胞、木霉属(Trichoderma)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞)中为优选的密码子编码氨基酸序列。优化的核苷酸序列被工程化以完全或尽可能多地保留最初由起始核苷酸序列编码的氨基酸序列，该起始核苷酸序列也称为“亲代”序列。
在两个或更多个核酸序列或多肽序列的语境中，术语“相同百分比”或“同一性百分比”是指两个或更多个序列或子序列相同的程度。如果两个序列在正在比较的区域上具有相同的氨基酸序列或核苷酸序列，则它们是“相同的”。当在比较窗口或指定区域内进行比较和比对以在使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查测量时获得最大对应时，如果两个序列具有规定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，在规定区域上或在没有规定时在整个序列上，60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，则这两个序列是“基本上相同的”。任选地，同一性存在于长度为至少30个核苷酸(或10个氨基酸)的区上或更优选地在长度为100个到500个或1000个或更多个核苷酸(或20个、50个、200个或更多个氨基酸)的区上。
对于序列比较，典型地一个序列充当参考序列，测试序列与参考序列比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法将基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用，“比较窗口”包括选自由20个到600个、通常为约50个到约200个，更通常为约100个到约150个组成的组的数目之一的连续位置的区段的指代，其中序列可以与具有相同数目的连续位置的参考序列在两个序列进行最佳比对后进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域是熟知的。例如通过Smith和Waterman Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482c(1970)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学期刊]48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444(1988)的相似性方法研究，通过这些算法(威斯康星州麦迪逊的科学大道575号遗传学计算机小组(Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)的威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)的计算机实现，或通过手动比对和目测检查(参见例如，Brent等人,Current Protocols in MolecularBiology[分子生物学实验指南],2003)，可以进行用于比较的序列的最佳比对。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，它们分别描述于Altschul等人,Nuc.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402,1977；和Altschul等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410,1990。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开地获得。此算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中的相同长度的字比对时，长度为W的短字匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻域字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初的邻域字命中点作为种子，用于启动搜索以找到包含它们的更长的HSP。字命中点沿着每个序列在两个方向上扩展，远至可以增加累积比对得分。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当出现以下情形时，字命中点向各方向的延伸终止：累积比对得分从其最大获得值跌落数量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积得分走向零或更低；或到达任一序列的一端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3和期望值(E)10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如，Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5787,1993)。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2、更优选地小于约0.01、最优选地小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
两个氨基酸序列之间的同一性百分比也可以使用已并入ALIGN算法(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller,Comput.Appl.Biosci.[计算机应用生物科学],4:11-17,(1988)的算法，利用PAM120权重残基表、空位长度罚分12以及空位罚分4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用已经并入GCG软件包中的GAP程序(可以从万维网以gcg.com获得)中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:444-453,1970)算法，利用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重为16、14、12、10、8、6或4以及长度权重为1、2、3、4、5或6来确定。
除了上述序列同一性百分比之外，两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体进行免疫交叉反应，如下所述。因此，多肽典型地与第二多肽基本上相同，例如其中两种肽仅通过保守取代而不同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子或它们的互补序列在严格条件下彼此杂交，如下所述。两个核酸序列基本上相同的又一个指示是可使用相同的引物来扩增序列。
术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，这些核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另外指示，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。具体地，如下文详述，简并密码子取代可以通过产生如下序列而实现，在这些序列中，一个或多个所选择的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,(1991)Nucleic Acid Res.[核酸研究]19:5081；Ohtsuka等人,(1985)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260:2605-2608；和Rossolini等人,(1994)Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98)。
术语“可操作地连接”在核酸的语境中是指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)区段之间的功能性关系。典型地，它是指转录调节序列与已转录序列的功能性关系。例如，如果启动子或增强子序列在适当的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调控编码序列的转录，则启动子或增强子序列可操作地连接至编码序列。通常，与转录序列可操作地连接的启动子转录调节序列与转录序列在物理上邻接，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列例如增强子不需要在物理上邻接或位于极为接近这些转录调节序列增强其转录的编码序列的位置。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来指氨基酸残基的聚合物。术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另外说明，否则特定的多肽序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体。
如本文所用，术语“缀合物”或“抗体药物缀合物”是指抗体或其抗原结合片段与另一种药剂如化学治疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针等连接。连接可以是共价键或非共价相互作用，如借助静电力。可以采用本领域已知的多种接头以形成缀合物。另外地，可以将缀合物以可能是从编码缀合物的多核苷酸表达的融合蛋白的形式提供。如本文所用，“融合蛋白”是指通过连接两个或多个基因或基因片段而产生的蛋白质，这些基因或基因片段最初编码分开的蛋白质(包括肽和多肽)。融合基因的翻译产生具有从每种原始蛋白质衍生的功能特性的单一蛋白。
术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物如非人类灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非指出时，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。
如本文所用，术语“毒素”、“细胞毒素”或“细胞毒性剂”是指对细胞的生长和增殖有害并可以发挥作用以减少、抑制或摧毁细胞或恶性肿瘤的任何药剂。
如本文所用，术语“抗癌剂”是指可以用来治疗细胞增殖性障碍如癌症的任何药剂，包括但不限于细胞毒性剂、化学治疗剂、放射疗法和放射治疗剂、靶向抗癌剂和免疫治疗剂。
如本文所用，术语“药物部分”或“有效负载”是指与抗体或抗原结合片段缀合或适用于与抗体或抗原结合片段缀合的化学部分，并且可以包括任何治疗剂或诊断剂和具有所希望的治疗或诊断特性的本文披露的抗体药物缀合物的代谢物，例如，抗癌剂、抗炎剂、抗感染剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂)或麻醉剂。在某些方面，药物部分选自Eg5抑制剂、V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞他汀、多拉司他汀、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、核输出蛋白CRM1抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DHFR抑制剂和促凋亡剂。
如本文所用，术语“药物部分”不包含特异性抑制MCL-1、BCL-2或BCLXL的BH3模拟抑制剂，也称为MCL-1抑制剂、BCL-2抑制剂和BCLXL抑制剂。如本文所用，术语“骨髓细胞白血病1”或“Mcl-1”或“MCL1”是指人Mcl-1的任何天然形式，涵盖全长人Mcl-1(例如，UniProt参考序列：Q07820)，以及保留人Mcl-1的一种或多种生物学功能的任何剪接变体、等位基因变体和同种型。本文中排除的特异性Mcl-1抑制剂披露于PCT申请号PCT/EP2014/078947、PCT/EP2016/064417、PCT/EP2016/064418、PCT/EP2016/064433、PCT/EP2016/064436和PCT/EP2016/081688中，每一篇文献均通过引用以其全文并入本文。
如本文所用，术语“B细胞淋巴瘤2”或“Bcl-2”或“BCL2”是指人Bcl-2的任何天然形式，涵盖全长人Bcl-2(例如UniProf参考序列P10415-1或P10415-2)，以及保留人Bcl-2的一种或多种生物学功能的任何剪接变体、等位基因变体和同种型。本文中排除的特异性Bcl-2抑制剂披露于PCT申请号PCT/FR2013/050136、PCT/FR2014/051888、PCT/FR2014/051887、PCT/FR2014/051884、PCT/FR2014/051885、PCT/EP2014/065764和PCT/EP2018/079113中，每一篇文献均通过引用以其全文并入本文。
如本文所用，术语“B细胞淋巴瘤-特大型”或“Bcl-xL”或“BCLXL”是指人Bcl-xL的天然形式，涵盖全长人Bcl-xL(例如UniProt参考序列：Q07817-1)，以及保留人Bcl-xL的一种或多种生物学功能的任何剪接变体、等位基因变体和同种型。本文中排除的特异性Bcl-xL抑制剂披露于PCT申请号PCT/EP2020/071179和PCT/EP2020/071181中，每一篇文献均通过引用以其全文并入本文。
用于将这些药物部分中的每种附接至与本披露抗体和方法相容的接头的方法是本领域已知的。参见例如，Singh等人,(2009)Therapeutic Antibodies:Methods andProtocols[治疗性抗体：方法和方案],第525卷,445-457。此外，有效负载可以是生物物理探针、荧光团、自旋标记、红外探针、亲和探针、螯合剂、光谱探针、放射性探针、脂质分子、聚乙二醇、聚合物、自旋标记、DNA、RNA、蛋白质、肽、表面、抗体、抗体片段、纳米粒子、量子点、脂质体、PLGA粒子、糖或多糖。
术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤(例如，其细胞未移行至受试者身体中除原始肿瘤部位之外部位的那些)和继发性恶性肿瘤(例如，因转移、肿瘤细胞移行至与原始肿瘤部位不同的继发部位而产生的那些)。术语“癌症”包括癌症和癌症转移的所有类型，包括血液癌症、实体瘤、肉瘤、癌以及其它实体和非实体肿瘤癌症。血液癌症可以包括B细胞恶性肿瘤，血癌(白血病)、浆细胞癌(骨髓癌，例如，多发性骨髓瘤)或淋巴结癌(淋巴瘤)。示例性B细胞恶性肿瘤包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤。白血病可以包括急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性髓单核细胞性白血病(CMML)、急性单核细胞性白血病(AMoL)等。淋巴瘤可以包括霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤等。其它血液癌症可以包括骨髓增生异常综合征(MDS)。实体瘤可以包括癌例如腺癌(例如乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌)、结肠癌或结肠直肠癌、肺癌、胃癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胆管癌、胶质瘤、黑色素瘤等。在一些实施例中，癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T-细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。
在一些实施例中，癌症是血液癌症，例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。例如，本文所述的组合可用于治疗癌症、恶性肿瘤和相关障碍，包括但不限于，例如，急性白血病，例如，B细胞急性淋巴性白血病(BALL)、T细胞急性淋巴性白血病(TALL)、急性髓性白血病(AML)、急性淋巴性白血病(ALL)；慢性白血病，例如，慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；另外的血液癌或血液病症，例如B细胞幼淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金氏淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、骨髓纤维化、淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、慢性中性粒细胞性白血病、原发性血小板增多症、慢性嗜酸性粒细胞白血病、慢性髓单核细胞性白血病、里氏综合征、混合表型急性白血病、急性双表型白血病，以及“白血病前期”(其是由骨髓血细胞的无效产生(或发育异常)联合的血液学病症的多样化集合)等。
如本文所用，术语“肿瘤”是指由良性或恶性的过度细胞生长或增殖导致的任何组织块，包括癌前病变。在一些实施例中，肿瘤是乳腺癌、胃癌、膀胱癌、脑癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。在一些实施例中，肿瘤症是胃癌。
术语“肿瘤细胞”和“瘤细胞”在本文中可以互换地使用并且是指源自肿瘤或癌症的单个细胞或总细胞群体，包括非致瘤细胞和癌症干细胞。术语“肿瘤细胞”和“瘤细胞”仅当指那些缺乏更新和分化能力的细胞时，将由术语“非致瘤”修饰以区分那些细胞和癌干细胞。
术语“CD48”是指分化簇48蛋白，也称为B-淋巴细胞活化标记物(BLAST-1)或信号传导淋巴细胞活化分子2(SLAMF2)。在一些实施例中，CD48是人CD48同种型。在一些实施例中，人CD48同种型是具有以下氨基酸序列的同种型1(NP_001769.2)：
MCSRGWDSCLALELLLLPLSLLVTSIQGHLVHMTVVSGSNVTLNISESLPENYKQLTWFYTFDQKIVEWDSRKSKYFESKFKGRVRLDPQSGALYISKVQKEDNSTYIMRVLKKTGNEQEWKIKLQVLDPVPKPVIKIEKIEDMDDNCYLKLSCVIPGESVNYTWYGDKRPFPKELQNSVLETTLMPHNYSRCYTCQVSNSVSSKNGTVCLSPPCTLARSFGVEWIASWLVVTVPTILGLLLT(SEQ ID NO:53)。
在一些实施例中，人CD48同种型是具有以下氨基酸序列的同种型2(NP_001242959.1)：
MCSRGWDSCLALELLLLPLSLLVTSIQGHLVHMTVVSGSNVTLNISESLPENYKQLTWFYTFDQKIVEWDSRKSKYFESKFKGRVRLDPQSGALYISKVQKEDNSTYIMRVLKKTGNEQEWKIKLQVLDPVPKPVIKIEKIEDMDDNCYLKLSCVIPGESVNYTWYGDKRPFPKELQNSVLETTLMPHNYSRCYTCQVSNSVSSKNGTVCLSPPCTLGKKDPWELRGAQGNWSCFEQRKAGGPIQPPCTVWW(SEQ ID NO:54)。
如本文所用，将术语“CD48”用于共同指CD48蛋白的所有天然存在的同种型、或其变体。
术语“变体”是指与参考多肽具有基本上相同的氨基酸序列、或由基本上相同的核苷酸序列编码，并且能够具有参考多肽的一种或多种活性的多肽。例如，变体与参考多肽可以具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，同时保留参考多肽的一种或多种活性。
如本文所用，术语任何疾病或障碍的“治疗(treat、treating或treatment)”在一个方面是指改善疾病或障碍(即，减慢或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个方面，“治疗”是指缓解或改善至少一种身体参数(包括不能被患者辨别的那些)。在又一个方面，“治疗”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定化)、在生理上(例如，身体参数的稳定化)或二者调节疾病或障碍。在又一个方面，“治疗(treat、treating或treatment)”是指延迟疾病或障碍的发病或发展或进展。在一些实施例中，治疗包括在身体上(例如，可辨别症状的稳定)、生理上(例如，物理参数的稳定)亦或在这两个方面调节疾病、障碍或病症。在一些实施例中，治疗包括向受试者(例如患者)施用所描述的抗体、其抗原结合片段、其ADC或组合物，以获得本文枚举的治疗益处。治疗可以是治疗、治愈、缓解、延迟、解除、改变、补救、减轻、缓和、改善或影响疾病，障碍或病症(例如，癌症)，疾病、障碍或病症(例如，癌症)的症状。
术语“治疗上可接受的量”或“治疗有效剂量”可互换地指足以实现所希望结果(即，肿瘤尺寸减小、抑制肿瘤生长、防止转移、抑制或防止病毒、细菌、真菌或寄生虫感染)的量。在一些方面，治疗可接受量不诱导或不引起不期望的副作用。可以通过首先施用低剂量并且随后递增地增加该剂量直至实现所需效果来确定治疗上可接受的量。本披露分子的“治疗有效剂量”可以分别防止疾病症状发作或导致疾病症状的严重程度下降，这些疾病症状包括与癌症相关的症状。
术语“共同施用”是指个体的血液中同时存在两种活性药剂。共同施用的活性试剂可以并行地或顺序地递送。
如本文所用，术语“硫醇-马来酰亚胺”是指通过硫醇与马来酰亚胺反应形成的基团，具有以下该通式：
其中Y和Z是经由硫醇-马来酰亚胺键连接的基团，并且可以包含接头组分、抗体或有效负载。硫醇-马来酰亚胺可以形成以下开环结构
如本文所用，“可切割的”是指通过共价连接来连接两个部分，但是在生理学相关条件下分解以切断部分之间的共价连接的连接基团或接头组分，典型地，与在细胞外环境时相比可切割的连接基团在细胞内环境内更快速地体内切断，导致有效负载的释放优先发生在靶细胞内。切割可以是酶促的或非酶促的，但通常从抗体释放有效负载而不降解抗体。切割可以留下附接基团或接头组分的一些部分附接至有效负载上，或者它可以释放不具有附接基团的任何残基的有效负载。
如本文所用，“不可切割的”是指在生理条件下不特别易于分解的连接基团或接头基团，例如，它至少与缀合物的抗体或抗原结合片段部分一样稳定。此类连接基团有时被称为“稳定的”，这意味着它们足以抵抗降解以保持有效负载与抗体或抗原结合片段连接，直到抗体或抗原结合片段本身至少部分降解，即，抗体或抗原结合片段的降解在体内切割连接基团之前。具有稳定或不可切割的附接基团的ADC的抗体部分的降解可以留下附接基团的一些或全部(例如，来自抗体的一个或多个氨基酸基团)附接至递送在体内的有效负载或药物部分上。
CD48抗体
本文披露了特异性结合人CD48的抗体或抗体片段(例如，抗体结合片段)。本披露的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包括但不限于本文所述的人单克隆抗体或其抗原结合片段。
表1、表2和表3列出了本披露的示例性抗CD48抗体的氨基酸序列。
如本文所述，抗体以其名称命名，例如NY920。如果对抗体进行修饰，则进一步用此修饰命名它们。例如，如果抗体中选定的氨基酸已经改变为半胱氨酸(例如根据抗体重链的EU编号的E152C、S375C以促进与接头-药物部分的缀合)，则它们被命名为“CysMab”；或如果抗体已经用根据EU编号的IgG1恒定区的Fc沉默突变D265A和P329A进行修饰，则将“DAPA”添加至抗体名称中。如果抗体用于抗体药物缀合物，则使用以下形式对它们命名：抗体名称-接头-有效负载。
表1.抗CD48 mAb CDR的氨基酸序列
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表2.抗CD48 mAb可变区的氨基酸序列和核酸序列
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表3.全长mAb IgG链的氨基酸序列和核酸序列
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在一些实施例中，本文披露的抗体或其抗原结合片段可以包含上表所列出的任一组重链和轻链可变结构域或来自上表所列出的任一组重链和轻链可变结构域的一组六个CDR。在一些实施例中，本文披露的抗体或其抗原结合片段可以包含保守修饰的和/或与上表所列的序列同源的氨基酸序列，只要抗体保留与其靶癌抗原结合的能力(例如，KD小于1x10-8M)并且保留一种或多种本文披露的抗体的功能特性(例如，内化能力、与抗原靶标(例如，在肿瘤或其它瘤细胞上表达的抗原)结合的能力等)。
在一些实施例中，本文披露的抗体或其抗原结合片段进一步包含人重链恒定结构域和人轻链恒定结构域或其片段。例如，如本文所述的抗体药物缀合物(ADC)的抗体或抗原结合片段可以包含人IgG重链恒定结构域(例如IgG1)和人κ或λ轻链恒定结构域。在一些实施例中，如本文所述的ADC的抗体或抗原结合片段包含具有人Igκ轻链恒定结构域的人免疫球蛋白G亚型1(IgG1)重链恒定结构域。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：由SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3(LCDR3)。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:10的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:23的轻链可变区氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:10至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:23至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:36的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:49的轻链可变区氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD48抗体或其抗原结合片段具有与SEQ ID NO:36至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链可变区氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:49至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施例中，抗CD48抗体包含SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:12至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:25的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:25至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD48抗体包含SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列和SEQID NO:25的轻链氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD48抗体具有与SEQ ID NO:12至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:25至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施例中，抗CD48抗体包含SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:14至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:25的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:25至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD48抗体包含SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列和SEQID NO:25的轻链氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD48抗体具有与SEQ ID NO:14至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:25至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施例中，抗CD48抗体包含SEQ ID NO:38的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:38至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:51的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:51至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD48抗体包含SEQ ID NO:38的重链氨基酸序列和SEQID NO:51的轻链氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD48抗体具有与SEQ ID NO:38至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:51至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。
在一些实施例中，抗CD48抗体包含SEQ ID NO:40的重链氨基酸序列或与SEQ IDNO:40至少95％相同的序列，以及SEQ ID NO:51的轻链氨基酸序列或与SEQ ID NO:51至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD48抗体包含SEQ ID NO:40的重链氨基酸序列和SEQID NO:51的轻链氨基酸序列或与披露的序列至少95％相同的序列。在一些实施例中，抗CD48抗体具有与SEQ ID NO:40至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:51至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链氨基酸序列。
如果在多肽结构中残基占据类似位置，则称两个或更多个多肽中的残基“对应”。可以通过基于氨基酸序列或结构相似性比对多肽序列来确定两个或更多个多肽中的类似位置。本领域技术人员理解，可能需要在任一序列中引入空位以产生令人满意的比对。
在一些实施例中，氨基酸取代是单个残基取代。插入通常将在约1至约20个氨基酸残基的数量级，但是只要保留生物学功能(例如，与靶抗原结合)，可以耐受相当大的插入。缺失的范围通常为约1至约20个氨基酸残基，但是在一些情况下缺失可以更大。可以使用取代、缺失、插入或其任何组合获得最后的衍生物或变体。通常，这些变化是在几个氨基酸上进行，以最小化分子的改变，特别是抗原结合蛋白的免疫原性和特异性最小化。然而，在某些情况下可以耐受更大的改变。根据如表4所描绘的下图进行保守取代。
表4：氨基酸取代
原始残基 示例性取代
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln、HIs
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn、Gln
Ile Leu、Val
Leu Ile、Val
Lys Arg、Gln、Glu
Met Leu、Ile
Phe Met、Leu、Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp、Phe
Val Ile、Leu
本文披露的抗体或其抗原结合片段在其范围内包括与瘤细胞上的靶抗原(例如，人CD48)特异性结合的任何抗体或抗原结合片段。抗体或抗原结合片段可以与靶抗原(例如，人CD48)结合，其中解离常数(KD)≤1mM、≤100nM或≤10nM或之间的任何量，如通过例如，分析所测量的。在一些实施例中，KD是1pM至500pM。在一些实施例中，KD在500pM至1μM、1μM至100nM或100mM至10nM之间。在一些实施例中，KD在500nM至10pM之间。
在一些实施例中，抗体或抗体结合片段是四链抗体(也称为免疫球蛋白或全长或完整抗体)，包含两条重链和两条轻链。在一些实施例中，抗体或抗体结合片段是免疫球蛋白抗原结合片段。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是保留与靶癌抗原(例如CD48)结合的能力和/或提供免疫球蛋白的至少一种功能的免疫球蛋白抗原结合片段。
在一个实施例中，抗体分子是完全抗体或其片段(例如，Fab、Fab’、F(ab')2、dAb、Fd、Fv、二硫键连接的Fv(sdFv)或单链Fv(scFv)片段)。在其他实施例中，抗体分子是半抗体、单臂抗体、单结构域抗体、大型抗体、微型抗体、纳米抗体、胞内抗体或双抗体。在又其他实施例中，抗体分子具有重链恒定区(Fc)，该重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、和IgE的重链恒定区；特别地，选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区，更特别地，选自IgG1或IgG4(例如人IgG1或IgG4)的重链恒定区。在一个实施例中，重链恒定区是人IgG1或人IgG4。在一个实施例中，改变(例如突变)恒定区以修饰抗体分子的特性(例如，以增加或减少以下中的一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能或补体功能)。
在某些实施例中，抗体分子处于双特异性或多特异性抗体分子的形式。在一个实施例中，双特异性抗体分子对人CD48具有第一结合特异性并且对CD3具有第二结合特异性。在一个实施例中，抗CD48抗体是双特异性T细胞接合(BiTE)抗体。
在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段(例如，scFv片段)处于嵌合抗原受体T细胞(CAR-T或CART)的形式。
本披露的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等效物也可以与放射性同位素缀合以产生细胞毒性放射药物，称之为放射免疫缀合物。可以与抗体缀合的用于诊断或治疗性用途的放射性同位素的实例包括但不限于碘-131、铟-111、钇-90和镥-177。本领域中建立了用于制备放射免疫缀合物的方法。放射免疫缀合物的实例是可商业获得的，包括ZevalinTM(DEC制药公司(DEC Pharmaceuticals))和BexxarTM(科里克萨制药公司(Corixa Pharmaceuticals))，并且可以利用本文披露的抗体使用类似方法来制备放射免疫缀合物。在某些实施例中，大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(DOTA)，其可以经由接头分子附接至抗体。此类接头分子是本领域公知的，并且描述于Denardo等人,(1998)Clin Cancer Res.[临床癌症研究]4(10):2483-90；Peterson等人,(1999)Bioconjug.Chem.[生物缀合化学]10(4):553-7；和Zimmerman等人,(1999)Nucl.Med.Biol.[核医学和生物学]26(8):943-50，每一篇文献均通过引用以其全文并入。
本披露的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等效物还可以与异源蛋白或多肽(或其片段、优选地与至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸的多肽)缀合以产生融合蛋白。特别地，本披露提供了融合蛋白，这些融合蛋白包含本文所述的抗体片段(例如，抗原结合片段)(例如Fab片段、Fd片段、Fv片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、VH结构域、VH CDR、VL结构域或VLCDR)和异源蛋白质、多肽或肽。
可以通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)的技术生成另外的融合蛋白。可采用DNA改组来改变本披露的抗体或其片段的活性(例如，具有较高亲和力和较低解离速率的抗体或其片段)。通常参见，美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252、和5,837,458；Patten等人,(1997)Curr.OpinionBiotechnol.[当前生物技术观点]8:724-33；Harayama,(1998)Trends Biotechnol.[生物技术趋势]16(2):76-82；Hansson等人,(1999)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:265-76；和Lorenzo和Blasco,(1998)Biotechniques[生物技术]24(2):308-313(这些专利和出版物中的每一篇均据此通过引用以其全文并入)。抗体或其片段、或编码的抗体或其片段可以通过在重组之前通过易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法进行随机诱变来改变。编码特异性结合抗原的抗体或其片段的多核苷酸可以与一种或多种异源分子的一个或多个组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。
此外，本披露的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等效物可以与标志物序列如肽缀合以促进纯化。在优选的实施例中，标志物氨基酸序列是六组氨酸肽(SEQ IDNO:84)，例如pQE运载体中提供的标签(凯杰公司(QIAGEN,Inc.)，伊顿大街(Eton Avenue)9259号，加利福尼亚州查茨沃思(Chatsworth)，91311)等，其中许多是商购可得的。如Gentz等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:821-824中所述，例如六组氨酸(SEQ ID NO:84)为纯化融合蛋白提供便利。可用于纯化的其他肽标签包括但不限于，对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位的血凝素(“HA”)标签(Wilson等人,(1984)Cell[细胞]37:767)和“FLAG”标签(A.Einhauer等人,J.Biochem.Biophys.Methods[生化和生物物理方法杂志]49:455-465,2001)。根据本披露，抗体或抗原结合片段也可以与渗透肿瘤的肽缀合以提高它们的功效。
在其他实施例中，本披露的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等效物与诊断剂或可检测剂缀合。此类免疫缀合物可用于监测或预后疾病或障碍的发作、发展、进展和/或严重程度以作为临床试验程序(如确定特定疗法的功效)的一部分。这种诊断和检测可以通过将抗体与可检测物质偶联来实现，这些可检测物质包括但不限于各种酶，如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，例如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光材料，如但不限于Alexa Fluor 350、Alexa Fluor405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、AlexaFluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor680、Alexa Fluor700、Alexa Fluor 750、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如但不限于鲁米诺；生物发光材料，例如但不限于萤光素酶、萤光素和水母素；放射性材料，如但不限于碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、64Cu、113Sn和117Sn；以及使用各种正电子发射断层扫描的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。
本披露的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等效物也可以附接至特别可用于靶抗原的免疫测定法或纯化的固体支持物。这种固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是内化抗体或其内化抗原结合片段。在一些实施例中，内化抗体或其内化抗原结合片段与在细胞表面表达的靶癌抗原(例如CD48)结合且在结合后进入细胞。在一些实施例中，在ADC进入并存在于表达靶癌抗原细胞中之后(即，ADC已经被内化后)，ADC的药物部分从ADC的抗体或抗原结合片段中释放，例如，通过切割、通过降解抗体或抗原结合片段或通过任何其它合适的释放机制。在ADC中使用变体抗体序列的一些实施例中，变体典型地表现出相同的定性的生物学活性且将引起相同的免疫应答，即使也可以根据需要选择变体以修饰抗原结合蛋白的特性。可替代地，可以设计变体使得抗原结合蛋白的生物活性被改变。例如，可以改变或去除糖基化位点。
本披露的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等效物可以包含经修饰的抗体或其抗原结合片段，这些经修饰的抗体或其抗原结合片段进一步在VH和/或VL内包含对框架残基的修饰，例如以改善抗体的性质。在一些实施例中，进行这种框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”为相应的种系序列。更具体地，已经历体细胞突变的抗体可以含有与衍生出抗体的种系序列不同的框架残基。可以通过将抗体框架序列与衍生抗体的种系序列进行比较来鉴定此类残基。为了使框架区序列恢复为其种系构型，可以通过例如定点诱变将体细胞突变“回复突变”为种系序列。此类“回复突变的”抗体也旨在为本文所涵盖。
另一类型的框架修饰涉及使框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变以去除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。此方法也称为“去免疫化”，并且在Carr等人的美国专利公开号20030153043中有进一步详细描述。
除了在框架或CDR区内进行的修饰之外或在于框架或CDR区内进行的修饰的替代方案中，可以将本披露的抗体工程化以包含Fc区内的修饰，典型地是为了改变抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性(ADCC)。此外，本披露的抗体可以经化学修饰(例如，一个或多个化学部分可以附接至抗体)或经修饰以改变其糖基化，从而再次改变抗体的一种或多种功能特性。以下更详细地描述了这些实施例中的每一个。
在一个实施例中，修饰CH1的铰链区，使得铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，例如，增加或减少。此方法在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步描述。改变CH1铰链区中半胱氨酸残基的数目，以例如促进轻链和重链的组装或增加或降低抗体的稳定性。
在一些实施例中，本文披露的抗体或抗体片段包含经修饰或工程化的氨基酸残基，例如一个或多个半胱氨酸残基，以作为用于与药物部分缀合的位点(Junutula JR等人:Nat Biotechnol[自然生物技术]2008,26:925-932)。在一个实施例中，本披露提供了经修饰的抗体或抗体片段，该经修饰的抗体或抗体片段包含在本文所述的位置处用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代。用于半胱氨酸取代的位点是在抗体或抗体片段的恒定区中并且因此适用于多种抗体或抗体片段，并且选择位点以提供稳定且均质的缀合物。经修饰的抗体或片段可以具有一个、两个或更多个半胱氨酸取代，并且这些取代可以与如本文所述的其他修饰和缀合方法组合使用。用于将半胱氨酸插入在抗体的特定位置处的方法是本领域已知的，参见例如Lyons等人,(1990)Protein Eng.[蛋白质工程]3:703-708、WO 2011/005481、WO 2014/124316、WO 2015/138615。在某些实施例中，经修饰的抗体包含在其选自以下位置的恒定区上用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：抗体的重链的位置117、119、121、124、139、152、153、155、157、164、169、171、174、189、191、195、197、205、207、246、258、269、274、286、288、290、292、293、320、322、326、333、334、335、337、344、355、360、375、382、390、392、398、400和422，并且其中位置是根据EU系统编号的。在一些实施例中，经修饰的抗体或抗体片段包含在其选自以下位置的恒定区上用半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代：抗体或抗体片段的轻链的位置107、108、109、114、129、142、143、145、152、154、156、159、161、165、168、169、170、182、183、197、199、和203，其中这些位置是根据EU系统编号的，并且其中该轻链是人κ轻链。在某些实施例中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸对两个或更多个氨基酸的取代的组合，其中组合包含在抗体重链的位置375、抗体重链的位置152、抗体重链的位置360、或抗体轻链的位置107处的取代，并且其中这些位置是根据EU系统编号的。在某些实施例中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸对一个氨基酸的取代，其中该取代是在抗体重链的位置375、抗体重链的位置152、抗体重链的位置360、抗体轻链的位置107、抗体轻链的位置165或抗体轻链的位置159，并且其中这些位置是根据EU系统编号的，并且其中该轻链是κ链。在特定的实施例中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在其恒定区上用半胱氨酸对两个氨基酸的取代的组合，其中组合包含在抗体重链的位置375和抗体重链的位置152处的取代，其中这些位置是根据EU系统编号的。在特定的实施例中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在抗体重链的位置360处用半胱氨酸对一个氨基酸的取代，其中这些位置是根据EU系统编号的。在其他具体实施例中，经修饰的抗体或其抗体片段包含在抗体轻链的位置107处用半胱氨酸对一个氨基酸的取代并且其中位置是根据EU系统编号的，并且其中轻链是κ链。
在另外的实施例中，可用于本披露的免疫缀合物的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)包括经修饰的或工程化的抗体，如以下抗体，该抗体经修饰以引入一个或多个其他反应性氨基酸(除半胱氨酸外)(包括Pcl、吡咯赖氨酸、肽标签(如S6、A1和ybbR标签)和非天然氨基酸)以替代天然序列的至少一个氨基酸，从而在抗体或抗原结合片段上提供用于与具有互补反应性的药物部分或接头-药物部分缀合的反应位点。例如，可以修饰抗体或抗体片段以掺入Pcl或吡咯赖氨酸(W.Ou,等人,(2011)PNAS[美国国家科学院院刊]108(26),10437-10442；WO 2014124258)或非天然氨基酸(J.Y.Axup等人,Proc Natl Acad Sci U SA[美国国家科学院院刊],109(2012),第16101-16106页；审查参见C.C.Liu和P.G.Schultz(2010)Annu Rev Biochem[生物化学年鉴]79,413-444；C.H.Kim等人,(2013),Curr OpinChem Biol.[化学生物学研究现状]17,412-419)作为与药物缀合的位点。类似地，可以将用于酶学缀合方法的肽标签引入到抗体中(Strop P.等人,Chem Biol.[化学生物学]2013,20(2):161-7；Rabuka D.,Curr Opin Chem Biol.[化学生物学新见]2010年12月；14(6):790-6；Rabuka D,等人,Nat Protoc.[自然实验手册]2012,7(6):1052-67)。一个其他实例是使用4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)用于辅酶A类似物的缀合(WO 2013184514)和(Grünewald等人,(2015)Bioconjugate Chem.[生物缀合化学]26(12),2554-62)。用于将此类经修饰或工程化的抗体与有效负载或接头-有效负载组合缀合的方法是本领域已知的。
在另一个实施例中，使抗体的Fc铰链区突变以缩短抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中，使得抗体具有相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合而言受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。此方法在Ward等人的美国专利号6,165,745中进一步详细描述。
在又其他实施例中，通过用不同的氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基替代一个或多个氨基酸，使得抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。改变亲和力的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。此方法在例如Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中得到描述。
在另一个实施例中，选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸可以用不同的氨基酸残基替代，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。此方法在例如Idusogie等人的美国专利号6,194,551中得到描述。
在另一个实施例中，改变一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。例如，Bodmer等人在PCT公开WO 94/29351中描述了这一方法。同种异型氨基酸残基包括但不限于：IgG1、IgG2、和IgG3亚类的重链的恒定区以及κ同种型的轻链的恒定区，如Jefferis等人,MAbs.1:332-338(2009)所描述的。
在一些实施例中，抗体包含介导降低的或没有的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的突变。在一些实施例中，这些突变被称为Fc沉默(Silencing)、Fc沉默(Silent)或Fc沉默(Silenced)突变。在一些实施例中，IgG1恒定区的氨基酸残基L234和L235被取代为A234和A235(也称为“LALA”)。在一些实施例中，IgG1恒定区的氨基酸残基N297被取代为A297(也称为“N297A”)。在一些实施例中，IgG1恒定区的氨基酸残基D265和P329被取代为A265和A329(也称为“DAPA”)。也可以使用其他抗体Fc沉默突变。在一些实施例中，组合使用Fc沉默突变，例如D265A、N297A和P329A(也称为“DANAPA”)。
在另一个实施例中，改变一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。此方法在例如Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中得到描述。在特定的实施例中，本披露的抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸被一个或多个异型氨基酸残基替代。异型氨基酸残基也包括但不限于IgG1、IgG2、和IgG3亚类的重链的恒定区以及κ同种型的轻链的恒定区，如由Jefferis等人,MAbs.[单克隆抗体]1:332-338(2009)所述的。
在仍另一个实施例中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对“抗原”的亲和力。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，这导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除在该位点处的糖基化。此类无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。此种方法描述于例如Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中。
在另一个实施例中，修饰抗体以增加其生物半衰期。可以采用各种方法。例如，可以引入以下突变中的一种或多种：如在美国专利号6,277,375中由Ward所述的T252L、T254S、T256F。可替代地，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区内改变抗体，以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。
结合相同表位的抗体
本披露提供了特异性结合人CD48细胞外结构域内的表位的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。在某些方面，抗体或抗体片段可以结合人CD48的氨基酸29-130内的表位。在一些实施例中，表位在人CD48(SEQ ID NO:53)的氨基酸54-64或氨基酸105-121内。在一些实施例中，表位包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列的氨基酸54、58、60、61、62、64、105、107、119、111、114、115、117、119和121中的一个或多个。
本披露还提供了与表1、表2、表3中描述的抗CD48抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)结合相同表位的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。因此可以基于其在CD48结合测定中与另外的抗体或抗体片段交叉竞争(例如，以统计上显著方式竞争性抑制结合)的能力来鉴定另外的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。例如，在国际专利公开号WO 2003/48731中描述了基于抗体的交叉竞争将这些抗体“分箱”的高通量方法。测试抗体或抗体片段抑制本文披露的抗体或抗体片段与CD48蛋白(例如，人CD48)的结合的能力证明测试抗体或抗体片段可以与抗体或抗体片段竞争结合CD48；根据非限制性理论，这样的抗体或抗体片段可以和与其竞争的抗体或抗体片段结合相同、重叠或相关(例如，结构上相似或空间上接近)的CD48蛋白上的表位。在某个方面，与本文披露的抗体或抗体片段结合CD48上的相同表位的抗体或抗体片段是人或人源化抗体或抗体片段。可如本文所述那样制备和分离这种人或人源化抗体或抗体片段。
CD48抗体或抗体片段的产生
可以通过本领域已知的任何手段产生抗CD48抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)，这些手段包括但不限于全长单克隆抗体(其可以通过例如杂交瘤或重组产生而获得)的重组表达、化学合成或酶促消化。重组表达可以来自本领域已知的任何适当的宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞)、或通过无细胞系统制备(例如，苏特罗公司(Sutro)的Xpress CFTM平台，万维网sutrobio.com/technology/)。
本披露进一步提供了编码本文描述的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)的多核苷酸，例如编码包含如本文描述的互补决定区的重链或轻链可变区或区段的多核苷酸。在一些方面，编码重链可变区(VH)的多核苷酸与选自由SEQ ID NO:11和37组成的组的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些方面，编码轻链可变区(VL)的多核苷酸与选自由SEQ ID NO:24和50组成的组的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
在一些方面，编码抗体重链的多核苷酸与SEQ ID NO:13或15的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。在一些方面，编码抗体轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:26或52的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸序列同一性。
本披露的多核苷酸可以仅编码抗CD48抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)的可变区序列。它们还可以编码抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)的可变区和恒定区两者。一些多核苷酸序列编码包含例示抗CD48抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)之一的重链和轻链两者的可变区的多肽。
多核苷酸序列可以通过从头固相DNA合成或通过PCR诱变编码抗CD48抗体或其结合片段的现有序列(例如，如下文实例中所述的序列)来产生。核酸的直接化学合成可以通过本领域已知的方法完成，这些方法如Narang等人,Meth.Enzymol.[酶学方法]68:90,1979的磷酸三酯方法；Brown等人,Meth.Enzymol.[酶学方法]68:109,1979的磷酸二酯方法；Beaucage等人,Tetra.Lett.[四面体快报],22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺法；以及美国专利号4,458,066的固体支持物法。通过PCR向多核苷酸序列引入突变可以如以下文献中所述进行，例如，PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification[PCR技术：DNA扩增的原理和应用],H.A.Erlich(编辑),Freeman Press[弗里曼出版社],纽约州纽约市(NY,NY),1992；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications[PCR方案：方法和应用指南],Innis等人(编辑),Academic Press[学术出版社],加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA),1990；Mattila等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]19:967,1991；以及Eckert等人,PCR Methods and Applications[PCR方法和应用]1:17,1991。
本披露还提供了用于产生本文所述的任何抗CD48抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)的表达载体和宿主细胞。可以使用各种表达载体来表达编码抗CD48抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)的多核苷酸。基于病毒的载体和非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质粒、附加型载体(典型地具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒)以及人类人工染色体(参见例如，Harrington等人,Nat Genet.[自然遗传学]15:345,1997)。例如，可用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达抗CD48多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B和C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B和C(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州圣地亚哥)、MPSV载体和本领域已知用于表达其他蛋白质的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP EB病毒、牛痘病毒载体和塞姆利基森林病毒(Semliki Forestvirus)(SFV)的载体。参见，Brent等人,同上；Smith,Annu.Rev.Microbiol.[微生物学年度评论]49:807,1995；和Rosenfeld等人,Cell[细胞]68:143,1992。
表达载体的选择取决于要表达载体的预期宿主细胞。通常，表达载体含有启动子和其他调节序列(例如增强子)，它们与编码抗CD48抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)的多核苷酸可操作地连接。在一些方面，使用诱导型启动子以防止插入的序列在诱导条件之外的条件下表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。可以在非诱导条件下、而不在偏向宿主细胞更好耐受其表达产物的编码序列的群体的情况下扩大经转化的生物体的培养。除了启动子之外，还可能需要或希望其他调节元件以有效表达抗CD48抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。这些元件典型地包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。此外，通过包含适合于使用中的细胞系统的增强子，可以提高表达效率(参见，例如，Scharf等人,Results Probl.Cell Differ.[细胞分化中的结果和问题]20:125,1994；和Bittner等人,Meth.Enzymol.[酶学方法],153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可以用于增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体还可以提供分泌信号序列位置，以与由插入的抗CD48抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)序列编码的多肽形成融合蛋白。更常见的是，所插入的抗CD48抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)序列在包含在载体中之前与信号序列连接。用于接收编码抗CD48抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)轻链和重链可变结构域的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。此类载体允许将可变区表达为具有恒定区的融合蛋白，从而导致产生完整的抗体或其片段。
用于包含和表达抗CD48抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)链的宿主细胞可以是原核的或真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆并表达本披露的多核苷酸的原核宿主。适合使用的其他微生物宿主包括杆菌(如枯草杆菌)和其他肠杆菌科(如沙门氏菌属、沙雷氏菌属)以及各种假单胞菌属的种。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其典型地含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。此外，将存在任何数目的多种熟知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统、或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子典型地任选使用操纵子序列控制表达，并且具有核糖体结合位点序列等，以用于启动和完成转录和翻译。其他微生物(如酵母)也可用于表达抗CD48抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)多肽。也可以使用与杆状病毒载体组合的昆虫细胞。
在其他方面，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本披露的抗CD48抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)多肽。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如，如实例中所述的骨髓瘤杂交瘤克隆)或携带外源表达载体的哺乳动物细胞系(例如，下文例举的SP2/0骨髓瘤细胞)。这些包括任何正常的必死或正常或异常的永生的动物或人细胞。例如，已经开发出能够分泌完整免疫球蛋白的众多合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。利用哺乳动物组织细胞培养表达多肽一般在例如Winnacker,From Genes to Clones[从基因到克隆],VCHPublishers[VCH出版商],纽约州纽约市,1987中讨论。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可包含表达控制序列，如复制起点、启动子、和增强子(参见，例如，Queen等人,Immunol.Rev.[免疫学评论]89:49-68,1986)，和必要的处理信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点、和转录终止子序列。这些表达载体通常含有源自哺乳动物基因或源自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的、和/或可调控的或可调节的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人CMV立即早期启动子)、组成型CMV启动子、和本领域已知的启动子-增强子组合。
用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可以用于其他细胞宿主(通常参见Sambrook等人，同上)。其他方法包括例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、弹击法、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22的融合物(Elliot和O'Hare,Cell[细胞]88:223,1997)、药剂增强的DNA摄取、和离体转导。对于重组蛋白的长期高产量产生，通常希望稳定的表达。例如，可以使用含有病毒复制起点或内源性表达元件和可选择标记基因的表达载体来制备稳定表达抗CD48抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)链的细胞系。在引入载体之后，可以使细胞在富集培养基中生长1-2天，之后将它们转换至选择性培养基。选择性标记的目的是赋予选择抗性，并且它的存在允许成功表达引入的序列的细胞在选择性培养基中的生长。可以使用适合于细胞类型的组织培养技术来增殖抗性、稳定转染的细胞。
抗体片段，例如抗原结合片段，可通过使用酶如木瓜蛋白酶(用于产生Fab片段)或胃蛋白酶(用于产生Fab’片段)等蛋白水解切割免疫球蛋白分子来产生。与Fab片段相比，Fab'片段也含有铰链区，该铰链区包含在免疫球蛋白分子的两个重链之间形成二硫键的两个天然半胱氨酸。
药物部分(D)
在一个方面，本申请提供了特异性结合人CD48的免疫缀合物。本披露的抗体药物缀合物包含与药物部分，例如诊断剂、抗癌剂、自身免疫治疗剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生生物剂、抗病毒剂或麻醉剂缀合的抗CD48抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等效物。可以使用本领域已知的任何方法，将抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或其功能等效物与若干个相同或不同的药物部分缀合。
在某些实施例中，本披露的免疫缀合物的药物部分选自由以下组成的组：Eg5抑制剂、V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定化剂、澳瑞他汀、多拉司他汀、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、核输出蛋白CRM1抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DHFR抑制剂和促凋亡剂，但不包括BCL-2抑制剂、MCL-1抑制剂和BCL-XL抑制剂。
在一个实施例中，本披露的免疫缀合物的药物部分是类美登素药物部分，例如但不限于DM1、DM3或DM4。
此外，本披露的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等效物可以与调节给定生物学应答的药物部分缀合。药物部分不应该解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所希望生物活性的蛋白质、肽或多肽。此类蛋白质可包括例如毒素，如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、细胞因子、凋亡剂、抗血管生成剂或生物应答调节剂如淋巴因子。
在一个实施例中，本披露的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等效物与药物部分，如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素缀合。细胞毒素的实例包括但不限于吡咯并苯并二氮杂(PBD，参见例如，替西林(tesirine)(描述于Tiberghien等人,ACS Med Chem Lett[ACS医药化学通讯]7(11):983-987(2016))、吲哚啉苯二氮卓二聚体负载(IGN，描述于Singh等人,Mol Pharm[分子药理学]202017(1),50-58))、紫杉烷(参见例如，国际(PCT)专利申请号WO 01/38318和PCT/US03/02675)、DNA-烷基化剂(例如，CC-1065类似物)、蒽环类、微管溶素(tubulysin)类似物、多卡米星(duocarmycin)类似物、澳瑞他汀E(MMAE)、澳瑞他汀F(MMAF)、类美登素和包含反应性聚乙二醇部分的细胞毒性剂(参见例如，Sasse等人,J.Antibiot.[抗生素杂志](东京),53,879-85(2000)；Suzawa等人,Bioorg.Med.Chem.[生物有机医学与化学],8,2175-84(2000)；Ichimura等人,J.Antibiot.[抗生素杂志](东京),44,1045-53(1991)；Francisco等人,Blood[血液学](2003)(电子出版先于印刷出版)；美国专利号5,475,092、6,340,701、6,372,738和6,436,931、美国专利申请公开号2001/0036923A1、等待审批的美国专利申请序列号10/024,290和10/116,053，以及国际(PCT)专利申请号WO 01/49698)、泰素(taxon)、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂还包括例如抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、消融剂(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑(meiphalan)、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素C和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂、蒽环类(例如，柔红霉素(旧称道诺霉素)和多柔比星)、抗生素类(例如更生霉素(旧称放线菌素)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。(参见例如，西雅图遗传学公司(Seattle Genetics)US 20090304721)。
可以与本披露的抗体、抗体片段(抗原结合片段)或功能等效物缀合的细胞毒素的其他实例包括多卡米星、加利车霉素(calicheamicin)、美登素和澳瑞他汀及其衍生物。
各种细胞毒素类型、接头和使治疗剂与抗体缀合的方法的是本领域已知的，参见例如Saito等人,(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.[先进药物递送评论]55:199-215；Trail等人,(2003)Cancer Immunol.Immunother.[癌症免疫学和免疫治疗]52:328-337；Payne,(2003)Cancer Cell[癌细胞]3:207-212；Allen,(2002)Nat.Rev.Cancer[自然综述-癌症]2:750-763；Pastan和Kreitman,(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs[当前研究药物观点],3:1089-1091；Senter和Springer,(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.[高级药物递送审查]53:247-264。
在一个方面，本披露的药物部分是具有式(A)的化合物：
其中：
R1是
R2是H，C1-C6烷基，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
在一个方面，本披露的药物部分是具有式(B)的化合物：
其中：
R1是
R2是H，C1-C6烷基，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
本披露的药物部分的某些方面及实例提供在以下另外列举的实施例列表中。将认识到的是，每个实施例中指定的特征可以与其他指定的特征组合，以提供本披露的另外的实施例。
实施例1.具有式(A)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(A-1)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：
R2是H，C1-C6烷基，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
实施例2.具有式(A)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(A-2)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：
R2是H，C1-C6烷基，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
实施例3.具有式(A)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(A-3)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：
R2是H，C1-C6烷基，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
实施例4.具有式(A)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(A-4)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：
R2是H，C1-C6烷基，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
实施例5.具有式(A)、式(A-1)、式(A-2)、式(A-3)或式(A-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H或C1-C6烷基。
实施例6.具有式(A)、式(A-1)、式(A-2)、式(A-3)或式(A-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H或甲基。
实施例7.具有式(A)、式(A-1)、式(A-2)、式(A-3)或式(A-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H。
实施例8.具有式(A)、式(A-1)、式(A-2)、式(A-3)或式(A-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是甲基。
实施例9.具有式(A)、式(A-1)或式(A-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是
实施例10.具有式(A)、式(A-1)或式(A-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是
实施例11.具有式(A)、式(A-1)或式(A-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是
实施例12.具有式(A)、式(A-1)或式(A-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是
实施例13.具有式(A)、式(A-2)或式(A-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是
实施例14.具有式(A)、式(A-2)或式(A-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是
实施例15.具有式(A)、式(A-2)或式(A-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是
实施例16.具有式(A)、式(A-2)或式(A-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是
实施例17.具有式(B)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(B-1)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：
R2是H，C1-C6烷基，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
实施例18.具有式(B)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(B-2)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：
R2是H，C1-C6烷基，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
实施例19.具有式(B)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(B-3)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：
R2是H，C1-C6烷基，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
实施例20.具有式(B)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(B-4)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：
R2是H，C1-C6烷基，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
实施例21.具有式(B)、式(B-1)、式(B-2)、式(B-3)或式(B-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H或C1-C6烷基。
实施例22.具有式(B)、式(B-1)、式(B-2)、式(B-3)或式(B-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H或甲基。
实施例23.具有式(B)、式(B-1)、式(B-2)、式(B-3)或式(B-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H。
实施例24.具有式(B)、式(B-1)、式(B-2)、式(B-3)或式(B-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是甲基。
实施例25.具有式(B)、式(B-1)或式(B-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是
实施例26.具有式(B)、式(B-1)或式(B-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是
实施例27.具有式(B)、式(B-1)或式(B-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是
实施例28.具有式(B)、式(B-1)或式(B-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是
实施例29.具有式(B)、式(B-2)或式(B-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是
实施例30.具有式(B)、式(B-2)或式(B-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是
实施例31.具有式(B)、式(B-2)或式(B-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是
实施例32.具有式(A)、式(A-2)或式(A-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是
接头
在一个方面，本披露的抗体药物缀合物可以包括接头。如本文所用，“接头”是能够将抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)或功能等效物与另一个部分如药物部分连接的任何化学部分。接头可以在化合物或抗体仍保持活性的条件下易于切割(可切割接头)，例如，酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割。可替代地，接头可以对切割有实质性抗性(例如，稳定接头或不可切割接头)。在一些方面，接头是预先带电荷的接头、亲水性接头或基于二羧酸的接头。
在一个方面，用于本发明中的接头衍生自交联试剂，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(磺基-SMCC)或2,5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七碳-1-酸酯(CX1-1)。
不可切割接头是能够使药物如类美登素与抗体以稳定、共价方式连接的任何化学部分并且不归入上文对可切割接头所列的分类。因此，不可切割接头对酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割有实质性抗性。此外，不可切割是指接头中或毗邻接头的化学键在药物如类美登素或抗体不丧失其活性的条件下经受住酸、光不稳定性切割剂、肽酶、酯酶或切割二硫键的化学或生理学化合物诱导的切割的能力。
酸不稳定性接头是在酸性pH下可切割的接头。例如，某些细胞内区室如核内体和溶酶体具有酸性pH(pH 4-5)并且提供适于切割酸不稳定性接头的条件。
光不稳定性接头是在体表和在光可抵达的许多体腔中可用的接头。此外，红外线可穿透组织。
一些接头可以被肽酶切割，即肽酶可切割接头。仅某些肽易于在细胞内部或外部被切割，参见例如，Trout等人,79Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],626-629(1982)和Umemoto等人43Int.J.Cancer[国际癌症杂志],677-684(1989)。此外，肽由α-氨基酸和肽键组成，这些肽键在化学上是一个氨基酸的羧酸根与第二个氨基酸的氨基基团之间的酰胺键。将其他酰胺键，如赖氨酸的羧酸根与α-氨基基团之间的键不理解为是肽键并且视为不可切割的。
一些接头可以由酯酶切割，即酯酶可切割接头。同样，仅某些酯可以被细胞内部或外部存在的酯酶切割。酯由羧酸和醇的缩合形成。简单酯是用简单醇如脂族醇和小环状醇和小芳族醇产生的酯。
预先带电荷的接头衍生自带电荷交联试剂，这些带电荷交联试剂掺入到抗体药物缀合物中后保持其电荷。预先带电荷的接头的实例可以在US 2009/0274713中找到。
接头-药物部分
在一个方面，本披露的接头-药物部分(LB-(D)n )包含一种或多种共价附接至接头(LB)的细胞毒素，其中该一种或多种细胞毒素独立地选自具有式(A)、式(A-1)、式(A-2)、式(A-3)、式(A-4)、式(B)、式(B-1)、式(B-2)、式(B-3)和式(B-4)的化合物或如实施例9至16中任一项或实施例25至32中任一项所述的化合物。
在一个方面，本文披露的接头-药物部分包含一种或多种共价附接至接头(LB)的细胞毒素，其中该一种或多种细胞毒素独立地选自具有式(A)、式(A-1)、式(A-2)、式(A-3)和式(A-4)的化合物或如实施例7至14中任一项所述的化合物。
在一个方面，本披露的接头-药物部分包含一种或多种共价附接至接头(LB)的细胞毒素，其中该一种或多种细胞毒素独立地选自具有式(B)、式(B-1)、式(B-2)、式(B-3)和式(B-4)的化合物或如实施例23至30中任一项所述的化合物。
在一个方面，本披露的接头-药物部分是具有式(C)的结构的化合物，或其立体异构体或药学上可接受的盐，
其中：
RA是
R2是H，C1-C6烷基，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
R5是-L1R14、-L1R24、-L1R34或-L1R44；
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**或-X2X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**，其中**指示与R14的附接点；
X1是 其中**指示与-NH-或与X2的附接点；
X2是其中**指示与-NH-的附接点；
X3是其中**指示与-NH-的附接点；
X4是 />其中*指示附接点朝向R14、R24、R34或R44；
R14是-N3、-ONH2、-NR6C(＝O)CH＝CH2、SH、-SSR7、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR6S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR6C(＝O)CH2Br、-NR6C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-C(＝O)NHNH2、/>-CO2H、-NH2、/>
R24是
R34是-N3、-ONH2、-NR7C(＝O)CH＝CH2、-C(＝O)NHNH2、-CO2H、-NH2、
R44是-NR7C(＝O)CH2R8；
每个R6独立地选自H和C1-C6烷基；
R7是2-吡啶基或4-吡啶基；
R8是-S(CH2)nCHR9NH2；
R9是-C(＝O)OR7；
每个R10独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、和-OH；
每个R11独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R12独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个p独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
本文披露的接头-药物部分的某些方面及实例提供在以下另外列举的实施例列表中。将认识到的是，每个实施例中指定的特征可以与其他指定的特征组合，以提供本披露的另外的实施例。
实施例33.具有式(C)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(C-1)的结构或其药学上可接受的盐：
/>
其中：R2和R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例34.具有式(C)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(C-2)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R2和R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例35.具有式(C)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(C-3)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R2和R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例36.具有式(C)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(C-4)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R2和R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例37.具有式(C)、式(C-1)、式(C-2)、式(C-3)或式(C-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H或C1-C6烷基。
实施例38.具有式(C)、式(C-1)、式(C-2)、式(C-3)或式(C-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H或甲基。
实施例39.具有式(C)、式(C-1)、式(C-2)、式(C-3)或式(C-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H。
实施例40.具有式(C)、式(C-1)、式(C-2)、式(C-3)或式(C-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是甲基。
实施例41.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(C-5)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例42具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(C-6)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例43.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(C-7)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例44.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(C-8)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例45.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(C-9)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例46.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(C-10)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例47.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(C-11)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例48.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(C-12)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R5如上文对于具有式(C)的化合物所定义的。
实施例49.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)或如实施例37所述的化合物，其中所述化合物是
实施例50.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)或如实施例37所述的化合物，其中所述化合物是
实施例51.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)或如实施例38所述的化合物，其中所述化合物是
实施例52.具有式(C)、式(C-1)或式(C-3)或如实施例38所述的化合物，其中所述化合物是
在一个方面，所述接头-药物部分是具有式(C)的结构的化合物，或其立体异构体或药学上可接受的盐，
其中：
RA是
R2是H，C1-C6烷基，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
R5是-L1R14、-L1R24、-L1R34或-L1R44；
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**或-X2X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**，其中**指示与R14的附接点；
X1是 其中**指示与-NH-或与X2的附接点；
X2是其中**指示与-NH-的附接点；
X3是其中**指示与-NH-的附接点；
X4是 />其中*指示附接点朝向R14、R24、R34或R44；
R14是-N3、-ONH2、-NR6C(＝O)CH＝CH2、SH、-SSR7、-S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR6S(＝O)2(CH＝CH2)、-NR6C(＝O)CH2Br、-NR6C(＝O)CH2I、-NHC(＝O)CH2Br、-NHC(＝O)CH2I、-C(＝O)NHNH2、/>-CO2H、-NH2、/> />
R24是
R34是-N3、-ONH2、-NR7C(＝O)CH＝CH2、-C(＝O)NHNH2、-CO2H、-NH2、
R44是-NR7C(＝O)CH2R8；
每个R6独立地选自H和C1-C6烷基；
R7是2-吡啶基或4-吡啶基；
R8是-S(CH2)nCHR9NH2；
R9是-C(＝O)OR7；
每个R10独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、和-OH；
每个R11独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R12独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个p独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
所述接头-药物部分的某些方面及实例提供在以下另外列举的实施例列表中。将认识到的是，每个实施例中指定的特征可以与其他指定的特征组合，以提供本披露的另外的实施例。
实施例53.具有式(D)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(D-1)的结构或其药学上可接受的盐：
/>
其中：R2和R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例54.具有式(D)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(D-2)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R2和R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例55.具有式(D)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(D-3)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R2和R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例56.具有式(D)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(D-4)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R2和R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例57.具有式(D)、式(D-1)、式(D-2)、式(D-3)或式(D-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H或C1-C6烷基。
实施例58.具有式(D)、式(D-1)、式(D-2)、式(D-3)或式(D-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H或甲基。
实施例59.具有式(D)、式(D-1)、式(D-2)、式(D-3)或式(D-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是H。
实施例60.具有式(D)、式(D-1)、式(D-2)、式(D-3)或式(D-4)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R2是甲基。
实施例61.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(D-5)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例62.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(D-6)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例63.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(D-7)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例64.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(D-8)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例65.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(D-9)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例66.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(D-10)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例67.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(D-11)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例68.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式(D-12)的结构或其药学上可接受的盐：
其中：R5如上文对于具有式(D)的化合物所定义的。
实施例69.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)或如实施例61所述的化合物，其中所述化合物是
实施例70.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)或如实施例61所述的化合物，其中所述化合物是
实施例71.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)或如实施例62所述的化合物，其中所述化合物是
实施例72.具有式(D)、式(D-1)或式(D-3)或如实施例62所述的化合物，其中所述化合物是
在一个方面，本披露的接头-药物部分包含缬氨酸-瓜氨酸MMAE(valcit-MMAE)：
抗体药物缀合物
本披露提供了抗体药物缀合物，其中特异性结合CD48的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)(例如，抗原结合片段)任选地通过接头与药物部分(例如，细胞毒性剂)连接。在一个方面，抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)(例如，抗原结合片段)通过接头经由共价附接与药物部分(其是细胞毒性剂)连接。
在一些实施例中，本文提供了缀合物，这些缀合物包含任选地通过接头与药物部分(例如，细胞毒性剂)连接的特异性结合CD48的抗体片段(例如，抗原结合片段)(例如，抗原结合片段)。
在一个方面，本披露提供了具有式(I)的缀合物：
A-(LB-(D)n)y(I)；
其中：
A是特异性结合人CD48的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)；
LB是接头；
D是细胞毒性剂；
n是从1至10的整数，并且
y是从1至10的整数，
其中接头-药物部分(LB-(D)n)共价附接至抗体或抗体片段(A)。
在一个方面，本披露涉及具有式(II)的缀合物：
A1是特异性结合人CD48的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)；
A2是特异性结合人CD48的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)；
LB是接头；
D是细胞毒性剂，并且
n是从1至10的整数，
其中接头-药物部分(LB-(D)n)共价偶联抗体或抗体片段A1和A2。
在一个方面，本文披露的缀合物包含一种或多种共价附接至接头(LB)的细胞毒素，其中该一种或多种细胞毒素独立地选自具有式(A)、式(A-1)、式(A-2)、式(A-3)、式(A-4)、式(B)、式(B-1)、式(B-2)、式(B-3)和式(B-4)的化合物或如实施例7至14中任一项或如实施例23至30中任一项所述的化合物。
在一个方面，本披露的缀合物包含一种或多种共价附接至接头(LB)的细胞毒素，其中该一种或多种细胞毒素独立地选自具有式(A)、式(A-1)、式(A-2)、式(A-3)和式(A-4)的化合物或如实施例7至14中任一项所述的化合物。
在一个方面，本披露的缀合物包含一种或多种共价附接至接头(LB)的细胞毒素，其中该一种或多种细胞毒素独立地选自具有式(B)、式(B-1)、式(B-2)、式(B-3)和式(B-4)的化合物或如实施例23至30中任一项所述的化合物。
在具有式(I)的缀合物中，一个或多个接头-药物部分(LB-(D)n)可以与抗体或抗体片段A(例如，抗原结合片段)共价附接，从而通过接头LB将一个或多个药物部分D与抗体或抗体片段A(例如，抗原结合片段)共价附接。LB是能够将抗体或抗体片段A(例如，抗原结合片段)与一个或多个药物部分D连接的任何化学部分。可以使用具有一个或多个相同或不同的反应性官能团的双功能或多功能接头试剂形成具有式(I)的缀合物，其中一个或多个药物部分D共价连接至抗体或抗体片段A(例如，抗原结合片段)。双功能或多功能接头试剂的反应性官能团之一用于与抗体或抗体片段A上的基团例如硫醇或胺(例如半胱氨酸、N末端或氨基酸侧链如赖氨酸)反应以与LB接头的一端形成共价键。双功能或多功能接头试剂的此类反应性官能团包括但不限于马来酰亚胺、硫醇和NHS酯。双功能或多功能接头试剂的一个或多个其他反应性官能团用于将一个或多个药物部分D共价附接至接头LB。
在具有式(II)的缀合物中，通过抗体或抗体片段A1和A2上的侧接硫醇(pendentthiol)与1,3-二卤代丙酮(如1,3-二氯丙酮、1,3-二溴丙酮、1,3-二碘丙酮)和1,3-二羟基丙酮的二磺酸酯的反应形成酮桥，该酮桥从而共价偶联抗体或抗体片段A1和A2。该酮桥部分用于通过接头LB将一个或多个药物部分D共价附接至抗体或抗体片段A1和A2。LB是能够将抗体或抗体片段A1和A2与一个或多个药物部分D连接的任何化学部分。可以使用具有一个或多个相同或不同的反应性官能团的双功能或多功能接头试剂形成具有式(II)的缀合物，其中一个或多个药物部分D共价连接至抗体或抗体片段A1和A2。在一个实施例中，双功能或多功能接头试剂的一个反应性官能团是烷氧基胺，该烷氧基胺用于与酮桥反应以与接头LB的一端形成肟键，并且双功能或多功能接头试剂的一个或多个其他反应性官能团用于将一个或多个药物部分D共价附接至接头LB。在另一个实施例中，双功能或多功能接头试剂的一个反应性官能团是肼，该肼用于与酮桥反应以与接头LB的一端形成腙键，并且双功能或多功能接头试剂的一个或多个其他反应性官能团用于将一个或多个药物部分D共价附接至接头LB。
在一个方面，LB是可切割接头。在另一个方面，LB是不可切割接头。在一些方面，LB是酸不稳定接头、光不稳定接头、肽酶可切割接头、酯酶可切割接头、糖苷酶可切割接头、磷酸二酯酶可切割接头、二硫键可还原接头、亲水接头、或基于二羧酸的接头。
虽然对于特定缀合物分子而言，药物对抗体比率具有确切的整数值(例如，在式(I)中为n和y的乘积并且在式(II)中为“n”)，但是应理解当用来描述含有许多分子的样品时，该值将经常是平均值，这归因于典型地与缀合步骤相关的某种程度的非均匀性。缀合物样品的平均负载在本文中称为药物与抗体(或抗体片段)的比率，或“DAR”。在一些方面，DAR在约1与约5之间，并且典型地是约1、2、3或4。在一些方面，按重量计至少50％的样品是具有平均DAR加或减2的化合物，并且优选地至少50％的样品是含有平均DAR加或减1的缀合物。其他方面包括其中DAR是约2的缀合物。在一些方面，“约y”的DAR意指DAR的测量值在式(I)中n和y的乘积的20％内。在一些方面，“约n”的DAR意指DAR的测量值在式(II)中n的20％内。
在一个方面，在具有式(I)的缀合物中药物与抗体或抗体片段的平均摩尔比(即，n和y的乘积(也称为药物与抗体的比率(DAR))的平均值)是约1至约10、约1至约6(例如，0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0)、约1至约5、约1.5至约4.5、或约2至约4。
在一个方面，在具有式(II)的缀合物中药物与抗体或抗体片段A1和A2的平均摩尔比(即，n(也称为药物与抗体比率(DAR))的平均值)是约1至约10、约1至约6(例如，0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0)、约1至约5、约1.5至约4.5或约2至约4。
在由本披露提供的一个方面，缀合物具有实质上高的纯度并且具有以下特征中的一个或多个：(a)大于约90％(例如大于或等于约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)、优选大于约95％的缀合物种类是单体的，(b)缀合物制剂中的未缀合的接头水平小于约10％(例如小于或等于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或0％)(相对于总接头)，(c)小于10％的缀合物种类是交联的(例如小于或等于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或0％)，(d)缀合物制剂中的游离药物(例如澳瑞他汀、鹅膏蕈碱、类美登素或皂草素)水平小于约2％(例如小于或等于约1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、或0％)(相对于总细胞毒性剂的mol/mol)。
在一个方面，本文披露的缀合物具有式(E)的结构：
其中：
A代表特异性结合人CD48的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)；
y是从1至10的整数；
R2是H，C1-C6alkyl，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**或-X2X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**，其中**指示与R114的附接点；
X1是 其中**指示与-NH-或与X2的附接点；/>
X2是其中**指示与-NH-的附接点；
X3是其中**指示与-NH-的附接点；
X4是 其中*指示附接点朝向R114；
R114是-NR6C(＝O)CH2-*、-NHC(＝O)CH2-*、-S(＝O)2CH2CH2-*、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6C(＝O)CH2CH2-*、-NH-、-C(＝O)-、-NHC(＝O)-*、-CH2NHCH2CH2-*、-NHCH2CH2-*、-S-、/> 其中*指示与A的附接点；
每个R6独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R10独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、和-OH；
每个R11独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R12独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
每个R15独立地选自H、-CH3和苯基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个p独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
在一个方面，本披露的缀合物具有式(F)的结构：
其中：
A代表特异性结合人CD48的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)；
y是从1至10的整数；
R2是H，C1-C6alkyl，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**或-X2X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**，其中**指示与R114的附接点；
X1是 其中**指示与-NH-或与X2的附接点；
X2是其中**指示与-NH-的附接点；/>
X3是其中**指示与-NH-的附接点；
X4是 其中*指示附接点朝向R114；
R114是-NR6C(＝O)CH2-*、-NHC(＝O)CH2-*、-S(＝O)2CH2CH2-*、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6C(＝O)CH2CH2-*、-NH-、-C(＝O)-、-NHC(＝O)-*、-CH2NHCH2CH2-*、-NHCH2CH2-*、-S-、/> 其中*指示与A的附接点；
每个R6独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R10独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、和-OH；
每个R11独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R12独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
每个R15独立地选自H、-CH3和苯基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个p独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
在一个方面，本披露的缀合物具有式(G)的结构：
其中：
A代表特异性结合人CD48的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)；
y是从1至10的整数；
R2是H，C1-C6alkyl，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**或-X2X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**，其中**指示与R114的附接点；
X1是 其中**指示与-NH-或与X2的附接点；
X2是其中**指示与-NH-的附接点；/>
X3是其中**指示与-NH-的附接点；
X4是 其中*指示附接点朝向R114；
R114是-NR6C(＝O)CH2-*、-NHC(＝O)CH2-*、-S(＝O)2CH2CH2-*、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6C(＝O)CH2CH2-*、-NH-、-C(＝O)-、-NHC(＝O)-*、-CH2NHCH2CH2-*、-NHCH2CH2-*、-S-、/> 其中*指示与A的附接点；
每个R6独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R10独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、和-OH；
每个R11独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R12独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
每个R15独立地选自H、-CH3和苯基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个p独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
在一个方面，本披露的缀合物具有式(H)的结构：
其中：
A代表特异性结合人CD48的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)；
y是从1至10的整数；
R2是H，C1-C6alkyl，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**或-X2X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**，其中**指示与R114的附接点；
X1是
其中**指示与-NH-或与X2的附接点；
X2是其中**指示与-NH-的附接点；/>
X3是其中**指示与-NH-的附接点；
X4是 其中*指示附接点朝向R114；
R114是-NR6C(＝O)CH2-*、-NHC(＝O)CH2-*、-S(＝O)2CH2CH2-*、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6C(＝O)CH2CH2-*、-NH-、-C(＝O)-、-NHC(＝O)-*、-CH2NHCH2CH2-*、-NHCH2CH2-*、-S-、/> 其中*指示与A的附接点；
每个R6独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R10独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、和-OH；
每个R11独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R12独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
每个R15独立地选自H、-CH3和苯基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个p独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
缀合物的某些方面及实例提供在以下另外列举的实施例列表中。将认识到的是，每个实施例中指定的特征可以与其他指定的特征组合，以提供本披露的另外的实施例。
实施例73.具有式(E)的结构的缀合物是具有式(E-1)的结构的缀合物：
其中：R2、R114、A、y和L1是如以上对于具有式(E)的缀合物所定义的。
实施例74.具有式(F)的结构的缀合物是具有式(F-1)的结构的缀合物：
其中：R2、R114、A、y和L1是如以上对于具有式(F)的缀合物所定义的。
实施例75.具有式(G)的结构的缀合物是具有式(G-1)的结构的缀合物：
其中：R2、R114、A、y和L1是如以上对于具有式(G)的缀合物所定义的。
实施例76.具有式(H)的结构的缀合物是具有式(H-1)的结构的缀合物：
其中：R2、R114、A、y和L1是如以上对于具有式(H)的缀合物所定义的。
实施例77.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)或如实施例69至72中任一项所述的缀合物，其中R2是H或C1-C6烷基。
实施例78.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)或如实施例69至72中任一项所述的缀合物，其中R2是H或甲基。
实施例79.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)或如实施例69至72中任一项所述的缀合物，其中R2是H。
实施例80.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)或如实施例69至72中任一项所述的缀合物，其中R2是甲基。
实施例81.具有式(E)的结构的缀合物是具有式(E-2)的结构的缀合物：
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(E)的缀合物所定义的。
实施例82.具有式(E)的结构的缀合物是具有式(E-3)的结构的缀合物：
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(E)的缀合物所定义的。
实施例83.具有式(E)或式(E-1)的结构的缀合物是具有式(E-4)的结构的缀合物：
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(E)的缀合物所定义的。
实施例84.具有式(E)或式(E-1)的结构的缀合物是具有式(E-5)的结构的缀合物：
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(E)的缀合物所定义的。
实施例85.具有式(F)的结构的缀合物是具有式(F-2)的结构的缀合物：
/>
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(F)的缀合物所定义的。
实施例86.具有式(F)的结构的缀合物是具有式(F-3)的结构的缀合物：
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(F)的缀合物所定义的。
实施例87.具有式(F)或式(F-1)的结构的缀合物是具有式(F-4)的结构的缀合物：
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(F)的缀合物所定义的。
实施例88.具有式(F)或式(F-1)的结构的缀合物是具有式(F-5)的结构的缀合物：
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(F)的缀合物所定义的。
实施例89.具有式(G)的结构的缀合物是具有式(G-2)的结构的缀合物：
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(G)的缀合物所定义的。
实施例90.具有式(G)的结构的缀合物是具有式(G-3)的结构的缀合物：
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(G)的缀合物所定义的。
实施例91.具有式(G)或式(G-1)的结构的缀合物是具有式(G-4)的结构的缀合物：
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(G)的缀合物所定义的。
实施例92.具有式(G)或式(G-1)的结构的缀合物是具有式(G-5)的结构的缀合物：
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(G)的缀合物所定义的。
实施例93.具有式(H)的结构的缀合物是具有式(H-2)的结构的缀合物：
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(H)的缀合物所定义的。
实施例94.具有式(H)的结构的缀合物是具有式(H-3)的结构的缀合物：
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(H)的缀合物所定义的。
实施例95.具有式(H)或式(H-1)的结构的缀合物是具有式(H-4)的结构的缀合物：
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(H)的缀合物所定义的。
实施例96.具有式(H)或式(H-1)的结构的缀合物是具有式(H-5)的结构的缀合物：
其中：R114、A、y和L1是如以上对于具有式(H)的缀合物所定义的。
实施例97.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至96中任一项所述的缀合物，其中：
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**或-X1C(＝O)(CH2)m-**，其中**指示与R114的附接点；
并且
X1是
其中**指示与-NH-或与X2的附接点。
实施例98.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至96中任一项所述的缀合物，其中：
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**，其中**指示与R114的附接点；
并且
X1是
其中**指示与-NH-或与X2的附接点。
实施例99.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至98中任一项所述的缀合物，每个m独立地选自1、2、3、4、5和6。
实施例100.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至98中任一项所述的缀合物，每个m独立地选自1、2、3、4和5。
实施例101.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至98中任一项所述的缀合物，每个m独立地选自1、2、3和4。
实施例102.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至98中任一项所述的缀合物，每个m独立地选自1、2和3。
实施例103.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至98中任一项所述的缀合物，每个m独立地选自1和2。
实施例104.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至103中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。
实施例105.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至103中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11。
实施例106.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至103中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
实施例107.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至103中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。
实施例108.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至103中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2、3、4、5、6、7和8。
实施例109.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至103中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2、3、4、5、6和7。
实施例110.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至103中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2、3、4、5和6。
实施例111.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至103中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2、3、4和5。
实施例112.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至103中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2、3和4。
实施例113.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至103中任一项所述的缀合物，每个n独立地选自1、2和3。在上述实施例中的每一项中，每个n独立地选自1和2。
实施例114.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至113中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。
实施例115.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至113中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11。
实施例116.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至113中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
实施例117.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至113中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8和9。
实施例118.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至113中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2、3、4、5、6、7和8。
实施例119.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至113中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2、3、4、5、6和7。
实施例120.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至113中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2、3、4、5和6。
实施例121.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至113中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2、3、4和5。
实施例122.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至113中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2、3和4。
实施例123.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至113中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1、2和3。
实施例124.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至113中任一项所述的缀合物，每个y独立地选自1和2。
实施例125.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至124中任一项所述的缀合物，其中：
L1是其中**指示与-NH-或与X2的附接点。
实施例126.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至124中任一项所述的缀合物，其中：
L1是其中**指示与-NH-或与X2的附接点。
实施例127.具有式(E)、式(F)、式(G)、式(H)的缀合物或如实施例73至126中任一项所述的缀合物，其中：
R114是其中*指示与A的附接点。
实施例128.具有式(E)、式(E-1)、式(E-2)和式(E-4)的缀合物，所述缀合物选自：
其中y和A是如以上对于具有式(E)的缀合物所定义的。
实施例129.具有式(E)、式(E-1)、式(E-3)和式(E-5)的缀合物，所述缀合物选自：
其中y和A是如以上对于具有式(E)的缀合物所定义的。
实施例130.具有式(F)、式(F-1)、式(F-2)和式(F-4)的缀合物，所述缀合物选自：
其中y和A是如以上对于具有式(F)的缀合物所定义的。
实施例131.具有式(F)、式(F-1)、式(F-3)和式(F-5)的缀合物，所述缀合物选自：
其中y和A是如以上对于具有式(F)的缀合物所定义的。
实施例132.具有式(G)、式(G-1)、式(G-2)和式(G-4)的缀合物，所述缀合物选自：
/>
其中y和A是如以上对于具有式(G)的缀合物所定义的。
实施例133.具有式(G)、式(G-1)、式(G-3)和式(G-5)的缀合物，所述缀合物选自：
其中y和A是如以上对于具有式(G)的缀合物所定义的。
实施例134.具有式(H)、式(H-1)、式(H-2)和式(H-4)的缀合物，所述缀合物选自：
其中y和A是如以上对于具有式(H)的缀合物所定义的。
实施例135.具有式(H)、式(H-1)、式(H-3)和式(H-5)的缀合物，所述缀合物选自：
/>
其中y和A是如以上对于具有式(H)的缀合物所定义的。
实施例136.所述缀合物选自：
实施例137.所述缀合物选自：
本文披露的具有任一种式(如式(A)、式(B)、式(C)、式(D)、式(E)、式(F)、式(G)和式(H))的化合物可以使用在以下实例中所述的方法产生。以下实例旨在说明本发明，而不应被解释为对其的限制。温度以摄氏度给出。如果没有另外提及，则所有蒸发都在减压下进行，典型地在约15mm Hg与100mm Hg(＝20-133毫巴)之间进行。最终产物、中间体和起始材料的结构通过标准分析方法(例如，微量分析和光谱表征(例如，MS、IR、NMR))确认。所使用的缩写是本领域常规的缩写。
缩写：
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用于合成本披露的化合物的所有起始材料、结构单元、试剂、酸、碱、脱水剂、溶剂、和催化剂是可商购的或者可以通过本领域的普通技术人员已知的有机合成方法生产或可以通过如本文所述的有机合成方法生产。
中间体的合成
(S)-(3-(2-氨基-3-羟丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(i-1)的合成
步骤1：在0℃下在搅拌下将在THF中的BH3(1M，10ml)添加至在THF(10ml)中的(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-(3-硝基苯基)丙酸(562mg，1.81mmol)中。然后，将反应在50℃下搅拌1h。将反应混合物在0℃下冷却，用水淬灭，用EtOAc稀释并且用10％K2CO3水溶液洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。将粗制物通过硅胶柱(30％-70％EtOAc-己烷)纯化，获得呈白色固体的(S)-(1-羟基-3-(3-硝基苯基)丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 319.1(M+Na)。保留时间1.183分钟。1HNMR(600MHz,氯仿-d)δ8.13-8.04(m,2H),7.57(d,J＝7.7Hz,1H),7.46(dd,J＝8.9,7.6Hz,1H),4.76(s,1H),3.87(dq,J＝8.0,4.6,4.1Hz,1H),3.69(dd,J＝10.9,3.9Hz,1H),3.58(dd,J＝10.8,4.7Hz,1H),2.97(td,J＝13.1,12.5,7.3Hz,2H),1.37(s,9H)。
步骤2：向在乙腈(5ml)中的(S)-(1-羟基-3-(3-硝基苯基)丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯(0.31g，1.0mmol)中添加10％盐酸(5ml)。将反应混合物在室温下搅拌48h，然后浓缩，得到作为HCl盐的(S)-2-氨基-3-(3-硝基苯基)丙-1-醇。MS m/z 197.2(M+H)。保留时间0.775分钟。
步骤3：将(S)-2-氨基-3-(3-硝基苯基)丙-1-醇HCl盐(0.243g，1.046mmol)溶解于MeOH(10ml)中并且添加10％钯碳(50mg，0.047mmol)。附接2L氢气球。将反应用H2吹扫三次，然后在室温下搅拌1h。LCMS指示反应完成。将反应通过硅藻土垫过滤并且浓缩，得到作为HCl盐的(S)-2-氨基-3-(3-氨基苯基)丙-1-醇。MS m/z 167.2(M+H)。保留时间0.373分钟。
步骤4：将(S)-2-氨基-3-(3-氨基苯基)丙-1-醇HCl盐(0.212g，1.046mmol)和Boc2O(228mg，1.05mmol)和二噁烷-水-AcOH(10:9:1，20ml)合并并且在室温下搅拌3天。LCMS指示反应完成75％。添加另外的Boc2O(150mg)并且将反应再搅拌6h。然后将反应混合物浓缩并且用制备型HPLC(具有0.05％TFA的10％-40％乙腈水溶液)纯化，得到呈油状物的(S)-(3-(2-氨基-3-羟丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(i-1)。MS m/z 267.2(M+H)。保留时间1.011分钟。
(3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸(i-2)的合成
步骤1：将Dil-OtBu HCl盐(：388mg，0.982mmol)、(1R,3S,4S)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酸(/>287mg，1.19mmol)、HATU(411mg，1.08mmol)和DIEA(0.42ml，2.38mmol)和DMF(5ml)合并并且在室温下搅拌30分钟。将反应混合物用水(10ml)稀释并且通过RP-C18 ISCO纯化，得到(1R,3S,4S)-3-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-(叔丁氧基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酰基)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯MS(m+1)＝582.5，HPLC峰值RT＝1.542分钟/>
步骤2：将步骤1中获得的产物(540mg，0.93mmol)在4M HCl的1.4-二噁烷溶液(10ml)中在室温下搅拌过夜。将反应混合物浓缩，得到(3R,4S,5S)-4-((S)-2-((1R,3S,4S)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸，MS(m+1)＝426.2，HPLC峰值RT＝0.736分钟
步骤3：将步骤2中获得的产物(430mg，0.93mmol)、37％甲醛溶液(0.38ml，4.7mmol)、乙酸(0.27ml，4.65mmol)、NaBH3CN(585mg，9.31mmol)和MeOH(10ml)合并并且在室温下搅拌30分钟然后浓缩。将残余物通过RP-C18 ISCO纯化，得到450mg作为TFA盐的(3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸(i-2)。将TFA盐用10ml 12N HCl溶液处理并且浓缩两次，得到(3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸HCl盐。MS(m+1)＝440.2，HPLC峰值RT＝0.754分钟。
Dap-OMe的合成：((2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酸甲酯)(i-3)
步骤1：将Boc-Dap-OH(3.11g，10.8mmol)、K2CO3(2.99g，21.6mmol)、碘甲烷(2.95g)和丙酮(55mL)合并。将反应在20℃下搅拌2h。将另外的甲基碘(2.28g)添加至反应中并且将反应在40℃下搅拌3h。将反应混合物浓缩。将残余物在200mLEtOAc与100mL H2O之间分配。将有机层分离，用50mL饱和的NaCl水溶液洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩，提供呈黄色油状物的Boc-Dap-OMe，/>MS(ESI+)m/z计算值324.2，实测值324.2(M+23)。保留时间1.245分钟。
步骤2：将Boc-Dap-OMe(3.107g，10.3mmol)与HCl的乙醚溶液(2M，10mL)合并并且浓缩。重复该操作。在第7次处理后反应完成。在浓缩之后获得呈白色固体的Dap-OMe(i-3)的HCl盐。MS(ESI+)m/z计算值202.1，实测值202.2(M+1)。保留时间0.486分钟。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.065-4.041(m,1H),3.732(br.s,1H),3.706(s,3H),3.615(s,3H),3.368(br.s,1H),3.314(br.s,1H),2.795(q,1H,J＝6.8Hz),2.085-1.900(m,4H),1.287(d,3H,J＝7.2Hz)。
(S)-(3-(2-氨基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(i-4)的合成
步骤1：在室温下向2-(3-硝基苯基)乙酸(3g，16.56mmol)在DMF(无水，17ml)的溶液中添加HATU(6.93g，18.22mmol)、N,O-二甲基羟基胺盐酸盐(1.615g，16.56mmol)和DIPEA(14.46ml，83mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在高真空下浓缩以去除大部分溶剂。然后将残余物在DCM与水之间萃取。将水相用DCM萃取2次。将合并的DCM相在真空下浓缩。将残余物通过硅胶快速柱(EtOAc/庚烷0％-70％，然后70％)分离，获得3.5g呈白色固体的N-甲氧基-N-甲基-2-(3-硝基苯基)乙酰胺。MS m/z 225.1(M+1)。保留时间1.09分钟。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.28-8.09(m,2H),7.67(m,1H),7.63-7.46(m,1H),3.90(s,2H),3.74(s,3H),3.24(s,3H)。
步骤2：在N2气氛下在-78℃(丙酮-干冰浴)下向TMEDA(2.63mL，17.39mmol)在THF(无水，30ml)中的溶液中逐滴添加正丁基锂(2.5M，在己烷中)(1.028g，16.06mmol)。然后还在-78℃下，将2-溴噻唑(2.63g，16.06mmol)逐滴添加至反应混合物中。将反应混合物在-78℃下搅拌1h。在-78℃下，将N-甲氧基-N-甲基-2-(3-硝基苯基)乙酰胺(3g，13.38mmol)在THF(30ml)中的混合物逐滴添加至反应混合物中。将反应混合物在-78℃下搅拌1h，然后在-10℃(丙酮-冰浴)下搅拌2h。将反应混合物通过添加饱和KHSO4水溶液淬灭，然后用EtOAc萃取3次。将合并的EtOAc相经饱和NaCl、NaSO4干燥，并且浓缩。将残余物通过硅胶快速柱(EtOAc/庚烷0％-30％，然后30％)分离，获得1.95g呈浅黄色油状物的2-(3-硝基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙-1-酮。MS m/z 249.0(M+1)。保留时间1.34分钟。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.33-8.22(m,1H),8.17(ddd,J＝8.1,2.3,1.0Hz,1H),8.10(d,J＝3.0Hz,1H),7.79-7.67(m,2H),7.54(t,J＝7.9Hz,1H),4.62(s,2H)。
步骤3：在N2气氛下在0℃(冰水浴)下向(+)-DIP-氯化物TM(9.22g，28.8mmol)在二乙醚(7ml)中的溶液中逐滴添加2-(3-硝基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙-1-酮(2.38g，9.59mmol)在乙醚(37ml)中的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌24h。然后在10℃下在水-冰浴中将混合物用10％NaOH和30％H2O2的30ml(1:1)混合物中和。将混合物在室温下搅拌1h。然后将混合物用水稀释，用EtOAc萃取3次。将合并的EtOAc相用饱和K2CO3、饱和NaCl洗涤，并经NaSO4干燥，并且浓缩。将残余物通过硅胶快速柱(EtOAc/庚烷0％-60％，然后60％)分离，获得1.639g呈浅黄色固体的(R)-2-(3-硝基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙-1-醇。MS m/z 251.1(M+1)。保留时间1.09分钟。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.33-8.07(m,2H),8.07-7.80(m,1H),7.74-7.55(m,1H),7.55-7.36(m,2H),5.55(dd,J＝7.9,4.1Hz,1H),4.48(s,1H),3.53(dd,J＝13.9,4.0Hz,1H),3.32(dd,J＝13.9,8.1Hz,1H)。92％e.e.，通过手性SFC确定的。
步骤4：向(R)-2-(3-硝基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙-1-醇(1.636g，6.54mmol)在MeOH(20ml)中的溶液中添加Pd/C(10％，0.696g，0.654mmol)。在三次真空/H2循环后，向反应混合物中通入H2(1atm)，并且将反应混合物在室温下搅拌。在过夜搅拌后，将反应混合物通过硅藻土过滤并且用MeOH洗涤。将滤液在真空下浓缩，获得1.3g呈固体的(R)-2-(3-氨基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙-1-醇，将该固体不经进一步纯化而直接用于下一个步骤。MS m/z221.1(M+1)。保留时间0.50分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.72(d,J＝3.2Hz,1H),7.59(d,J＝3.2Hz,1H),6.88(t,J＝7.7Hz,1H),6.46(t,J＝1.9Hz,1H),6.42-6.29(m,2H),6.14(d,J＝5.7Hz,1H),5.03-4.78(m,3H),3.03(dd,J＝13.7,4.0Hz,1H),2.72(dd,J＝13.7,8.7Hz,1H)。
步骤5：向(R)-2-(3-氨基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙-1-醇(1.3g，5.92mmol)在二噁烷/水(1/1，16ml/16ml)中的混合物中添加Boc2O(1.512ml，6.51mmol)和NaOH(0.284g，7.10mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。向反应混合物中添加10ml水，然后用EtOAc(3*40ml)萃取。将有机相合并，经Na2SO4干燥，然后在真空下浓缩。然后将残余物通过硅胶快速柱(EtOAc/庚烷0％至80％，然后80％)分离，获得1.24g呈固体的(R)-(3-(2-羟基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 321.3(M+1)。保留时间1.26分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.24(s,1H),7.73(d,J＝3.2Hz,1H),7.60(d,J＝3.3Hz,1H),7.39(t,J＝1.8Hz,1H),7.25(ddd,J＝8.2,2.3,1.1Hz,1H),7.11(t,J＝7.8Hz,1H),6.80(dt,J＝7.7,1.2Hz,1H),6.20(d,J＝5.7Hz,1H),4.97(ddd,J＝8.6,5.7,4.0Hz,1H),3.13(dd,J＝13.7,4.0Hz,1H),2.83(dd,J＝13.7,8.7Hz,1H),1.47(s,9H)。
步骤6：在N2气氛下向(R)-(3-(2-羟基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(1.2g，3.75mmol)在THF(无水，25ml)中的冰-水浴冷却的溶液中添加PPh3(1.670g，6.37mmol)。然后在0℃下逐滴添加DEAD(40％wt，在甲苯中)(2.90ml，6.37mmol)，之后逐滴添加DPPA(1.372ml，6.37mmol)。然后去除冷却浴，将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在真空下浓缩，然后进行快速硅胶柱分离(EtOAc/庚烷0％至30％，然后30％)，获得1.03g呈油状物的(S)-(3-(2-叠氮基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z346.3(M+1)。保留时间1.55分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.29(s,1H),7.86(d,J＝3.2Hz,1H),7.76(d,J＝3.2Hz,1H),7.41(t,J＝1.9Hz,1H),7.29(ddd,J＝8.3,2.2,1.1Hz,1H),7.16(t,J＝7.8Hz,1H),6.86(dt,J＝7.9,1.2Hz,1H),5.31(dd,J＝8.7,5.7Hz,1H),3.17(d,J＝5.3Hz,1H),3.09(dd,J＝13.9,8.7Hz,1H),1.47(s,9H)。
步骤7：向(S)-(3-(2-叠氮基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(861mg，2.493mmol)在MeOH(4ml)中的溶液中添加Pd/C(10％湿的，265mg，0.249mmol)。在三次真空/H2循环后，向反应混合物中通入H2(1atm)，并且将反应混合物在室温下搅拌。在过夜搅拌后，将反应混合物浓缩然后通过硅藻土过滤并且用MeOH洗涤。将滤液在真空下浓缩，获得781mg呈粘性油状物的(S)-(3-(2-氨基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(i-4)。MS m/z 320.2(M+1)。保留时间0.91分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.26(s,1H),7.71(d,J＝3.3Hz,1H),7.55(d,J＝3.3Hz,1H),7.36(t,J＝1.9Hz,1H),7.26(dt,J＝8.3,1.5Hz,1H),7.13(t,J＝7.8Hz,1H),6.78(dt,J＝7.6,1.3Hz,1H),4.31(dd,J＝8.7,4.7Hz,1H),3.14(dd,J＝21.2,5.0Hz,1H),2.73(dd,J＝13.4,8.7Hz,1H),2.11(s,2H),1.47(s,9H)。
示例性药物部分的合成
实例A：(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-氨基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(C1)的合成
步骤1：向(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(250mg，0.346mmol)在DMF(4ml)中的溶液中添加(S)-(3-(2-氨基-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(i-4)(110mg，0.346mmol)、HATU(158mg，0.415mmol)和DIPEA(362μl，2.075mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在真空下浓缩。然后将残余物溶解于MeOH中，并且通过ISCO gold C-18 100克反相柱(MeCN/H2O 0％-100％)分离，获得173mg呈白色粉末的(3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 911.0(M+1)。保留时间1.15分钟。
步骤2：将(3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(173mg，0.190mmol)溶解于1ml二噁烷中，然后将10ml 4N HCl的二噁烷溶液添加至混合物中。将反应混合物在室温下搅拌30分钟。将反应混合物在高真空下浓缩，然后在饱和NaHCO3与DCM之间分配以使水相pH为8。将碱性水相用DCM萃取3次。将合并的DCM相经饱和NaCl和Na2SO4干燥，然后在高真空下浓缩，获得155mg呈固体的(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-氨基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺。MS m/z810.5(M+1)。保留时间0.90分钟。
实例B：(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-氨基苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(C2)的合成
步骤1：将DIEA(0.105ml，0.60mmol)和HATU(45.5mg，0.12mmol)添加至在DMF(2ml)中的(3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸(i-2)(57mg，0.12mmol)中。将反应混合物在室温下搅拌5分钟然后添加在DMF(1ml)中的DapOMe(i-3)(28.5mg，0.12mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h然后通过制备型HPLC(含有0.05％TFA的10％-50％乙腈-H2O)纯化，获得(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯。MS m/z 623.5(M+H)。保留时间1.225分钟。
步骤2：将LiOH(30mg，1.25mmol)添加至在MeOH-H2O(1:1，4ml)中的(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸甲酯(43.2mg，0.059mmol)中。将反应混合物在室温下搅拌18h，浓缩并且用HCl(1N，1ml)酸化。将粗制物通过制备型HPLC(含有0.05％TFA的10％-38％乙腈-H2O)纯化，获得作为TFA盐的(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸。MS m/z 609.5(M+H)。保留时间0.962分钟。
步骤3：向在DMF(1ml)中的(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(45.7mg，0.063mmol)中添加DIEA(0.055ml，0.32mmol)和HATU(24.0mg，0.063mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10分钟然后添加至在DMF(1ml)中的(S)-(3-(2-氨基-3-羟丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯TFA盐(i-1)(24.1mg，0.063mmol)中。将反应混合物在室温搅拌1h然后浓缩。将粗制物通过制备型HPLC(含有0.05％TFA的20％-70％乙腈-H2O)纯化，获得作为TFA盐的(3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-羟丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 857.5(M+H)。保留时间1.145分钟。
步骤4：将(3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-羟丙基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(61.4mg，0.063mmol)在具有5％HCl的乙腈-水(1:1，4ml)中的溶液在室温下搅拌24h。然后将反应混合物浓缩并且通过制备型HPLC(含有0.05％TFA的10％-30％乙腈-H2O)纯化，得到作为TFA盐的(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-氨基苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(C2)。MS m/z 757.5(M+H)。保留时间0.744分钟。
示例性接头-药物化合物的合成
实例C：(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(LP1)的合成
步骤1：向(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-氨基苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(C1)(154mg，0.190mmol)和Boc-Val-Cit-OH(92mg，0.247mmol)在DCM(5ml)/MeOH(0.1ml)中的混合物中添加EEDQ(94mg，0.380mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在真空下浓缩。然后将残余物溶解于MeOH中，并且通过ISCO gold C-18 50克反相柱(含有0.05％TFA的MeCN/H2O，0％-100％)分离，获得232mg作为TFA盐的((S)-1-(((S)-1-((3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯。MS m/z 1167.3(M+1)。保留时间1.10分钟。
步骤2：在0℃下在冰-水浴的情况下将((S)-1-(((S)-1-((3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-2-(噻唑-2-基)乙基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(232mg，0.181mmol)添加至TFA/DCM(25％，6ml)的冷溶液中，然后将混合物在0℃下搅拌15分钟，然后温热至室温。将混合物在室温下搅拌30分钟。将反应混合物在真空下浓缩。然后将残余物溶解于DMSO中并且通过ISCO gold C-18 50克反相柱(含有0.05％TFA的MeCN/H2O，0％-100％)分离，获得219mg作为TFA盐的((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺。MS m/z 1067.2(M+1)。保留时间0.88分钟。
步骤3：将((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(219mg 0.18mmol)溶解于DMF(2ml)中，然后添加MAL-PEG1-NHS酯(73.1mg，0.236mmol)和DIPEA(190μl，1.087mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物在真空下浓缩。然后将残余物溶解于DMSO中并且通过ISCO gold C-18 50克反相柱(含有0.05％TFA的MeCN/H2O，0％-100％)分离，获得174mg作为TFA盐的(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-2-(3-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(LP1)。MS m/z 1262.4(M+1)。保留时间1.02分钟。
实例D：(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(LP2)的合成
步骤1：向Fmoc-Cit-OH(10.0mg，0.025mmol)在DMF(1ml)中的溶液中添加DIEA(13.0mg，0.10mmol)然后添加HATU(9.6mg，0.025mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌5分钟然后将溶液添加至(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-氨基苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(C2)(20mg，0.025mmol)中。将反应混合物在室温下搅拌1小时然后使用C18柱通过反相HPLC纯化，用含有0.05％TFA的10％-45％乙腈-H2O洗脱。将含有所希望产物的级分浓缩，获得作为TFA盐的((S)-1-((3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-羟丙基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯。LCMS MS m/z 1136.6(M+1)，保留时间1.042分钟。
步骤2：将((S)-1-((3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-羟丙基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(31.5mg，0.025mmol)TFA盐溶解于MeOH(1mL)中。然后添加Pd/C(10mg，9.40μmol)。附接2L氢气球并且将反应混合物用H2真空吹扫三次然后在室温下在H2下搅拌30分钟。然后将催化剂通过硅藻土过滤去除并且将混合物浓缩并用1N NaOH处理。将粗制混合物使用C18柱通过反相HPLC纯化，用含有0.05％TFA的5％-37％乙腈-H2O洗脱。将含有所希望产物的级分冻干，获得作为TFA盐的(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-((S)-2-氨基-5-脲基戊酰胺基)苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺。LCMS m/z914.6(M+1)，保留时间0.773分钟。
步骤3：向Cbz-Val-OH(2.6mg，0.011mmol)在DMF(1ml)中的溶液中添加DIEA(0.011ml，0.061mmol)然后添加HATU(3.86mg，0.011mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5分钟然后添加至(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-((S)-2-氨基-5-脲基戊酰胺基)苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(11.6mg，0.011mmol)TFA盐在DMF(1ml)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1小时然后将粗制物使用C18柱通过反相HPLC纯化，用含有0.05％TFA的10％-50％乙腈-H2O洗脱。将含有所希望产物的级分冻干，获得作为TFA盐的((S)-1-(((S)-1-((3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-羟丙基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸苄酯。LCMS m/z1147.6(M+1)，保留时间0.986分钟。
步骤4：将((S)-1-(((S)-1-((3-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((1R,3S,4S)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-羟丙基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸苄酯(7.7mg，0.006mmol)TFA盐溶解于MeOH(2ml)中然后添加Pd/C(5mg，4.70μmol)。附接2L氢气球并且将反应混合物用H2真空吹扫三次然后在H2下搅拌30分钟。LCMS指示反应完成。然后将催化剂通过硅藻土过滤去除并且然后将混合物浓缩，得到作为TFA盐的(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺。LCMS m/z 1013.6(M+1)保留时间0.774分钟。
步骤5：向Mal-PEG1-酸(1.0mg，0.005mmol)在DMF(0.5ml)中的溶液中添加DIEA(2.8mg，0.022mmol)然后添加HATU(1.8mg，0.005mmol)。将反应在室温下搅拌5分钟然后添加至(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(4.8mg，0.005mmol)TFA盐在DMF(1ml)中的溶液中。将反应在室温下搅拌1小时然后将粗制物使用C18柱通过反相HPLC纯化，用含有0.05％TFA的10％-38％乙腈-H2O洗脱。将含有所希望产物的级分冻干，获得作为TFA盐的(1R,3S,4S)-N-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(3-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-3-羟基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-2-甲基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-甲酰胺(LP-2)。LCMS m/z 1208.5(M+1)保留时间0.882分钟。
ADC的缀合和制备
用于制备具有式(I)的抗体缀合物的方法
用于形成具有式(I)的缀合物的一般反应方案示出在以下方案1中：
方案1
其中：RG1是反应性基团(仅举例来说，硫醇或胺或酮)，该反应性基团与附接至接头-药物部分的相容性反应性基团RG2反应，从而将抗体或抗体片段A与一个或多个接头-药物部分共价连接。RG1和RG2基团的此类反应的非限制性实例是马来酰亚胺(RG2)与硫醇(RG1)反应得到琥珀酰亚胺环，或羟胺(RG2)与酮(RG1)反应得到肟。
用于形成具有式(II)的缀合物的一般反应方案示出在以下方案2中：
方案2
其中：A1、A2、LB、D和n是如本文所定义的，1,3-二卤代丙酮选自1,3-二氯丙酮、1,3-二溴丙酮、和1,3-二碘丙酮，并且使用选自二硫苏糖醇(DTT)和三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)的还原剂完成还原步骤。
用于形成具有式(E)的缀合物的一般反应方案示出在以下方案3中：
方案3
其中：R5是-L1R14、-L1R24、-L1R34或-L1R44并且RG1是反应性基团(仅举例来说，硫醇或胺或酮)，该反应性基团与具有式(C-1)的化合物的相容性R14、R24、R34或R44基团反应形成相应的R114基团。举例来说，马来酰亚胺与硫醇反应得到琥珀酰亚胺环，或者羟胺与酮反应得到肟。A、y、L1、R2、R5和R114如本文所定义的。
用于形成具有式(F)的缀合物的一般反应方案示出在以下方案4中：
方案4
其中：R5是-L1R14、-L1R24、-L1R34或-L1R44并且RG1是反应性基团(仅举例来说，硫醇或胺或酮)，该反应性基团与具有式(C-2)的化合物的相容性R14、R24、R34或R44基团反应形成相应的R114基团。举例来说，马来酰亚胺与硫醇反应得到琥珀酰亚胺环，或者羟胺与酮反应得到肟。A、y、L1、R2、R5和R114如本文所定义的。
用于形成具有式(G)的缀合物的一般反应方案示出在以下方案5中：
方案5
其中：R5是-L1R14、-L1R24、-L1R34或-L1R44并且RG1是反应性基团(仅举例来说，硫醇或胺或酮)，该反应性基团与具有式(D-1)的化合物的相容性R14、R24、R34或R44基团反应形成相应的R114基团。举例来说，马来酰亚胺与硫醇反应得到琥珀酰亚胺环，或者羟胺与酮反应得到肟。A、y、L1、R2、R5和R114如本文所定义的。
用于形成具有式(H)的缀合物的一般反应方案示出在以下方案6中：
方案6
其中：R5是-L1R14、-L1R24、-L1R34或-L1R44并且RG1是反应性基团(仅举例来说，硫醇或胺或酮)，该反应性基团与具有式(D-2)的化合物的相容性R14、R24、R34或R44基团反应形成相应的R114基团。举例来说，马来酰亚胺与硫醇反应得到琥珀酰亚胺环，或者羟胺与酮反应得到肟。A、y、L1、R2、R5和R114如本文所定义的。
治疗用途
本文披露的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物可用于治疗任何表达CD48的癌症，例如血液病或血液恶性肿瘤。可用本文披露的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物治疗的血液病/恶性肿瘤包括：多发性骨髓瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、急性单核细胞性白血病(AMoL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞性白血病(T-PLL)、大颗粒淋巴细胞性白血病和成人T细胞白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、前体T细胞白血病/淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤、MALT淋巴瘤、蕈样真菌病、外周T细胞淋巴瘤非特指型、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、结节性硬化型霍奇金氏淋巴瘤、混合细胞亚型霍奇金氏淋巴瘤和骨髓增生异常综合征。
在一些实施例中，本文披露的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物可用于治疗任何表达CD48的实体瘤，该实体瘤选自以下中的任一项：肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肝细胞癌、小肠癌、食道癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、甲状腺癌、宫颈癌、卵巢癌、皮肤癌、黑色素瘤和前列腺癌。癌症可以处于早期、中期、晚期或可以是转移性癌症。
在一些实施例中，本文披露的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物用于治疗乳腺癌、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T-细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。
组合疗法
在某些情况下，本披露的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物可以与另一种调理方案(如放射疗法或化学疗法)组合使用。
在某些情况下，本披露的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)和抗体药物缀合物可以与另一种治疗剂(如抗癌剂、抗恶心剂(或止吐剂)、止痛剂、动员剂或其组合)组合使用。
考虑用于组合疗法中的一般化学治疗剂包括阿那曲唑比卡鲁胺/>硫酸博莱霉素/>白消安/>白消安注射液/>卡培他滨/>N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂卡莫司汀/>苯丁酸氮芥/>顺铂克拉屈滨/>环孢霉素(/>或)、环磷酰胺(/>或/>)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷阿糖胞苷脂质体注射液/>达卡巴嗪/>更生霉素(放线菌素D、Cosmegan)、盐酸柔红霉素/>柠檬酸柔红霉素脂质体注射液/>地塞米松、多西他赛/>盐酸阿霉素依托泊苷/>磷酸氟达拉滨/>5-氟尿嘧啶/>氟他胺/>替扎他滨(tezacitibine)、吉西他滨(双氟脱氧胞苷)、羟基脲/>伊达比星/>异环磷酰胺伊立替康/>L-天冬酰胺酶/>亚叶酸钙、美法仑/>6-巯嘌呤/>甲氨蝶呤/>米托蒽醌mylotarg、紫杉醇/>phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁(pentostatin)、聚苯丙生(polifeprosan)20与卡莫司汀的植入物/>枸橼酸它莫西芬/>替尼泊苷/>6-硫代鸟嘌呤、噻替派、替拉扎明/>注射用盐酸托泊替康/>长春花碱/>长春新碱/>和长春瑞滨/>
在一个方面，本披露的抗体、抗体片段(例如，抗原结合片段)以及抗体药物缀合物在药物组合配制品或作为组合疗法的给药方案中与具有抗癌特性的第二化合物组合。药物组合配制品或给药方案的第二化合物可以对组合的缀合物具有互补活性，使得它们不会对彼此有不利影响。
如本文所用，术语“药物组合”是指在一个剂量单位形式中的固定组合、或用于组合施用的非固定组合或成套药盒，其中两种或更多种治疗剂可以在同一时间独立地施用或在时间间隔内分别施用，特别地其中这些时间间隔允许组合配偶体显示合作性例如协同效应。
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗本披露中描述的治疗性病症或障碍。这种施用涵盖以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，如以具有固定比率的活性成分的单一胶囊施用。可替代地，这种施用涵盖在多个容器中或在每种活性成分的独立容器(例如，胶囊、粉末和液体)中共同施用。可以在施用之前将粉末和/或液体重构或稀释至所需剂量。此外，这种施用也涵盖在大致相同的时间或在不同的时间以依序方式使用每种类型的治疗剂。在任何一种情况下，治疗方案将在治疗本文所述的病症或障碍方面提供药物组合的有益作用。
组合疗法可以提供“协同”并且证明是“协同的”，即，当活性成分一起使用时所实现的效应大于由分别使用这些化合物所产生的效应的总和。当将活性成分为下述情形时可以获得协同效应：(1)共同配制并以组合的单位剂量配制品的形式同时施用或递送；(2)以分开的配制品的形式交替或平行递送；或(3)通过一些其他方案进行。当以交替疗法递送时，可以在依序(例如通过在单独注射器中不同的注射)施用或递送化合物时获得协同效应。通常，在交替疗法期间，将有效剂量的每种活性成分依序地即顺次地施用，而在组合疗法中，将有效剂量的两种或更多种活性成分一起施用。
在一些实施例中，本披露提供了治疗方法，其中本文披露的抗体-药物缀合物与一种或多种另外的治疗剂组合施用。本文披露了示例性组合配偶体。
在某些实施例中，本文所述的组合包含PD-1抑制剂。在一些实施例中，PD-1抑制剂选自PDR001(诺华股份有限公司(Novartis))、纳武单抗(百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))、派姆单抗(默克公司(Merck&Co))、匹地利珠单抗(CureTech公司)、MEDI0680(医学免疫公司(Medimmune))、REGN2810(再生元公司(Regeneron))、TSR-042(泰萨罗公司(Tesaro))、PF-06801591(辉瑞制药公司(Pfizer))、BGB-A317(百济神州公司(Beigene))、BGB-108(百济神州公司)、INCSHR1210(因赛特公司(Incyte))、或AMP-224(安普利公司(Amplimmune))。在一些实施例中，PD-1抑制剂是PDR001。PDR001还被称为斯巴达珠单抗。
在某些实施例中，本文所述的组合包含LAG-3抑制剂。在一些实施例中，LAG-3抑制剂选自LAG525(诺华股份有限公司)、BMS-986016(百时美施贵宝公司)、或TSR-033(泰萨罗公司)。
在某些实施例中，本文所述的组合包含TIM-3抑制剂。在一些实施例中，TIM-3抑制剂是MBG453(诺华股份有限公司)、TSR-022(泰萨罗公司)、LY-3321367(礼来公司(EliLily))、Sym23(Symphogen公司)、BGB-A425(百济神州公司)、INCAGN-2390(艾吉纳斯公司(Agenus))、BMS-986258(BMS公司)、RO-7121661(罗氏公司(Roche))或LY-3415244(礼来公司)。MBG453还被称为沙巴托利单抗(sabatolimab)。
在某些实施例中，本文所述的组合包含PDL1抑制剂。在一个实施例中，PDL1抑制剂选自FAZ053(诺华股份有限公司)、阿特利珠单抗(基因泰克公司(Genentech))、德瓦鲁单抗(阿斯利康公司(Astra Zeneca))或阿维鲁单抗(辉瑞制药公司)。
在某些实施例中，本文所述的组合包含GITR激动剂。在一些实施例中，GITR激动剂选自GWN323(诺华股份有限公司(NVS))、BMS-986156、MK-4166或MK-1248(默克公司(Merck))、TRX518(利普治疗公司(Leap Therapeutics))、INCAGN1876(因赛特公司/艾吉纳斯公司)、AMG 228(美商安进公司(Amgen))或INBRX-110(印希彼公司(Inhibrx))。
在一些实施例中，本文所述的组合包含IAP抑制剂。在一些实施例中，IAP抑制剂包含LCL161或国际申请公开号WO 2008/016893中所披露的化合物。
在一个实施例中，组合包含mTOR抑制剂，例如RAD001(也称为依维莫司)。
在一个实施例中，组合包含HDAC抑制剂，例如LBH589。LBH589还被称为帕比司他。
在一个实施例中，组合包含IL-17抑制剂，例如CJM112。
在某些实施例中，本文所述的组合包含雌激素受体(ER)拮抗剂。在一些实施例中，雌激素受体拮抗剂与PD-1抑制剂、CDK4/6抑制剂或两者组合使用。在一些实施例中，组合用于治疗ER阳性(ER+)癌或乳腺癌(例如，ER+乳腺癌)。
在一些实施例中，雌激素受体拮抗剂是选择性雌激素受体降解剂(SERD)。SERD是与受体结合并导致例如受体的降解或下调的雌激素受体拮抗剂(Boer K.等人,(2017)Therapeutic Advances in Medical Oncology[肿瘤医学治疗进展]9(7):465-479)。ER是激素活化的转录因子，其对于例如人生殖系统的生长、发育和生理学是重要的。ER被例如激素雌激素(17β雌二醇)活化。ER表达和信号传导涉及癌症(例如，乳腺癌)，例如ER阳性(ER+)乳腺癌。在一些实施例中，SERD选自LSZ102、氟维司群、布利司群(brilanestrant)、或依拉司群(elacestrant)。
在一些实施例中，SERD包含国际申请公开号WO 2014/130310(将其通过引用以其全文特此并入)中所披露的化合物。
在一些实施例中，SERD包含LSZ102。LSZ102具有化学名称：(E)-3-(4-((2-(2-(1,1-二氟乙基)-4-氟苯基)-6-羟基苯并[b]噻吩-3-基)氧基)苯基)丙烯酸。在一些实施例中，SERD包含氟维司群(CAS登记号：129453-61-8)或国际申请公开号WO 2001/051056(将其通过引用以其全文特此并入)中所披露的化合物。在一些实施例中，SERD包含依拉司群(CAS登记号：722533-56-4)或美国专利号7,612,114(将其通过引用以其全文并入)中所披露的化合物。依拉司群也称为RAD1901、ER-306323或(6R)-6-{2-[乙基({4-[2-(乙基氨基)乙基]苯基}甲基)氨基]-4-甲氧基苯基}-5,6,7,8-四氢萘-2-醇。依拉司群是口服生物可利用的、非甾体结合选择性雌激素受体调节剂(SERM)和SERD。依拉司群还披露于例如Garner F等人,(2015)Anticancer Drugs[抗癌药物]26(9):948-56中。在一些实施例中，SERD是布利司群(CAS登记号：1365888-06-7)或国际申请公开号WO 2015/136017(将其通过引用以其全文并入)中所披露的化合物。
在一些实施例中，SERD选自RU 58668、GW7604、AZD9496、巴多昔芬、哌喷昔芬(pipendoxifene)、阿佐昔芬、OP-1074、或阿考比芬，例如，如McDonell等人(2015)Journalof Medicinal Chemistry[医药化学杂志]58(12)4883-4887中所披露的。
其他示例性雌激素受体拮抗剂披露于例如WO 2011/156518、WO 2011/159769、WO2012/037410、WO 2012/037411、和US 2012/0071535(所有这些文献都通过引用以其全文特此并入)中。
在某些实施例中，本文所述的组合包含细胞周期蛋白依赖性激酶4或6的抑制剂(CDK4/6)。在一些实施例中，CDK4/6抑制剂与PD-1抑制剂、雌激素受体(ER)拮抗剂或两者组合使用。在一些实施例中，组合用于治疗ER阳性(ER+)癌或乳腺癌(例如，ER+乳腺癌)。在一些实施例中，CDK4/6抑制剂选自利波西利、阿贝西利(abemaciclib)(礼来公司(EliLilly))或帕柏西利。
在一些实施例中，CDK4/6抑制剂包含利波西利(CAS登记号：1211441-98-3)或美国专利号8,415,355和8,685,980(将其通过引用以其全文并入)中所披露的化合物。
在一些实施例中，CDK4/6抑制剂包含国际申请公开号WO 2010/020675，以及美国专利号8,415,355和8,685,980(将其通过引用以其全文并入)中所披露的化合物。
在一些实施例中，CDK4/6抑制剂包含利波西利(CAS登记号：1211441-98-3)。利波西利也称为LEE011、或7-环戊基-N,N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺。
在一些实施例中，CDK4/6抑制剂包含阿贝西利(CAS登记号：1231929-97-7)。阿贝西利也称为LY835219或N-[5-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]-2-吡啶基]-5-氟-4-[4-氟-2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-苯并咪唑-6-基]-2-嘧啶胺。阿贝西利是对CDK4和CDK6具有选择性的CDK抑制剂，并披露于例如Torres-Guzman R等人(2017)Oncotarget[肿瘤靶标]10.18632/oncotarget.17778中。
在一些实施例中，CDK4/6抑制剂包含帕柏西利(CAS登记号：571190-30-2)。帕柏西利也称为PD-0332991、或6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(1-哌嗪基)-2-吡啶基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮。帕博西尼(Palbociclib)抑制CDK4(具有11nM的IC50)和抑制CDK6(具有16nM的IC50)，并披露于例如Finn等人(2009)Breast CancerResearch[乳腺癌研究]11(5):R77。
在某些实施例中，本文所述的结合包含趋化因子(C-X-C基序)受体2(CXCR2)的抑制剂。在一些实施例中，CXCR2抑制剂选自6-氯-3-((3,4-二氧代-2-(戊烷-3-基氨基)环丁-1-烯-1-基)氨基)-2-羟基-N-甲氧基-N-甲基苯磺酰胺、达尼利星(danirixin)、瑞帕利星(reparixin)、或那伐利星(navarixin)。
在一些实施例中，CSF-1/1R结合剂选自巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的抑制剂，例如，M-CSF的单克隆抗体或Fab(例如，MCS110)，CSF-1R酪氨酸激酶抑制剂(例如，4-((2-(((1R,2R)-2-羟基环己基)氨基)苯并[d]噻唑-6-基)氧基)-N-甲基吡啶酰胺或BLZ945)，受体酪氨酸激酶抑制剂(RTK)(例如，培达替尼)或靶向CSF-1R的抗体(例如，依米妥珠单抗(emactuzumab)或FPA008)。在一些实施例中，CSF-1/1R抑制剂是BLZ945。在一些实施例中，CSF-1/1R结合剂是MCS110。在其他实施例中，CSF-1/1R结合剂是培达替尼。
在某些实施例中，本文所述的组合包含c-MET抑制剂。C-MET(在许多肿瘤细胞类型中过表达或突变的受体酪氨酸激酶)在肿瘤细胞增殖、存活、侵袭、转移和肿瘤血管生成中起关键作用。c-MET的抑制可以在过表达c-MET蛋白或表达组成型活化的c-MET蛋白的肿瘤细胞中诱导细胞死亡。在一些实施例中，c-MET抑制剂选自卡玛替尼(INC280)、JNJ-3887605、AMG 337、LY2801653、MSC2156119J、克唑替尼(crizotinib)、替万替尼、或戈伐替尼(golvatinib)。
在某些实施例中，本文所述的组合包含转化生长因子β(也称为TGF-βTGFβ、TGFb、或TGF-β，可在本文互换地使用)抑制剂。在一些实施例中，TGF-β抑制剂选自夫苏木单抗或XOMA 089。
在一些实施例中，本文所述的组合包含腺苷A2a受体(A2aR)拮抗剂(例如A2aR途径的抑制剂，例如腺苷抑制剂，例如A2aR或CD-73的抑制剂)。在一些实施例中，A2aR拮抗剂与PD-1抑制剂、和以下中的一种或多种(例如，两种、三种、四种、五种或全部)组合使用：CXCR2抑制剂、CSF-1/1R结合剂、LAG-3抑制剂、GITR激动剂、c-MET抑制剂或IDO抑制剂。在一些实施例中，组合用于治疗胰腺癌、结肠直肠癌、胃癌、或黑色素瘤(例如难治性黑色素瘤)。在一些实施例中，A2aR拮抗剂选自PBF509(NIR178)(帕罗生物制药公司/诺华股份有限公司(Palobiofarma/Novartis))、CPI444/V81444(卡沃斯公司/基因泰克公司(Corvus/Genentech))、AZD4635/HTL-1071(阿斯利康公司/海普泰公司(AstraZeneca/Heptares))、维帕迪南(Vipadenant)(雷达思公司/朱诺公司(Redox/Juno))、GBV-2034(Globavir公司)、AB928(阿克斯生物科学公司(Arcus Biosciences))、茶碱、伊曲茶碱(协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko Kogyo))、托扎迪南/SYN-115(阿索尔公司(Acorda))、KW-6356(协和发酵工业株式会社)、ST-4206(理地安生物科学公司(Leadiant Biosciences))、或普瑞迪南/SCH 420814(默克公司/谢林公司(Merck/Schering))。不希望受理论束缚，据信在一些实施例中，A2aR的抑制导致IL-1b的上调。
在某些实施例中，本文所述的组合包含吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和/或色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)的抑制剂。在一些实施例中，IDO抑制剂与PD-1抑制剂、和以下中的一种或多种(例如两种、三种、四种或全部)组合使用：TGF-β抑制剂、A2aR拮抗剂、CSF-1/1R结合剂、c-MET抑制剂或GITR激动剂。在一些实施例中，组合用于治疗胰腺癌、结肠直肠癌、胃癌、或黑色素瘤(例如难治性黑色素瘤)。在一些实施例中，IDO抑制剂选自(4E)-4-[(3-氯-4-氟苯胺基)-亚硝基亚甲基]-1,2,5-噁二唑-3-胺(也称为依多司他(epacadostat)或INCB24360)、吲哚西莫德(indoximod)(NLG8189)、(1-甲基-D-色氨酸)、α-环己基-5H-咪唑并[5,1-a]异吲哚-5-乙醇(也称为NLG919)、吲哚西莫德、BMS-986205(以前称为F001287)。
在某些实施例中，本文所述的组合包括半乳凝素，例如，半乳凝素-1或半乳凝素-3抑制剂。在一些实施例中，组合包含半乳凝素-1抑制剂和半乳凝素-3抑制剂。在一些实施例中，组合包含靶向半乳凝素-1和半乳凝素-3两者的双特异性抑制剂(例如，双特异性抗体分子)。在一些实施例中，半乳凝素抑制剂与本文所述的一种或多种治疗剂组合使用。在一些实施例中，半乳凝素抑制剂选自抗半乳凝素抗体分子、GR-MD-02(半乳凝素治疗学公司(Galectin Therapeutics))、半乳凝素-3C(曼德勒医学院(Mandal Med))、Anginex、或OTX-008(翁科埃斯克斯公司(OncoEthix)，默克公司)。
在一些实施例中，本文所述的组合包含MEK抑制剂。在一些实施例中，MEK抑制剂选自曲美替尼、司美替尼、AS703026、BIX 02189、BIX 02188、CI-1040、PD0325901、PD98059、U0126、XL-518、G-38963、或G02443714。在一些实施例中，MEK抑制剂是曲美替尼。
在一个实施例中，本文所述的组合包括白介素-1β(IL-1β)抑制剂。在一些实施例中，IL-1β抑制剂选自卡那单抗(canakinumab)、格沃吉珠单抗(gevokizumab)、阿那白滞素、或利纳西普(Rilonacept)。
在某些实施例中，本文所述的组合包含IL-15/IL-15Ra复合物。在一些实施例中，IL-15/IL-15Ra复合物选自NIZ985(诺华股份有限公司)、ATL-803(亚拉斯托公司(Altor))或CYP0150(Cytune公司)。
在某些实施例中，本文所述的组合包含小鼠双微小体2同源物(MDM2)抑制剂。MDM2的人同源物也称为HDM2。在一些实施例中，本文所述的MDM2抑制剂也称为HDM2抑制剂。在一些实施例中，MDM2抑制剂选自HDM201或CGM097。
在实施例中，MDM2抑制剂包含(S)-1-(4-氯苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-(甲基(((1r,4S)-4-(4-甲基-3-氧代哌嗪-1-基)环己基)甲基)氨基)苯基)-1,2-二氢异喹啉-3(4H)-酮(也称为CGM097)或PCT公开号WO 2011/076786中所披露的化合物，以治疗障碍，例如本文所述的障碍)。在一个实施例中，将本文披露的治疗剂与CGM097组合使用。
在一些实施例中，本文所述的组合包含低甲基化剂(HMA)。在一个实施例中，HMA选自地西他滨(decitabine)或阿扎胞苷(azacitidine)。
药物组合物
为了制备包含一种或多种本文所述的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物的药物组合物或无菌组合物，可以将提供的一种或多种缀合物与药学上可接受的载剂或赋形剂混合。
治疗剂和诊断剂的配制品可以通过与生理学上可接受的载剂、赋形剂、或稳定剂以例如冻干粉末、浆液、水性溶液、洗剂、或悬浮液的形式混合来制备(参见例如，Hardman等人,Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics[Goodman和Gilman的治疗的药理学基础],McGraw-Hill[麦格劳-希尔集团],纽约州纽约市,2001；Gennaro,Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践],Lippincott,Williams,and Wilkins[利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司],纽约州纽约市,2000；Avis等人(编辑),Pharmaceutical Dosage Forms:ParenteralMedications[药物剂型：肠胃外药物],Marcel Dekke[马塞尔德克尔公司],纽约,1993；Lieberman等人(编辑),Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets[药物剂型：片剂],MarcelDekke[马塞尔德克尔公司],纽约,1990；Lieberman等人(编辑)Pharmaceutical DosageForms:Disperse Systems[药物剂型：分散系统],Marcel Dekker[马塞尔·德克尔公司],纽约,1990；Weiner和Kotkoskie,Excipient Toxicity and Safety[赋形剂毒性和安全性],Marcel Dekker,Inc.[马塞尔德克尔公司],纽约州纽约市,2000)。
在一些实施例中，包含本披露的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物的药物组合物是冻干物制剂。在某些实施例中，包含抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物的药物组合物是含有在缓冲溶液中抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物的小瓶中的冻干物。冻干物可以例如用水、盐水重构用于注射。为了静脉内施用，可以将获得的溶液进一步稀释于载剂溶液中。
为治疗剂选择施用方案取决于若干种因素，包括实体的血清或组织周转速率、症状水平、实体的免疫原性、和生物基质中的靶细胞的可及性。在某些实施例中，施用方案使递送至患者的治疗剂的量最大化，与可接受水平的副作用一致。因此，递送的生物制品的量部分地取决于特定的实体和正在治疗的病症的严重程度。选择适当剂量的抗体、细胞因子、和小分子的指南是可获得的(参见，例如，Wawrzynczak,Antibody Therapy[抗体疗法],Bios Scientific Pub.Ltd[Bios科学出版社有限公司],英国牛津郡,1996；Kresina(编辑),Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis[单克隆抗体、细胞因子和关节炎],Marcel Dekker[马塞尔德克尔公司],纽约州纽约市,1991；Bach(编辑),MonoclonalAntibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases[自身免疫疾病中的单克隆抗体和肽疗法],Marcel Dekker[马塞尔德克尔公司],纽约州纽约市,1993；Baert等人,NewEngl.J.Med.[新英格兰医学杂志]348:601-608,2003；Milgrom等人,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]341:1966-1973,1999；Slamon等人,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]344:783-792,2001；Beniaminovitz等人,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]342:613-619,2000；Ghosh等人,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]348:24-32,2003；Lipsky等人,New Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]343:1594-1602,2000)。
由临床医生，例如，使用本领域已知或疑似影响治疗或预计影响治疗的参数或因素确定适当的剂量。通常，剂量始于稍微小于最佳剂量的量并在此后以小增量增加，直至相对于任何不良副作用，实现所希望的或最佳的效果。重要的诊断测量值包括症状(例如炎症)的那些测量值或产生的炎性细胞因子的水平。
可以改变本披露的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得一定量的活性成分，该活性成分的量有效地实现对于特定患者、组合物和施用方式的希望的治疗应答，而对该患者没有毒性。所选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括所采用的本公开特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所采用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所采用的特定组合物组合的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和先前病史、以及医学领域中已知的类似因素。
包含本文披露的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物的组合物可通过连续输注提供，或通过例如一天、一周、或每周1-7次、隔周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、或每八周一次的时间间隔的剂量来提供。剂量可以静脉内、皮下或骨内方式提供。特定剂量方案是涉及避免显著的不期望的副作用的最大剂量或给药频率的方案。
对于本披露的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物，施用至患者的剂量可以是0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重。剂量可以在0.001mg/kg患者体重与50mg/kg患者体重之间、在0.005mg/kg患者体重与20mg/kg患者体重之间、在0.01mg/kg患者体重与20mg/kg患者体重之间、在0.02mg/kg患者体重与10mg/kg患者体重之间、在0.05mg/kg患者体重与5mg/kg患者体重之间、在0.1mg/kg患者体重与10mg/kg患者体重之间、在0.1mg/kg患者体重与8mg/kg患者体重之间、在0.1mg/kg患者体重与5mg/kg患者体重之间、在0.1mg/kg患者体重与2mg/kg患者体重之间、在0.1mg/kg患者体重与1mg/kg患者体重之间。可以使用以千克(kg)计的患者体重乘以按mg/kg计的待施用的剂量，计算抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物的剂量。
可以重复本披露的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物的剂量并且各次施用可以相隔少于1天、至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月、4个月、5个月、或至少6个月。在一些实施例中，本披露的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物每周施用两次、每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、或以较低频率施用。
特定患者的有效量可以根据如以下的因素而改变：待治疗的病症，患者的总体健康状况，施用的方法、途径和剂量，和副作用的严重程度(参见，例如，Maynard等人,AHandbook of SOPs for Good Clinical Practice[用于良好临床实践的SOP手册],Interpharm Press[国际药物出版社],佛罗里达州波卡拉顿(Boca Raton,Fla.),1996；Dent,Good Laboratory and Good Clinical Practice[良好实验和良好临床实践],UrchPubl.[厄奇出版社],英国伦敦,2001)。
施用途径可以是通过例如局部或皮肤应用，通过皮下、静脉内、腹膜内、脑内、肌内、眼内、动脉内、脑脊内、病灶内施用进行的注射或输注，或通过持续释放系统或植入物(参见例如，Sidman等人,Biopolymers[生物聚合物]22:547-556,1983；Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.[生物医学材料研究杂志]15:167-277,1981；Langer,Chem.Tech.[化学技术]12:98-105,1982；Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]82:3688-3692,1985；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:4030-4034,1980；美国专利号6,350,466和6,316,024)。必要时，组合物也可以包括增溶剂或用于减轻注射部位疼痛的局部麻醉药如利多卡因，或二者。此外，也可以采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或雾化器、以及含有雾化剂的配制品。参见例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540、和4,880,078；以及PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346、和WO 99/66903，每一篇文献均通过引用以其全文并入本文。
用于共同施用或用第二治疗剂(例如，细胞因子、类固醇、化学治疗剂、抗生素或放射(如全身放射(TBI))治疗的方法在本领域中是已知的(参见例如，Hardman等人,(编辑)(2001)Goodman and Gilman'sThe Pharmacological Basis of Therapeutics[Goodman和Gilman的治疗的药理学基础],第10增版,McGraw-Hill[麦格劳-希尔集团],纽约州纽约市；Poole和Peterson(编辑)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:APractical Approach[用于先进实践的药物治疗学：实用方法],Lippincott,Williams&Wilkins[利平科特、威廉姆斯和威尔金斯出版社],宾夕法尼亚州费城市(Phila.,Pa.)；Chabner和Longo(编辑)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy[癌症化学疗法和生物疗法],Lippincott,Williams&Wilkins[利平科特、威廉姆斯和威尔金斯出版公司],宾夕法尼亚州费城市)。治疗剂的有效量可以将症状减少至少10％；至少20％；至少约30％；至少40％、或至少50％。
可以与本披露的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物组合施用的另外的疗法可以与本披露的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物相隔少于5分钟、相隔少于30分钟、相隔1小时、相隔约1小时、相隔约1小时至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔约12小时至18小时、相隔18小时至24小时、相隔24小时至36小时、相隔36小时至48小时、相隔48小时至52小时、相隔52小时至60小时、相隔60小时至72小时、相隔72小时至84小时、相隔84小时至96小时、或相隔96小时至120小时进行施用。两种或更多种疗法可以在同一患者访视中施用。
本披露提供了用于向有需要的受试者单独或与其他疗法组合施用包含抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物的药物组合物的方案。本文披露的组合疗法可以同时或依序向受试者施用。本披露的组合疗法也可以循环施用。循环疗法涉及施用第一疗法一段时间，随后施用第二疗法一段时间并重复这种依序施用，即，该循环，以减少对一种疗法(例如药剂)的耐药性形成，以避免或减少一种疗法(例如药剂)的副作用和/或以改善疗法的功效。
本文披露的组合疗法的疗法可以并行施用至受试者。
术语“并行”不限于在完全相同的时间施用疗法，而是意指将包含本文披露的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)和抗体药物缀合物的药物组合物以这样的顺序并在这样的时间间隔内施用至受试者，该顺序和该时间间隔使得抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)和抗体药物缀合物可以与一种或多种其他疗法一起发挥作用，以提供与如果另外施用它们相比增加的益处。例如，可以将每种疗法在相同的时间或以任何次序依序在不同的时间点施用于受试者；然而，如果不在相同的时间施用，则它们应当在时间上充分接近地施用，从而以提供所希望的治疗效果。可以将每种疗法以任何适当的形式并通过任何合适的途径分别施用于受试者。在各种实施例中，将疗法相隔少于5分钟、相隔少于15分钟、相隔少于30分钟、相隔少于1小时、相隔约1小时、相隔约1小时至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔24小时、相隔48小时、相隔72小时、或相隔1周施用至受试者。在其他实施例中，将两种或更多种疗法在同一患者访视中施用。
组合疗法可以在相同的药物组合物中施用至受试者。可替代地，组合疗法的治疗剂可以在单独的药物组合物中并行施用至受试者。治疗剂可以通过相同或不同施用途径施用至受试者。
应理解，本文描述的实例和实施例仅用于举例说明目的，其各种修饰或改变对于本领域技术人员将是明了的，并包括在本申请的精神和范围内和所附权利要求书的范围内。
实例
实例1：抗CD48抗体的产生
作为免疫原的人CD48-小鼠IgG1融合蛋白质的表达构建体的产生
从商业载体“真克隆(Trueclone)，CD48(未标记)-人CD48分子”(傲锐东源公司(Origene)，NM_001778.2)扩增人CD48。将扩增的DNA片段克隆到合适的表达载体中。
将HEK293T细胞以1x 106个细胞/孔接种在预热DMEM(吉博科公司(Gibco)，32430-027)和10％FBS(吉博科公司(Gibco)，10082-137)的6孔细胞培养板中。第二天，对于每个孔，将3μg DNA构建体分别稀释于150μL Opti-MEM(吉博科公司(Gibco)，31985070)中，并将12μL LipofectamineTM2000(赛默飞世尔科技公司(Thermofischer Scientific)，1051561)稀释于150μL Opti-MEM中。将稀释的DNA添加至每个相应的稀释的LipofectamineTM2000转染试剂的管中并在室温下孵育5分钟。将250μL DNA/LipofectamineTM2000试剂复合物添加至每个孔并在37℃、5％CO2下在培养基中孵育6小时。6小时后，将培养基替换为预热DMEM+10％FBS，并将细胞在37℃、5％CO2下再孵育72小时。
使用“血清抗体纯化试剂盒-蛋白质G”(艾博抗公司(Abcam)#ab128751)纯化人CD48-小鼠IgG重组蛋白。按照供应商的建议，将条件培养基与结合缓冲液混合，并在柱填充之前与蛋白质G树脂在室温下一起孵育2小时。将柱洗涤以去除未结合蛋白质，并且在低pH下洗脱huCD48-小鼠IgG蛋白并立即中和。通过A280 OD测定确认洗脱级分中蛋白质的存在。将洗脱级分合并、脱盐，并使用Amicon Ultra-15离心过滤装置(30K)浓缩。通过抗-小鼠IgGELISA对纯化的蛋白质进行定量。
重组人和食蟹猴CD48蛋白的表达
基于氨基酸序列基因合成人和食蟹猴蛋白质(GeneArt，瑞士)(参见表5)。将所有合成的DNA片段克隆到合适的具有不同C-末端标签(hFc1P，APP6-Avi，His)的表达载体中，以允许纯化和标记。
表5：CD48蛋白序列
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将HEK293T细胞以1x106个细胞/孔接种在预热DMEM(吉博科公司(Gibco)，32430-027)和10％FBS(吉博科公司(Gibco)，10082-137)的6孔细胞培养板中。第二天，对于每个孔，将2μg DNA构建体分别稀释于100μL Opti-MEM(吉博科公司(Gibco)，31985070)中，并添加7μL FuGENE HD(普洛麦格公司(Promega)，104810)。将混合物在室温下孵育15分钟并添加至细胞中。将板在37℃、5％CO2下于培养基中孵育72小时。
通过抗-APP或蛋白-A柱纯化人和食蟹猴CD48-huIgG-Fc和APP标记的重组蛋白。将柱洗涤，且用PBS(pH 7.4)平衡以去除未结合蛋白质。用0.1M甘氨酸(pH 2.7)洗脱结合的蛋白质并立即中和。通过A280OD测量确定蛋白质浓度。
人和食蟹猴CD48蛋白过表达细胞系
将CHO和300.19细胞工程化以表达人CD48与GFP标记的组合。用人或食蟹猴CD48表达载体转染HKB11细胞。对于CHO和300.19细胞系，应用Amaxa 4D核转染促进了CD48-EGFP编码表达质粒。将每个样品2.5x105个细胞悬浮于20μl 4DNucleofectorTM溶液(龙沙集团(Lonza)，V4XC-9064)中，添加DNA并放置在比色皿中。电穿孔后，在室温下将比色皿孵育10分钟。将细胞悬浮于预热培养基(RPMI 1640，(吉博科公司(Gibco)，72400-021)、10％FBS(吉博科公司(Gibco)，16000044)、青霉素-链霉素(吉博科公司(Gibco)，15140122)和2-巯基乙醇中(吉博科公司(Gibco)，31350010)中，并在潮湿、37℃/5％CO2培养箱中孵育。为了筛选，以1mg/ml的终浓度添加G418(吉博科公司(Gibco)，10131-027)。使用未转染的300.19或CHO细胞作为CD48-阴性对照细胞，在用荧光标记的抗人CD48抗体、克隆CD48A-PE(来自分子探针公司(Molecular Probes)的PE标记抗体，A15768)的对细胞进行染色后，通过流式细胞术分析细胞池。对于两种细胞系，已鉴定出一种细胞池，其显示出各自靶蛋白的高且一致的表达。将这种池的小瓶冷冻；在含有G418的细胞培养基继续培养细胞两周后，确认了重组CD48过表达的稳定性。
对于过表达HKB11细胞系，基于来自Uniprot数据库的氨基酸序列基因合成了人全长CD48。基于使用分离自多种食蟹猴组织的mRNA产生的氨基酸序列信息，基因合成编码食蟹猴全长CD48的序列。全部序列由GenArt公司(瑞士)合成。对于工程化HKB11细胞系，将合成的DNA片段克隆至pD2529-CMVa Leap-In转座子载体(Atum公司，纽瓦克市/加利福尼亚州(Newark/CA)，美国)中。使用JetMessenger转染试剂(保利嘉公司(Polyplus)，150-07)，一式三份转染HKB11(ATCC，CRL-12568)细胞。将转座子载体与编码Leap-In转座酶的mRNA(Atum公司，纽瓦克市/加利福尼亚州(Newark/CA)，美国)一起共转染至细胞中。将转染细胞在抗生素嘌呤霉素存在的情况下于培养基中培养4周，以选择稳定的转染细胞。在用抗CD48一抗(CD48A)和荧光标记的二抗对细胞进行染色后，通过流式细胞术分析细胞池，其中未转染的HKB11细胞作为CD48-阴性对照细胞。对于人和食蟹猴CD48，已鉴定出一种细胞池，其显示出各自靶蛋白的高且一致的表达。将这种池的小瓶冷冻；在含有嘌呤霉素的细胞培养基继续培养细胞两周后，确认了重组CD48过表达的稳定性。
将全部合成的DNA片段克隆至pD2529-CMVa Leap-In转座子载体(Atum公司，纽瓦克市/加利福尼亚州(Newark/CA)，美国)中。使用JetMessenger转染试剂，一式三份转染HKB11(ATCC，CRL-12568)细胞。将转座子载体与编码Leap-In转座酶的mRNA(Atum公司，纽瓦克市/加利福尼亚州(Newark/CA)，美国)一起共转染至细胞中。将转染细胞在抗生素嘌呤霉素存在的情况下于培养基中培养4周，以选择稳定的转染细胞。在用抗CD48一抗((MEM-102，PE标记的，分子探针公司(Molecular Probes)，A15768))和荧光标记的二抗对细胞进行染色后，通过流式细胞术分析细胞池，其中未转染的HKB11细胞作为CD48-阴性对照细胞。对于人和食蟹猴CD48，已鉴定出一种细胞池，其显示出各自靶蛋白的高且一致的表达。将这种池的小瓶冷冻；在含有嘌呤霉素的细胞培养基继续培养细胞两周后，确认了重组CD48过表达的稳定性。
表6.应用于工程化过表达细胞系的构建体
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表达CD48的Raji和U266细胞系的培养
使高CD48表达的Raji、CCL-86TM和U266/>TIB-196TM在37℃、5％CO2以及足够的湿度下在补充有10％FCS(吉博科公司(Gibco)，16000-044)、10mM HEPES(吉博科公司(Gibco)，15630080)和青霉素/链霉素(吉博科公司(Gibco)，15140-122)的含有Glutamax的RPMI(吉博科公司(Gibco)，11835-063)中生长。在Raji细胞中的CD48表达是高度可变的。用α-CD48-PE(英杰公司(Invitrogen)A-15768)和α-CD45-APC(BD制药公司(BDPharmingen)，555485)对细胞进行染色。在FACS ARIA上分选高度表达CD48的细胞，并随后以不同的接种浓度作为Raji-CD48high培养，以低浓度和高浓度在37℃、5％CO2和足够湿度下于添加ZellShield、Minerva Biolabs 13-0150的上述培养基中培养。扩增后，低密度和高密度接种的Raji CD48high+细胞示出了相同的高CD48表达。
小鼠的免疫和杂交瘤的产生
在PBS中制备抗原溶液。对于重组人CD48(R&D公司，3644-CD-050)为125μg/ml，而对于细胞系为200x106个细胞/ml。用含有重组CD48(R&D公司，3644-CD-050)、Raji或U266细胞的抗原对BALB/c和Biozzi ABH/RjiHSD小鼠(各三只雄性和三只雌性)进行初免和加强两次。选择四只小鼠进行融合。未用于融合的脾脏作为单细胞悬浮液冷冻。
通过ELISA进行血清抗体测定和杂交瘤筛选
为了滴度测定，将F96 cent Maxisorp Nunc免疫板(赛默科技公司(ThermoScientific)，439454)在包被缓冲液(百进公司(Biolegend)，421701)中以100μl/孔，用1μg/ml重组人CD48进行包被，并在4℃下孵育过夜。将鼠α-人CD48抗体、克隆MEM-102(英杰公司(Invitrogen)，MA-19119S)(也在本文描述为“CD48A”)和鼠α人CD48、克隆156-4H9(电子生物科学公司(eBioscience)，16-0489-85)应用为校准品并在测定稀释液(含有2％FCS和0.05％吐温20的PBS)中稀释至1000ng/ml。进行连续1:3稀释步骤一直到1.37ng/ml。在包被孔上没有抗体用作背景。为了排除非特异性作用，将用抗体稀释的非蛋白质包被的孔作为阴性对照。为了杂交瘤筛选，将上清液按1:10稀释。对于每个校准品浓度和小鼠血清或杂交瘤上清液稀释物，以100μl/孔的浓度一式两份使用。将板在定轨振荡器上在37℃和300xrpm下孵育1h。
孵育后，轻弹板以去除上清液并用300μl洗涤缓冲液将每孔洗涤五次。测定稀释液中以1:10000稀释二抗(山羊α-小鼠IgG(H+L)HRP(英杰公司(Invitrogen)，31430))并每孔使用100μl。将板在定轨振荡器上在室温下以300xrpm孵育一小时。再次轻弹板以去除上清液并用300μl洗涤缓冲液将每孔洗涤七次。通过每孔添加100μl底物溶液(生命技术公司(Life Technology)，002023)开始检测反应。将板在黑暗中、室温、不进行搅拌的情况下孵育15-30分钟。根据显色动力学，通过添加100μl/孔终止溶液(生命技术公司(LifeTechnology)，SS04)终止测定。在反应终止后的30分钟内使用SpectraMax在450nm和570nm处读取吸光度。
通过FACS进行血清抗体测定和杂交瘤筛选
通过对用于免疫的细胞系(RajiCD48high+和U266)进行孵育和FACS分析，分析所有血清对天然CD48蛋白质的特异性。CD48阴性T细胞系CEM(ATCC，CCL-119TM)作为对照。将每只小鼠的1μl未稀释、1:10和1:100稀释的血清与0.5x106个细胞/孔的对应细胞系一起于FACS缓冲液(AutoMACS冲洗缓冲液，美天旎公司(Milteny)；130-091-222和1:20稀释的BSA储备溶液；美天旎公司(Milteny)；130-091-376)中在冰上孵育30分钟。孵育后，将样品用FACS缓冲液洗涤两次，用二抗α-小鼠IgG-FITC(BD制药公司(BD Pharmingen)，554001(FACS缓冲液中1:50稀释))染色；并在黑暗中于冰上孵育30分钟。孵育后，将细胞用FACS缓冲液洗涤两次并将细胞沉淀悬浮于FACS缓冲液中且在FACS CANTO II上测量。
为了杂交瘤筛选，使用1.5x105个300-19WT和0.5x105个huCD48GFP转染子。将细胞悬浮于100μl杂交瘤上清液(纯的或1:10稀释的)中。作为对照，使用0.2μl/孔未标记的CD48A(MEM-102，英杰公司(Invitrogen)，A-15768)并用0.1μl/孔抗-小鼠IgG APC(BD制药公司(BD Pharmingen)，550826)进行检测。
杂交瘤的产生
制备CD48免疫小鼠脾脏的单细胞溶液。用PEG Hybrimax溶液(西格玛公司(Sigma)，P7181)进行融合，并将细胞铺板在HAT培养基(RPMI 1640，含有Glutamax和25mMHEPES、50μMβ-巯基乙醇、100μM次黄嘌呤、400nM氨喋呤、16μM胸苷、10％超低IgG FCS和100μg/ml Normocin)中的96孔板(100ml/孔)上，该培养基含有50μl小鼠腹膜细胞的饲养细胞层(BALB/c，请求ID107701)。以三种不同浓度：10x104、3x104和5x103个细胞/孔接种融合细胞。
在融合后第13天，应用ELISA和FACS开始筛选。在第15天，将HAT培养基更换为不含氨喋呤的HT培养基。
将ELISA和FACS阳性克隆在无饲养物的克隆和扩增培养基(RPMI 1640，含有Glutamax和25mM HEPES、10％超低IgG FCS、50μMβ-巯基乙醇、100μg/ml Normocin、HT补充物(吉博科公司(Gibco)，41056-012)和经调整H1杂交瘤克隆补充物；罗氏诊断公司(RocheDiagnostics)11088947001)中亚克隆，调整至2.5个细胞/ml的细胞浓度，每种杂合体铺板在两个96孔板上。
选择的杂交瘤克隆的克隆
根据制造商的方案，使用RNeasy迷你试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，74104)进行沉淀杂交瘤细胞的RNA分离。使用NanoDrop(赛默飞世尔公司(Thermo Fischer))确定RNA产率。
根据制造商的说明，使用来自生命技术公司(LifeTechnologies)的用于RT PCR的Superscript III第一链合成系统(180880-051)将RNA转化为cDNA。根据制造商的说明，应用来自诺瓦根公司(Novagen)的小鼠Ig-引物集(69831-3)和来自富酶泰斯公司(Fermentas)的Taq聚合酶(K0171)进行合成cDNA的扩增。在1.2％琼脂糖凝胶上分析25μl的PCR反应并用溴化乙锭染色。根据制造商的方案，使用手术刀切下条带并使用来自凯杰公司(Qiagen)的QIAquick凝胶提取试剂盒(28704)进行DNA凝胶提取。根据制造商的说明，使用来自凯杰公司(Qiagen)的PCR克隆试剂盒(231122)将提取的DNA用于PCR克隆，并将最终质粒产物用于TOP10化学感受态细胞(英杰公司(Invitrogen)，C-404010)的转化。将转化的细胞铺展在用X-gal(英杰公司(Invitrogen)，R-0402)处理的LB-卡那霉素的板上。由不含PCR产物的pDrive克隆载体转化的细胞将表达LacZα-肽并且当在X-gal的存在下生长时将形成蓝色菌落。因此，根据制造商的方案，使用QIAprep Spin微量制备试剂盒(凯杰公司(Qiagen)27106)仅挑选白色菌落并培养用于质粒制备。
如对于CD48免疫原产生所述的，进行用于抗体表达和纯化的HEK细胞的转染。
人源化序列的产生
编码人源化VL和VH结构域的DNA序列以GeneArt(生命技术公司(LifeTechnologies Inc.)，楚格州(Zug)，瑞士)订购，包含针对智人的优化密码子。将编码VL和VH结构域的序列通过从GeneArt衍生的运载体切割和粘贴从而亚克隆到适于在哺乳动物细胞中分泌的表达运载体中。将重链和轻链克隆到单独的表达运载体中以允许共转染。表达运载体的元件包括启动子(巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子)、促进分泌的信号序列、多腺苷酸化信号和转录终止子(牛生长激素(BGH)基因)、允许在原核生物中游离型复制和复制的元件(例如SV40起点和ColE1或本领域已知的其他元件)和允许选择的元件(氨苄青霉素抗性基因)。
抗体的表达和纯化
在FreeStyle293TM表达培养基(英杰公司(Invitrogen)，12338)中使用40kDa线性PEI(PEI Max，波利塞斯公司(Polysciences)，VWR，POLS24765-2)作为基因递送载体，用合适的重链和轻链表达质粒瞬时转染CAP-细胞(人羊水细胞；CEVEC制药有限公司(CEVECPharmaceuticals GmbH)，德国科隆(Cologne，Germany))。
简言之，将1ml OptiMEM培养基(英杰公司(Invitrogen)，51985)中的30ug轻链和重链质粒DNA逐滴添加至含有1E+8细胞的18ml FreeStyle培养基的250ml摇瓶中，随后边摇动边添加1ml Pei Max溶液。之后将烧瓶在37℃、6％CO2、85％湿度下以100rpm孵育4小时。随后，将20ml预热的蛋白质表达培养基(PEM，英杰公司(Invitrogen)，12661，该培养基含有4mM L-谷氨酰胺和5ug/ml杀稻瘟菌素(英杰公司(Invitrogen)R21001)以及最终浓度为4mM的丙戊酸(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，P4543)添加至培养物中。将细胞在37℃、6％CO2、85％湿度、115rpm下继续培养7天。
用Steri-Flip过滤上清液并且在200μl树脂上用Tecan robot MabSelect Sure纯化抗体。简言之，用10体积的水和PBS(诺华股份有限公司)洗涤柱。加载样品并用10体积的水再次洗涤。用三体积的50mM柠檬酸、70mM NaCl(pH 3.2)进行抗体洗脱，随后用140μl 1MTris(pH 9.0)中和,并通过0.22μm膜(密理博公司(Millipore)Steriflip)过滤。
对于浓度，在分光光度计ND-1000(NanoDrop)上在280nm处测量测定抗体，并且基于序列数据计算蛋白质浓度。检测洗脱液的聚集性(SEC-MALS)。
从诺华股份有限公司帕拉斯(Pallas)噬菌体文库淘选的抗体
使用合成的人Fab噬菌粒文库(诺华生物医学研究所)用于噬菌体展示选择。通过GeneArt(生命技术公司(Life Technologies Inc.)，楚格州，瑞士)合成编码种系框架组合(IGHV3-23和IGKV1-39、IGHV3-23和IGLV3-9、IGHV1-46和IGKV1-39、IGHV3-15和IGLV1-47)的基因片段(呈Fab形式)，并将其克隆至作为基础模板的噬菌粒载体中。使用这些人种系作为噬菌体展示文库的展示有利框架组合。噬菌粒载体由氨苄青霉素抗性、CilE1起源、M13起源和lac启动子之下的双顺反子表达盒组成，该lac启动子具有OmpA-轻链、随后是phoA-重链-Flag-6xHis(SEQ ID NO:84)-琥珀(Amber)终止-截短的pIII(氨基酸231-406)。
仅HCDR3是多样性的，且设计引物以掺入多达11个氨基酸(以模仿其天然存在的定义比率)：天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、酪氨酸和色氨酸。在HCDR3的某些位置也允许亮氨酸和苯丙氨酸。有意地省略某些残基以去除潜在的翻译后修饰位点。使用三核苷酸技术(Trinucleotide technology)(ELLA生物技术公司(ELLA Biotech))进行随机引物合成以排除终止密码子、甲硫氨酸、半胱氨酸和天冬酰胺。
允许长度在8、10、12、14、16和20个氨基酸之间，其中最后两个氨基酸保持恒定，对于长度8-16而言是序列Asp-Tyr而对于长度20而言是Asp-Val。最后两个HCDR3氨基酸的设计反映出人VDJ重组。短HCDR3更经常使用J-片段IGHJ4，其中在HCDR3的末端带有“DY”，而较长的HCDR3(这里20个aa)更经常使用IGHJ6，其中在HCDR3的末端带有“DV”。使用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB生物实验室公司(NEB Biolabs))通过PCR生成文库插入片段。将所得HCDR3文库插入片段连接到基础模板，转化到每个HCDR3长度的最小文库大小为3E+08个转化体的大肠杆菌TG1F+DUO(路西根公司(Lucigen))中，且使用VCSM13辅助噬菌体(安捷伦技术公司(Agilent Technologies))、使用标准方案产生噬菌体。
采用全细胞淘选分离识别人CD48的抗体。在室温下于1ml PBS/5％FBS(吉博科公司(Gibco)，16000044)中将噬菌体文库阻断2小时，随后添加1E+07个CHO野生型细胞。将混合物在4℃、30rpm下孵育过夜，随后在300g、4℃下离心5分钟。将预吸附的噬菌体上清液添加至靶细胞中。
用不同的荧光染料(充满活力的(Vibrant)细胞标记溶液，英杰公司(Invitrogen)，#V22885、#V22886、#V22887)标记CHO野生型和人CD48过表达细胞并以不同比例混合。在4℃下在旋转器上进行淘选持续4小时。在5ml 5％FBS/PBS中将细胞洗涤三次并在300g、4℃下离心。将细胞悬浮于FACS缓冲液(PBS，0.5％FBS)中并过滤至FACS管中。在BD Aria II上根据颜色将细胞FACS分选至两个管-WT CHO和CD48+CHO细胞。
为洗脱结合的噬菌体，将细胞沉淀悬浮于1ml 100mM甘氨酸-HCl、500mM NaCl(pH2.2)((GE医疗集团(GE Healthcare)，BR-1003-55)中。在室温下孵育10分钟，在300g下离心2分钟，并将洗脱的噬菌体(上清液)转移到含有用于中和的110μl 1M Tris(pH 8)(弗鲁克公司(Fluka)，93350)新的管中。
使用洗脱的噬菌体来感染指数生长的琥珀抑制因子TG1F+细胞(Lubio科学公司)。感染的细菌在2YT(16g/l细菌用胰蛋白胨(bactotryptone)；贝克顿迪金森公司(Becton-Dickinson 211699)、10g/l细菌用酵母提取物；贝克顿迪金森公司(Becton-Dickinson212720))、5g/l NaCl(默克公司(Merck)6404)、100μg/ml氨苄青霉素(西格玛公司(Sigma)，A0166)和1％葡萄糖(西格玛公司(Sigma)，G8270)培养基中在37℃、200rpm下培养过夜并用VCSM13辅助噬菌体进行重复感染。
然后，通过将重复感染的细菌在含有0.25mM异丙基b-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG，罗氏公司，11 411 446 001))的2YT/氨苄青霉素/卡那霉素(卡比化学公司(Calbiochem)，420411)培养基中在22℃、180rpm下培养过夜来诱导噬菌体颗粒的产生。将含有来自过夜培养物的噬菌体的上清液通过PEG/NaCl沉淀进行纯化、滴定，并在下一轮中进行选择。
通过NGS筛选回收富集的抗体序列
每一轮噬菌体选择后，使用QIAprep Spin微量制备试剂盒(凯杰公司(Qiagen))制备回收的与野生型CHO细胞和表达CD48的CHO细胞的结合体的多克隆质粒DNA。在第一次PCR中，用悬垂引物将CDR-H3扩增9个循环，允许在连续步骤中进行标准TruSeq引物退火。在第二次PCR中，在12个循环内使用了带有TruSeq通用正向衔接子的引物和24个TrueSeq索引反向引物之一。使用1.5％琼脂糖凝胶和Wizard SV凝胶以及PCR清除系统(普洛麦格公司(Promega)，A9282)纯化所得片段。使用Qubit DNA高灵敏度试剂盒(英杰公司(Invitrogen)，Q32B54)测量DNA浓度。在MiSeq上使用MiSeq试剂5试剂盒v3(依诺米那公司(Illumina))分析样品，进行150次正向循环。
如(Liu等人,2019,BMC Bioinformatics[BMC生物信息学],20,401.)所述对NGSFastQ输出文件进行数据分析。对于每个淘选输出，使用可变区边界上固定的侧翼序列为模板，分析100,000个序列以定位和分割出HCDR3序列。根据淘选输出池鉴定约40,000至70,000个HCDR3序列，并以CSV形式纳入频率报告。为了抗体表达，选择高于2％出现率的克隆。
噬菌体和杂交瘤衍生的/人源化抗体的亲和力成熟
对帕拉斯(Pallas)选择的抗体NOV3731以Fab形式进一步工程化，以通过使用在HCDR1、HCDR2和所有轻链CDR中具有多样性的亲和力成熟盒文库来改善亲和力。根据天然存在的重排人CDR序列库，CDR是多样化的。设计引物，掺入相应的重链和轻链CDR氨基酸(以模仿其天然存在的定义比率)：天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸和酪氨酸。在LCDR3的某些位置也允许谷氨酰胺、脯氨酸和色氨酸。
对于CDR成熟盒，使用三核苷酸技术(ELLA生物技术公司(ELLA Biotech))进行随机引物合成以排除终止密码子、甲硫氨酸、半胱氨酸和天冬酰胺。通过两个PCR步骤使用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB生物实验室公司(NEB Biolabs))进行CDR随机化。首先，进行随机化PCR，随后应用在两端引入限制性位点的引物扩增随机化片段。然后，使用合适的限制性位点将这种扩增PCR连接到基础模板噬菌粒载体，转化到最小文库大小为1E+08个转化体的大肠杆菌TG1F+DUO(路西根公司(Lucigen))中。
重链和轻链CDR特定亲和力成熟文库受到相关酶限制，并将其单独地克隆至亲本抗体中，用多样化序列的随机盒代替亲本CDR。将文库转化到TG1F+感受态细胞(英杰公司(Invitrogen))中。通过用VCSM13辅助噬菌体重复感染产生噬菌体颗粒，然后将其通过PEG/NaCl沉淀。
通过产生LCDR1和LCDR3以及HCDR1、HCDR2和HCDR3的NNK文库，将杂交瘤衍生的和人源化的抗体NY258以Fab形式进一步工程化。将扩增文库经由合适的限制性位点克隆至噬菌粒载体中，转化到最小文库大小为1E+08个转化体的大肠杆菌TG1F+DUO(路西根公司(Lucigen))中。通过用VCSM13辅助噬菌体重复感染产生噬菌体颗粒，然后将其通过PEG/NaCl沉淀。
对于每个候选抗体(NOV3731和NY258)，这五个亲和力成熟文库在重组人(北京百谱塞斯生物科技股份有限公司(Acrobiosystems)，BC1-H5255)和食蟹猴(室内iProt112617)CD48-huIgG-FC上进行两轮固相淘选。将每个文库5x109个噬菌体在体积为500μL的PBS(PanReac AppliChem，A0830)、0.05％吐温(西格玛公司(Sigma)，P9416)中的2.5％乳粉中封闭过夜。将96孔maxisorb板(能肯公司(Nunc)，442404)用PBS中的5ug/ml的300ul无关FC蛋白质包被。将板用300μL PBS洗涤3次，并在摇动的同时将封闭的噬菌体文库在室温下以250μL/孔孵育30分钟以预吸附潜在的人IgG-FC结合噬菌体。
之后，将预吸附的噬菌体转移至人或食蟹猴CD48包被的板中并在室温下孵育2小时，伴随摇动。将板用5μL/ml的300μL CD48-IgGFc蛋白进行包被并用PBS洗涤3次。此外，将噬菌体文库与无关蛋白和BSA一起孵育。也仅是将噬菌体一轮一轮地转入，即模拟淘选。
在选择轮次期间强化洗涤方案，使用0.05％吐温20的PBS进行2个循环(3x快速和2x 5分钟)的快速洗涤，并且使用PBS进行5分钟洗涤，随后在第二轮中进行2个循环(5x快速和4x 5分钟)。用10mM甘氨酸/HCl(pH 2.0)洗脱噬菌体。用洗脱噬菌体(预先使用1M Tris/HCl(pH8.0)将其中和)感染大肠杆菌TG1F+。使用VCSM13辅助噬菌体(安捷伦公司(Agilent))在各轮之间进行噬菌体繁殖。第二轮淘选后，使用DNA微量制备物用于NGS筛选。以GenArt订购所选择的序列，并在各个重链和轻链表达载体中进行克隆。在HEK293细胞中进行IgG表达并且在200μl树脂上用Tecan robot MabSelect Sure纯化抗体。
分析NGS筛选的抗体-与人和食蟹猴CD48的交叉结合
在ELISA中测试纯化的抗体与重组人和食蟹猴CD48的结合。用20μl huCD48-huFc、cyCD48-huFc、huCD48-bio或在PBS中以5μg/mL稀释的BSA作为对照(西格玛公司(Sigma)，A7906)，在4℃下对Black MaxisorpTM(能肯公司(Nunc))384孔板(赛默飞世尔公司(Thermofischer)，460518)包被过夜。第二天，用120μL/孔的TBST(TBS-0.05％吐温20)将板洗涤三次。在室温下用120μL/孔的5％乳粉/PBS将板封闭3h并用120μL/孔的TBST洗涤三次。将抗体以1:3的比例从100nM稀释至45pM，并以20μL/孔添加。在室温下孵育1小时后，用120μL/孔的TBST将板洗涤3次。为了检测，每孔添加在0.25％乳粉/PBS+0.05％吐温20中以1:5000稀释的20μl AP缀合的抗-huIgG(特定Fab片段，杰克逊公司(Jackson)，109-055-097)。在室温下孵育1小时后，用120μL/孔的TBST将板洗涤3次。将Attophos荧光底物(罗氏公司，11681982001)在水中以1:5稀释并以20μL/孔添加，孵育10分钟，并在405nm处测量吸光度。利用ELISA方法，检测候选抗体NY920和NY938与人和食蟹猴CD48的特异性结合。
测试纯化的抗体与表达人和食蟹猴CD48的细胞的结合。每次染色在96孔板(赛默飞世尔公司(Thermo Fischer)，NunclonΔ表面163320)的一个孔中应用5x105个人或食蟹猴CD48过表达HKB11细胞以及野生型细胞。以3种浓度(100、10和1μg/ml)应用抗体。在每孔50μl PBS/1％FCS(FACS缓冲液)中稀释抗体并在冰上孵育30分钟。用250μl FACS缓冲液将孔洗涤2次，以300g离心2分钟，并通过翻转板并在纸上轻拍去除上清液。为了检测，每孔添加在FACS缓冲液中以1:2000稀释的50μl小鼠抗人Fab(PE-缀合的，杰克逊公司(Jackson)，109-116-097)并在黑暗中、在冰上孵育30分钟。用250μl FACS缓冲液将细胞洗涤2次，并悬浮于每孔200μl FACS缓冲液中用于FACS分析。在BD Calibur上分析细胞。利用细胞结合和FACS分析揭示了候选抗体NY920和NY938与人和食蟹猴CD48的特异性结合。
实例2：抗CD48抗体与人和食蟹猴CD48蛋白的亲和力
使用SPR技术、使用配备有蛋白质A传感器芯片(思拓凡公司(Cytiva)，订购号29-1275-56)的Biacore T200仪器(思拓凡公司(Cytiva))，确定各种抗体与人CD48及其食蟹猴直向同源物的亲和力。使用含有10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％(v/v)表面活性剂P20(天惠华公司(Teknova)，订购号H8022)的HBS-EP+(pH 7.4)作为运行缓冲液以及用于样品稀释。
将抗CD48抗体以5μg/ml稀释并在流动池2和4上以10μl/min注射20秒。所有抗体的捕获水平是370-440RU。将流动池1和3留空(没有捕获抗体)并用作参考表面。人和食蟹猴CD48用作溶液中的分析物。随后通过在所有流动池上以50μl/min注射分析物1:2稀释系列(人CD48：100-0.8nM，食蟹猴CD48：500-3.9nM)持续180s，随后经360s解离时间，获得动力学数据。在每个抗体捕获和分析物注射循环后，在50μl/min的流速下用10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)(思拓凡公司(Cytiva)，订购号BR100354)将芯片表面再生2x30s。进行三次重复测量并进行缓冲液空白注射。在25℃下进行测量并在10Hz的速率下收集数据。
使用Biacore 8K评估软件评估数据。对原始数据进行双重参考，即，用参考流动池(没有捕获抗体)的应答校正测量流动池的应答，并且在第二步骤中减去空白注射液(缓冲液)的应答。最后，通过应用1:1交互模型来拟合传感图，恒定拟合为RI(0)并且对Rmax进行全局拟合。计算动力学速率常数(ka，kd)和平衡解离常数(KD)。每次运行都单独地处理数据。使用生成的值来计算平均值和相应平衡解离常数和动力学速率常数的标准差。
表7：获得的抗CD48抗体对人和食蟹猴CD48的亲和力估计值
实例3：用突变的人CD48蛋白质构建体进行表位分箱(Epitope binning)
应用CD48蛋白的3D结构模型，选择蛋白质的三个暴露环并利用PCR通过定点突变进行改变。通过ELISA确定抗体结合表位。指定位点是残基50-55；将ENYKQ(SEQ ID NO:78)-修饰为GSSKQ(SEQ ID NO:79)，残基70-74；将DSRK(SEQ ID NO:80)-修饰为AAGK(SEQ IDNO:81)，和残基103-108；将KKTGNE(SEQ ID NO:82)修饰为KKDASG(SEQ ID NO:83)。模板构建体，hCD48EC：小鼠Ig来源于为表达用于免疫的人类CD48-小鼠IgG1融合蛋白而产生的表达质粒，该质粒由商业载体“真克隆，CD48(未标记)-人CD48分子”(傲锐东源公司(Origene)，NM_001778.2)扩增而来。通过微波合成仪(Microsynth，瑞士)合成用于定点突变的引物。
用1:10稀释的HEKT293培养上清液和抗CD48抗体NY938、NY920和人源化CD48A(也称为人源化MEM102抗体：重链序列QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTFTGEPSYGNVFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARRHGNGNVFDSWGQGTLVTVSSATKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:73)；轻链序列EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSNIHWYQQKPDQSPKLLIKYTSESISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNSWPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:74))以500、250和25ng/ml进行用于表位分箱的ELISA。未突变的CD48-小鼠IgG融合构建体作为阳性对照，并且未转染的细胞上清液作为阴性对照。用山羊α-小鼠IgG(H+L)HRP(英杰公司(Invitrogen)，31430)进行检测。
构建体#2248在氨基酸50-55处携带突变的残基，#2249在氨基酸70-74处携带突变的残基以及#2250在氨基酸103-105处携带突变的残基。候选抗体NOV3731(图1A)和NY258(图1B)失去与构建体#2250的结合，并表明与构建体#2248的结合减少，因而NY258受氨基酸50-55的突变的影响更大。对照抗体人源化CD48A(图1C)示出与构建体#2250结合(与未突变CD48蛋白的结合范围相同)，并且未与构建体#2248结合。这些分析表明抗体NOV3731和NY258结合至与CD48A不同的表位。
实例4：含有NY938IgG的复合物中人CD48EC结构域的X射线晶体结构确定
迄今为止，人CD48的三维结构是未知的。确定含有抗CD48NY938-hIgG1_κ(a-fuc)复合物中人CD48细胞外结构域片段的晶体结构。如下文详述，表达人CD48(氨基酸29-130)，将其纯化并与抗CD48-NY938-hIgG1_κ(a-fuc)混合以形成复合物，随后将复合物进行结晶。然后，采用蛋白质晶体学以产生与NY938结合的人CD48的原子级分辨数据以定义表位。
表8：用于晶体学而产生的人CD48 ECD和抗CD48-NY938-hIgG1_κ(a-fuc)氨基酸序列
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用于晶体学的人CD48细胞外结构域和抗CD48-NY938-hIgG1_κ(a-fuc)的蛋白质产 生
NY938-hIgG1_κ(a-fuc)的产生
为了NY938-hIgG1产生，应用PeiMAX(波利塞斯公司(Polysciences)，24765)用表达构建体瞬时转染HEK293T细胞。简言之，在M11V3无血清培养基中(生物概念公司(Bioconcept)，瑞士，目录号：V3K)培养细胞并在36％的最终体积中调整至2.8x106个细胞/ml。通过在7％终体积M11V3中稀释0.8mg/L终体积DNA并温和混合来制备DNA溶液(溶液1)。为了预防培养物污染，可以使用0.22μm过滤器(例如密理博公司(Millipore)Stericup)过滤该溶液。然后，将2.4mg/l终体积PEI溶液在7％终体积M11V3中稀释并温和混合(溶液2)。将两种溶液在室温下孵育5至10分钟。此后，在温和混合下将溶液2添加到溶液1中，并在室温下再孵育5至15分钟。孵育后，将转染混合物添加到细胞中，并将培养物培养四至六小时。最后，为了调整剩余的50％培养体积，添加ExCell VPRO培养基(西格玛-奥德里奇公司(SigmaAldrich)，目录号：14561C)。将细胞继续培养7天。将上清液在4500rpm、4℃下离心20分钟，(贺利氏公司(Heraeus)，Multifuge 3SR)并通过无菌过滤器0.22μm(Stericup过滤器)澄清。将950ml细胞培养上清液(2.6mg/ml)以1ml/min加载到25ml Mab Select SuRe柱(用2CV的0.1M NaOH汽提；用PBS(pH 7.4)平衡)上过夜。用PBS(pH 7.4)进行基线洗涤后，用50mM柠檬酸/140mm NaCl(pH 2.7)洗脱结合物质，用5M NaOH将pH调整至7.2，并且进行无菌过滤。理论pI：9.2产率：130.0mg，2.6mg/ml。分析表明14.3％蛋白质聚集。使用Amicon搅拌池(MWCO 30kDa，密理博公司(Millipore)；#PLTK04310)，将Mab Select SuRe洗脱液浓缩至10ml并经由10ml样品环将浓缩物质注射至HiLoad XK26/600Superdex 200PrepGrade柱中。运行缓冲液：PBS，pH 7.4；流速：1.0ml/min；收集5ml级分。将含有蛋白质的级分合并，显示为34ml，2.48mg/ml。
Met-人CD48(aa29-130)-APP6-Avi-His蛋白质的产生
在大肠杆菌中，以1升比例表达Met-人CD48(aa29-130)-APP6-Avi-His。首先，将编码蛋白质片段的质粒转化到化学感受态TG1F-大肠杆菌细胞中。细菌在37℃下、在LB/Agar/1％葡萄糖/25μg/ml卡那霉素板上生长过夜后，用一个菌落接种3ml预培养物(2xYT/1.0％葡萄糖/34μg/ml卡那霉素)。在37℃下孵育培养物，以220rpm摇动直至达到OD600nm＝2。然后将预培养物转移至100mL预培养物(2xYT/1.0％葡萄糖/25μg/ml卡那霉素)中。在37℃下孵育此培养物，以220rpm摇动直至达到OD600nm＝2。第二天，将10mL预培养物转移至1000ml表达培养物(2xYT/0.1％葡萄糖/25μg/ml卡那霉素)中。在37℃下孵育表达培养物，以200rpm摇动直至达到OD600nm为1.0-1.2。通过添加IPTG至终浓度1mM诱导表达。在20℃和200rpm下进行表达过夜。第二天，将细胞沉淀并在-80℃下冷冻。
将每1克细菌沉淀悬浮于10ml裂解缓冲液(0.1M Tris/HCl、0.1MNaCl、1mM EDTA、3mM甲硫氨酸、0.1％溶菌酶)中，并伴随温和搅拌在4℃下孵育30分钟。添加10mM MgCl2和10U/ml全能核酸酶(Benzonase)并再次将细胞在4℃下温和搅拌30分钟。通过弗氏压碎器在800巴下将裂解的细胞进行两次传代。添加0.5体积的60mM EDTA、1.5M NaCl、5％(v/v)Triton X-100溶液，随后伴随搅拌在4℃下孵育60分钟。
通过在10,000g下离心30分钟去除细胞碎片。用一体积50mM Tris/HCl、0.8MNaCl、30mM EDTA、3mM甲硫氨酸将沉淀洗涤两次并用50mM Tris/HCl、0.3M NaCl、10mMEDTA、3mM甲硫氨酸洗涤3次。
在室温下，将每克内含体(IB)溶解于10ml 6M胍(pH 8.5)、20mM Tris、1mM EDTA和5mM DTT中过夜。向溶解的IB中补充20mM DTT并用于再折叠。在4℃下于50mM Tris(pH8.5)、0.5M Arg、5mM EDTA、4mM GSH、1.5mM GSSG中进行再折叠并在TFF装置上浓缩再折叠物(截留，5kDA)。将浓缩的再折叠物加载到5mL HisTrap Excel柱上，该柱先前已用10mMHepes、100mM NaCl(pH 7)平衡。用相同的缓冲液将柱洗涤至基线，并且通过线性梯度从0％至100％500mM咪唑在20mL缓冲液中进行洗脱。将含有蛋白质的级分合并，并用10mM Hepes、100mM NaCl(pH 7)透析以除去咪唑。在-80℃下冷冻蛋白质。
人CD48与NY938-IgG的复合物通过以下来制备：以1.5:1.0摩尔比混合蛋白质并在25mM Hepes(pH 7)、150mM NaCl(总浓度1.4mg/ml)中平衡。使晶体在Swissci 96孔2滴MRC结晶板中通过坐滴蒸汽扩散法生长。详细地，将0.2μl蛋白质与0.2μl储液混合，并在20℃下将滴剂与80μl相同的储液平衡。用0.1M三水乙酸钠、40％w/vPEG200制成的储液，在10天内获得适用于X射线衍射分析的晶体。
为了数据收集，将一个抗CD48(29-130)-Avi-His//抗CD48(NY938)-hIgG1_κ晶体安装在低温回路中，并在液氮中快速冷却。在瑞士光源(瑞士保罗谢尔研究所(PaulScherrer Institute，Switzerland))的光束线X10SA(PX-II)处收集衍射数据，该瑞士光源具有Pilatus像素检测器和波长的X射线。总计，在晶体与检测器距离为430mm处各记录了720个0.25deg振荡图像。使用autoPROC工具箱(Vonrhein,C.,Flensburg,C.,Keller,P.,Sharff,A.,Smart,O.,Paciorek,W.,Womack,T.和Bricogne,G.ActaCrystallogr D Biol Crystallogr[晶体学报D辑：生物晶体学]2011年4月；67(Pt 4):293-302)在/>分辨率下处理并缩放数据。晶体处于空间组P212121中，其中细胞维度 α＝90°，β＝90.0°，γ＝90°。使用移相器(Phaser)(McCoy等人,(2007)J.Appl.Cryst.[应用结晶学杂志]40:658-674)，通过分子置换解析人CD48残基29-130/NY938 Fab复合物结构。在COOT(Emsley等人,(2010)ActaCrystallogr.Sect.D:Biol.Crystallogr.[晶体学报D辑：生物晶体学]66:486-501)中建立最终模型并用Buster(全球定相公司(Global Phasing，LTD))精修至R工作和R自由值分别为20.1％和24.8％，键长和键角的rmsd分别为/>和1.11°。通过CCP4程序套件的程序Ncont(Collaborative Computing Project[协同计算项目]，第4期(1994)ActaCrystallogr.Sect.D:Biol.Crystallogr.[晶体学报D辑：生物晶体学]50:760-763)鉴定人CD48残基29-130(在NY938 Fab中的任一原子的/>内含有原子)的残基并在表9和表10中列出。
NY938的CD48表位
将CD48-NY938 IgG复合物的晶体结构用于鉴定NY938 IgG的CD48表位。NY938 IgG在人CD48上的相互作用表面是由两段不连续(即，非连续)序列形成，这两段不连续的序列涵盖氨基酸残基54至64以及残基105至121。其中，残基54、58、60、61、62、64、105、107、119、111、114、115、117、119和121中可以被映射，这有助于短于的直接分子间接触(在非氢原子间)，如表9和表10中所详述。这些残基在人CD48上形成由NY938识别的三维表面。/>
表9.人CD48和NY938-IgG重链(H)之间的相互作用。将CD48残基基于人CD48序列(SEQ ID NO:53)进行编号。将NY938-IgG重链残基基于其线性氨基酸序列SEQ ID NO:65进行编号。所示的CD48残基在NY938 IgG中的原子的内具有至少一个原子。
表10.人CD48和NY938-IgG轻链(L)之间的相互作用。将CD48残基基于CD48(SEQ IDNO:53)进行编号。将NY938-IgG轻链残基基于SEQ ID NO:51的氨基酸序列进行编号。所示的CD48残基在NY938IgG中的原子的内具有至少一个原子。/>
基于亲本抗体NY258对NY938进行亲和力成熟化。用突变的人CD48蛋白质构建体进行表位分箱(第23页)示出，NY258与CD48的主要接触位于CD48蛋白质氨基酸50-55和105-108的区域。此结果与NY938 IgG-CD48复合物的结晶和结构测定一致。
实例5：抗CD48抗体缀合
CD48A-valcit-MMAE的合成
使用聚乙烯亚胺将编码CD48A-CysMab抗体的重链和轻链(重链序列：QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTFTGEPSYGNVFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARRHGNGNVFDSWGQGTLVTVSSATKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPCPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPCDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:70)；轻链序列EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSNIHWYQQKPDQSPKLLIKYTSESISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNSWPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:74))的表达载体转染至悬浮HEK293细胞中并培养5天。通过离心收获培养上清液，过滤，并通过蛋白质A亲和色谱法纯化抗体。如果需要，通过尺寸排阻色谱法去除聚集体。由分析型尺寸排阻色谱法确定亲和色谱法后的抗体纯度并且是纯度>98％的单体。将抗体在磷酸盐缓冲盐水(pH 7.2)中缓冲。将10mg CD48A抗体(0.068微摩尔，1.0当量)与1ml沉降的RMP蛋白质A树脂(GE生命科学公司(GE Lifesciences)，17513803)一起孵育并搅动15分钟。添加半胱氨酸HCl一水合物至终浓度为20mM，并在室温伴随搅动孵育30分钟，以使反应性半胱氨酸解粘连。用50倍柱体积的PBS在真空歧管上快速洗涤树脂。然后将树脂重悬在含有250nMCuCl2的等体积PBS中。通过采取时间点来监测抗体链间二硫键的重新形成。在每个时间点，除去25μL树脂浆液，添加1μL 20mM的MC-valcit-PAB-MMAE(联宁生物制药公司(LevenaBiopharma)；SET0201)，并将管轻弹几次。旋转沉降树脂，除去上清液，然后用50μL抗体洗脱缓冲液(赛默科技公司(Thermo Scientific)，21004)洗脱。沉淀树脂，并使用安捷伦PLRP-S4000A 5um，4.6x50mm柱(缓冲液A为水、0.1％TFA，缓冲液B为乙腈、0.1％TFA，柱保持在80C，流速1.5ml/min；梯度0分钟-30％B，5分钟-45％B，6.5分钟-100％B，8分钟-100％B，10分钟-30％)通过反相色谱法分析上清液。添加CuCl2后60分钟，通过用50倍柱体积PBS在真空歧管上洗涤将其去除，然后添加2ml PBS以重悬。向此树脂和抗体的浆液中添加MC-valcit-MMAE(DMSO中27.5μl的20mM溶液，0.544微摩尔，8当量)。然后，将所得混合物在环境温度下孵育3小时。然后用50倍柱体积的PBS洗涤树脂。用抗体洗脱缓冲液(赛默科技公司(ThermoScientific)，21004)将ADC从树脂上洗脱。然后，通过透析将ADC缓冲液更换为1X PBS(20XPBS，天惠华公司(Teknova)P0191)。然后，使用离心浓缩器(使用Amicon Ultra-15，50KDa，再生纤维素)(密理博公司(Millipore)，UFC0905024)将该物质浓缩至1mg/ml，并通过0.22μm无菌PVDF过滤器，25mm(密理博公司(Millipore)，SLGV013SL)无菌过滤且在4℃下储存。最终产量为1.7mg(0.011μmol)。进行了以下分析：分析型尺寸排阻色谱法(SEC)以确定单体百分比，质谱法(MS)以确定DAR，LAL试验以确定内毒素载荷，以及蛋白浓度由A280利用消光系数和抗体分子量确定。HRMS数据(蛋白方法)指示重链的主要质量为53042da，通过比较DAR1、DAR2和DAR3物种的峰的MS强度给出计算的DAR为3.9。如通过比较210和280nm处的高分子量峰值吸光度面积与单体ADC的峰值吸光度面积确定的，SEC指示1.3％的聚集。
一般方法(1)：根据以下方法，通过液相色谱-质谱法(LC/MS)确定示例性ADC中药物与抗体的比率(DAR)。对于所有LC方法，流动相A为纯化的MS级水(霍尼韦尔公司(Honeywell)，LC015-1)，流动相B为MS级80％异丙醇(霍尼韦尔公司(Honeywell)LC323-1):20％乙腈(霍尼韦尔公司(Honeywell)，LC015-1)，LC323-1)，补充有1％甲酸(FA)(赛默科技公司(Thermo Scientific)，85178)。将柱温设定在80℃。对所有合成的ADC优化通用MS方法。用于分析的柱为安捷伦(Agilent)PLRP-S 4000A；2.1x150mm，8um(安捷伦公司(Agilent)，PL1912-3803)。使用的流速为0.3ml/min。在Acquitty Bio H-ClassQuaternary UPLC(沃特世公司(Waters))上使用的梯度为0-0.75分钟95％A，0.76-1.9分钟75％A，1.91-11.0分钟50％A，11.01-11.5010％A，11.51-13.50分钟95％A，13.51-18分钟95％A。MS系统为Xevo G2-XS QToF ESI质谱仪(沃特世公司(Waters))，从1.5-11分钟获取数据并且在15000-80000道尔顿之间分析质量。从解卷积光谱或UV色谱图通过对未缀合和缀合的给定物种(mAb或相关片段)的完整MS(总离子流)或UV(280nm)峰面积求和(通过每个面积乘以附接的药物数量加权)确定DAR。将求和且加权的面积和除以总面积的和，结果得到全部ADC的最终平均DAR值。
纯化后进行尺寸排阻色谱法(SEC)(1)以确定ADC的质量和聚集百分比(％)。在分析柱Superdex 200Increase 5/150GL(GE医疗集团(GE Healthcare)，28990945)上，等度条件100％PBS(pH 7.2)(海克隆(Hyclone)SH30028.03)、150mM NaCl、1mM EDTA，流速0.45ml/min下进行分析持续8分钟。基于280nm处的峰面积吸光度定量ADC样品的聚集级分％。计算是基于280nm处高分子量洗脱液除以相同波长处高分子量洗脱液和单体洗脱液的峰面积吸光度之和的比值乘以100％。在配备有Wyatt miniDAWN光散射和Treos折射率检测器的安捷伦(Agilent)Bio-Inert 1260HPLC(怀雅特技术公司(Wyatt Technologies)，圣巴巴拉市，加利福尼亚州(Santa Barbara，CA))上获得数据。
NY920-valcit-MMAE的合成
通常如上所述合成并表达抗体NY920。将20mg抗体NY920 CysMab(0.136微摩尔，1.0当量)与2ml沉降的RMP蛋白质A树脂(GE生命科学公司，17513803)一起孵育并搅动15分钟。添加半胱氨酸HCl水合物至终浓度为20mM，并在室温伴随搅动孵育30分钟，以使反应性半胱氨酸解粘连。用50倍柱体积的PBS在真空歧管上快速洗涤树脂。然后将树脂重悬在含有250nM CuCl2的等体积PBS中。通过采取时间点来监测抗体链间二硫键的重新形成。在每个时间点，除去25μL树脂浆液，添加1μL 20mM的MC-valcit-PAB-MMAE，并将管轻弹几次。旋转沉降树脂，除去上清液，然后用50μL抗体洗脱缓冲液(赛默科技公司(Thermo Scientific)，21004))洗脱。沉淀树脂，并使用安捷伦PLRP-S 4000A 5μm，4.6x50mm柱(缓冲液A为水、0.1％TFA，缓冲液B为乙腈、0.1％TFA，柱保持在80C，流速1.5ml/min；梯度0分钟-30％B，5分钟-45％B，6.5分钟-100％B，8分钟-100％B，10分钟-30％)通过反相色谱法分析上清液。添加CuCl2后60分钟，通过用50倍柱体积PBS在真空歧管上洗涤去除CuCl2，然后添加2ml PBS以重悬。向此树脂和抗体浆液中添加MC-valcit-MMAE(DMSO中55μl的20mM溶液，1.088微摩尔，8当量)。然后将所得混合物在环境温度下孵育3小时。然后用50倍柱体积的PBS洗涤树脂。用抗体洗脱缓冲液(赛默科技公司(Thermo Scientific)，21004)从树脂上洗脱ADC。然后通过透析将ADC缓冲液更换为1X PBS(20X PBS，天惠华公司(Teknova)P0191)并用HiLoad 16/600Superdex 200pg(GE医疗集团(GE Healthcare)，28989335)在杜氏PBS(Dulbecco’sPBS)(pH 7.2)(海克隆(Hyclone)SH30028.03)中进行制备型尺寸排阻色谱洗脱以去除聚集体。然后，使用离心浓缩器(使用Amicon Ultra-15，50KDa，再生纤维素)(密理博公司(Millipore)，UFC0905024)将该物质浓缩至4.5mg/ml，并通过0.22μm无菌PVDF过滤器，25mm(密理博公司(Millipore)，SLGV013SL)无菌过滤且在4℃下储存。进行了以下分析：分析型尺寸排阻色谱法(SEC)以确定单体百分比，质谱法(MS)以确定DAR(药物抗体比率)，LAL试验以确定内毒素载荷，以及蛋白浓度由A280利用消光系数和抗体分子量确定。HRMS数据(蛋白方法)可以指示重链+2物种的主要质量，给出DAR为4.0，此数据通过比较DAR1，DAR2和DAR3物种的峰的MS强度进行计算。如通过比较210和280nm处的高分子量峰值吸光度面积与单体ADC的峰值吸光度面积确定的，SEC可以指示聚集。
使用如上所披露的相似方案制备含有不同的如本文披露的CD48抗体的另外的ADC。
实例6：CD48抗体的内化和细胞增殖抑制
针对以下三种内源癌细胞系测试CD48抗体的内化活性：KMS-27：RPMI-1640+10％FBS中培养的JCRB号JCRB1188；NCI-H929：RPMI-1640+10％FBS+0.05mM 2-巯基乙醇中培养的ATCC号CRL-9068；和KMS-21-BM：RPMI-1640+10％FBS中培养的JCRB号JCRB1185。使用普洛麦格公司(Promega)CellTiter-增殖测定评估CD48抗体NY920、NY938和人源化CD48A内化结合到二级抗人Fc ADC缀合物导致抑制细胞增殖和生存的能力。
通常如实例5中所述合成并表达CD48抗体。将细胞系在组织培养箱中在5％CO2、37℃下在对其生长最佳的培养基中培养。在用于增殖测定的接种之前，在测定前至少2天分开细胞，以确保最佳生长密度。接种当天，使用细胞计数器(Vi-Cell XR细胞活力分析仪，贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))确定细胞活力和细胞密度。将活力高于85％的细胞接种在白色透明底部的384孔TC处理板(康宁公司(Corning)目录号3765)中。将细胞以1,000个细胞/孔的密度接种于40μL的标准生长培养基中。将板在组织培养箱中于5％CO2、37℃孵育过夜。第二天，在标准生长培养基中以10X制备游离MMAE有效负载、CD48A-CysMab-VC-MMAEADC(如在实例5中所述合成)、CD48抗体和非靶向同种型抗体。然后将MMAE游离有效负载和CD48A-CysMab-VC-MMAE ADC添加到细胞中，得到0.007 -150nM的最终浓度和50μL/孔的最终体积。然后将制备的抗体处理物(包括CD48IgG和非靶向同种型抗体)添加到细胞中，得到0.001-20nM的最终浓度和45μL/孔的最终体积。在标准生长培养基中以10X制备抗人Fc-VC-MMAE ADC(DAR2.0)。然后将制备的ADC添加到细胞中，得到60nM的最终浓度和50μL/孔的最终体积。每个药物浓度一式四份地进行测试。将板在组织培养箱中在5％CO2、37℃下孵育5天，之后通过添加25μL的CellTiter(普洛麦格公司(Promega)，目录号G7573)(一种裂解细胞并测量三磷酸腺苷(ATP)总含量的试剂)来评估细胞活力。将板在室温下孵育10分钟以稳定发光信号，然后使用发光读取器(EnVision多标记板读取器，珀金埃尔默公司(PerkinElmer))读数。为了评价药物处理的效果，使用来自含有未处理细胞(100％活力)的孔的发光计数对处理样品进行归一化。应用可变斜率模型以使非线性回归曲线与GraphPadPRISM版本7.02软件中数据相拟合。从所得曲线推算IC50和Amax值。
用表11中总结的所测试细胞系的代表性IC50值计算抑制50％细胞生长或存活(IC50)所需的mAb处理浓度。图2A(KMS-27)、图2B(NCI-H929)和图2C(KMS-21-BM)中示出了代表性癌细胞系的剂量应答曲线。
显示出代表性癌细胞系对MMAE有效负载敏感，IC50值范围为0.021-0.116nM活性。与抗人Fc-VC-MMAE ADC组合给药的同种型对照IgG未诱导脱靶活性。代表性癌细胞系对CD48A-CysMab-VC-MMAE ADC敏感，IC50值范围为0.062-6.1nM活性，表明靶向CD48的ADC可能存在内化和细胞毒性。NY938和NY920当与抗人Fc ADC组合给药时，诱导细胞死亡，其活性大于CD48A的活性。两种候选物(NY938和NY920)在三种癌细胞系中最有效。
这些研究表明CD48 IgG候选物能够在表达CD48的多种癌细胞系上内化并最终抑制细胞增殖。NY938和NY920抗CD48抗体比CD48A更有效。相对于癌细胞系上匹配的非靶向IgG对照同种型，几乎未表现出细胞毒性活性。
表11：CD48 IgG候选物：IC50
实例7：CD48抗体的KD测定
使用Biacore，评估了WT IgG和DAPA(D265A和P329A突变)变体与人和食蟹猴CD48结合的亲和力测定。如下所述，使用Biacore T200仪器(思拓凡公司(Cytiva)，以前为GE医疗生命科学公司(GE Healthcare Lifesciences))经由SPR进行动力学速率常数计算。
使用蛋白A捕获方法来确定对抗体的动力学。使用可商购的蛋白质A传感器芯片(思拓凡公司(Cytiva)，目录号29127556)，通过该传感器芯片，在表面上的蛋白质A捕获WT和DAPA变体，并且可溶性人和食蟹猴CD48流过作为分析物。人CD48和食蟹猴CD48浓度分别始于50nM和200nM，并且逐一连续稀释九个浓度。用甘氨酸(pH 1.5)(思拓凡公司(Cytiva)，目录号BR100354)洗涤的每个浓度结尾进行再生。
完成双参考减法以产生最终数据。将原始数据拟合至1:1结合模型，其中将一个或多个参数Rmax设置为本地。图3至图5和表12中示出了WT和DAPA IgG变体对人抗原的动力学结果。图6至图8和表13中示出了WT和DAPA IgG变体对食蟹猴抗原的动力学结果。
表12：WT和DAPA IgG候选物对人CD48的结合亲和力
实验序号 样品 抗原 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
1 NY920 WT 人CD48 2.57E+05 7.21E-04 2.81E-09
2 NY920 WT 人CD48 2.24E+05 6.98E-04 3.11E-09
1 NY920 DAPA 人CD48 2.74E+05 7.26E-04 2.65E-09
2 NY920 DAPA 人CD48 2.06E+05 3.43E-04 1.67E-09
1 NY938 DAPA 人CD48 3.52E+05 1.04E-04 2.96E-10
2 NY938 DAPA 人CD48 4.56E+05 1.15E-04 2.52E-10
表13：WT和DAPA IgG候选物对食蟹猴CD48的结合亲和力
实验序号 样品 抗原 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
1 NY920 WT 食蟹猴CD48 3.25E+05 4.47E-03 1.38E-08
2 NY920 WT 食蟹猴CD48 3.11E+05 4.01E-03 1.29E-08
1 NY920 DAPA 食蟹猴CD48 3.19E+05 4.25E-03 1.34E-08
2 NY920 DAPA 食蟹猴CD48 3.01E+05 3.92E-03 1.30E-08
1 NY938 DAPA 食蟹猴CD48 2.71E+05 2.89E-04 1.07E-09
2 NY938 DAPA 食蟹猴CD48 4.09E+05 3.16E-04 7.74E-10
实例8：抗CD48 MMAE ADC的体外评估
细胞系
针对以下四种内源癌细胞系测试CD48抗体药物缀合物(ADC)：NCI-H929：RPMI-1640+10％FBS+0.05mM 2-巯基乙醇中培养的ATCC号CRL-9068；KMS-21-BM：RPMI-1640+10％FBS中培养的JCRB号JCRB1185；KMS-27：RPMI-1640+10％FBS中培养的JCRB号JCRB1188；和KMS-20：RPMI-1640+10％FBS中培养的JCRB号JCRB1196。
细胞增殖和存活的抑制
使用普洛麦格公司(Promega)的CellTiter-增殖测定评估CD48ADC抑制细胞增殖和存活的能力。将细胞系在组织培养箱中在5％CO2、37℃下在对其生长最佳的培养基中培养。在用于增殖测定的接种之前，在测定前至少2天分开细胞，以确保最佳生长密度。接种当天，使用细胞计数器(Vi-Cell XR细胞活力分析仪，贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter))确定细胞活力和细胞密度。将活力高于85％的细胞接种在白色透明底部的384孔TC处理板(康宁公司(Corning)目录号3765)中。将细胞以1,000个细胞/孔的密度接种于45μL的标准生长培养基中。将板在组织培养箱中于5％CO2、37℃孵育过夜。
第二天，在标准生长培养基中以10X制备靶向CD48的MMAE ADC和非靶向同种型ADC。将制备的靶向CD48的ADC处理物和同种型匹配的非靶向对照ADC处理物添加至细胞中，得到0.001-25nM的最终浓度和50μL/孔的最终体积。每个药物浓度一式四份地进行测试。
将板在组织培养箱中在5％CO2、37℃下孵育5天，之后通过添加25μL的CellTiter(普洛麦格公司(Promega)，目录号G7573)(一种裂解细胞并测量三磷酸腺苷(ATP)总含量的试剂)来评估细胞活力。将板在室温下孵育10分钟以稳定发光信号，然后使用发光读取器(EnVision多标记板读取器，珀金埃尔默公司(PerkinElmer))读数。为了评价药物处理的效果，使用来自含有未处理细胞(100％活力)的孔的发光计数对处理样品进行归一化。应用可变斜率模型以使非线性回归曲线与GraphPad PRISM版本7.02软件中数据相拟合。从所得曲线推算IC50和Amax值。
图9A至图9D中示出了代表性癌细胞系的剂量应答曲线。用表14中总结的所测试细胞系的代表性IC50值计算抑制50％细胞生长或存活(IC50)所需的处理浓度。
相对于同种型匹配的非靶向对照ADC(IgG-VC-MMAE)，代表性癌细胞系对靶向CD48的MMAE ADC敏感，IC50范围为0.014nM-0.077nM。NY920和NY938 CD48抗体作为ADC以Fc沉默形式(DAPA)和野生型形式(CysMab)进行测试。当与VC-MMAE缀合时，各种抗体形式之间在活性上不存在差异。如在细胞增殖测定中所证明的，NY920MMAE ADC和NY938 MMAE ADC在给定的细胞系模型上的活性等效。这些研究表明靶向CD48的VC-MMAE ADC能够在表达CD48的多种癌细胞系上抑制细胞增殖。
表14：CD48 ADC体外活性
除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与熟悉本披露所属领域的技术人员通常理解的相同含义。
除非另外指明，否则没有详细地具体描述的所有方法、步骤、技术和操作可以并且已经按照本身已知的方式进行，这应是技术人员所清楚的。再次对例如本文提及的标准手册和普通背景技术和其中引用的另外的参考文献进行引用。除非另外指明，否则本文引用的每个参考文献都通过引用以其全文而并入。
本发明的权利要求是非限制性的并且提供于下文中。
尽管本文已经详细披露了具体方面和权利要求，但是这仅是出于说明的目的以举例方式来进行的，并且这并不旨在对所附权利要求的范围或任何相应的未来申请的权利要求主题的范围加以限制。具体而言，本发明人考虑到，在不脱离如由权利要求定义的本披露的精神和范围的情况下，可以对本披露进行多种替代、改变和修饰。核酸起始材料、目的克隆或文库类型的选择被认为对于具有本文描述的方面的知识的本领域普通技术人员而言是常规的。其他方面、优点和修饰被认为落入下列权利要求的范围内。使用不超过常规的实验，本领域技术人员应认识到或能够确认本文描述的本发明的具体方面的很多等效物。此类等效物旨在为下列权利要求所涵盖。在今后提交的相应申请中重写权利要求的范围可能是由于不同国家专利法的限制，而不应当被理解为放弃权利要求的主题。
序列表
<110> 诺华股份有限公司（NOVARTIS AG）
<120> 抗CD48抗体、抗体药物缀合物及其用途
<130> PAT058966
<140>
<141>
<150> 63/117,817
<151> 2020-11-24
<160> 84
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala Met Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 2
Ala Ile Ser Gly Phe Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 3
Gln Phe Trp Glu Asp Gln Pro Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 4
Ser Phe Ala Met Ser
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 5
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 6
Ser Gly Phe Gly Gly Ser
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 7
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 8
Ile Ser Gly Phe Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 9
Ala Arg Gln Phe Trp Glu Asp Gln Pro Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 10
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Phe Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Phe Trp Glu Asp Gln Pro Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 11
gaagtgcagc tgctggagtc cgggggtgga ctggtgcagc ccggaggttc cctgcggttg 60
tcttgtgccg cctcgggatt caccttctcg tccttcgcga tgagctgggt ccgccaagct 120
cctggaaaag ggctcgaatg ggtgtccgcg atcagcggat ttggcggctc cacctactac 180
gccgattcag tgaagggccg gttcaccatc tcacgggaca acagcaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga actccctgcg cgctgaggac accgcagtgt actactgcgc gagacagttc 300
tgggaggacc agccgttcta cttcgactac tggggacagg ggaccctcgt gactgtctcc 360
tcc 363
<210> 12
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 12
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Phe Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Phe Trp Glu Asp Gln Pro Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Cys Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Cys Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 13
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 13
gaagtgcagc tgctggagtc cgggggtgga ctggtgcagc ccggaggttc cctgcggttg 60
tcttgtgccg cctcgggatt caccttctcg tccttcgcga tgagctgggt ccgccaagct 120
cctggaaaag ggctcgaatg ggtgtccgcg atcagcggat ttggcggctc cacctactac 180
gccgattcag tgaagggccg gttcaccatc tcacgggaca acagcaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga actccctgcg cgctgaggac accgcagtgt actactgcgc gagacagttc 300
tgggaggacc agccgttcta cttcgactac tggggacagg ggaccctcgt gactgtctcc 360
tccgcctcca ctaagggccc atccgtgttc cctctggccc cttccagcaa gtccacctct 420
ggcggcaccg ccgctctggg ctgcctggtc aaggactact tcccctgtcc cgtgaccgtg 480
tcctggaact ctggcgccct gacctccggc gtgcacacct tccctgccgt gctgcagtcc 540
tccggcctgt actccctgtc ctccgtcgtg accgtgccct ccagctctct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc tccaacacca aagtggacaa gcgggtggaa 660
cccaagtcct gcgacaagac ccacacctgt cctccctgcc ctgcccctga gctgctgggc 720
ggaccctccg tgttcctgtt ccctccaaag cccaaggaca ccctgatgat ctcccggacc 780
cctgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg atcccgaagt gaagttcaat 840
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggaacagtac 900
aactccacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960
aaagagtaca agtgcaaagt gtccaacaag gccctgcctg ccccaatcga aaagaccatc 1020
tccaaggcca agggccagcc ccgcgagccc caagtgtaca cactgcctcc cagccgggaa 1080
gagatgacca agaaccaagt gtccctgacc tgcctcgtga agggcttcta cccctgcgat 1140
atcgccgtgg agtgggagtc caacggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc attcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagtcccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgtccct gagccccggc aag 1353
<210> 14
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 14
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Phe Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Phe Trp Glu Asp Gln Pro Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Cys Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Cys Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 15
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 15
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gccgattcag tgaagggccg gttcaccatc tcacgggaca acagcaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga actccctgcg cgctgaggac accgcagtgt actactgcgc gagacagttc 300
tgggaggacc agccgttcta cttcgactac tggggacagg ggaccctcgt gactgtctcc 360
tccgcctcca ctaagggccc tagcgtgttc ccactggcgc cttcctcgaa atcgactagc 420
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agctggaact ccggggcact cacctccggt gtgcatactt tccctgctgt cttgcagtcc 540
tcgggcctgt acagcctgtc ctccgtggtg accgtgcctt cgtcgtccct gggaacccag 600
acgtacatct gcaacgtgaa ccacaagccg agcaacacca aagtcgataa gagagtcgag 660
cccaagagct gcgataagac ccacacttgt ccgccttgtc ctgcccctga gcttctgggt 720
ggcccatcgg tgtttctgtt tcccccgaag cccaaagaca ccctgatgat ctcgcgcact 780
ccggaggtca cttgcgtggt cgtggcggtg tcccacgagg acccagaagt gaagtttaac 840
tggtacgtgg acggagtgga agtccacaac gcgaaaacta agccccggga ggaacaatac 900
aactccacct accgcgtcgt gtccgtgctc actgtgctgc accaggattg gctgaacggt 960
aaagagtaca agtgtaaggt gtcgaacaaa gccctcgccg cccctatcga aaagactatt 1020
tcgaaagcta agggccagcc gcgagaaccc caagtgtata ccctgccccc ttcacgggaa 1080
gagatgacta agaatcaggt gtcgctcacc tgtctggtga agggatttta tccctgcgac 1140
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gtgcttgaca gcgacggttc gttcttcctc tactctaagc tcaccgtgga caagtcacgg 1260
tggcaacagg gcaacgtgtt ctcgtgctct gtgatgcacg aagctctcca caaccattac 1320
acccagaagt ccctcagcct cagcccgggg aag 1353
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 16
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 17
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 18
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 19
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 20
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 20
Ala Ala Ser
1
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 21
Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
1 5
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 22
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105
<210> 24
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 24
gatattcaga tgacccagtc cccgtcgtcg ctgagcgcca gcgtgggaga cagagtgacc 60
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<210> 25
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
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35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 26
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 26
gatattcaga tgacccagtc cccgtcgtcg ctgagcgcca gcgtgggaga cagagtgacc 60
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gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tcatactcca cccctctgac attcggccaa 300
gggaccaagg tcgaaatcaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gagagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 27
Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His
1 5 10
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 28
Gly Ile Asn Pro Asp Thr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Thr
1 5 10 15
Gly
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 29
Ala Gln Phe Trp Thr Thr Pro Arg Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 30
Glu Tyr Thr Met His
1 5
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 31
Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
1 5
<210> 32
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 32
Asn Pro Asp Thr Gly Asp
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 33
Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 34
Ile Asn Pro Asp Thr Gly Asp Thr
1 5
<210> 35
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 35
Ala Arg Ala Gln Phe Trp Thr Thr Pro Arg Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Asp Thr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gln Phe Trp Thr Thr Pro Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 37
caagtgcagc tcgtgcagtc cggagcggaa gtgaaaaagc ccggagcctc agtgaaagtg 60
tcctgcaaag cctcggggta caccttcacc gagtacacta tgcattgggt ccgccaagct 120
cctggtcaag gcctcgaatg gatgggcggc atcaatcccg acaccggcga caccagctat 180
aaccagaagt tcaccggacg cgccactctg actgtcgata agagcacaag caccgcctac 240
atggaactgt cgtccttgcg gtccgaggat accgccgtgt actactgcgc gagagcgcag 300
ttttggacta ccccgcggtt cgcctactgg ggacagggca ctctcgtgac tgtgtcatcg 360
<210> 38
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Asp Thr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gln Phe Trp Thr Thr Pro Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Cys Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Cys Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 39
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 39
caagtgcagc tcgtgcagtc cggagcggaa gtgaaaaagc ccggagcctc agtgaaagtg 60
tcctgcaaag cctcggggta caccttcacc gagtacacta tgcattgggt ccgccaagct 120
cctggtcaag gcctcgaatg gatgggcggc atcaatcccg acaccggcga caccagctat 180
aaccagaagt tcaccggacg cgccactctg actgtcgata agagcacaag caccgcctac 240
atggaactgt cgtccttgcg gtccgaggat accgccgtgt actactgcgc gagagcgcag 300
ttttggacta ccccgcggtt cgcctactgg ggacagggca ctctcgtgac tgtgtcatcg 360
gcgtccacca agggcccatc cgtgttccct ctggcccctt ccagcaagtc cacctctggc 420
ggcaccgccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc cctgtcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtcctcc 540
ggcctgtact ccctgtcctc cgtcgtgacc gtgccctcca gctctctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaaag tggacaagcg ggtggaaccc 660
aagtcctgcg acaagaccca cacctgtcct ccctgccctg cccctgagct gctgggcgga 720
ccctccgtgt tcctgttccc tccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggacccct 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggatc ccgaagtgaa gttcaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900
tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaagtgtc caacaaggcc ctgcctgccc caatcgaaaa gaccatctcc 1020
aaggccaagg gccagccccg cgagccccaa gtgtacacac tgcctcccag ccgggaagag 1080
atgaccaaga accaagtgtc cctgacctgc ctcgtgaagg gcttctaccc ctgcgatatc 1140
gccgtggagt gggagtccaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac ccctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1260
cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320
cagaagtccc tgtccctgag ccccggcaag 1350
<210> 40
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Asp Thr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gln Phe Trp Thr Thr Pro Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Cys Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Cys Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 41
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 41
caagtgcagc tcgtgcagtc cggagcggaa gtgaaaaagc ccggagcctc agtgaaagtg 60
tcctgcaaag cctcggggta caccttcacc gagtacacta tgcattgggt ccgccaagct 120
cctggtcaag gcctcgaatg gatgggcggc atcaatcccg acaccggcga caccagctat 180
aaccagaagt tcaccggacg cgccactctg actgtcgata agagcacaag caccgcctac 240
atggaactgt cgtccttgcg gtccgaggat accgccgtgt actactgcgc gagagcgcag 300
ttttggacta ccccgcggtt cgcctactgg ggacagggca ctctcgtgac tgtgtcatcg 360
gcgtccacca agggccctag cgtgttccca ctggcgcctt cctcgaaatc gactagcggg 420
ggtaccgccg ctctgggatg cttggtgaaa gactactttc cgtgtccggt gaccgtgagc 480
tggaactccg gggcactcac ctccggtgtg catactttcc ctgctgtctt gcagtcctcg 540
ggcctgtaca gcctgtcctc cgtggtgacc gtgccttcgt cgtccctggg aacccagacg 600
tacatctgca acgtgaacca caagccgagc aacaccaaag tcgataagag agtcgagccc 660
aagagctgcg ataagaccca cacttgtccg ccttgtcctg cccctgagct tctgggtggc 720
ccatcggtgt ttctgtttcc cccgaagccc aaagacaccc tgatgatctc gcgcactccg 780
gaggtcactt gcgtggtcgt ggcggtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaactgg 840
tacgtggacg gagtggaagt ccacaacgcg aaaactaagc cccgggagga acaatacaac 900
tccacctacc gcgtcgtgtc cgtgctcact gtgctgcacc aggattggct gaacggtaaa 960
gagtacaagt gtaaggtgtc gaacaaagcc ctcgccgccc ctatcgaaaa gactatttcg 1020
aaagctaagg gccagccgcg agaaccccaa gtgtataccc tgcccccttc acgggaagag 1080
atgactaaga atcaggtgtc gctcacctgt ctggtgaagg gattttatcc ctgcgacatt 1140
gccgtggagt gggaatcgaa cggccagcct gagaacaact acaagaccac tccgccggtg 1200
cttgacagcg acggttcgtt cttcctctac tctaagctca ccgtggacaa gtcacggtgg 1260
caacagggca acgtgttctc gtgctctgtg atgcacgaag ctctccacaa ccattacacc 1320
cagaagtccc tcagcctcag cccggggaag 1350
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 42
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 43
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 44
Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Ile Thr
1 5
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 45
Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
1 5
<210> 46
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 46
Trp Ala Ser
1
<210> 47
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 47
Tyr Ser Thr Tyr Pro Ile
1 5
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 48
Gln Asp Val Gly Thr Ala
1 5
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 49
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 50
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 50
gacatccaaa tgacccagag cccttcgagc ctgtcagcct ccgtgggcga cagagtgacc 60
attacttgca aagccagcca ggacgtggga actgcagtcg cctggtatca gcagaagcca 120
ggaaaggtcc ccaagctcct gatctactgg gcttccaccc ggcacactgg cgtgccgtca 180
aggttttcgg gatcgggttc cgggactgat ttcaccctga ccatttcctc cctccaaccc 240
gaggatgtgg ccacctacta ctgccagcag tactccacct acccgatcac attcggacag 300
ggcaccaagc tcgaaatcaa g 321
<210> 51
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 52
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 52
gacatccaaa tgacccagag cccttcgagc ctgtcagcct ccgtgggcga cagagtgacc 60
attacttgca aagccagcca ggacgtggga actgcagtcg cctggtatca gcagaagcca 120
ggaaaggtcc ccaagctcct gatctactgg gcttccaccc ggcacactgg cgtgccgtca 180
aggttttcgg gatcgggttc cgggactgat ttcaccctga ccatttcctc cctccaaccc 240
gaggatgtgg ccacctacta ctgccagcag tactccacct acccgatcac attcggacag 300
ggcaccaagc tcgaaatcaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gagagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642
<210> 53
<211> 243
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Met Cys Ser Arg Gly Trp Asp Ser Cys Leu Ala Leu Glu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Pro Leu Ser Leu Leu Val Thr Ser Ile Gln Gly His Leu Val His
20 25 30
Met Thr Val Val Ser Gly Ser Asn Val Thr Leu Asn Ile Ser Glu Ser
35 40 45
Leu Pro Glu Asn Tyr Lys Gln Leu Thr Trp Phe Tyr Thr Phe Asp Gln
50 55 60
Lys Ile Val Glu Trp Asp Ser Arg Lys Ser Lys Tyr Phe Glu Ser Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Arg Val Arg Leu Asp Pro Gln Ser Gly Ala Leu Tyr Ile
85 90 95
Ser Lys Val Gln Lys Glu Asp Asn Ser Thr Tyr Ile Met Arg Val Leu
100 105 110
Lys Lys Thr Gly Asn Glu Gln Glu Trp Lys Ile Lys Leu Gln Val Leu
115 120 125
Asp Pro Val Pro Lys Pro Val Ile Lys Ile Glu Lys Ile Glu Asp Met
130 135 140
Asp Asp Asn Cys Tyr Leu Lys Leu Ser Cys Val Ile Pro Gly Glu Ser
145 150 155 160
Val Asn Tyr Thr Trp Tyr Gly Asp Lys Arg Pro Phe Pro Lys Glu Leu
165 170 175
Gln Asn Ser Val Leu Glu Thr Thr Leu Met Pro His Asn Tyr Ser Arg
180 185 190
Cys Tyr Thr Cys Gln Val Ser Asn Ser Val Ser Ser Lys Asn Gly Thr
195 200 205
Val Cys Leu Ser Pro Pro Cys Thr Leu Ala Arg Ser Phe Gly Val Glu
210 215 220
Trp Ile Ala Ser Trp Leu Val Val Thr Val Pro Thr Ile Leu Gly Leu
225 230 235 240
Leu Leu Thr
<210> 54
<211> 252
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Met Cys Ser Arg Gly Trp Asp Ser Cys Leu Ala Leu Glu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Pro Leu Ser Leu Leu Val Thr Ser Ile Gln Gly His Leu Val His
20 25 30
Met Thr Val Val Ser Gly Ser Asn Val Thr Leu Asn Ile Ser Glu Ser
35 40 45
Leu Pro Glu Asn Tyr Lys Gln Leu Thr Trp Phe Tyr Thr Phe Asp Gln
50 55 60
Lys Ile Val Glu Trp Asp Ser Arg Lys Ser Lys Tyr Phe Glu Ser Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Arg Val Arg Leu Asp Pro Gln Ser Gly Ala Leu Tyr Ile
85 90 95
Ser Lys Val Gln Lys Glu Asp Asn Ser Thr Tyr Ile Met Arg Val Leu
100 105 110
Lys Lys Thr Gly Asn Glu Gln Glu Trp Lys Ile Lys Leu Gln Val Leu
115 120 125
Asp Pro Val Pro Lys Pro Val Ile Lys Ile Glu Lys Ile Glu Asp Met
130 135 140
Asp Asp Asn Cys Tyr Leu Lys Leu Ser Cys Val Ile Pro Gly Glu Ser
145 150 155 160
Val Asn Tyr Thr Trp Tyr Gly Asp Lys Arg Pro Phe Pro Lys Glu Leu
165 170 175
Gln Asn Ser Val Leu Glu Thr Thr Leu Met Pro His Asn Tyr Ser Arg
180 185 190
Cys Tyr Thr Cys Gln Val Ser Asn Ser Val Ser Ser Lys Asn Gly Thr
195 200 205
Val Cys Leu Ser Pro Pro Cys Thr Leu Gly Lys Lys Asp Pro Trp Glu
210 215 220
Leu Arg Gly Ala Gln Gly Asn Trp Ser Cys Phe Glu Gln Arg Lys Ala
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ile Gln Pro Pro Cys Thr Val Trp Trp
245 250
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<400> 55
000
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<400> 56
000
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<400> 57
000
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<400> 58
000
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<400> 59
000
<210> 60
<400> 60
000
<210> 61
<400> 61
000
<210> 62
<400> 62
000
<210> 63
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 63
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Phe Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Phe Trp Glu Asp Gln Pro Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 64
<400> 64
000
<210> 65
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Asp Thr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gln Phe Trp Thr Thr Pro Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 66
<400> 66
000
<210> 67
<400> 67
000
<210> 68
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 68
Met His Leu Val His Met Thr Val Val Ser Gly Ser Asn Val Thr Leu
1 5 10 15
Asn Ile Ser Glu Ser Leu Pro Glu Asn Lys Gln Leu Thr Trp Phe Tyr
20 25 30
Thr Phe Asp Gln Lys Ile Val Glu Trp Asp Ser Arg Lys Ser Lys Tyr
35 40 45
Phe Glu Ser Lys Phe Lys Gly Arg Val Arg Leu Asp Pro Gln Ser Gly
50 55 60
Ala Leu Tyr Ile Ser Lys Val Gln Lys Glu Asp Asn Ser Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Met Arg Val Leu Lys Lys Thr Gly Asn Glu Gln Glu Trp Lys Ile Lys
85 90 95
Leu Gln Val Leu Asp Pro Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys
100 105 110
Ile Glu Trp His Glu His His His His His His
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<210> 69
<211> 235
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 69
Met Gly Ser Arg Gly Trp Asn Arg Cys Leu Ala Leu Glu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Ser Leu Leu Ala Ile Ser Ile Gln Gly Arg Leu Val His
20 25 30
Met Thr Val Val Ser Gly Ser Asn Val Thr Leu Asn Ile Ser Glu Ser
35 40 45
Leu Pro Glu Asn Tyr Lys Gln Leu Thr Trp Phe Tyr Thr Phe Asp Gln
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Lys Ile Val Glu Trp Asp Ser Gly Lys Ser Lys Tyr Phe Glu Ser Lys
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Pro Val Pro Lys Pro Val Ile Lys Ile Glu Lys Asp Val Asp Asp Asn
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Ala Ala Arg Ser Phe Gly Val Glu Trp Ile Ala Ser Trp Leu Val Val
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225 230 235
<210> 70
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 70
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Phe Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Gly Asn Val Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Gly Asn Gly Asn Val Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Cys Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
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His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
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Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
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Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Cys Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 71
<400> 71
000
<210> 72
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 72
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
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Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
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85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
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Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
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Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
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Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
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Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser
225 230 235 240
Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Gly Ser Asp Tyr Lys
245 250 255
Asp Asp Asp Asp Lys Ser Gly
260
<210> 73
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 73
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Phe Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Gly Asn Val Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
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130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 74
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 74
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Thr Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 75
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 75
gaggtccaat tgctggaatc tggcggagga ctggttcagc ctggtggctc tctgagactg 60
tcttgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctttgcca tgtcctgggt tcgacaggcc 120
cctggaaaag gactcgagtg ggtgtccgct atctctggct ttggcggcag cacatattac 180
gccgatagcg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acagccgtgt attactgcgc gcgtcagttc 300
tgggaagatc agcccttcta cttcgactac tggggccagg gcacactggt cacagttagc 360
tcagctagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420
ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaaca gcggagccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540
agcggcctgt acagcctgtc cagcgtggtg acagtgccca gcagcagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagtggag 660
cccaagagct gcgacaagac ccacacatgc cccccctgcc cggcgccaga gctgctgggc 720
ggaccctccg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca ccctgatgat cagcaggacc 780
cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg agccacgagg acccagaggt gaagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggagcagtac 900
aacagcacct acagggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960
aaggaataca agtgcaaggt ctccaacaag gccctgccag cccccatcga aaagaccatc 1020
agcaaggcca agggccagcc acgggagccc caggtgtaca ccctgccccc ctcccgggag 1080
gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccca 1200
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagtccagg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaaga gcctgagctt aagccccggc aag 1353
<210> 76
<400> 76
000
<210> 77
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 77
caggtccaat tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgtaaag ccagcggcta cacctttacc gagtacacca tgcactgggt ccgacaggct 120
ccaggacaag gactcgagtg gatgggcggc atcaatcctg ataccggcga caccagctac 180
aaccagaagt tcacaggcag agccacactg accgtggaca agagcacaag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt attattgcgc gcgtgcccag 300
ttttggacca cacctagatt tgcctactgg ggccagggca ccctggtcac agttagctca 360
gctagcacca agggccccag cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggcacagccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtaca gcctgtccag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agtggagccc 660
aagagctgcg acaagaccca cacatgcccc ccctgcccgg cgccagagct gctgggcgga 720
ccctccgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag caggaccccc 780
gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc cagaggtgaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga gcagtacaac 900
agcacctaca gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 960
gaatacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgccagccc ccatcgaaaa gaccatcagc 1020
aaggccaagg gccagccacg ggagccccag gtgtacaccc tgcccccctc ccgggaggag 1080
atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac ccccccagtg 1200
ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gtccaggtgg 1260
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320
cagaagagcc tgagcttaag ccccggcaag 1350
<210> 78
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 78
Glu Asn Tyr Lys Gln
1 5
<210> 79
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 79
Gly Ser Ser Lys Gln
1 5
<210> 80
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 80
Asp Ser Arg Lys
1
<210> 81
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 81
Ala Ala Gly Lys
1
<210> 82
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 82
Lys Lys Thr Gly Asn Glu
1 5
<210> 83
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 83
Lys Lys Asp Ala Ser Gly
1 5
<210> 84
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成6xHis标签”
<400> 84
His His His His His His
1 5

Claims (55)

1.一种抗CD48抗体或抗原结合片段，所述抗CD48抗体或抗原结合片段包含如下三个重链CDR和三个轻链CDR：
(i)由SEQ ID NO:1组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:2组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQID NO:17组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(ii)由SEQ ID NO:4组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:2组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:16组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:17组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(iii)由SEQ ID NO:5组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:6组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:3组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:19组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:20组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:21组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(iv)由SEQ ID NO:7组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:8组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:9组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:22组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:20组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:18组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(v)由SEQ ID NO:27组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:28组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:29组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:42组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:43组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(vi)由SEQ ID NO:30组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:28组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:29组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:42组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:43组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)；
(vii)由SEQ ID NO:31组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:32组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:29组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:45组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:46组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:47组成的轻链CDR3(LCDR3)；或
(viii)由SEQ ID NO:33组成的重链CDR1(HCDR1)、由SEQ ID NO:34组成的重链CDR2(HCDR2)、由SEQ ID NO:35组成的重链CDR3(HCDR3)；由SEQ ID NO:48组成的轻链CDR1(LCDR1)、由SEQ ID NO:46组成的轻链CDR2(LCDR2)以及由SEQ ID NO:44组成的轻链CDR3(LCDR3)。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CD48抗体或其抗原结合片段包含：
(i)含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链可变区；或
(ii)含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链可变区。
3.如权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗CD48抗体包含：
(a)SEQ ID NO:12的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:25的轻链氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO:14的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:25的轻链氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO:63的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:25的轻链氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO:38的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:51的轻链氨基酸序列；
(f)SEQ ID NO:40的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:51的轻链氨基酸序列；或
(g)SEQ ID NO:65的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:51的轻链氨基酸序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fd片段、Fv片段、dAb片段、单结构域抗体、大型抗体、微型抗体、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、半抗体、单臂抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、双特异性T细胞接合抗体、多特异性抗体、嵌合抗原受体T细胞或放射免疫缀合物。
5.一种核酸，所述核酸编码如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
6.如权利要求5所述的核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:50的核酸序列。
7.如权利要求5所述的核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:13、15、39、41、75、77、26或52的核酸序列。
8.一种载体，所述载体包含如权利要求5-7中任一项所述的核酸。
9.一种细胞系，所述细胞系包含如权利要求8所述的载体或如权利要求5-7中任一项所述的核酸。
10.一种制备如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括使如权利要求9所述的细胞系在适于表达所述抗体或其抗原结合片段的条件下生长，然后纯化并分离所述抗体或其抗原结合片段。
11.一种具有式(I)的抗体药物缀合物：
A-(LB-(D)n)y (I)；
其中：
A是特异性结合人CD48的抗体或其抗体抗原结合片段；
LB是接头；
D是细胞毒性剂；
n是从1至10的整数，并且
y是从1至10的整数，
其中所述接头-药物部分(LB-(D)n)共价附接至所述抗体或其抗原结合片段(A)。
12.如权利要求11所述的抗体药物缀合物，其中所述药物部分是Eg5抑制剂、V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞他汀、多拉司他汀、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、核输出蛋白CRM1抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DHFR抑制剂或促凋亡剂，但不包括BCL-2抑制剂、MCL-1抑制剂和BCL-XL抑制剂。
13.如权利要求11所述的抗体药物缀合物，其中所述药物部分是Eg5抑制剂、V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞他汀、多拉司他汀、类美登素、MetAP(甲硫氨酸氨基肽酶)、核输出蛋白CRM1抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合物、RNA聚合酶抑制剂、鹅膏蕈碱、剪接体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DHFR抑制剂。
14.如权利要求11-13中任一项所述的抗体药物缀合物，其中所述药物部分是澳瑞他汀。
15.如权利要求11所述的抗体药物缀合物，其中：
D是选自具有式(A)的化合物的细胞毒性剂：
其中：
R1是
R2是H，C1-C6烷基，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，
-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
并且
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
或者D是选自具有式(B)的化合物的细胞毒性剂：
其中：
R1是
R2是H，C1-C6烷基，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，
-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；并且
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基。
16.如权利要求11-15中任一项所述的抗体药物缀合物，其中n是1、2、3、4、5、6、7或8。
17.如权利要求11-16中任一项所述的抗体药物缀合物，其中y是1、2、3或4。
18.如权利要求11-17中任一项所述的抗体药物缀合物，其中每个LB独立地选自可切割接头或不可切割接头。
19.如权利要求11-18中任一项所述的抗体药物缀合物，其中每个LB是可切割接头。
20.如权利要求11-18中任一项所述的抗体药物缀合物，其中每个LB是不可切割接头。
21.一种抗体药物缀合物，所述抗体药物缀合物包含式(E)的结构：
其中：
A代表特异性结合人CD48的抗体或其抗原结合片段；
y是从1至10的整数；
R2是H，C1-C6alkyl，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，
-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)m-**、
-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**或
-X2X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**，其中**指示与R114的附接点；
X1是 其中**指示与-NH-或与X2的附接点；
X2是其中**指示与-NH-的附接点；
X3是其中**指示与-NH-的附接点；
X4是 其中*指示附接点朝向R114；
R114是-NR6C(＝O)CH2-*、-NHC(＝O)CH2-*、-S(＝O)2CH2CH2-*、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6C(＝O)CH2CH2-*、-NH-、-C(＝O)-、-NHC(＝O)-*、-CH2NHCH2CH2-*、-NHCH2CH2-*、-S-、 其中*指示与A的附接点；
每个R6独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R10独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、和-OH；
每个R11独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R12独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
每个R15独立地选自H、-CH3和苯基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个p独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
22.如权利要求21所述的抗体药物缀合物，所述抗体药物缀合物选自
23.一种抗体药物缀合物，所述抗体药物缀合物包含式(G)的结构：
其中：
A代表特异性结合人CD48的抗体或其抗原结合片段；
y是从1至10的整数；
R2是H，C1-C6alkyl，-C(＝O)R3，-(CH2)mOH，-C(＝O)(CH2)mOH，
-C(＝O)((CH2)mO)nR4，-((CH2)mO)nR4或任选地被-CN、-C(＝O)NH2或1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R3独立地选自C1-C6烷基和任选地被1至5个羟基取代的C1-C6烷基；
每个R4独立地选自H和C1-C6烷基；
L1是-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)m-**、
-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)((CH2)mO)p(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)mNHC(＝O)(CH2)m-**、-X3C(＝O)(CH2)m-**、-X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**、-X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**、-X2X1C(＝O)((CH2)mO)p(CH2)mX4(CH2)m-**或
-X2X1C(＝O)(CH2)mX4(CH2)m-**，其中**指示与R114的附接点；
X1是 其中**指示与-NH-或与X2的附接点；
X2是其中**指示与-NH-的附接点；
X3是其中**指示与-NH-的附接点；
X4是 其中*指示附接点朝向R114；
R114是-NR6C(＝O)CH2-*、-NHC(＝O)CH2-*、-S(＝O)2CH2CH2-*、-(CH2)2S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6S(＝O)2CH2CH2-*、-NR6C(＝O)CH2CH2-*、-NH-、-C(＝O)-、-NHC(＝O)-*、-CH2NHCH2CH2-*、-NHCH2CH2-*、-S-、 其中*指示与A的附接点；
每个R6独立地选自H和C1-C6烷基；
每个R10独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、和-OH；
每个R11独立地选自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2和-OH；
每个R12独立地选自H、C1-6烷基、氟、被-C(＝O)OH取代的苄氧基、被-C(＝O)OH取代的苄基、被-C(＝O)OH取代的C1-4烷氧基和被-C(＝O)OH取代的C1-4烷基；
每个R15独立地选自H、-CH3和苯基；
每个m独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且
每个p独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。
24.如权利要求23所述的抗体药物缀合物，所述抗体药物缀合物选自
25.如权利要求11所述的抗体药物缀合物，所述抗体药物缀合物选自
26.如权利要求11-25中任一项所述的抗体药物缀合物，其中A是如权利要求1-4中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
27.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或如权利要求11-26中任一项所述的抗体药物缀合物以及药学上可接受的载剂。
28.如权利要求27所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含一种或多种另外的治疗剂。
29.如权利要求27或28所述的药物组合物，其中所述组合物是冻干物。
30.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求11-26中任一项所述的抗体药物缀合物或如权利要求27-29中任一项所述的药物组合物。
31.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求11-26中任一项所述的抗体药物缀合物、或如权利要求27-29中任一项所述的药物组合物用于治疗有需要的患者的癌症的用途。
32.如权利要求27-29中任一项所述的药物组合物，用于在治疗有需要的患者的癌症中使用。
33.如权利要求30所述的方法、如权利要求31所述的用途或如权利要求32所述的药物组合物，其中所述癌症表达CD48。
34.如权利要求30所述的方法、如权利要求31所述的用途或如权利要求32所述的药物组合物，其中所述癌症是肿瘤或血液癌症，优选地，所述癌症是乳腺癌、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T-细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。
35.如权利要求30所述的方法、如权利要求31所述的用途或如权利要求32所述的药物组合物，进一步包含施用或使用一种或多种另外的治疗剂。
36.一种减少或抑制受试者的肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求11-26中任一项所述的抗体药物缀合物或如权利要求27-29中任一项所述的药物组合物。
37.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求11-26中任一项所述的抗体药物缀合物或如权利要求27-29中任一项所述的药物组合物用于减少或抑制有需要的受试者的肿瘤生长的用途。
38.如权利要求27-29中任一项所述的药物组合物，用于在减少或抑制有需要的受试者的肿瘤生长中使用。
39.如权利要求36所述的方法、如权利要求37所述的用途或如权利要求38所述的药物组合物，其中所述肿瘤表达CD48。
40.如权利要求36所述的方法、如权利要求37所述的用途或如权利要求38所述的药物组合物，其中施用或使用所述抗体或其抗原结合片段、抗体药物缀合物或药物组合物使所述肿瘤的生长减少或抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
41.一种减少或减缓受试者中癌细胞群体扩增的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求11-26中任一项所述的抗体药物缀合物或如权利要求27-29中任一项所述的药物组合物。
42.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求11-26中任一项所述的抗体药物缀合物或如权利要求27-29中任一项所述的药物组合物用于减少或抑制有需要的受试者的肿瘤生长的用途。
43.如权利要求27-29中任一项所述的药物组合物，用于在减少或抑制有需要的受试者的肿瘤生长中使用。
44.如权利要求41所述的方法、如权利要求42所述的用途或如权利要求43所述的药物组合物，其中所述癌细胞群体表达CD48。
45.如权利要求41所述的方法、如权利要求42所述的用途或如权利要求43所述的药物组合物，其中所述癌细胞群体是来自肿瘤或血液癌症，优选地，所述癌症群体是来自乳腺癌、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、急性髓性白血病、膀胱癌、脑癌、骨髓癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、结肠直肠癌、食道癌、肝细胞癌、成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、T-细胞或B细胞起源的淋巴恶性肿瘤、黑色素瘤、髓细胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。
46.如权利要求41所述的方法、如权利要求42所述的用途或如权利要求43所述的药物组合物，其中施用或使用所述抗体药物缀合物、组合物或药物组合物使所述癌细胞群体减少或使所述癌细胞群体的扩增减缓至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。
47.一种抗体，所述抗体与NY920或NY938竞争与人CD48的结合。
48.一种抗体，所述抗体与如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段竞争与人CD48的结合。
49.如权利要求47或48所述的抗体，其中所述抗体与NY920或NY938结合相同或重叠的人CD48的表位。
50.如权利要求49所述的抗体，其中所述抗体与人CD48(SEQ ID NO:53)的残基54-64或105-121内的一个或多个氨基酸结合。
51.如权利要求49所述的抗体，其中所述抗体与选自人CD48(SEQ ID NO:53)的残基54、58、60、61、62、64、105、107、119、111、114、115、117、119和121的一个或多个氨基酸结合。
52.如权利要求51所述的抗体，其中所述抗体与内的一个或多个氨基酸接触。
53.一种诊断剂，所述诊断剂包含如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或如权利要求11所述的抗体药物缀合物。
54.如权利要求53所述的诊断剂，其中将所述抗体或其抗原结合片段、或所述抗体药物缀合物用放射标记、荧光团、发色团、显像剂或金属离子进行标记。
55.一种检测组织或细胞中人CD48的方法，所述方法包括使如权利要求53或54所述的诊断剂与所述组织或细胞接触以及检测所述诊断剂与所述组织或细胞的结合。
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