CN111788306A - 核酸酶以及用于制备和使用其的方法 - Google Patents
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- C11D3/38636—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing enzymes other than protease, amylase, lipase, cellulase, oxidase or reductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/30—Endoribonucleases active with either ribo- or deoxyribonucleic acids and producing 5'-phosphomonoesters (3.1.30)
- C12Y301/30002—Serratia marcescens nuclease (3.1.30.2)
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Abstract
本文公开了具有核酸酶活性的多肽。通过经过改进的基因位点诱变(“GSSM”)方法或定制的多位点组合装配(“TMCA”)方法产生具有核酸酶活性的多肽中的一些多肽。还公开了包括具有核酸酶活性的多肽的组合物和试剂盒以及用于制备和使用这些多肽、组合物和试剂盒的方法。
Description
序列表的引用
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以于2017年12月20日创建的大小为4Kb的以BASF_060PR_SEQLISTING.TXT命名的文件提供。序列表的电子格式中的信息通过全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本公开总体上涉及分子和细胞生物学以及生物化学。更具体地,本公开涉及具有核酸酶活性的多肽、包括这些多肽的编码序列的多核苷酸以及用于制备和使用这些多肽和多核苷酸的方法。
背景技术
核酸酶是能够切割核酸单体之间的磷酸二酯键的酶,使得它们可以将核酸的长链加工成更小的单元。核酸酶已广泛用于工业和药物应用中。例如,在发酵过程中使用核酸酶可以去除DNA,并促进和改善蛋白质和其它所关注分子的产生和回收。在发酵过程中,DNA去除很重要,因为那些过程中的许多过程利用重组DNA技术,并且许多适用法规要求确认不存在可以被核酸酶去除的rDNA。核酸酶也可以用于生物膜去除,这具有多种应用,例如清洁食品机械、硬表面清洁、造纸机、伤口愈合和口腔护理。需要产生具有期望的最佳温度和pH范围的有效核酸酶。
发明内容
本文公开的包含具有核酸酶活性的多肽(以下称为“核酸酶”或“核酸酶多肽”)、包括这些多肽的编码序列的多核苷酸(以下称为“核酸酶多核苷酸”)以及用于制备和使用这些多肽和多核苷酸的方法。本文还提供了包括本文公开的核酸酶多肽中的一种或多种核酸酶多肽、核酸酶编码多核苷酸中的一种或多种核酸酶编码多核苷酸以及其任何组合的组合物和试剂盒。
本文公开的包含一种合成或重组多肽,所述合成或重组多肽包括与SEQ IDNO:1具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中,所述多肽具有核酸酶活性,并且其中所述多肽包括E230L、L114F、E260R、E230M、D246P、S161R、N54S、T227H、V226K、E230R、G263A、G119N、V226K、G263A、N127S、P84V、D83E、D28G、V45T、M262V、A190K、P84N、I44R、G256S、A73M、P179L、Q135E、A60P、V247I、G263K、S161E、P72N、P84L、S74N、T82R、G75R、Q141R和D107N中的一个或多个突变。在一些实施例中,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性。在一些实施例中,所述多肽包括选自由以下组成的组的一个或多个突变:L114F、G119N、D107N、S74N、Q141R、T82R和G75R。在一些实施例中,所述多肽包括选自由以下组成的组的突变的组合:
·(T82R,L114F);
·(T82R,L114F,G119N);
·(T82R);
·(T82R,G119N);
·(L114F);
·(L114F,G119N);
·(G119N);
·(G75R,T82R,L114F,G119N);
·(G75R,T82R,L114F,G119N);
·(G75R,T82R);
·(G75R,L114F);
·(G75R,L114F,G119N);
·(S74N,G75R,T82R,G119N,Q141R);
·(S74N,T82R,L114F,G119N);
·(S74N,T82R,L114F,G119N,Q141R);
·(S74N,T82R,Q141R);
·(S74N,T82R,G119N,Q141R);
·(S74N,L114F,Q141R);
·(S74N,L114F,G119N,Q141R);
·(S74N,Q141R);
·(S74N,G75R,T82R,L114F,Q141R);
·(S74N,G75R,T82R,L114F,G119N,Q141R);·(S74N,G75R,T82R,Q141R);
·(S74N,G75R,L114F,Q141R);
·(S74N,G75R,Q141R);
·(T82R,D107N);
·(G75R,T82R,D107N);
·(D107N);
·(G75R,T82R,G119N);
·(T82R,D107N,G119N);
·(G75R,T82R,D107N,G119N);
·(D107N,G119N);
·(G75R,D107N,G119N);
·(S74N,T82R,D107N,Q141R);
·(S74N,G75R,T82R,D107N,Q141R);
·(S74N,G75R,D107N,Q141R);
·(S74N,G119N,Q141R);
·(S74N,G75R,G119N,Q141R);
·(S74N,T82R,D107N,G119N,Q141R);
·(S74N,G75R,T82R,D107N,G119N,Q141R);
·(S74N,D107N,G119N,Q141R);
·(S74N,G75R,D107N,G119N,Q141R);
·(T82R,D107N,L114F);
·(G75R,T82R,D107N,L114F);
·(D107N,L114F);
·(G75R,D107N,L114F);
·(G75R,D107N);
·(T82R,D107N,L114F,G119N);
·(D107N,L114F,G119N);
·(G75R,D107N,L114F,G119N);
·(S74N,T82R,D107N,L114F,Q141R);
·(S74N,G75R,T82R,D107N,L114F,Q141R);
·(S74N,D107N,L114F,Q141R);
·(S74N,G75R,D107N,L114F,Q141R);
·(S74N,D107N,Q141R);
·(S74N,G75R,L114F,G119N,Q141R);
·(S74N,T82R,D107N,L114F,G119N,Q141R);
·(S74N,G75R,T82R,D107N,L114F,G119N,Q141R);
·(S74N,D107N,L114F,G119N,Q141R);
·(S74N,G75R,D107N,L114F,G119N,Q141R);以及
·(G75R,T82R,D107N,L114F,G119N)。
在一些实施例中,所述多肽的所述氨基酸序列不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列,因为或仅因为包括E230L、L114F、E260R、E230M、D246P、S161R、N54S、T227H、V226K、E230R、G263A、G119N、V226K、G263A、N127S、P84V、D83E、D28G、V45T、M262V、A190K、P84N、I44R、G256S、A73M、P179L、Q135E、A60P、V247I、G263K、S161E、P72N、P84L、S74N、T82R、G75R、Q141R和D107N中的一个或多个突变。
在一些实施例中,与具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶相比,所述多肽更耐热。在一些实施例中,在10℃到70℃下,所述多肽的所述核酸酶活性比具有SEQ ID NO:1的序列的所述核酸酶的核酸酶活性高至少5%。在一些实施例中,在37℃到60℃下,所述多肽的所述核酸酶活性比具有SEQ ID NO:1的序列的所述核酸酶的核酸酶活性高至少5%。在一些实施例中,在40℃到60℃下,所述多肽的所述核酸酶活性比具有SEQ ID NO:1的序列的所述核酸酶的核酸酶活性高至少5%。在一些实施例中,所述多肽的核酸酶活性比54℃/37℃比具有SEQ ID NO:1的序列的所述核酸酶的核酸酶活性比高至少5%。在一些实施例中,所述多肽的最佳温度介于45℃到55℃之间。在一些实施例中,所述多肽的最佳pH介于pH 4到pH 11之间。在一些实施例中,所述多肽不包括信号序列。在一些实施例中,所述多肽包括信号序列。在一些实施例中,所述信号序列是异源序列。
本文公开的还包含一种包括本文公开的多肽中的一种或多种多肽的组合物。在一些实施例中,所述组合物是反应混合物、洗涤剂组合物、洗涤剂添加剂、食品、食品补充剂、饲料补充剂、饲料、药物组合物、发酵产物、发酵中间物、发酵下游反应混合物、反应混合物或其组合。在一些实施例中,包括所述多肽中的一种或多种多肽的反应混合物用于蛋白质表达或纯化。例如,所述多肽可以是包括与SEQ ID NO:1具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽具有核酸酶活性,并且其中所述多肽包括E230L、L114F、E260R、E230M、D246P、S161R、N54S、T227H、V226K、E230R、G263A、G119N、V226K、G263A、N127S、P84V、D83E、D28G、V45T、M262V、A190K、P84N、I44R、G256S、A73M、P179L、Q135E、A60P、V247I、G263K、S161E、P72N、P84L、S74N、T82R、G75R、Q141R和D107N中的一个或多个突变。
本文公开的还包含一种对本文公开的多肽中的任何一种多肽进行编码的合成或重组核酸,以及包括所述合成或重组核酸的多核苷酸序列的表达载体。在一些实施例中,所述表达载体包括病毒载体、质粒、噬菌体(phage)、噬菌粒、粘粒、福斯质粒(fosmid)、噬菌体(bacteriophage)、人工染色体或其组合。例如,所述多肽可以是包括与SEQ ID NO:1具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽具有核酸酶活性,并且其中所述多肽包括E230L、L114F、E260R、E230M、D246P、S161R、N54S、T227H、V226K、E230R、G263A、G119N、V226K、G263A、N127S、P84V、D83E、D28G、V45T、M262V、A190K、P84N、I44R、G256S、A73M、P179L、Q135E、A60P、V247I、G263K、S161E、P72N、P84L、S74N、T82R、G75R、Q141R和D107N中的一个或多个突变。
本文公开的包含一种重组细胞,其包括本文公开的多肽中的一种或多种多肽、一种或多种对本文公开的多肽中的任一种多肽进行编码的合成或重组核酸、一种或多种包括所述合成或重组核酸的多核苷酸序列的表达载体或其组合。在一些实施例中,所述核酸是所述重组细胞的染色体的一部分。在一些实施例中,所述重组细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。例如,所述多肽可以是包括与SEQ ID NO:1具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽具有核酸酶活性,并且其中所述多肽包括E230L、L114F、E260R、E230M、D246P、S161R、N54S、T227H、V226K、E230R、G263A、G119N、V226K、G263A、N127S、P84V、D83E、D28G、V45T、M262V、A190K、P84N、I44R、G256S、A73M、P179L、Q135E、A60P、V247I、G263K、S161E、P72N、P84L、S74N、T82R、G75R、Q141R和D107N中的一个或多个突变。
本文公开的包含一种产生具有核酸酶活性的重组多肽的方法。在一些实施例中,所述方法包括:在允许所述多肽的表达的条件下表达对本文公开的多肽中的任一种多肽进行编码的核酸,由此产生具有核酸酶活性的重组多肽,其中所述核酸可操作地连接到启动子。在一些实施例中,所述核酸存在于表达载体中。在一些实施例中,所述核酸存在于宿主细胞中以允许所述多肽的表达。在一些实施例中,所述核酸存在于所述宿主细胞的染色体中。在一些实施例中,所述宿主细胞是来自选自由以下组成的组的生物体的细胞:巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(巴斯德驹形氏酵母(Komagataella pastoris))、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、嗜热毁丝霉(Myceliopthora thermophile)真菌、里氏木霉(Tricodermea reesei)、大肠杆菌(Escherichia coli)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、黑曲霉(Aspergillusniger)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和酿酒酵母(Sacaramycescerevisiae)。在一些实施例中,所述核酸存在于体外表达系统中。在一些实施例中,所述多肽可以是包括与SEQ ID NO:1具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽具有核酸酶活性,并且其中所述多肽包括E230L、L114F、E260R、E230M、D246P、S161R、N54S、T227H、V226K、E230R、G263A、G119N、V226K、G263A、N127S、P84V、D83E、D28G、V45T、M262V、A190K、P84N、I44R、G256S、A73M、P179L、Q135E、A60P、V247I、G263K、S161E、P72N、P84L、S74N、T82R、G75R、Q141R和D107N中的一个或多个突变。
本文公开的包含一种用于降解多核苷酸的方法,所述方法包括使多核苷酸分子与本文公开的多肽中的一种或多种多肽接触,由此降解所述多核苷酸分子。例如,所述多肽可以是包括与SEQ ID NO:1具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽具有核酸酶活性,并且其中所述多肽包括E230L、L114F、E260R、E230M、D246P、S161R、N54S、T227H、V226K、E230R、G263A、G119N、V226K、G263A、N127S、P84V、D83E、D28G、V45T、M262V、A190K、P84N、I44R、G256S、A73M、P179L、Q135E、A60P、V247I、G263K、S161E、P72N、P84L、S74N、T82R、G75R、Q141R和D107N中的一个或多个突变。在一些实施例中,所述多核苷酸分子是DNA分子或RNA分子。在一些实施例中,所述接触在pH 4到pH 11下发生。在一些实施例中,所述反应混合物的温度在约10℃到约70℃下。在一些实施例中,所述接触在40℃到60℃下发生。
本文公开的包含一种用于洗涤物体的方法。在一些实施例中,所述方法包括在足以进行所述洗涤的条件下使包括本文公开的多肽中的一种或多种多肽的组合物与所述物体接触。在一些实施例中,所述多肽包括与SEQ ID NO:1具有至少80%序列同一性的氨基酸序列,其中所述多肽具有核酸酶活性,并且其中所述多肽包括E230L、L114F、E260R、E230M、D246P、S161R、N54S、T227H、V226K、E230R、G263A、G119N、V226K、G263A、N127S、P84V、D83E、D28G、V45T、M262V、A190K、P84N、I44R、G256S、A73M、P179L、Q135E、A60P、V247I、G263K、S161E、P72N、P84L、S74N、T82R、G75R、Q141R和D107N中的一个或多个突变。在一些实施例中,所述物体是纺织品。
本文公开的还包含一种用于在蛋白质产生期间降解DNA或RNA的方法。在一些实施例中,所述方法包括:培养宿主细胞,其中所述宿主细胞包括对所关注蛋白质进行编码的核酸;以及在允许通过一种或多种多肽降解DNA或RNA的条件下表达本文公开的多肽中的一种或多种多肽。在一些实施例中,所述宿主细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、植物细胞或昆虫细胞。在一些实施例中,所述多肽由存在于所述宿主细胞中的表达载体表达,或者所述多肽由所述宿主细胞的染色体中的核酸序列编码。在一些实施例中,所述多肽由不表达所述所关注蛋白质的细胞表达。在一些实施例中,所述所关注蛋白质和所述多肽中的一种或多种的表达是可诱导的或不可诱导的。在一些实施例中,本文公开的多肽中的一种或多种多肽是从外部添加的。例如,所述多肽可以是包括与SEQ ID NO:1具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽具有核酸酶活性,并且其中所述多肽包括E230L、L114F、E260R、E230M、D246P、S161R、N54S、T227H、V226K、E230R、G263A、G119N、V226K、G263A、N127S、P84V、D83E、D28G、V45T、M262V、A190K、P84N、I44R、G256S、A73M、P179L、Q135E、A60P、V247I、G263K、S161E、P72N、P84L、S74N、T82R、G75R、Q141R和D107N中的一个或多个突变。
本文公开的还包含一种反应混合物,其中所述反应混合物包括:(a)本文公开的多肽中的一种或多种多肽;(b)一种或多种核酸分子;以及(c)水溶液,其中所述多肽水解所述一种或多种核酸分子。在一些实施例中,所述一种或多种核酸分子包括单链DNA分子、双链DNA分子、单链RNA分子、双链RNA分子或其任何组合。在一些实施例中,所述一种或多种核酸分子来自用于产生蛋白质的宿主细胞。在一些实施例中,所述多肽在选自由以下组成的组的宿主细胞中表达:细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞和昆虫细胞。在一些实施例中,所述反应混合物的温度在约10℃到约70℃下。在一些实施例中,所述反应混合物的温度在约45℃到约55℃下。在一些实施例中,所述反应混合物在约pH 4到约pH 11下。在一些实施例中,所述反应混合物在约pH 6到约pH 7下。在一些实施例中,所述水溶液是洗涤剂组合物、洗涤剂添加剂、食品、食品补充剂、饲料补充剂、饲料、药物组合物、发酵产物、发酵中间物、发酵下游反应混合物、来自蛋白质产生过程的产物、来自蛋白质产生过程的中间物、蛋白质纯化溶液或其组合。例如,所述多肽可以是包括与SEQ ID NO:1具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽具有核酸酶活性,并且其中所述多肽包括E230L、L114F、E260R、E230M、D246P、S161R、N54S、T227H、V226K、E230R、G263A、G119N、V226K、G263A、N127S、P84V、D83E、D28G、V45T、M262V、A190K、P84N、I44R、G256S、A73M、P179L、Q135E、A60P、V247I、G263K、S161E、P72N、P84L、S74N、T82R、G75R、Q141R和D107N中的一个或多个突变。
本文公开的包含一种用于降解蛋白质产生混合物中的DNA或RNA的方法。在一些实施例中,所述方法包括:培养宿主细胞,所述宿主细胞包括对所关注蛋白质进行编码的核酸;以及在允许通过多肽降解DNA或RNA的条件下表达本文公开的多肽中的一种或多种多肽。在一些实施例中,所述多肽的表达可以延迟,直到产生所述所关注蛋白质之后。在一些实施例中,所述多肽的表达不被延迟。所述多肽的表达可以在所述所关注蛋白质表达的开始之前、之后或同时开始。所述宿主细胞可以是例如细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、植物细胞或昆虫细胞。在一些实施例中,所述多肽由存在于所述宿主细胞中的表达载体表达,或者所述多肽由所述宿主细胞的染色体中的核酸序列编码。在一些实施例中,所述多肽由不表达所述所关注蛋白质的细胞表达。所述所关注蛋白质和所述多肽中的一种或多种的表达可以是可诱导的或不可诱导的。
本文公开的还包含一种用于在蛋白质产生期间降解DNA或RNA的方法。在一些实施例中,所述方法包括:培养宿主细胞,所述宿主细胞包括对所关注蛋白质进行编码的核酸;以及在允许通过多肽降解DNA或RNA的条件下添加本文公开的多肽。所述宿主细胞可以是例如细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、植物细胞或昆虫细胞。
附图说明
图1示出了具有SEQ ID NO:1的序列和对应的核酸编码序列(SEQ ID NO:2)的核酸酶的蛋白质序列。
图2示出了十种核酸酶变体的温度图谱。
图3示出了十种核酸酶变体在37℃下的pH图谱。
图4是示出淀粉酶的热灭活温度斜升的图。
图5示出了淀粉酶发酵液中核酸酶预处理的归一化结果。
具体实施方式
本文所引用的所有专利、申请、公开的申请和其它出版物均通过引用方式整体并入作为参考材料。如果本文中使用的术语或短语与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其它出版物中阐述的定义相反或在其它方面不一致,则本文中的使用优先于通过引用方式并入本文的定义。
定义
除非另外定义,否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。所有专利、申请、公开的申请和其它出版物均通过引用整体并入。在本文中所使用的术语存在多个定义的情况下,除非另有说明,否则以在此部分中的那些定义为准。
如本文所使用的,除非明确地或通过上下文另有说明,否则单数形式“一个/种(a/an)”以及“所述(the)”包含复数指代物。例如,除非明确地或通过上下文另有说明,否则“一个”二聚体包含一个或多个二聚体。
术语“扩增”(“聚合酶延伸反应”)意指多核苷酸的拷贝数增加。
如本文所使用的,在两个蛋白质序列(或核苷酸序列)的背景下,“序列同一性”或“同一性”包含当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应性时对两个序列中残基的引用。
序列同一性通常以“%序列同一性”或“%同一性”提供。为了确定第一步骤中两个氨基酸序列之间的同一性百分比,在这两个序列之间生成成对的序列比对,其中两个序列在其整个长度上比对(即,成对的全局比对)。使用实施Needleman和Wunsch算法的程序(《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》(1979)48,第443-453页),优选地通过使用带有程序默认参数(空位开放=10.0,空位延伸=0.5并且矩阵=EBLOSUM62)的程序“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)(EMBOSS))来生成比对。出于本说明书的目的,优选的比对是所述比对,可以根据所述比对确定最高的序列同一性。
在比对两个序列之后,在第二步骤中,根据所产生的比对确定同一性值。出于本说明书的目的,同一性百分比计算如下:%同一性=(相同残基/比对区域的长度,所述比对区域的长度示出了在其整个长度上本说明书的相应序列)*100。
因此,通过将相同残基的数量除以比对区域的长度来计算与根据本实施的两个氨基酸序列的比较有关的序列同一性,所述比对区域的长度示出了在其整个长度上本说明书的相应序列。将此值乘以100以得出“%同一性”。
计算两个DNA序列的同一性百分比与计算具有一些规格的两个氨基酸序列的同一性百分比相同。
对于编码蛋白质的DNA序列,应在从起始密码子到终止密码子(不包含内含子)的编码区域的整个长度上进行成对比对。内含子存在于其它序列中,因此也可以去除与本说明书的序列进行比较的序列以进行成对比对。然后同一性百分比计算如下:%同一性=(相同残基/比对区域的长度,所述比对区域的长度示出了从起始密码子到终止密码子(不包含内含子)在其整个长度上的本说明书的序列的编码区域)*100。
对于非蛋白质编码DNA序列,应在本说明书的序列的整个长度上进行成对比对,因此同一性百分比计算如下:%同一性=(相同残基/比对区域的长度,所述比对区域的长度示出了在其整个长度上本说明书的序列)*100。
此外,实施Needleman和Wunsch算法(《分子生物学杂志》(1979)48,第443-453页)的优选比对程序是带有程序默认参数(空位开放=10.0,空位延伸=0.5并且矩阵=EDNAFULL)的“NEEDFE”(欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS))。
与本说明书的序列具有相同或类似区域并且应与本说明书的序列进行比较以确定%同一性的序列可以容易地通过本领域技术范围内的各种方式来鉴定,例如,使用公开可用的计算机方法和程序,如可从例如NCBI获得的BLAST、BLAST-2。
亲本酶分子的变体可以具有氨基酸序列,所述氨基酸序列与具有酶活性的相应的亲本酶的氨基酸序列具有至少n百分比同一性,n为介于50与100之间的整数,优选地50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99(与全长多肽序列比较)。优选地,当与亲本酶比较时,具有n百分比同一性的变体酶具有酶活性。
当与亲本酶比较时,酶变体可以由其序列相似性限定。序列相似性通常以“%序列相似性”或“%相似性”提供。为了在第一步骤中计算序列相似性,必须如上文描述的产生序列比对。在第二步骤中,必须计算相似性百分比,而序列相似性百分比考虑到所限定的氨基酸组共享相似的特性,例如通过其大小、通过其疏水性、通过其电荷或通过其它特性。在本文中,一种氨基酸与相似的氨基酸的交换被称为“保守突变”。当与亲本酶的酶特性相比时,包括保守突变的酶变体似乎对蛋白质折叠具有最小的影响,使得基本上保持某些酶特性。
为了根据本说明书确定%相似性,应用以下内容,其也符合例如程序“NEEDLE”所使用的BLOSUM62矩阵,所述矩阵是用于数据库搜索和序列比对的最常用的氨基酸相似性矩阵中的一个矩阵。
氨基酸A与氨基酸S相似;
氨基酸D与氨基酸E;N相似;
氨基酸E与氨基酸D;K;Q相似;
氨基酸F与氨基酸W;Y相似;
氨基酸H与氨基酸N;Y相似;
氨基酸I与氨基酸L;M;V相似;
氨基酸K与氨基酸E;Q;R相似;
氨基酸L与氨基酸I;M;V相似;
氨基酸M与氨基酸I;L;V相似;
氨基酸N与氨基酸D;H;S相似;
氨基酸Q与氨基酸E;K;R相似;
氨基酸R与氨基酸K;Q相似;
氨基酸S与氨基酸A;N;T相似;
氨基酸T与氨基酸S相似;
氨基酸V与氨基酸I;L;M相似;
氨基酸W与氨基酸F;Y相似;并且
氨基酸Y与氨基酸F;H;W相似。
保守氨基酸取代可以在功能蛋白质如酶的多肽序列的序列的全长上发生。在一个实施例中,这种突变与酶的功能结构域无关。在一个实施例中,保守突变与酶的催化中心无关。
因此,根据本说明书,相似性百分比的以下计算适用:
%相似性=[(相同残基+相似残基)/比对区域的长度,所述比对区域的长度示出了在其整个长度上本说明书的相应序列]*100。
特别地,期望包括保守突变的变体酶具有基本上不变的酶特性,所述变体酶与相应的亲本序列至少m%相似,m为介于50与100之间的整数,优选地50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99(与全长多肽序列比较)。优选地,当与亲本酶比较时,具有m%相似性的变体酶具有酶活性。
同源的是指具有高度相似性的基因、多肽、多核苷酸,例如在位置、结构、功能或特性上,但不一定具有高度的序列同一性。
如本文所使用的,“基本上互补或基本上匹配”意指两个核酸序列具有至少约90%序列同一性。优选地,两个核酸序列具有至少或至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。可替代地,“基本上互补或基本上匹配”意指两个核酸序列可以在一种或多种高严格性条件下杂交。
如本文所定义的,术语“杂交”是其中基本上互补的核苷酸序列彼此粘接的过程。杂交过程可以完全在溶液中发生,即两种互补核酸均在溶液中。杂交过程也可以通过将互补核酸中的一个互补核酸固定到基质(如磁珠、琼脂糖珠或任何其它树脂)发生。此外,杂交过程可以通过将互补核酸中的一个互补核酸固定到固相支持物(如硝化纤维素或尼龙膜)或通过例如光刻法固定到例如硅质玻璃支持物(后者被称为核酸阵列或微阵列或核酸芯片)发生。为了允许杂交发生,通常使核酸分子热变性或化学变性以将双链熔化成两条单链和/或从单链核酸中去除发夹或其它二级结构。根据本说明书的杂交意指杂交必须在本发明的序列的整个长度上发生。如本文所定义的,在整个长度上的这种杂交意指,当将本发明的序列片段化为300-500个碱基的片段时,每个片段将杂交。
术语“严格性”是指发生杂交的条件。杂交的严格性受如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成等条件的影响。通常,低严格性条件在限定的离子强度和ph下被选择为比特定序列的热熔点(Tm)低约30℃。中等严格性条件是温度在Tm以下20℃时,并且高严格性条件是温度在Tm以下10℃时。高严格性杂交条件通常用于分离与靶核酸序列具有高度序列同一性的杂交序列。然而,由于遗传密码的简并性,核酸可以在序列中偏离并且仍然对基本上相同的多肽进行编码。因此,有时可能需要中等严格性杂交条件来鉴定此类核酸分子。“Tm”是在限定的离子强度和pH下的温度,在所述温度下,50%的靶序列与完全匹配的探针杂交。Tm取决于溶液条件以及碱基组成和探针的长度。例如,更长的序列在更高温度下特异性杂交。从Tm以下约16℃到32℃获得最大杂交速率。杂交溶液中一价阳离子的存在减少了两条核酸链之间的静电排斥,由此促进了杂交体形成;对于高达0.4M的钠浓度,此效果是可见的(对于更高的浓度,此效果可以忽略)。甲酰胺将DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度降低0.6到0.7℃(每百分比的甲酰胺),并且加入50%的甲酰胺允许在30到45℃的温度下进行杂交,尽管杂交速率将降低。碱基对错配会降低杂交速率和双链体的热稳定性。平均而言,并且对于大型探针,每%碱基错配,Tm降低约1℃。根据杂交体的类型,可以使用以下等式计算Tm:
·DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl,《生物化学分析(Anal.Biochem.)》,138:267-284,1984):
Tm=81.5℃+16.6×log[Na+]a+0.41×%[G/Cb]-500×[Lc]-1-0.61×%甲酰胺
·DNA-RNA或RNA-RNA杂交体:
Tm=79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(%G/Cb)+11.8(%G/Cb)2-820/Lc
·寡核苷酸-DNA或寡核苷酸-RNAd杂交体:
对于<20个核苷酸:Tm=2(ln)
对于20-35个核苷酸:Tm=22+1.46(ln)
a或对于其它单价阳离子,但仅在0.01-0.4M范围内准确。
b对于%GC,仅在30%到75%范围内准确。
cL=碱基对中双链体的长度。
d寡核苷酸(Oligo),寡核苷酸(oligonucleotide);ln,引物的有效长度=2×(G/C数)+(A/T数)。
可以使用多种已知技术中的任何一种技术来控制非特异性结合,例如用含蛋白质的溶液封闭膜、向杂交缓冲液添加异源RNA、DNA和SDS以及用RNase处理。对于非相关探针,可以通过改变以下中的一个进行一系列杂交:(i)逐渐降低退火温度(例如,从68℃到42℃)或(ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如,从50%到0%)。技术人员知道杂交期间可以改变并且将维持或改变严格性条件的各个参数。
除了杂交条件外,杂交的特异性通常还取决于杂交后洗涤的功能。为了去除由非特异性杂交产生的背景,用稀盐溶液洗涤样品。此类洗涤的关键因素包含最终洗涤溶液的离子强度和温度:盐浓度越低,洗涤温度越高,洗涤的严格性越高。洗涤条件通常在杂交严格性下或以下进行。阳性杂交产生的信号是背景信号的至少两倍。通常,用于核酸杂交测定或基因扩增检测程序的适合严格性条件如上所阐述。也可以选择更多或更少的严格性条件。技术人员知道洗涤期间可以改变并且将维持或改变严格性条件的各个参数。
例如,对于长于50个核苷酸的DNA杂交体,典型的高严格性杂交条件涵盖在65℃下在l×SSC中或在42℃下在l×SSC中和50%甲酰胺中杂交,然后在65℃下在0.3×SSC中洗涤。对于长于50个核苷酸的DNA杂交体,中等严格性杂交条件的实例涵盖在50℃下在4×SSC中或在40℃下在6×SSC中和50%甲酰胺中杂交,然后在50℃下在2×SSC中洗涤。杂交体的长度是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸杂交时,可以通过比对序列并鉴定本文描述的保守区域来确定杂交体长度。1×SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠;杂交溶液和洗涤溶液可以另外包含5×Denhardt试剂、0.5-1.0%SDS、100μg/ml变性的片段化鲑鱼精DNA、0.5%焦磷酸钠。高严格性条件的另一个实例是在65℃下在0.1×SSC中杂交,然后在65℃下在0.3×SSC中洗涤,所述0.1×SSC包括0.1SDS和任选地5×Denhardt试剂、100μg/ml变性的片段化鲑鱼精DNA、0.5%焦磷酸钠。
出于定义严格性水平的目的,可以参考Sambrook等人(2001)《分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:a laboratory manual)》,第3版,冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press),CSH,纽约或《当代分子生物学实验手册(CurrentProtocols in Molecular Biology)》,约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons),纽约(1989和年度更新)。
如本文所使用的,“引物”是指可以粘接到模板核酸并且用作DNA扩增的起点的核酸分子。引物可以与模板多核苷酸(例如,所关注密码子上游或下游的20个核苷酸)的特异性区域完全或部分互补。非互补核苷酸在本文中定义为错配。错配可以位于引物内或引物的任一端处。优选地,单个核苷酸错配,更优选地两个,并且更优选地三个或更多个连续或不连续的核苷酸错配位于引物内。引物可以具有例如5到200个核苷酸,优选地20到80个核苷酸,并且更优选地43到65个核苷酸。更优选地,引物具有10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个、140个、145个、150个、155个、160个、165个、170个、175个、180个、185个或190个核苷酸。如本文所定义的,“正向引物”是与模板多核苷酸的负链互补的引物。如本文所定义的,“反向引物”是与模板多核苷酸的正链互补的引物。优选地,正向引物和反向引物不包括重叠的核苷酸序列。如本文所定义的,“不包括重叠的核苷酸序列”意指正向引物和反向引物分别不粘接到模板多核苷酸的负链和正链的区域,其中正链和负链彼此互补。关于粘接到模板多核苷酸的相同链的引物,“不包括重叠的核苷酸序列”意指引物不包括与模板多核苷酸的相同链的相同区域互补的序列。如本文所使用的,“引物组”是指“正向引物”和对应“反向引物”的组合。
如本文所使用的,正链等同于有义链并且也可以被称为编码或非模板链。这是与mRNA具有相同序列的链(除了它具有Ts而不是Us)。被称为模板链、负链或反义链的另一条链与mRNA互补。
如本文所描述的,“密码子优化”是指将密码子改变为已知增加最大蛋白质表达效率的密码子的设计过程。在一些替代方案中,描述了用于在细胞中表达的密码子优化,其中密码子优化可以通过使用本领域技术人员已知的算法来执行,以便在所关注宿主细胞(例如,细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞)(包括人类细胞)中产生针对高mRNA和蛋白质产率而优化的合成遗传转录本。例如,可以优化密码子以在细菌细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞中表达蛋白质。含有用于人类细胞中密码子优化的算法的程序容易获得。此类程序可以包含例如OptimumGeneTM或算法。另外,经过密码子优化的序列可以例如从集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)商购获得。在一些实施例中,对基因进行密码子优化以在细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞或昆虫细胞中表达。
DNA的“消化”是指通过仅在DNA的某些序列上起作用的限制酶对DNA的催化切割。本文所使用的各种限制酶是可商购获得的,并且使用其反应条件、辅因子和其它要求如普通技术人员已知的那样。出于分析目的,1μg质粒或DNA片段通常与含约2个单位的酶的约20μl缓冲溶液一起使用。出于分离用于质粒构建的DNA片段的目的,通常在较大体积中用20到250个单位的酶消化5到50μg的DNA。特定限制酶的适当缓冲液和底物量由制造商指定。一般使用37℃下约1小时的温育时间,但是可以根据供应商的说明而变化。消化后,所述反应可以在凝胶上电泳。
酶是包括氨基酸序列的生物分子,其中所述酶可以催化反应。基于国际生物化学和分子生物学联盟(IUBMB)命名委员会(Nomenclature Committee of the InternationalUnion of Biochemistry and Molecular Biology)的推荐,酶名称是本领域技术人员已知的。酶名称包含:EC(酶委员会)编号、推荐名称、替代性名称(如果有的话)、催化活性和其它因素。酶也被称为多肽、蛋白质、肽、氨基酸序列或由SEQ ID NO鉴定。在本公开中,酶的替代性名称可以互换使用。
术语“异源的”(或外源的或外来的或重组的)多肽在本文中定义为:
(a)不是宿主细胞天然的多肽。这种异源多肽的蛋白质序列是合成的、非天然存在的、“人造”蛋白质序列;
(b)宿主细胞天然的多肽,其中已经进行了结构修饰,例如缺失、取代和/或插入,以改变天然多肽;或者
(c)宿主细胞天然的多肽,由于通过重组DNA技术(例如,更强的启动子)操纵宿主细胞的DNA,所述多肽的表达被定量改变或其表达从不同于天然宿主细胞的基因组位置引导。
上面的描述(b)和(c)是指呈其天然形式、但不由用于其产生的细胞天然表达的序列。因此,将产生的多肽更精确地定义为“重组表达的内源多肽”,这与上面定义并不矛盾,但反映了特定情况:不是合成的或操纵的蛋白质的序列,而是多肽分子产生的方式。
类似地,术语“异源的”(或外源的或外来的或重组的)多核苷酸是指:
(a)不是宿主细胞天然的多核苷酸;
(b)宿主细胞天然的多核苷酸,其中已经进行了结构修饰,例如缺失、取代和/或插入,以改变天然多核苷酸;
(c)宿主细胞天然的多核苷酸,由于通过重组DNA技术(例如,更强的启动子)操纵多核苷酸的调控元件,所述多核苷酸的表达被定量改变;或者
(d)宿主细胞天然的多核苷酸,但是由于通过重组DNA技术的遗传操纵而没有整合到其天然遗传环境内。
关于两个或更多个多核苷酸序列或两个或更多个氨基酸序列,术语“异源的”用于表征两个或更多个多核苷酸序列或两个或更多个氨基酸序列不是以彼此特异性组合的方式天然存在的。
如本文所使用的,“转基因的”、“转基因”或“重组的”意指关于例如核酸序列、表达盒、遗传构建体或包括核酸序列的载体或通过所述核酸序列、表达盒或载体转化的生物体、所有那些通过重组或基因技术方法合成产生的构造,其中
(a)包括有待表达的期望遗传信息的核酸序列,或
(b)与包括所述期望遗传信息的核酸序列(例如,启动子)可操作连接的一个或多个遗传控制序列,或
(c)(a)和(b)两者,
不位于其天然遗传环境中或已通过重组方法修饰。天然遗传环境理解为意指原始生物体中的天然基因组基因座或染色体基因座。当通过人为干预(如诱变处理)修饰此表达盒时,天然存在的表达盒-例如核酸序列的天然启动子与对多肽进行编码的对应核酸序列的天然存在的组合成为转基因表达盒。适合的方法例如在美国专利第5,565,350号、US200405323和WO 00/15815中进行描述。此外,当此表达盒从其天然遗传环境中分离出来并随后重新引入不是天然遗传环境的遗传环境中时,天然存在的表达盒成为重组表达盒。
“合成的”或“人工的”化合物是通过体外化学或酶促合成产生的。所述化合物包含但不限于通过最佳密码子用法为宿主生物体制备的变体核酸,如酵母细胞宿主或其它选择的表达宿主或与亲本蛋白质序列相比具有氨基酸修饰(例如,取代)的变体蛋白质序列,例如以优化多肽的特性。
术语“限制位点”是指表现限制酶的作用所必需的识别序列,并且包含催化切割位点。应了解,切割位点可以包含或可以不包含在包括低模糊度序列(即,含有限制位点出现频率的主要决定因素的序列)的限制位点的一部分内。因此,在许多情况下,相关的限制位点仅含有具有内部切割位点(例如,EcoRI位点中的G/AATTC)或紧邻的切割位点(例如,EcoRII位点中的/CCWGG)的低模糊度序列。在其它情况下,相关的限制酶(例如,Eco57I位点或CTGAAG(16/14))含有具有外部切割位点(例如,在Eco57I位点的N16部分中)的低模糊度序列(例如,Eco57I位点中的CTGAAG序列)。当提到酶(例如,限制酶)“切割”多核苷酸时,应理解为意指限制酶催化或促进多核苷酸的切割。
限制位点中的“模糊碱基要求”是指未完全规定的核苷酸碱基要求,即不是特定碱基(如在非限制性例示中,选自A、C、G和T的特定碱基),但可以是至少两个或更多个碱基中的任何一个。在本领域以及本文中用来表示碱基模糊度的普遍接受的缩写包含以下:R=G或A;Y=C或T;M=A或C;K=G或T;S=G或C;W=A或T;H=A或C或T;B=G或T或C;V=G或C或A;D=G或A或T;N=A或C或G或T。
“参考序列”是用作序列比较的基础的所定义的序列;参考序列可以是更大序列的子集,例如,作为序列表中给出的全长cDNA或基因序列的区段,或者可以包括完整的cDNA或基因序列。一般地,参考序列的长度为至少20个核苷酸,通常长度为至少25个核苷酸,并且经常长度为至少50个核苷酸。因为两个多核苷酸各自可以:(1)包括在所述两个多核苷酸之间类似的序列(即,完整多核苷酸序列的一部分);并且(2)可以进一步包括在所述两个多核苷酸之间存在差异的序列,通常通过在“比较窗口”内比较所述两个多核苷酸的序列来执行两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。
如本文所使用的,“比较窗口”是指至少20个连续核苷酸位置的概念性区段,其中多核苷酸序列可以与至少20个连续核苷酸的参考序列进行比较,并且其中比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包括与参考序列(不包括添加或缺失)相比20%或更小的添加或缺失(即缺口),以实现两个序列的最佳比对。可以通过Smith的局部同源性算法(Smith和Waterman,《应用数学进展(Adv Appl Math)》,1981;Smith和Waterman,《理论生物学杂志(JTeor Biol)》,1981;Smith和Waterman,《分子生物学杂志》,1981;Smith等人,《分子进化杂志(J Mol Evol)》,1981)、通过Needleman的同源比对算法(Needleman和Wuncsch,1970)、通过Pearson的相似性搜索方法(Pearson和Lipman,1988)、通过这些算法(威斯康星州麦迪逊科学大道575号遗传学计算机组(Genetics Computer Group)的威斯康星州遗传学软件包7.0版本中的BESTFIT、FASTA和TFASTA)的计算机化实施方案或通过检查和由所选择的各种方法产生的最佳比对(即,导致比较窗口的最高百分比同源性)来执行用于比对比较窗口的序列的最佳比对。
当提及参考多肽时,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”包括多肽,所述多肽保留至少一种与参考多肽至少基本相同的生物功能或活性。
术语“功能片段”是指仅分别包括全长核酸或全长氨基酸序列的一部分但仍然具有相同或相似的活性和/或功能的任何核酸或氨基酸序列。在一个实施例中,片段包括至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的原始序列。在一个实施例中,与原始核酸或原始氨基酸序列相比,功能片段分别包括连续的核酸或氨基酸。
术语“原形式”、“原蛋白”或“原肽”是指蛋白质前体,所述蛋白质前体是无活性或低活性的蛋白质(或肽),所述无活性或低活性的蛋白质(或肽)可以通过转译后修饰,如通过切割或通过添加另一种肽或分子转变为活性或更高活性的形式,以产生成熟的蛋白质(例如,由原酶形成酶)。
术语“基因”意指参与产生多肽链的DNA区段;其包含编码区域之前和之后的区域(前导区和尾区)以及任选地单个编码区段(外显子)之间的中间序列(内含子)。
如本文所使用的,术语“分离的”意指将材料从其原始环境(例如,如果其天然存在的话,自然环境)中去除。例如,存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或酶不是分离的,但是从天然系统中的一些或全部共存材料分离的相同的多核苷酸或酶是分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或酶可以是组合物的一部分,并且仍然是分离的,因为此类载体或组合物不是其天然环境的一部分。作为另外的实例,分离的核酸(例如,DNA或RNA分子)是一种与5'和3'侧翼序列不立即邻接的核酸,当存在于其衍生的生物体的天然存在的基因组中时,所述核酸通常与侧翼序列立即邻接。此类多核苷酸可以是载体的一部分,并入具有不相关遗传背景的细胞基因组中(或并入具有基本相似遗传背景的细胞基因组中,但在与其天然存在的位点不同的位点处)或通过PCR扩增或限制酶消化产生,或者是通过体外转录产生的RNA分子,和/或此类多核苷酸、多肽或酶可以是组合物的一部分,并且仍然被分离,因为此类载体或组合物不是其天然环境的一部分。
术语“分离的”意指将DNA并入到载体中,如质粒或病毒载体;并入到异源细胞的基因组(或同源细胞的基因组,但在非天然存在的位点处)中的核酸;以及以单独分子的形式存在的核酸,例如通过PCR扩增或限制酶消化产生的DNA片段或通过体外转录产生的RNA分子。
如本文所使用的,术语“纯化的”不需要绝对纯度;相反,它旨在作为相对定义。从文库获得的单独核酸已常规地纯化为电泳均质。例如,可以从生物体中的基因组DNA的其余部分中纯化本公开的纯化核酸至少104-106倍。然而,术语“纯化的”还包含已经从基因组DNA的其余部分或从文库或其它环境中的其它序列纯化至少一个数量级,通常两个或三个数量级,并且更通常地四个或五个数量级的核酸。“纯化的”意指材料处于相对纯态,例如至少约90%纯、至少约95%纯或至少约98%或99%纯。优选地,“纯化的”意指材料处于100%纯态。
术语“可操作地连接”意指所描述的组分处于允许所述组分按其预期方式起作用的关系。例如,与编码序列可操作地连接的调控序列连接的方式使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。如本文所使用的,当在启动子处启动转录的RNA聚合酶可以将编码序列转录成mRNA时,启动子序列“可操作地连接”到编码序列。
术语“突变”定义为核酸序列的遗传密码的改变或肽的序列的改变。此类突变可以是点突变,如转换或颠换。突变可以是一个或多个核苷酸或经过编码的氨基酸序列的改变。突变可以是缺失、插入或重复。
术语“一个或多个多核苷酸”、“一个或多个核酸序列”、“一个或多个核苷酸序列”、“一个或多个核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用并且是指核苷酸、或任何长度的聚合直链形式的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或两者的组合。
对于核苷酸序列,例如共有序列,使用IUPAC核苷酸命名(国际生物化学联盟命名委员会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry)(NC-IUB)(1984)“核酸序列中未完全指定碱基的命名(Nomenclature for IncompletelySpecified Bases in Nucleic Acid Sequences)”),具有与本说明书有关的以下核苷酸和核苷酸模糊性定义:A,腺嘌呤;C,胞嘧啶;G,鸟嘌呤;T,胸腺嘧啶;K,鸟嘌呤或胸腺嘧啶;R,腺嘌呤或鸟嘌呤;W,腺嘌呤或胸腺嘧啶;M,腺嘌呤或胞嘧啶;Y,胞嘧啶或胸腺嘧啶;D,不是胞嘧啶;N,任何核苷酸。
另外,符号“N(3-5)”意指所指示的共有位置可以具有3到5个任何(N)核苷酸。例如,共有序列“AWN(4-6)”表示3个可能的变体-末端带有4、5或6个任何核苷酸:AWNNNN、AWNNNNN、AWNNNNNN。
术语“对特定蛋白质或多肽进行编码的核酸序列”或“特定蛋白质或多肽的DNA编码序列”或“对特定蛋白质或多肽进行编码的核苷酸序列”是指当置于适当的调控序列的控制下时被转录并转译成蛋白质或多肽的DNA序列。
术语“对蛋白质或肽进行编码的核酸”或“对蛋白质或肽进行编码的DNA”或“对蛋白质或肽进行编码的多核苷酸”和其它同义术语涵盖仅包含蛋白质或肽的编码序列的多核苷酸以及包含另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在本文中全部可互换使用并且在广义上理解为是指能够实现与其相关联的序列的表达的调控核酸序列。本文中的“调控元件”或“调控核苷酸序列”可以意指在已经转化成宿主细胞或细胞器时驱动核酸序列表达的核酸的片段。调控核苷酸序列可以包含单独地并且在特定布置内或所述布置内的其它元件或序列的分组内具有功能或目的的任何核苷酸序列。调控核苷酸序列的实例包含但不限于转录控制元件,如启动子、增强子和终止元件。调控核苷酸序列对于要表达的核苷酸序列可以是天然的(即来自相同基因)或外来的(即来自不同基因)。
术语“启动子”通常是指位于基因转录起始上游的核酸控制序列并参与RNA聚合酶和其它蛋白质的识别和结合,由此指导可操作连接的核酸的转录。本文中的“启动子”可以进一步包含能够驱动编码序列转录的任何核酸序列。具体地,如本文所使用的,术语“启动子”可以指通常被描述为位于起始密码子附近的基因的5'调控子区域的多核苷酸序列。一个或多个编码序列的转录在启动子区域处引发。术语启动子还可以包含在引发基因转录中起作用的启动子的片段。启动子也可以被称为“转录起始位点”(TSS)。
前述术语涵盖的是另外的转录调控序列,所述转录调控序列衍生自经典的真核基因组基因(包含准确的转录起始所需的TATA盒,所述盒带有或不带有CCAAT盒序列)和另外的调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子),所述调控序列响应于发育和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达。
例如,如本领域已知的和如本文所使用的增强子通常是短的DNA区段(例如,50-1500bp),所述区段可以被蛋白质如转录因子结合以增加编码序列转录将发生的可能性。
所述术语中还包含经典的原核基因的转录调控序列,在这种情况下,所述转录调控序列可以包含-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语“调控元件”还涵盖赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中的表达的合成融合分子或衍生物。可以通过一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失来修饰启动子,而不干扰功能性或活性,但是也可以通过修饰其序列来增加活性。
另外元件可以是“转录终止元件”,所述转录终止元件包含标记基因末端并通过在mRNA内提供引发mRNA从转录复合物中释放的信号来介导转录终止的核酸序列的片段。原核生物中的转录终止通常是由Rho依赖性或Rho非依赖性终止子引发的。在真核生物中,转录终止通常通过与RNA聚合酶II相关联的蛋白质识别终止而发生。
“寡核苷酸”(或同义地“寡核苷酸(oligo)”)是指可以化学合成的单链聚脱氧核苷酸链或两条互补的聚脱氧核苷酸链。此类合成寡核苷酸可以具有或可以不具有5'磷酸。在激酶存在的情况下,不具有5'磷酸的那些寡核苷酸在不添加具有ATP的磷酸的情况下将不连接到另外的寡核苷酸。合成的寡核苷酸将连接到尚未去磷酸化的片段。
呈纯化形式的任何来源的核酸都可以用作起始核酸(也定义为“模板多核苷酸”)。因此,所述方法可以采用包含信使RNA的DNA或RNA,DNA或RNA可以是单链的,并且优选地双链的。另外,可以利用各自含有一条链的DNA-RNA杂交体。根据要突变的核酸序列的大小,核酸序列可以具有各种长度。优选地,特定核酸序列是50到50000个碱基对,并且更优选地50-11000个碱基对。
本文使用标准惯例(5'到3')来描述双链多核苷酸的序列。
与本文描述的那些类似或等同的所有方法和材料可以用于本文所公开的方法和组合物的实践或测试中,其中本文描述了适合的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考通过引用以其整体并入。进一步地,除非另有说明,材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨是限制性的。
核酸酶多肽
本文公开了具有核酸酶活性的多肽。在一些实施例中,多肽是分离的、合成的或重组的多肽,所述多肽包括与SEQ ID NO:1具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高序列同一性的氨基酸序列,其中多肽具有核酸酶活性。多肽可以例如与SEQ ID NO:1具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或介于这些值中的任何两个值之间的范围的序列同一性。如本文描述的,具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽展现出核酸酶活性。SEQ ID NO:1的N末端上的前21个氨基酸是信号序列,并且其余氨基酸形成成熟多肽。SEQ ID NO:1的编码核酸序列在本文中公开为SEQ ID NO:2。本文中相对于SEQ ID NO:1中的对应氨基酸位置描述了氨基酸突变。例如,在SEQ ID NO:1的位置230处从E到L的氨基酸取代在本文中描述为E230L。
在一些实施例中,多肽包括E230L、L114F、E260R、E230M、D246P、S161R、N54S、T227H、V226K、E230R、G263A、G119N、V226K、G263A、N127S、P84V、D83E、D28G、V45T、M262V、A190K、P84N、I44R、G256S、A73M、P179L、Q135E、A60P、V247I、G263K、S161E、P72N、P84L、S74N、T82R、G75R、Q141R和D107N中的一个或多个突变。在一些实施例中,多肽包括L114F、E230M、D107N、Q141R、G119N、S74N、T82R和G75R中的一个或多个突变。在一些实施例中,所述多肽包括选自由以下组成的组的突变的组合:(a)T82R、L114F和G119N;(b)G75R、T82R、L114F和G119N;(c)S74N、G75R、T82R、G119N和Q141R;(d)S74N、T82R、L114F和G119N;(e)S74N、T82R、L114F、G119N和Q141R;(f)S74N、T82R、G119N和Q141R;(g)S74N、L114F和Q141R;(h)S74N、L114F、G119N和Q141R;(i)S74N、G75R、T82R、L114F和Q141R;(j)S74N、G75R、T82R、L114F、G119N和Q141R;(k)S74N、G75R、T82R和Q141R;(1)S74N、G75R、L114F和Q141R;(m)S74N、G75R和Q141R;(n)T82R、D107N和G119N;(o)S74N、G75R、T82R、D107N和Q141R;(p)S74N、G75R、G119N和Q141R;(q)T82R、D107N和L114F;(r)G75R、T82R、D107N和L114F;(s)G75R、D107N和L114F;(t)T82R、D107N、L114F和G119N;以及(u)S74N、G75R、L114F、G119N和Q141R。在一些实施例中,多肽包括选自由以下组成的组的突变或突变的组合:
·(T82R,L114F);
·(T82R,L114F,G119N);
·(T82R);
·(T82R,G119N);
·(L114F);
·(L114F,G119N);
·(G119N);
·(G75R,T82R,L114F,G119N);
·(G75R,T82R,L114F,G119N);
·(G75R,T82R);
·(G75R,L114F);
·(G75R,L114F,G119N);
·(S74N,G75R,T82R,G119N,Q141R);
·(S74N,T82R,L114F,G119N);
·(S74N,T82R,L114F,G119N,Q141R);
·(S74N,T82R,Q141R);
·(S74N,T82R,G119N,Q141R);
·(S74N,L114F,Q141R);
·(S74N,L114F,G119N,Q141R);
·(S74N,Q141R);
·(S74N,G75R,T82R,L114F,Q141R);
·(S74N,G75R,T82R,L114F,G119N,Q141R);
·(S74N,G75R,T82R,Q141R);
·(S74N,G75R,L114F,Q141R);
·(S74N,G75R,Q141R);
·(T82R,D107N);
·(G75R,T82R,D107N);
·(D107N);
·(G75R,T82R,G119N);
·(T82R,D107N,G119N);
·(G75R,T82R,D107N,G119N);
·(D107N,G119N);
·(G75R,D107N,G119N);
·(S74N,T82R,D107N,Q141R);
·(S74N,G75R,T82R,D107N,Q141R);
·(S74N,G75R,D107N,Q141R);
·(S74N,G119N,Q141R);
·(S74N,G75R,G119N,Q141R);
·(S74N,T82R,D107N,G119N,Q141R);
·(S74N,G75R,T82R,D107N,G119N,Q141R);
·(S74N,D107N,G119N,Q141R);
·(S74N,G75R,D107N,G119N,Q141R);
·(T82R,D107N,L114F);
·(G75R,T82R,D107N,L114F);
·(D107N,L114F);
·(G75R,D107N,L114F);
·(G75R,D107N);
·(T82R,D107N,L114F,G119N);
·(D107N,L114F,G119N);
·(G75R,D107N,L114F,G119N);
·(S74N,T82R,D107N,L114F,Q141R);
·(S74N,G75R,T82R,D107N,L114F,Q141R);
·(S74N,D107N,L114F,Q141R);
·(S74N,G75R,D107N,L114F,Q141R);
·(S74N,D107N,Q141R);
·(S74N,G75R,L114F,G119N,Q141R);
·(S74N,T82R,D107N,L114F,G119N,Q141R);
·(S74N,G75R,T82R,D107N,L114F,G119N,Q141R);
·(S74N,D107N,L114F,G119N,Q141R);
·(S74N,G75R,D107N,L114F,G119N,Q141R);以及
·(G75R,T82R,D107N,L114F,G119N)。
如本文所使用的,氨基酸突变的组合可以描述为“突变1、突变2和突变3”,例如,突变的一种非限制性示例性组合为“T82R、D107N和G119N”或描述为(突变1,突变2和突变3),例如,突变的一种非限制性示例性组合为(T82R,D107N,G119N)。
在一些实施例中,多肽是本文所公开的核酸酶变体中的任何一种核酸酶变体,其中多肽具有核酸酶活性。
在一些实施例中,核酸酶多肽是热稳定的、耐热的或两者兼有。例如,核酸酶多肽可以比具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶和/或其亲本核酸酶更热稳定、更耐热或两者兼有。在一些实施例中,在给定温度下,例如在介于10℃与70℃之间的温度下、或介于37℃与60℃之间的温度下、或介于40℃与55℃之间的温度下或37℃的温度下,多肽的核酸酶活性比具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶的核酸酶活性高至少1%、2%、3%、4%、5%、7%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。在一些实施例中,在给定温度下,例如在介于10℃与70℃之间的温度下、在介于37℃与60℃之间的温度下、介于40℃与55℃之间的温度下或37℃的温度下,多肽的核酸酶活性比具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶的核酸酶活性高1%、2%、3%、4%、5%、7%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、75%、100%或介于这些值中的两个值之间的范围。在一些实施例中,在给定pH下,例如在pH 4到pH 11下、或在pH 6到pH 7.5下、或在pH 6到pH 7下、或在pH 6.5到pH 7下或在pH 6.5下,多肽的核酸酶活性比具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶的核酸酶活性高至少1%、2%、3%、4%、5%、7%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。
在一些实施例中,多肽的核酸酶活性比54℃/37℃比具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶的核酸酶活性比高至少1%、2%、3%、4%、5%、7%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。在一些实施例中,多肽的核酸酶活性比54℃/37℃比具有SEQID NO:1的序列的核酸酶的核酸酶活性比高至少1%、2%、3%、4%、5%、7%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、75%、100%或介于这些值中的两个值之间的范围。
多肽的最佳温度可以与具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶或其亲本核酸酶的最佳温度不同(例如,更高或更低)。例如,多肽的最佳温度可以比具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶或其亲本核酸酶的最佳温度高1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、20℃、25℃或介于这些值中的任意两个值之间的范围。在一些实施例中,多肽的最佳温度比具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶或其亲本核酸酶的最佳温度高至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、20℃、25℃或更多。在一些实施例中,多肽的最佳温度为或约为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、或介于这些值中的任意两个值之间的范围。在一些实施例中,多肽的最佳温度介于10℃与70℃之间。在一些实施例中,多肽的最佳温度介于37℃与60℃之间。
多肽的最佳pH可以与具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶和/或其亲本核酸酶的最佳pH不同(例如,更低或更高)。例如,多肽的最佳pH与具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶和/或其亲本核酸酶的最佳pH之差可以为pH 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3或更多或介于这些值中的任意两个值之间的范围。在一些实施例中,多肽的最佳pH高于具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶和/或其亲本核酸酶的最佳pH。在一些实施例中,多肽的最佳pH低于SEQ ID NO:1的核酸酶和/或其亲本核酸酶的最佳pH。在一些实施例中,多肽的最佳pH与具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶和/或其亲本核酸酶的最佳pH之差为至少或至多pH 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5或3。多肽的最佳pH可以是例如4、4.5、5、5.5、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.4、或11或介于这些值中的任意两个值之间的范围。多肽的最佳pH可以是至少或至多pH 4、4.5、5、5.5、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.4或11。在一些实施例中,多肽的最佳pH介于pH 4到pH 11之间、介于pH 6到pH7之间,例如pH 6.5。
在发酵过程期间,来自产生宿主的DNA可能使蛋白质回收过程的许多方面变得复杂。当前,已经添加DNA酶以从最终产物中去除DNA,这通常需要从其它来源添加昂贵的材料。在一些实施例中,本文所公开的核酸酶可以在与所关注产物相同的产生宿主中表达,这消除了添加外部DNA酶使得可以降低最终产物的总加工成本的需要。
本文所公开的核酸酶多肽可以具有一个或多个信号序列。在一些实施例中,所述一个或多个信号序列中的至少一个信号序列与包括其在内的核酸酶多肽是异源的。在一些实施例中,本文所公开的核酸酶多肽不含有任何信号序列。
本文还公开了抗体或其结合片段(例如,分离或纯化的抗体或其结合片段),所述抗体或其结合片段与分离的、合成的或重组的多肽特异性结合,所述多肽包括与SEQ IDNO:1具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高序列同一性的氨基酸序列,其中多肽具有核酸酶活性。多肽可以例如与SEQ ID NO:1具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或介于这些值中的任何两个值之间的范围的序列同一性。在一些实施例中,多肽包括E230L、L114F、E260R、E230M、D246P、S161R、N54S、T227H、V226K、E230R、G263A、G119N、G263A、N127S、P84V、D83E、D28G、V45T、M262V、A190K、P84N、I44R、G256S、A73M、P179L、Q135E、A60P、V247I、G263K、S161E、P72N、P84L、S74N、T82R、G75R、G119N、Q141R和D107N中的一个或多个突变。在一些实施例中,多肽包括L114F、E230M、D107N、Q141R、G119N、S74N、T82R或G75R的突变。在一些实施例中,所述多肽包括选自由以下组成的组的突变的组合:(a)T82R、L114F和G119N;(b)G75R、T82R、L114F和G119N;(c)S74N、G75R、T82R、G119N和Q141R;(d)S74N、T82R、L114F和G119N;(e)S74N、T82R、L114F、G119N和Q141R;(f)S74N、T82R、G119N和Q141R;(g)S74N、L114F和Q141R;(h)S74N、L114F、G119N和Q141R;(i)S74N、G75R、T82R、L114F和Q141R;(j)S74N、G75R、T82R、L114F、G119N和Q141R;(k)S74N、G75R、T82R和Q141R;(1)S74N、G75R、L114F和Q141R;(m)S74N、G75R和Q141R;(n)T82R、D107N和G119N;(o)S74N、G75R、T82R、D107N和Q141R;(p)S74N、G75R、G119N和Q141R;(q)T82R、D107N和L114F;(r)G75R、T82R、D107N和L114F;(s)G75R、D107N和L114F;(t)T82R、D107N、L114F和G119N;以及(u)S74N、G75R、L114F、G119N和Q141R。
本文所公开的核酸酶的变体可以包括在核酸酶的氨基酸位置中的一个或多个氨基酸位置处的取代、缺失和插入中的一个或多个。在一些实施例中,引入到亲本核酸酶(例如,具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶)中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数量不超过30,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29。氨基酸变化可以是性质上较不重要的,即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入;小的缺失(例如,1-20个氨基酸);小的氨基或羧基末端延伸,如氨基末端甲硫氨酸残基;至多20-25个残基的小的连接肽;或通过改变净电荷或另外功能促进纯化的小的延伸,如多组氨酸束、抗原表位或结合结构域。在一些实施例中,核酸酶的氨基酸变化可以改变亲本核酸酶的一种或多种物理化学特性。例如,与一个或多个亲本核酸酶相比,氨基酸变化可以改变(例如,改善或降低)核酸酶多肽的特性中的一个或多个特性,包含但不限于热稳定性、底物特异性、最适pH、最适温度等。
保守取代的实例在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨基酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的组内。通常不改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979在《蛋白质(The Proteins)》,学术出版社(AcademicPress),纽约中描述。非限制性示例性氨基酸取代包含Ala到Ser、Val到Ile、Asp到Glu、Thr到Ser、Ala到Gly、Ala到Thr、Ser到Asn、Ala到Val、Ser到Gly、Tyr到Phe、Ala到Pro、Lys到Arg、Asp到Asn、Leu到Ile、Leu到Val、Ala到Glu以及Asp到Gly。
可以使用本领域已知的针对蛋白质/DNA工程的方法(包含但不限于诱变、重组和/或改组)进行氨基酸取代、缺失和/或插入并进行测试,随后进行相关的筛选程序,如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,《科学(Science)》241:53-57;Bowie和Sauer,1989,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》86:2152-2156;WO 95/17413;或WO 95/22625所公开的那些筛选程序。可以使用的其它方法包含易错PCR、噬菌体展示(例如,Lowman等人,1991,《生物化学(Biochemistry)》30:10832-10837;美国专利第5,223,409号;WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,《基因(Gene)》46:145;Ner等人,1988,《DNA》7:127)。在一些实施例中,诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性。可以从宿主细胞中回收对活性多肽进行编码的诱变的DNA分子并使用本领域的标准方法快速地测序。这些方法允许快速确定多肽中单独氨基酸残基的重要性。
在一些实施例中,核酸酶多肽比其它核酸酶(例如,具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶)可以耐受更高或更低的pH。例如,核酸酶多肽可以在或约在pH3.0、pH 3.5、pH 4.0、pH4.5、pH 5.0、pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9.0、pH 9.5、pH10.0、pH 10.5、pH 11.0、pH 11.5、pH 12.0下或介于这些值中的任意两个值之间的范围保留核酸酶活性(例如,其核酸酶活性的至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%)。例如,核酸酶多肽在高于或低于pH 3.0、pH 3.5、pH 4.0、pH 4.5、pH 5.0、pH 5.5、pH6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9.0、pH 9.5、pH 10.0、pH 10.5、pH 11.0、pH 11.5、pH 12.0或介于这些值中的任意两个值之间的范围保留核酸酶活性(例如,其核酸酶活性的至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%)。在一些实施例中,这些pH耐受核酸酶多肽也是热稳定的。例如,热稳定的核酸酶多肽可以在10℃、15℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、70℃的温度下或介于这些值中的任意两个值之间的范围保留核酸酶活性(例如,其核酸酶活性的至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%)。
与具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶或其相应的亲本核酸酶相比,本文所公开的核酸酶多肽可以具有相同或不同的底物特异性。例如,与具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶或其相应的亲本核酸酶相比,所述核酸酶多肽可以具有基本上相同的底物特异性。在一些实施例中,与具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶或其相应的亲本核酸酶相比,核酸酶多肽具有约50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或介于这些值中的任意两个值之间的范围的底物特异性。本文还公开了包括本文所公开的核酸酶多肽中的一种或多种核酸酶多肽的组合物。
本文还提供了固定的核酸酶多肽,其中所述固定的多肽包括本文所公开的核酸酶多肽之一。在一些实施例中,多肽可以固定在细胞、金属、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极、石墨颗粒、珠粒、凝胶、板、阵列、毛细管或其组合上。
核酸酶多肽及其变体的产生
本文提供了用于修饰和制备本文所公开的核酸酶多核苷酸的变体的方法。一些实施例提供了对本文所公开的多肽中的一种或多种多肽进行编码的合成或重组核酸,以及包括所述核酸的载体(例如,表达载体)。所述方法的非限制性实例包含合成连接重装配、随机诱变、靶向诱变、优化的定向进化系统和/或饱和诱变(如基因位点饱和诱变(GSSM))以及其任意组合。如本文所使用的,术语“饱和诱变”、“基因位点饱和诱变”和“GSSM”可互换使用并且是指使用简并的寡核苷酸引物将点突变引入到多核苷酸中的方法。术语“优化的定向进化系统”或“优化的定向进化”包含用于重装配相关核酸序列(如相关基因)的片段的方法,并且在下面详细解释。术语“合成连接重装配”或“SLR”包含以非随机方式连接寡核苷酸片段的方法,并且在下面详细解释。术语“变体”是指根据本说明书的多核苷酸或多肽,所述多核苷酸或多肽(分别)在一个或多个碱基对、密码子、内含子、外显子或氨基酸残基处修饰,但仍保留核酸酶的生物活性。可以通过以下方法产生变体,如通过易错PCR、改组、定点诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变(噬菌体辅助连续进化、体内连续进化)、盒式诱变、递归整体诱变、指数整体诱变、位点特异性诱变、基因重装配、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重装配(SLR)、重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含尿嘧啶的模板诱变、缺口双重诱变、点错配修复诱变、修复缺陷型宿主菌株诱变、化学诱变、放射引起的诱变、缺失诱变、限制选择诱变、限制纯化诱变、人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚体创建和/或这些和其它方法的组合。
另外,如美国专利第9,476,078号(其内容特此通过引用整体并入本文)中所描述的,定制的多位点组合装配(“TMCA”)方法可以高效并快速地产生包括多个变化的特定基因变体或组合基因文库;需要最少的成本和精力;并且可以根据“需求”进行定制以制作偏置的组合文库。TMCA方法可以在不采用连接步骤的情况下进行,因此简化了产生多个突变的过程。特定文库的“需求”因实验而异。潜在的突变位点—“需求”—例如可以是(1)合理设计的氨基酸变化或(2)凭经验确定的对酶产生期望效果的单独氨基酸变化(由GSSM和筛选工作确定)。每个文库都创建有特定数量的潜在突变位点。可以优选地创建朝着子代偏置的文库,所述文库在潜在的突变位点处具有更多或更少的突变。同样,可以优选地创建其中存在朝向或反向特定突变或突变位点的偏置的文库。使用TMCA方法产生了本文所公开的各种核酸酶多肽。
包括表达盒(如载体)的克隆载体可以在本文中用于表达本文所公开的核酸酶多肽中的一种或多种核酸酶多肽。如本文所使用的,术语“载体”涵盖任何种类的克隆媒剂,如但不限于质粒、噬菌粒、病毒载体(例如,噬菌体(phage))、噬菌体(bacteriophage)、杆状病毒、粘粒、福斯质粒、人工染色体或和任何其它对所关注的特定宿主具有特异性的载体。还包含低拷贝数或高拷贝数载体。外来多核苷酸序列通常包括编码序列,所述编码序列在本文中可以被称为“所关注基因”。所关注基因可以包括内含子和外显子,这取决于宿主细胞的起源或目的地的种类。克隆媒剂可以是病毒载体、质粒、噬菌体(phage)、噬菌粒、粘粒、福斯质粒、噬菌体(bacteriophage)、人工染色体或其组合。病毒载体可以包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体。克隆媒剂可以包括细菌人工染色体(BAC)、质粒、噬菌体P1衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)。在一些实施例中,将对一种或多种核酸酶多肽进行编码的多核苷酸序列整合到其中存在多核苷酸序列的宿主细胞的染色体中,因此所述多核苷酸是宿主细胞的染色体的一部分。宿主细胞可以是例如细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。在一些实施例中,对一种或多种核酸酶多肽进行编码的多核苷酸序列不位于宿主细胞的染色体中。
本文还提供了包括核酸或表达盒(如载体)的转化的宿主细胞或包括对本文所公开的核酸酶多肽中的一种或多种核酸酶多肽进行编码的核酸序列的克隆媒剂。一些实施例提供了用于产生具有核酸酶活性的重组多肽的方法,其中所述方法包括在允许表达所述一种或多种核酸酶多肽中的至少一种核酸酶多肽的条件下表达对本文所公开的一种或多种核酸酶多肽进行编码的多核苷酸。在一些实施例中,对本文所公开的一种或多种核酸酶多肽进行编码的多核苷酸可操作地连接到启动子。在一些实施例中,所述多肽存在于表达载体中。在一些实施例中,多核苷酸存在于宿主细胞中以允许多肽的表达。在一些实施例中,多核苷酸存在于宿主细胞的染色体中以允许多肽的表达。在一些实施例中,转化的宿主细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。在一些实施例中,转化的宿主细胞是来自以下的细胞:巴斯德毕赤酵母(巴斯德驹形氏酵母)、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌、嗜热毁丝霉真菌、里氏木霉、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、粟酒裂殖酵母或酿酒酵母。
表达载体的非限制性实例包含病毒颗粒、杆状病毒、噬菌体、质粒、噬菌粒、粘粒、福斯质粒、细菌人工染色体、病毒DNA(例如,牛痘、腺病毒、禽痘病毒(foul pox virus)、假狂犬病和SV40的衍生物)、基于PI的人工染色体、酵母质粒、酵母人工染色体以及任何其它对所关注的特定宿主具有特异性的载体(如杆菌、曲霉属真菌和酵母)。本文所公开的编码核酸酶DNA可以包含在用于表达核酸酶多肽的多种表达载体中的任何一种表达载体中。此类载体包含染色体、非染色体和合成DNA序列。许多适合的载体是本领域技术人员已知的,并且是可商购获得的,例如,细菌类的:pQE载体(凯杰公司(Qiagen))、pBluescript质粒、pNH载体(λ-ZAP载体(斯特拉塔根公司(Stratagene));ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(法玛西亚公司(Pharmacia));以及真核类的:pXT1、pSG5(Stratagene公司)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(法玛西亚公司)。根据期望的用途,可以使用低拷贝数或高拷贝数载体。
密码子优化可以用于在宿主细胞中实现高水平的蛋白质表达。在一些实施例中,可以优化对本文所公开的核酸酶多肽中的一种或多种核酸酶多肽进行编码的核酸中的密码子以增加或减少其在宿主细胞中的表达。例如,可以将对核酸酶多肽进行编码的核酸中的非优选或次优选的密码子中的一个或多个密码子替换为对所关注宿主细胞的相同氨基酸进行编码的一个或多个“优选的密码子”。如本文所使用的,“优选的密码子”是在宿主细胞中的基因的编码序列中过表示的密码子,并且“非优选或次优选的密码子”是在宿主细胞中的基因的编码序列中表示不足的密码子。
用于表达根据本公开的核酸、表达盒和载体的宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞,并且可以包含细菌、酵母、真菌、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞;并且提供了用于优化所有这些细胞、密码子改变的核酸和由密码子改变的核酸制备的多肽中的密码子用途的方法。示例性宿主细胞包含革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌)、革兰氏阳性细菌(如链霉菌属)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳脂链球菌(Lactococcus cremoris)、枯草芽孢杆菌和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)。示例性宿主细胞还包含:真核生物体,如各种酵母,如酵母菌属,包含酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、黑曲霉;以及哺乳动物细胞和细胞系;以及昆虫细胞和细胞系。在一些实施例中,宿主细胞是来自选自由以下组成的组的生物体的细胞:巴斯德毕赤酵母(巴斯德驹形氏酵母)、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌、嗜热毁丝霉真菌、里氏木霉、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、粟酒裂殖酵母和酿酒酵母。对本文所公开的核酸酶多肽进行编码的核酸可以位于宿主细胞的基因组上,例如是宿主细胞染色体的一部分。在一些实施例中,对核酸酶多肽进行编码的核酸位于与宿主细胞的基因组分开的表达载体上。在一些实施例中,产生本文所公开的核酸酶多肽的方法可以包括在允许表达核酸酶多肽的条件下表达对核酸酶多肽进行编码的核酸,由此产生核酸酶多肽。在一些实施例中,对核酸酶多肽进行编码的核酸可操作地连接到诱导型启动子,例如通过温度和/或pH的变化和/或化合物(例如,异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)、阿拉伯糖、四环素、类固醇和金属)的存在、不存在或量/浓度的变化可诱导的启动子。
本说明书还包含针对在这些生物体和物种中的表达而优化的核酸和多肽。
核酸酶多肽的用途
一些实施例提供了用于使用本文所公开的核酸酶多肽中的一种或多种核酸酶多肽降解多核苷酸的方法。在一些实施例中,所述方法包括使一种或多种多核苷酸分子与本文所公开的核酸酶多肽中的一种或多种核酸酶多肽接触,由此降解所述多核苷酸分子。多核苷酸分子可以包括DNA(例如,单链或双链DNA)、RNA(例如,单链或双链DNA)或其任何组合。所述接触可以在各种pH值下进行,例如pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9、pH 10、pH 11或介于这些值中的任意两个值之间的范围。所述接触也可以在各种温度下进行,例如10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或介于这些值中的任意两个值之间的范围。所述一种或多种多核苷酸分子可以包括在各种物体中,例如用于洗涤的组合物(例如,纺织品、衣服、棉、织物或其任何组合)或水溶液(例如,反应混合物)。
核酸酶已被用于广泛的应用中,例如药物、农业和工业应用。本文提供了包括一种或多种本文所公开的核酸酶多肽的组合物和试剂盒。所述组合物可以是酶组合物、洗涤剂组合物、洗涤剂添加剂、食品、食品补充剂、饲料补充剂、饲料、药物组合物、发酵产物、发酵中间物、发酵下游反应混合物、反应混合物或其组合。在一些实施例中,所述反应混合物用于蛋白质表达或纯化。所述酶组合物可以例如包括本文所公开的核酸酶多肽中的一种或多种核酸酶多肽和储存缓冲液。在一些实施例中,储存缓冲液包括pH缓冲系统(例如,Tris-HCl),所述缓冲系统提供约6.0-9.0的pH,例如pH 6.0-7.0或约pH 6.5。储存缓冲液可以例如包含稳定剂,如甘油。在一些实施例中,所述储存缓冲液包含浓度为至少约5%、10%、20%、30%、40%、50%或更多的甘油。在一些实施例中,所述储存缓冲液包含浓度为约30-70%(例如,40-60%)的甘油。
本文还公开了用于在表达或产生所关注蛋白质期间降解多核苷酸的方法。在一些实施例中,所述方法包括:培养宿主细胞,其中所述宿主细胞包括对所关注蛋白质进行编码的核酸;以及在允许通过所述一种或多种核酸酶多肽中的至少一种核酸酶多肽降解多核苷酸的条件下表达本文所公开的核酸酶多肽中的一种或多种核酸酶多肽。所述多核苷酸分子可以包括DNA、RNA或其任何组合。所述多核苷酸分子可以包括来自宿主细胞的DNA或RNA(或其片段)。在一些实施例中,所关注蛋白质不是核酸酶。在一些实施例中,所关注蛋白质不是所述一种或多种核酸酶多肽中的任何一种核酸酶多肽。所述一种或多种核酸酶多肽可以由例如存在于宿主细胞中的一种或多种表达载体或宿主细胞的染色体中的核酸序列表达。在一些实施例中,所述一种或多种核酸酶多肽中的至少一种核酸酶多肽不由表达所关注蛋白质的细胞表达。在一些实施例中,所述一种或多种核酸酶多肽由不表达所关注蛋白质的细胞表达。所关注蛋白质的表达和/或核酸酶多肽的表达可以是可诱导的。例如,所关注蛋白质的编码序列、核酸酶多肽的编码序列或两者可以与诱导型启动子可操作地连接。诱导型启动子可以例如通过一种或多种化学或生物化合物的存在、不存在和/或量的变化、pH、温度、渗透压、离子强度/浓度的变化或其任何组合来诱导。一些实施例提供了宿主细胞,所述宿主细胞包括对所关注蛋白质进行编码的核酸和对本文所公开的核酸酶多肽中的一种或多种核酸酶多肽进行编码的核酸。
所述组合物可以以多种形式调配,如片剂、凝胶、药丸、植入物、液体、喷雾剂、薄膜、胶束、粉末、食品、饲料团粒、一种包封形式或其组合。
在一些实施例中,本文所公开的核酸酶多肽可以在洗涤剂应用中单独使用或与一种或多种另外的酶组合使用。一些实施例提供了包括本文所公开的核酸酶及其变体的洗涤剂组合物。在一些实施例中,洗涤剂组合物可以进一步包括一种或多种另外的酶、或一种或多种另外的组分或其任何组合。洗涤剂组合物可以是例如手用或机用衣物洗涤剂组合物。所述一种或多种另外的组分包含但不限于适合于对染色的织物进行预处理的一种或多种衣物添加剂组合物和漂洗添加的织物软化剂组合物。洗涤剂组合物可以调配成例如用于一般的家用硬表面清洁操作或用于手用或机用洗碗操作。另外的组分的非限制性实例包含表面活性剂(例如,阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、半极性表面活性剂、两性离子表面活性剂或其混合物)、助洗剂、共助洗剂、漂白系统、聚合物、织物调色剂、防沫剂、去污聚合物、防再污染剂、助水溶物、润湿剂、增稠剂、一种或多种pH控制缓冲液、稳定剂、香料、着色剂、填料等或其任何组合。助洗剂和/或共助洗剂可以是例如与Ca和Mg形成水溶性复合物的螯合剂。
一些实施例提供了在洗涤剂应用中使用核酸酶及其变体的方法。例如,所述方法可以包括:(a)使纺织品与包括本文所公开的核酸酶及其变体中的一种或多种的洗涤剂组合物接触;以及(b)进行至少一个洗涤循环以洗涤所述纺织品。所述方法可以例如进一步包括漂洗经过洗涤的纺织品。在一些实施例中,洗涤剂组合物进一步包括一种或多种另外的酶。在一些实施例中,所述纺织品是由棉或合成材料制成的物品,例如一件运动服、T恤或一件使用时暴露于汗水的衣服。所述纺织品也可以是寝具、床上用品或毛巾。
如本文所公开的,所述一种或多种另外的酶可以包含但不限于核酸酶、蛋白酶、脂酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(例如,虫漆酶和过氧物酶)和脱氧核糖核酸酶(DNa酶)中的一种或多种。所述洗涤剂组合物可以例如用于纺织品的洗涤方法中。在一些实施例中,洗涤剂组合物可以包括以下阴离子表面活性剂中的一种或多种:直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐和二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES)、仲链烷磺酸钠(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸、磺化脂肪酸甘油酯、α-磺基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)、甲酯磺酸盐(MES)、烷基-或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺基琥珀酸或皂的二酯和单酯。
还提供了药物组合物的药学上可接受的前药以及采用此类药学上可接受的前药的治疗方法。术语“前药”意指指定化合物的前体,在施用于受试者后,所述前体通过化学或生理过程(如溶剂分解或酶促切割)或在生理条件下(例如,达到生理pH的前药会转化为药剂)在体内产生化合物。“药学上可接受的前药”是无毒的、生物学上可耐受的和以其它方式生物学上适合于施用于受试者的前药。选择和制备适合的前药衍生物的说明性程序描述于例如Bundgaard,《前药设计(Design of Prodrugs)》(爱思唯尔出版社(Elsevier Press),1985)。
还提供了药物组合物的药学活性代谢物以及此类代谢物在本说明书的方法中的用途。“药学活性代谢物”意指化合物或其盐在体内代谢的药学活性产物。化合物的前药和活性代谢物可以使用本领域已知或可获得的常规技术确定。参见例如Bertolini等人,《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》1997,40,2011-2016;Shan等人,《药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)》1997,86(7),765-767;Bagshawe,《药物开发研究(Drug Dev.Res.)》1995,34,220-230;Bodor,《药物研究进展(Adv.Drug Res.)》1984,13,255-331;Bundgaard,《前药 设计》(爱思唯尔出版社,1985);以及Larsen,《前药的设计和应用(Design and Application of Prodrugs)》《药物设计和发展(Drug Design and Development)》(Krogsgaard-Larsen等人,编辑,哈伍德学术出版社(Harwood Academic Publishers),1991)。
可以制备本文描述的化合物的任何适合的调配物。通常参见《雷明顿药物科学 (Remington's Pharmaceutical Sciences)》(2000)Hoover,J.E.编辑,第20版,利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams and Wilkins Publishing Company),伊斯顿,宾夕法尼亚州,第780-857页。选择适合于适当的施用途径的调配物。一些施用途径是口服、肠胃外、通过吸入、局部、直肠、鼻、颊、阴道、通过植入式储药器或其它药物施用方法。在化合物具有足够的碱性或酸性以形成稳定的无毒酸盐或碱盐的情况下,以盐的形式施用化合物可能是适当的。药学上可接受的盐的实例是与形成生理可接受的阴离子的酸形成的有机酸加成盐,例如甲苯磺酸盐、甲烷磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、a-酮戊二酸盐和a-甘油磷酸盐。还可形成适合的无机盐,包含盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。药学上可接受的盐是使用本领域中众所周知的标准程序获得的,例如通过足够碱性化合物,如具有适合的酸的提供生理上可接受的阴离子的胺。还制备了羧酸的碱金属(例如,钠、钾或锂)或碱土金属(例如,钙)盐。
在一些实施例中,包括本文所公开的一种或多种核酸酶多肽的组合物是用于破坏生物膜、用于预防生物膜形成或两者的药物组合物或抗生物污垢组合物。在一些实施例中,所述药物组合物用于治疗牙菌斑;龋齿;牙周炎;自体瓣膜心内膜炎;慢性细菌性前列腺炎;中耳炎;与医疗装置相关的感染,如人工心脏瓣膜、人工起搏器、隐形眼镜、假关节、缝线、导管和动静脉分流器;与伤口、裂伤、疮疡和粘膜病变(如溃疡)相关的感染;口腔、口咽、鼻咽和喉咽的感染;外耳感染;眼睛感染;胃、小肠和大肠感染;尿道和阴道感染;皮肤感染;鼻内感染,如鼻窦感染;或其组合。在一些实施例中,包括本文所公开的一种或多种核酸酶多肽的组合物是用于口腔护理、伤口处理或两者的药物组合物。在一些实施例中,使用所述组合物的方法包括使组合物与生物膜接触。在一些实施例中,使用所述组合物的方法包括使组合物与伤口、裂伤、疮疡、粘膜病变或其任何组合接触。在一些实施例中,使用所述组合物的方法包括使组合物与医疗装置接触。在一些实施例中,使用所述组合物的方法包括使组合物与皮肤、外耳、眼睛或其组合接触。
在一些实施例中,包括本文所公开的一种或多种核酸酶多肽的组合物用于接触包括DNA底物的食品机械并清洁所述食品机械。在一些实施例中,包括本文所公开的一种或多种核酸酶多肽的组合物用于接触包括DNA底物的表面并清洁所述表面。在一些实施例中,包括本文所公开的一种或多种核酸酶多肽的组合物用于接触包括DNA底物的造纸机并清洁所述造纸机。
实例
在以下实例中进一步详细地公开了上文讨论的实施例的一些方面,所述实例不旨在以任何方式限制本公开的范围。
下文提供了以下实例中用于测试核酸酶变体的方案。
PicoGreen测定
PicoGreen阵列中使用的试剂包含:
·37℃缓冲液:50mM Tris-HCl、pH 8.30、1mM MgCl2,有或没有0.1-1mg/mL BSA;或50mM Bis-Tris丙烷、pH 8、1mM MgCl2,有或没有0.1-1mg/mL BSA;
·54℃缓冲液:50mM Tris-HCl、pH 8.78、1mM MgCl2,有或没有0.1-1mg/mL BSA;或50mM Bis-Tris丙烷、pH 8、1mM MgCl2,有或没有0.1-1mg/mL BSA;
·酶稀释缓冲液:具有0.1-1mg/mL BSA的37℃缓冲液;
·底物储备液:鲱鱼精子DNA(普洛麦格(Promega)D1815),10mg/mL;
·37℃底物:含4800ng/mL鲱鱼精子DNA的37℃缓冲液;
·54℃底物:含7200ng/mL鲱鱼精子DNA的54℃缓冲液;
·PicoGreen染料:赛默飞世尔(Thermal Fisher)(P7581);
·PicoGreen试剂:在50mM Tris-HCl、pH 7.5的缓冲液中,将来自供应商的PicoGreen染料原始储备液稀释50倍。
以适当的稀释度将上清液样品稀释于酶稀释缓冲液中。对于37℃测定,将30μL的37℃底物与10μL的稀释样品/对照物混合,并在37℃下温育1小时。对于54℃测定,将20μL的54℃底物与20μL的稀释样品/对照物混合,并在54℃下温育1小时。温育后,添加30μL的PicoGreen试剂。在Ex/Em=480/520nm下读取荧光。PicoGreen染料将与未降解的双链DNA结合并展现出荧光信号。
DNA降解百分比(在本文中也被称为“DNA降解%”,通常在20-60%之间)计算为:(不含酶的孔的荧光-含酶的孔的荧光)/不含酶的孔的荧光×100%。在一些实例中,在54℃/37℃下,通过DNA降解百分比来计算活性比。
A260测定
A260测定中使用的试剂包含:
·37℃缓冲液:50mM Tris-HCl、pH 8.30、1mM MgCl2,有或没有0.1-1mg/mL BSA;或50mM Bis-Tris丙烷、pH 8、1mM MgCl2,有或没有0.1-1mg/mL BSA;
·54℃缓冲液:50mM Tris-HCl、pH 8.78、1mM MgCl2,有或没有0.1-1mg/mL BSA;或50mM Bis-Tris丙烷、pH 8、1mM MgCl2,有或没有0.1-1mg/mL BSA;
·酶稀释缓冲液:具有0.1-1mg/mL BSA的37℃缓冲液;
·底物储备液:鲱鱼精子DNA(普洛麦格D1815),10mg/mL;
·37℃底物:含0.4mg/mL鲱鱼精子DNA的37℃缓冲液;
·54℃底物:含0.4mg/mL鲱鱼精子DNA的54℃缓冲液;
·4%高氯酸。
以适当的稀释度将上清液样品稀释于酶稀释缓冲液中。在浅的透明96孔板中,在每个孔中进行反应。对于37℃测定,将7μL的稀释酶/对照物与140μL的37℃底物混合。对于54℃测定,将21μL的稀释酶/对照物与140μL的54℃底物混合。将测定板分别在37℃和54℃下温育1小时。温育后,向每个孔中添加147μL的4%高氯酸,并在10℃下以约3200g离心15分钟。将230μL的上清液从每个板转移到UV透明板,并在260nm处读取吸光度。与未降解的DNA相比,降解的DNA展现出增加的吸光度260信号,并且更高的A260值对应于高核酸酶活性。在一些实例中,在54℃/37℃下,通过增加的Abs260来计算活性比。
荧光共振能量转移(FRET)测定-核酸酶检测系统
FRET测定是根据制造手册IDT DNaseAlertTM底物进行修改的。所述测定中使用的试剂包含:
·底物:DNaseAlertTM底物(IDT,目录号11-04-02-04)。向底物瓶中添加1mL无核酸酶的水,底物浓度=2mM;
·37℃缓冲液:50mM Tris-HCl、pH 8.30、1mM MgCl2,有或没有0.1-1mg/mL BSA;或50mM Bis-Tris丙烷、pH 8、1mM MgCl2,有或没有0.1-1mg/mL BSA;
·54℃缓冲液:50mM Tris-HCl、pH 8.78、1mM MgCl2,有或没有0.1-1mg/mL BSA;或50mM Bis-Tris丙烷、pH 8、1mM MgCl2,有或没有0.1-1mg/mL BSA;
·酶稀释缓冲液:具有0.1-1mg/mL BSA的37℃缓冲液。
在96孔半区板中,将5μL的DNA底物(2uM)与40μL的BTP缓冲液混合并在37℃或54℃下预热10分钟。将酶样品在酶稀释缓冲液中稀释约20-40倍。将5μL的稀释的样品添加到底物溶液中并在37℃或54℃下读取15分钟,激发=536nm,发射=566nm。通过拟合前三个点来计算斜率并获得RFU/分钟。
预期更高的斜率对应于更高的核酸酶活性。如果斜率太高或太低且在线性范围之外,则调整样品稀释度并再次进行测定。在一些实例中,在54℃/37℃下,通过斜率来计算活性比。
通过LabChip和ELISA进行蛋白质定量
根据制造商的方案或标准方案,通过LabChip或酶联免疫吸附测定(ELISA)进行蛋白质定量。
方案相比由凯利普生命科学公司(Caliper LifeSciences)提供的方案略有修改。高灵敏度样品遵循LabChip GXII蛋白质测定快速指南(凯利普生命科学公司,霍普金顿,马萨诸塞州)。简要地,样品制备如下:(1)通过将24.5μLβ-巯基乙醇添加到700μL的蛋白质表达样品缓冲液(Protein Express Sample Buffer)中来制备变性溶液;(2)将10μL的蛋白质样品添加到14μL的变性溶液中。样品可以在96孔板中制备;(3)将12μL的蛋白质表达序列梯(Protein Express Ladder)转移到微量离心管中,但未添加变性溶液;(4)使样品和序列梯在100℃下变性5分钟;(5)向样品中加入64μL水并向序列梯中添加120μL水,并以1200g离心2分钟以除去气泡;(6)将120μL的序列梯转移到提供的序列梯管中;并且(7)根据制造方案进行LabChip测量。
使用标准方案通过ELISA进行蛋白质定量。
实例1
通过PicoGreen测定测试核酸酶变体
使用PicoGreen测定来选择由GSSM产生的期望的核酸酶变体(在本文中也被称为“GSSM变体”)。将核酸酶变体相对于亲本核酸酶的DNA降解百分比54℃/37℃比率以及核酸酶变体的表达水平用作选择标准。
在37℃下进行活性测定之前,通过酶稀释确定酶表达水平。酶表达用“x”表示,并且表达水平定义如下表1所示。
表1.蛋白质表达水平的确定
稀释因子(DF)范围 | 表达水平 |
DF>=20000 | xxxx |
1000<DF<20000 | xxx |
DF 500=<DF<=1000 | xx |
DF<500 | x |
在54℃下,用DNA降解%×稀释因子除以酶浓度来计算54℃比活性指数。测试了由GSSM产生的各种核酸酶变体,并且测定结果示出于表2中。选择了变体VAR002、VAR003、VAR030、VAR033、VAR035、VAR036和VAR037,因为与亲本核酸酶相比,其在54℃下的活性有所提高,并且以期望水平或以上表达。
表2.核酸酶变体的特性
实例2
测试由TMSCA产生的核酸酶变体
使用FRET测定来选择由TMSCA产生的期望的核酸酶变体(在本文中也被称为“TMSCA突变体”)。将54℃/37℃反应速率比(>1)和酶稀释因子(>20)用作选择标准。与亲本核酸酶相比,所选的变体在54℃下具有改进的活性。表3示出了FRET测定的结果。
表3.由TMSCA产生的核酸酶变体的特性
实例3
通过A260测定测试核酸酶变体
使用A260测定测试由TMSCA产生的许多核酸酶变体。表4示出了测定的结果。使用的选择标准为:在pH 7和pH 8两者下的活性54℃/37℃>1;在37℃下,pH 7/pH 8>0.9;并且在54℃下,pH 7/pH 8>0.5。在54℃下,在pH 7和pH 8下,所选命中具有比亲本改进的活性;在37℃和54℃下,活性在pH 7下。
表4.TMSCA核酸酶变体的A260测定结果
pH 8 54℃/37℃ | pH 7 54℃/37℃ | 37℃pH 7/pH 8 | 54℃pH 7/pH 8 | |
VAR046 | 0.78 | 0.23 | 0.81 | 0.24 |
VAR053 | 1.04 | 0.62 | 0.95 | 0.57 |
VAR060 | 2.56 | 1.87 | 1.08 | 0.79 |
VAR061 | 2.70 | 1.29 | 1.07 | 0.51 |
VAR062 | 2.40 | 1.28 | 1.07 | 0.57 |
VAR064 | 1.25 | 0.86 | 0.90 | 0.62 |
VAR065 | 1.10 | 0.44 | 1.08 | 0.43 |
VAR066 | 2.34 | 0.70 | 1.08 | 0.33 |
VAR068 | 2.91 | 2.12 | 1.12 | 0.82 |
VAR069 | 3.48 | 2.75 | 1.12 | 0.88 |
VAR070 | 2.80 | 2.05 | 1.17 | 0.86 |
VAR071 | 3.02 | 2.05 | 1.18 | 0.80 |
VAR072 | 2.51 | 1.51 | 1.06 | 0.63 |
VAR077 | 0.56 | 0.42 | 0.16 | 0.12 |
VAR078 | 2.14 | 1.30 | 0.69 | 0.42 |
VAR085 | 1.63 | 1.04 | 1.09 | 0.70 |
VAR090 | 0.48 | 0.58 | 0.22 | 0.27 |
VAR091 | 1.36 | 0.97 | 0.30 | 0.21 |
VAR093 | 0.73 | 0.94 | 0.36 | 0.46 |
VAR095 | 0.54 | 0.74 | 0.21 | 0.28 |
VAR103 | 3.46 | 2.78 | 1.01 | 0.81 |
Seq 1 | 0.23 | 0.14 | 0.43 | 0.27 |
实例4
由TMSCA产生的核酸酶变体的温度图谱
针对温度图谱测试由TMSCA产生的许多核酸酶变体。测试结果示出在表5(PC=阳性对照物,并且NC=阴性对照物)和图2中。在表5中,在最左列处提供了测试核酸酶变体的温度(“温度(temp)”)。
表5.以TMSCA核酸酶变体的最大活性%归一化的A260测定结果
实例5
37℃下核酸酶变体的pH图谱
在37℃下,针对pH图谱测试由TMSCA产生的许多核酸酶变体。表6和图3中示出了测试结果。
表6.相对于核酸酶变体的最大活性归一化的A260读取结果
pH | VAR060 | VAR061 | VAR062 | VAR068 | VAR069 | VAR070 | VAR071 | VAR072 | VAR085 | VAR103 | PC | NC |
6.3 | 76.4 | 79.6 | 77.9 | 85.1 | 83.0 | 82.1 | 81.0 | 82.4 | 82.2 | 86.2 | 40.8 | |
6.7 | 95.3 | 97.9 | 95.4 | 97.8 | 98.5 | 99.2 | 94.8 | 94.3 | 95.4 | 97.5 | 63.1 | |
7.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100 | 75.9 | |
7.5 | 91.2 | 91.0 | 92.3 | 89.6 | 88.9 | 88.2 | 85.9 | 87.1 | 87.8 | 87.6 | 85.9 | |
8.0 | 78.9 | 82.2 | 85.5 | 79.7 | 80.1 | 76.3 | 76.3 | 77.1 | 79.1 | 76.0 | 96.7 | |
8.5 | 71.4 | 74.4 | 80.6 | 77.8 | 73.6 | 66.9 | 67.5 | 70.1 | 71.0 | 66.4 | 98.0 | |
9.0 | 63.7 | 72.9 | 82.3 | 66.5 | 69.5 | 59.8 | 68.3 | 65.7 | 68.1 | 68.5 | 85.2 | |
9.3 | 58.5 | 74.6 | 82.3 | 65.9 | 68.2 | 55.4 | 68.0 | 63.2 | 65.8 | 67.9 | 100.0 | |
10.0 | 56.6 | 58.3 | 64.5 | 59.9 | 61.1 | 56.6 | 53.4 | 60.3 | 62.3 | 54.3 | 67.9 |
实例6
α淀粉酶发酵液的核酸酶预处理
选择了五种先导变体VAR060、VAR062、VAR070、VAR072和VAR085。对于这些五个先导变体中的每个先导变体,执行α淀粉酶发酵液的热灭活(参见图4)。在两个小时斜升时间的热灭活过程期间,添加核酸酶。
通过核酸酶浓度归一化先导变体的预处理结果。每个变体按3个水平一式两份地给药:0.23ppb、0.45ppb和0.9ppb,其分别相当于核酸内切酶的250、500和1000U/F。用于每个剂量的对照物包含:阳性的(具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶)、阴性的(载体对照物,与亲本相同地稀释)和预处理的未归一化和归一化结果分别示出在图5中。在所有测试的先导变体中,VAR070在每个剂量下示出最大的粘度降低。
如本文公开的实例所示,与亲本核酸酶相比,具有单点突变的许多核酸酶变体具有更高的活性比54℃/37℃,同时保持相似的比活性。而且,具有点突变组合的许多核酸酶变体具有介于45℃-55℃之间的最佳温度(与亲本核酸酶的37℃相比),并且与亲本核酸酶的pH 8相比,最佳pH为约6.5。
前述描述和实例详述了本说明书的某些优选实施例并描述了发明人所设想的最佳模式。然而,应当理解,无论前述内容在文本中的详细程度如何,本说明书可以以多种方式实践,并且本说明书应根据所附权利要求和其任何等效物来解释。尽管上文已经详细描述了本申请,但是本领域的普通技术人员将理解,在不背离本说明书的精神的情况下,可以进行各种修改。
在本申请中,单数形式的使用可以包含复数形式,除非另有特别说明,或者除非本领域技术人员根据本公开将理解,否则单数形式是唯一的功能实施例。因此,例如,“一个/种”可以意指多于一个,并且“一个实施例”可以意指本说明书适用于多个实施例。另外,在本申请中,“和/或”表示“和”的包含性含义,并且可替代地,“或”的排他性含义适用于所述列表。因此,所述列表应理解为包含列表项的所有可能组合,并且还应排他性地包含来自其它项的每一项。此术语的添加并不意味着表示单独使用术语“和”或“或”的任何特定含义。在阅读特定的公开时,此类术语的含义对于本领域技术人员将是显而易见的。
本文所引用的所有参考文献(包含但不限于已公开和未公开的专利申请、专利、教科书、文献参考等)在尚未被引用的程度上通过引用整体并入本文。就所并入的文献中的一个或多个和类似材料与说明书中含有的本公开(包含但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等)不同或相矛盾而言,本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾材料。
如本文所使用的,术语“包括”与“包含”“含有”或“其特征在于”同义并且是包含性或开放式的并且不排除另外未列出的元件或方法步骤。
Claims (60)
1.一种合成或重组多肽,其包括与SEQ ID NO:1具有至少80%序列同一性的氨基酸序列,其中所述多肽具有核酸酶活性,并且其中所述多肽包括E230L、L114F、E260R、E230M、D246P、S161R、N54S、T227H、V226K、E230R、G263A、G119N、V226K、G263A、N127S、P84V、D83E、D28G、V45T、M262V、A190K、P84N、I44R、G256S、A73M、P179L、Q135E、A60P、V247I、G263K、S161E、P72N、P84L、S74N、T82R、G75R、Q141R和D107N中的一个或多个突变。
2.根据权利要求1所述的多肽,其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90%序列同一性。
3.根据权利要求1或2所述的多肽,其中所述多肽包括选自由以下组成的组的一个或多个突变:L114F、E230M、G119N、D107N、S74N、Q141R、T82R和G75R。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的多肽,其中所述多肽包括选自由以下组成的组的突变或突变的组合:
(T82R,L114F);
(T82R,L114F,G119N);
(T82R);
(T82R,G119N);
(L114F);
(L114F,G119N);
(G119N);
(G75R,T82R,L114F,G119N);
(G75R,T82R,L114F,G119N);
(G75R,T82R);
(G75R,L114F);
(G75R,L114F,G119N);
(S74N,G75R,T82R,G119N,Q141R);
(S74N,T82R,L114F,G119N);
(S74N,T82R,L114F,G119N,Q141R);
(S74N,T82R,Q141R);
(S74N,T82R,G119N,Q141R);
(S74N,L114F,Q141R);
(S74N,L114F,G119N,Q141R);
(S74N,Q141R);
(S74N,G75R,T82R,L114F,Q141R);
(S74N,G75R,T82R,L114F,G119N,Q141R);
(S74N,G75R,T82R,Q141R);
(S74N,G75R,L114F,Q141R);
(S74N,G75R,Q141R);
(T82R,D107N);
(G75R,T82R,D107N);
(D107N);
(G75R,T82R,G119N);
(T82R,D107N,G119N);
(G75R,T82R,D107N,G119N);
(D107N,G119N);
(G75R,D107N,G119N);
(S74N,T82R,D107N,Q141R);
(S74N,G75R,T82R,D107N,Q141R);
(S74N,G75R,D107N,Q141R);
(S74N,G119N,Q141R);
(S74N,G75R,G119N,Q141R);
(S74N,T82R,D107N,G119N,Q141R);
(S74N,G75R,T82R,D107N,G119N,Q141R);
(S74N,D107N,G119N,Q141R);
(S74N,G75R,D107N,G119N,Q141R);
(T82R,D107N,L114F);
(G75R,T82R,D107N,L114F);
(D107N,L114F);
(G75R,D107N,L114F);
(G75R,D107N);
(T82R,D107N,L114F,G119N);
(D107N,L114F,G119N);
(G75R,D107N,L114F,G119N);
(S74N,T82R,D107N,L114F,Q141R);
(S74N,G75R,T82R,D107N,L114F,Q141R);
(S74N,D107N,L114F,Q141R);
(S74N,G75R,D107N,L114F,Q141R);
(S74N,D107N,Q141R);
(S74N,G75R,L114F,G119N,Q141R);
(S74N,T82R,D107N,L114F,G119N,Q141R);
(S74N,G75R,T82R,D107N,L114F,G119N,Q141R);
(S74N,D107N,L114F,G119N,Q141R);
(S74N,G75R,D107N,L114F,G119N,Q141R);以及
(G75R,T82R,D107N,L114F,G119N)。
5.根据权利要求1所述的多肽,其中所述多肽的所述氨基酸序列不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列,因为包括E230L、L114F、E260R、E230M、D246P、S161R、N54S、T227H、V226K、E230R、G263A、G119N、V226K、G263A、N127S、P84V、D83E、D28G、V45T、M262V、A190K、P84N、I44R、G256S、A73M、P179L、Q135E、A60P、V247I、G263K、S161E、P72N、P84L、S74N、T82R、G75R、Q141R和D107N中的一个或多个突变。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的多肽,其中与具有SEQ ID NO:1的序列的核酸酶相比,所述多肽更耐热。
7.根据权利要求6所述的多肽,其中在10℃到70℃下,所述多肽的所述核酸酶活性比具有SEQ ID NO:1的序列的所述核酸酶的核酸酶活性高至少5%。
8.根据权利要求7所述的多肽,其中在37℃到60℃下,所述多肽的所述核酸酶活性比具有SEQ ID NO:1的序列的所述核酸酶的核酸酶活性高至少5%。
9.根据权利要求8所述的多肽,其中在40℃到60℃下,所述多肽的所述核酸酶活性比具有SEQ ID NO:1的序列的所述核酸酶的核酸酶活性高至少5%。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的多肽,所述多肽的核酸酶活性比54℃/37℃比具有SEQ ID NO:1的序列的所述核酸酶的核酸酶活性比高至少5%。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的多肽,所述多肽的最佳温度介于40℃到60℃之间。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的多肽,其中所述多肽的最佳pH介于pH 4到pH11之间。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的多肽,其中所述多肽不包括信号序列。
14.根据权利要求1到12中任一项所述的多肽,其中所述多肽包括信号序列。
15.根据权利要求14所述的多肽,其中所述信号序列是异源序列。
16.根据权利要求14所述的多肽,其中所述信号序列是天然信号序列。
17.一种组合物,其包括根据权利要求1到16中任一项所述的多肽。
18.根据权利要求17所述的组合物,其中所述组合物是反应混合物、洗涤剂组合物、洗涤剂添加剂、食品、食品补充剂、饲料补充剂、饲料、药物组合物、发酵产物、发酵中间物、发酵下游反应混合物或其组合。
19.根据权利要求18所述的组合物,其中所述反应混合物用于蛋白质表达或纯化。
20.一种合成或重组核酸,其对根据权利要求1到16中任一项所述的多肽进行编码。
21.一种表达载体,其包括根据权利要求20所述的核酸。
22.根据权利要求21所述的表达载体,其中所述表达载体包括病毒载体、质粒、噬菌体(phage)、噬菌粒、粘粒、福斯质粒(fosmid)、噬菌体(bacteriophage)、人工染色体或其组合。
23.一种重组细胞,其包括根据权利要求1到16中任一项所述的多肽、根据权利要求20所述的核酸、根据权利要求21或22所述的表达载体或其组合。
24.根据权利要求23所述的重组细胞,其中所述核酸是所述重组细胞的染色体的一部分。
25.根据权利要求23或24所述的重组细胞,其中所述细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。
26.一种产生具有核酸酶活性的重组多肽的方法,所述方法包括:在允许所述多肽的表达的条件下表达根据权利要求20所述的核酸,由此产生具有核酸酶活性的重组多肽,其中所述核酸可操作地连接到启动子。
27.根据权利要求26所述的方法,其中所述核酸存在于表达载体中。
28.根据权利要求26或27所述的方法,其中所述核酸存在于体外表达系统中。
29.根据权利要求26或27所述的方法,其中所述核酸存在于宿主细胞中以允许所述多肽的表达。
30.根据权利要求26所述的方法,其中所述核酸存在于宿主细胞的染色体中。
31.根据权利要求28或29所述的方法,其中所述宿主细胞是来自选自由以下组成的组的生物体的细胞:巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(巴斯德驹形氏酵母(Komagataellapastoris))、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、嗜热毁丝霉(Myceliopthora thermophile)真菌、里氏木霉(Tricodermeareesei)、大肠杆菌(Escherichia coli)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和酿酒酵母(sSacaramyces cerevisiae)。
32.根据权利要求26、27和31中任一项所述的方法,其中所述核酸是RNA分子。
33.一种用于降解多核苷酸的方法,所述方法包括使多核苷酸分子与根据权利要求1到16中任一项所述的多肽接触,由此降解所述多核苷酸分子。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述多核苷酸分子是DNA分子或RNA分子。
35.根据权利要求33或34所述的方法,其中所述接触在pH 4到pH 11下发生。
36.根据权利要求31到35中任一项所述的方法,其中所述接触在约10℃到约70℃下发生。
37.根据权利要求36所述的方法,其中所述接触在40℃到60℃下发生。
38.一种用于洗涤物体的方法,所述方法包括在足以进行所述洗涤的条件下使包括根据权利要求1到16中任一项所述的多肽的组合物与所述物体接触。
39.根据权利要求38所述的方法,其中所述物体是纺织品。
40.一种用于在蛋白质产生期间降解DNA或RNA的方法,所述方法包括:
培养宿主细胞,其中所述宿主细胞包括对所关注蛋白质进行编码的核酸;以及
在允许通过根据权利要求1到16中任一项所述的多肽降解DNA或RNA的条件下表达所述多肽。
41.根据权利要求40所述的方法,其中所述宿主细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、植物细胞或昆虫细胞。
42.根据权利要求40或41所述的方法,其中所述多肽由存在于所述宿主细胞中的表达载体表达,或者所述多肽由所述宿主细胞的染色体中的核酸序列编码。
43.根据权利要求40或41所述的方法,其中所述多肽由不表达所述所关注蛋白质的细胞表达。
44.根据权利要求40到43中任一项所述的方法,其中所述所关注蛋白质和/或所述多肽中的一种或多种的表达是可诱导的或不可诱导的。
45.一种反应混合物,其包括:
(a)根据权利要求1到16中任一项所述的多肽;
(b)一种或多种核酸分子;以及
(c)水溶液,其中所述多肽水解所述一种或多种核酸分子。
46.根据权利要求45所述的反应混合物,其中所述一种或多种核酸分子包括单链DNA分子、双链DNA分子、单链RNA分子、双链RNA分子或其任何组合。
47.根据权利要求45或46所述的反应混合物,其中所述一种或多种核酸分子来自用于产生蛋白质的宿主细胞。
48.根据权利要求45或46所述的反应混合物,其中所述多肽在选自由以下组成的组的宿主细胞中表达:细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、植物细胞和昆虫细胞。
49.根据权利要求45或46所述的反应混合物,其中所述核酸和/或多肽通过体外转录或转译表达。
50.根据权利要求45到49中任一项所述的反应混合物,其中所述反应混合物的温度在约10℃到约70℃下。
51.根据权利要求50所述的反应混合物,其中所述反应混合物的温度在约40℃到约60℃下。
52.根据权利要求45到51中任一项所述的反应混合物,其中所述反应混合物在约pH 4到约pH 11下。
53.根据权利要求45到52中任一项所述的反应混合物,其中所述水溶液是洗涤剂组合物、洗涤剂添加剂、食品、食品补充剂、饲料补充剂、饲料、药物组合物、发酵产物、发酵中间物、发酵下游反应混合物、来自蛋白质产生过程的产物、来自蛋白质产生过程的中间物或蛋白质纯化溶液。
54.一种用于降解蛋白质产生混合物中的DNA或RNA的方法,所述方法包括:
培养宿主细胞,其中所述宿主细胞包括对所关注蛋白质进行编码的核酸;以及
在允许通过根据权利要求1到16中任一项所述的多肽降解DNA或RNA的条件下表达所述多肽。
55.根据权利要求54所述的方法,其中所述宿主细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、植物细胞或昆虫细胞。
56.根据权利要求54或55所述的方法,其中所述多肽由存在于所述宿主细胞中的表达载体表达,或者所述多肽由所述宿主细胞的染色体中的核酸序列编码。
57.根据权利要求54或55所述的方法,其中所述多肽由不表达所述所关注蛋白质的细胞表达。
58.根据权利要求54到57中任一项所述的方法,其中所述所关注蛋白质和/或所述多肽中的一种或多种的表达是可诱导的或不可诱导的。
59.一种用于在蛋白质产生期间降解DNA或RNA的方法,所述方法包括:
培养宿主细胞,其中所述宿主细胞包括对所关注蛋白质进行编码的核酸;以及
在允许通过根据权利要求1到16中任一项所述的多肽降解DNA或RNA的条件下添加所述多肽。
60.根据权利要求59所述的方法,其中所述宿主细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、植物细胞或昆虫细胞。
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