CN109477083B - 热稳定性宏基因组碳酸酐酶及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有碳酸酐酶活性的多肽，和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞，连同产生和使用这些多肽的方法。

Description

热稳定性宏基因组碳酸酐酶及其用途

序列表的引用

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技术领域

本发明涉及多肽(这些多肽被鉴定为从Logatchev热液喷口分离的宏基因组序列，具有碳酸酐酶活性和催化结构域)，和编码这些多肽和催化结构域的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞，连同生产和使用这些多肽和催化结构域的方法。

背景技术

碳酸酐酶(CA)选择性地且可逆地以高催化效率催化二氧化碳与水的反应以产生碳酸氢盐(反应1)：

这种催化活性可以有利于将CO₂从气体混合物中分离、可以有利于将CO₂转化为替代化学形式，如碳酸氢盐和碳酸盐，并且可以有利于将CO₂从包含碳酸氢盐的组合物、尤其是水性组合物释放。碳酸酐酶(EC 4.2.1.1)在自然界中是丰富的并且发现于生命的所有结构域。然而，许多CA缺乏承受商业应用的热稳定性和物理稳定性。

碳酸酐酶由若干种不同的基因家族编码，这些基因家族包括称为α-CA、β-CA和γ-CA的三种家族(C.T.Supuran,A.Scozzafava和J.Conway编辑,Carbonic anhydrase:itsinhibitors and activators[碳酸酐酶：其抑制剂和活化剂],2004,Boca Raton:CRCPress LLC[博卡拉顿：CRC出版社有限责任公司]；Hewett-Emmett和Tashian,1996,Mol.Phylogenet.Evol.[分子系统发育及进化]5:50-77)。CA的其他种类仅发现于某些生物体，如硅藻中(Xu等人,2008,Structure and metal exchange in the cadmium carbonicanhydrase of marine diatoms[海洋硅藻的镉碳酸酐酶的结构和金属交换],Nature[自然]542:56-61)。不同的CA家族具有非常低的蛋白质序列相似性并且其三维结构不同。另外，CA家族内可能存在结构变异。例如，α-CA可以作为仅含有单条蛋白质链的单体存在，或者可以作为多聚体，如二聚体或四聚体存在，其中多于一种蛋白质链单体通过共价键或离子键或通过物理缔合(如疏水相互作用)或这些的组合而彼此结合(James等人,2014,Thestructure of a tetramericα-carbonic anhydrase from Thermovibrio ammonificansreveals a core formed around intermolecular disulfides that contribute to itsthermostability[来自生氨热弧菌的四聚体α-碳酸酐酶的结构揭示围绕有助于其热稳定性的分子间二硫化物形成核],Acta Cryst.[晶体学报]D70:2607-2618)。无论这些序列和结构差异如何，不同碳酸酐酶的活性位点典型地含有催化必需的Zn(II)离子，当水分子去质子化以呈酶的催化活性形式时，该Zn(II)离子结合水形成Zn氢氧化物亲核试剂(Christianson和Fierke,1996,Acc.Chem.Res.[化学研究述评]29:331-339)。在α-CA中，活性位点锌通过三个组氨酸残基保持在适当位置。

单独生物体可以具有位于细胞或组织的不同区域中的，或者在细胞外分泌的若干种不同的CA。CA参与多种代谢功能，如呼吸和pH控制，为脂肪酸和Krebs循环生物合成反应提供碳酸氢盐(Nishimori等人,2007,Carbonic anhydrase inhibitors:the inhibitionprofiles of the human mitochondrial isoforms VA and VB with anions are verydifferent[碳酸酐酶抑制剂：具有阴离子的人线粒体同种型VA和VB的抑制曲线非常不同],Bioorg.Med.Chem.[生物有机医学与化学]15:6742-6747)，并且参与用于光合作用碳固定的碳浓缩机制(

等人,2010,Structural basis of the oxidative activation ofthe carboxysomal gamma-carbonic anhydrase[羧基体γ-碳酸酐酶的氧化活化的结构基础],CcmM,PNAS[美国国家科学院院刊]107:2455-60)。使用遗传与生物工程技术，用来自不同来源的CA替代所固有的CA可以改善这些生物过程。

CA催化多种不同的化学反应(C.T.Supuran,A.Scozzafava和J.Conway编辑,Carbonic anhydrase:its inhibitors and activators[碳酸酐酶：其抑制剂和活化剂],2004,博卡拉顿：CRC出版社有限责任公司)，包括酯水解。最广泛关注的反应是CA催化的二氧化碳与碳酸氢盐之间的相互转化。该反应对于生理和医学利益很重要，并且在工业CO₂气体分离和封存领域中变得越来越重要。CA作为高效的环境友好型催化剂用于CO₂捕获过程中以有助于防止CO₂排放到大气中尤其受关注。为了满足工业应用的技术经济要求，CA必须在工业相关的应用条件下在暴露于可能包括高温、高盐浓度和浓缩化学溶液的恶劣环境的同时将活性和物理稳定性保持延长的时间段。例如，CO₂分离系统和过程通常利用高浓度碱性溶液和具有高离子强度的溶液以充当CO₂吸收介质。

此外，CA热稳定性使得能够使用热处理作为纯化工艺以在CA生产过程中将CA与其他蛋白质和污染物分离。另外，热稳定性延长了CA产品在制造、使用期间，或在闲置期，例如在热仓库中储存期间的储存稳定性。对于一些应用，CA可能必须在使用期间承受对较低温度和较高温度的反复暴露。

因此，需要热稳定性CA，这些热稳定性CA在暴露于恶劣的操作环境时能够将酶活性保持延长的时间段。

发明内容

本发明提供了具有碳酸酐酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。

因此，本发明涉及具有碳酸酐酶活性的多肽或其具有碳酸酐酶活性的片段，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性。

本发明还涉及编码本发明的多肽的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。

本发明还涉及具有碳酸酐酶活性的多肽作为催化剂用于通过包含水的介质吸收二氧化碳，或从包含水的介质中释放二氧化碳的方法和用途，并且涉及用于分离二氧化碳的反应器和系统以及有用于此类分离工艺的组合物。

本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体及重组宿主细胞；以及产生具有碳酸酐酶活性的多肽的方法。

本发明的其他方面和实施例在说明书和实例下是显而易见的。

附图说明

图1示出了逆流气-液接触器的示意图。在典型的逆流气-液接触器中，富含CO₂的入口气体(例如包含CO₂的混合气体)进入接触器的底部并且向上行进，同时缺乏CO₂的入口液体进入接触器的顶部并且向下流动。液体流可以是呈液滴，如喷雾的形式，或者作为连续流或板型的液体，如沿表面的流，或这些的组合。在气-液接触器内部，来自富含CO₂的入口气体的CO₂被液体吸收并且作为富含CO₂的出口液体从接触器输出。富含CO₂的液体意指该液体相对于缺乏CO₂的液体包含增加量的CO₂，该CO₂呈溶解的气态形式或任何离子形式的CO₂，如碳酸氢盐，或CO₂与入口吸收液体中的化合物的反应产物。部分或完全去除CO₂的缺乏CO₂的气体作为出口气体离开接触器。逆流气-液接触器是工业上使用的最常见类型的气-液接触器。接触器的内部可以很大程度上是空的，其中液体从顶部向下喷射并且气体从底部向上流动，或者更常见的是，接触器含有不同类型的填充材料，以增加气体和液体在接触器内部的停留时间，并且促进气体与液体之间相互作用的大表面积。液体典型地从喷雾嘴或其他类型的开口递送到填充材料上，这些开口被设计成以均匀的方式将液体递送在填充材料上。液体由吸收化合物、水和优化该工艺可能需要的其他组分组成。例如，液体可以包含CA，该CA呈可溶性形式或作为悬浮生物催化剂的小颗粒流过接触器。填充材料可以涂覆有CA或具有附接至其的CA。

图2示出了并流气-液接触器的示意图。在典型的并流气-液接触器中，富含CO₂的入口气体和缺乏CO₂的入口液体在同一端(例如顶部)进入接触器并且在同一端离开。出口气体优选地在存在的用于收集出口液体的任何贮槽上方的位置处离开接触器。与逆流接触器相比，这种类型的接触器可以提供更低的压降，因为气体和液体流动均在相同的方向上移动，然而与逆流设计相比，气-液相互作用的效率可能更低。并流接触器的内部和功能如图1所述，不同的是气体和液体沿相同方向流动。

图3示出了垂直流气-液接触器的示意图。在垂直的气-液接触器中，气体典型地在从入口气体到出口气体的总体水平方向上行进，同时液体从顶部处的入口液体到底部处的出口液体总体上垂直行进以利用重力。这种接触器设计可以利用专门的液体递送系统，如生成平板型液体的系统，从而以不需要高垂直结构的紧凑设计产生高气-液接触。接触器可以具有内部挡板或填充材料，以增强气-液接触并且控制气体和液体流动。并流接触器的内部和功能如图1所述，不同的是总体气体和液体流动彼此垂直。

图4示出了膜气-液接触器的示意图。膜接触器利用气体可渗透膜(虚线)将气体流与液体流分开。该图解示出了气体和液体的逆流流动，但是也可以采用并流和垂直型流动。富含CO₂的入口气体与膜接触，并且CO₂优选地选择性地穿过膜进入CO₂吸收液体中。在这些接触器中使用的膜可以是微孔的，允许液体的表面暴露于通过膜中的孔的气体，这些孔小到足以防止液体由于物理现象(如表面张力)而穿过。可替代地，膜可以是无孔的，但是由CO₂气体可渗透材料制成。微孔膜可以提供更快的CO₂吸收速率，而非多孔膜可以使液体在气体流中蒸发的损失最小化。在穿过接触器时，入口液体变得富含CO₂，使得出口液体相比较富含CO₂，并且入口气体的CO₂变得被消耗，使得出口气体是缺乏CO₂的。该图解仅示出了膜接触器的基本功能单元的表示，该膜接触器在操作形式中含有多层堆叠的膜或管状或中空纤维束、用分隔器安排在合适的壳体中的膜以及用于最佳地引导气体流和液体流的控制机构。膜接触器用于大型工业气体洗涤应用以及小型单元，如用于在透析过程中去除CO₂，其中可半渗透膜可以将两种液体，如富含CO₂的血液和能够从血液中吸收过量CO₂的缺乏CO₂的缓冲溶液分开。CA可以以可溶形式或悬浮微粒形式存在于液体中，并且可以固定在膜上或膜中。

图5示出了鼓泡槽式气-液接触器的示意图。所示系统是分批模式鼓泡槽式气-液接触器，其中包含CO₂的入口气体流鼓泡(或喷射)通过固定量的吸收液体。CO₂被吸收到液体中，使得出口气体的CO₂相比于入口气体被消耗。在分批模式中，最终液体将达到最大CO₂吸收能力，并且富含CO₂的入口气体可以被引导到另一个含有缺乏CO₂的吸收液体的分批式反应器，或者可以将分批式反应器清空并且填充有新鲜的缺乏CO₂的吸收液体，或者可以停止入口气体流，同时将分批式反应器从吸收模式改变为CO₂解吸模式，如通过向分批式反应器施用热量、吹扫气体或真空，以从富含CO₂的液体中释放吸收的CO₂。这种类型的接触器可以例如用于产生固体沉淀形式的CO₂，例如碳酸盐，如碳酸钙、碳酸镁和碳酸锰。产生非常小的气泡的气体递送喷嘴可以增强气-液接触并改善CO₂吸收效率。鼓泡槽式接触器可以是封闭设备或可以在开放环境中操作，如将富含CO₂的气体流鼓泡到藻类池中。CA可以以可溶性形式或悬浮微粒形式存在于液体中，并且可以固定在浸没在液体中或暴露于液体的结构或填料的表面上。

图6示出了分批模式搅拌槽式气-液接触器的示意图。在这种类型的接触器中，富含CO₂的气体暴露于液体表面，导致CO₂气体吸收到液体中。液体可以是静止的或者可以通过某种手段混合以引起液体和液体组分的移动。搅拌槽式接触器的原理可以应用于受控的封闭设备，或者可以应用于开放的环境，如将CO₂从空气中吸收到水体如海洋中。CA可以以可溶性形式或悬浮微粒形式存在于液体中，并且可以固定在浸没在液体中或暴露于液体的结构、混合器或填料的表面上。

图7示出了集成式CO₂洗涤系统的示意图。在所示的系统中，富含CO₂的进料气体(1)在靠近吸收器(2)的底部处进入并且向上流动，其中它与在靠近顶部处进入吸收器的缺乏CO₂的吸收液体(3)接触。去除了CO₂的洗涤气体(4)在顶部处离开吸收器。富含CO₂的吸收液体(5)在吸收器的底部处离开，并且(任选地)穿过生物催化剂回收单元(6)，该生物催化剂回收单元将催化剂分离以进行循环利用(7)并且随同缺乏CO₂的吸收液体(3)一起重新递送到吸收器中。主要量的富含CO₂的吸收液体(5)离开(任选的)生物催化剂回收单元(6)并且行进至其中将富含CO2的吸收液体预热的任选的温度调节器(例如，热交换器)(8)，之后行进至解吸器(9)。富含CO₂的吸收液体在靠近解吸器顶部处进入并向下流动。通过任何合适的手段(例如，再沸器)将热量供应至解吸器，并且将任选的另一种解吸驱动力如吹扫气体(10)或真空(13)或者这些的组合施用至解吸器，从而致使提取的CO₂从吸收液体中释放并离开解吸器，(任选地)穿过吸收液体冷凝器(11)以从气体流中去除吸收液体蒸气，并且(任选地)穿过吹扫气体冷凝器(12)以从CO₂气体流中去除吹扫气体化合物，之后释放、压缩和/或使用纯化的CO₂气体(14)。将在吹扫气体冷凝器(12)中分离的吹扫气体化合物任选地循环利用并且随着提供新鲜的吹扫气体(10)一起送回至解吸器。缺乏CO₂的吸收液体(15)离开解吸器，并且(任选地)穿过第二生物催化剂回收单元(16)，之后(任选地)穿过温度调节器(8)，并且(任选地)在返回至吸收器(3)之前穿过二级CO₂解吸器(18)，该第二生物催化剂回收单元将生物催化剂分离以进行循环利用(17)并且随同富含CO₂的吸收液体(5)一起重新递送到解吸器。尽管二级CO₂解吸器可以通过任何已知的解吸手段起作用，但二级CO₂解吸器的优选操作模式是作为利用基于膜的设计的二级空气吹扫解吸器，其中将缺乏CO₂的吹扫气体(22)如空气与缺乏CO₂的液体(15)接触，以进一步去除存留于缺乏CO₂的液体(15)中的残余CO₂并且提供非常缺乏CO₂的液体(3)用于重新进入吸收器。离开二级CO₂解吸器(18)的二级吹扫气体(23)可以释放到大气中或者可以用于如供应燃烧空气的用途，例如当CO₂洗涤器安装在发电厂时。吸收液体的消耗的生物催化剂和/或其他消耗组分可以在该过程的各个点处，如在指示的位置(20和21)处添加。用于过程监测和控制液位的样品的移取以及不溶性污染物的去除可以在过程中的各个点处，如在指示的位置(24和25)处进行。尽管未在图解中绘示出，但应理解，可以在需要位置处安装和利用用于提供和控制液体流量的泵、用于提供和控制气体流量的鼓风机，以及用于过程控制和监测的所有相关阀、仪表、检测仪器和设备。CA在流过系统时可以以可溶性形式或悬浮微粒形式存在于液体中，并且可以固定在浸没在液体中或暴露于液体的结构、混合器或填充材料的表面上。

图8示出了pLogatchev质粒图。

定义

碳酸酐酶：术语“碳酸酐酶活性”或“CA活性”在本文中定义为EC 4.2.1.1活性，该活性催化二氧化碳与碳酸氢盐之间的转化：

出于本发明的目的，根据实例3中所描述的程序确定CA活性。如果本发明的多肽具有由对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基1至226的氨基酸序列组成的多肽的CA活性的至少20％，优选至少40％、更优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％，并且甚至最优选至少100％，则认为本发明的多肽具有CA活性。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据相同染色体座位的基因的两种或更多种替代形式的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

催化结构域：术语“催化结构域”意指酶的含有该酶的催化机构的区域。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，该开放阅读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于：前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该DNA分子包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽或催化结构域；其中该片段具有碳酸酐酶活性。在一方面，该片段含有至少220个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸1至220)、至少210个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸1至210)、或至少200个氨基酸残基(例如，SEQ IDNO:2的氨基酸1至200)。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中；例如，宿主细胞可以经遗传修饰以表达本发明的多肽。来自该宿主细胞的发酵液将包含分离的多肽。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，该成熟多肽是SEQID NO:2的氨基酸1至226。SEQ ID NO:2的氨基酸-18至-1是信号肽。本领域已知，宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。在一方面，成熟多肽含有多达230个氨基酸残基、多达235氨基酸残基、或多达240个氨基酸残基。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有碳酸酐酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO 1的核苷酸55至735，并且SEQ ID NO 1的核苷酸1至54编码信号肽。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其被修饰成以本来在自然界中不存在的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包括一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列引导该编码序列的表达。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：The European MolecularBiology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件]，Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的参数是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记的“最长一致性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为一致性百分比并且如下计算：

(相同的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记的“最长一致性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为一致性百分比并且如下计算：

(相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“高严格条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“非常高严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

子序列：术语“子序列”意指具有从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的一个或多个(例如，若干个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有碳酸酐酶活性的片段。在一方面，子序列含有至少660个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸55至714)，至少630个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸55至684)，或至少600个核苷酸(例如，SEQ ID NO:55的核苷酸1至654)。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如若干个)位置上包含改变，即取代、插入、和/或缺失的具有碳酸酐酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占用某一位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占用某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。

具体实施方式

示出为SEQ ID NO:2的成熟氨基酸序列的碳酸酐酶(其在下文中也称为‘Logatchev CA’)被鉴定为从Logatchev热液喷口分离的宏基因组序列(Perner等人,2013,Environ.Microbiol.[环境微生物学]15:1551-1560)。使用宏基因组学测序技术使得发现了先前未通过其他方法发现的新的热稳定性碳酸酐酶多样性。传统的微生物基因组测序和基因组学依赖于从环境样品中分离的培养的克隆培养物。然而，对环境样品中16S核糖体RNA的研究揭示，基于培养的方法在样品中发现不到1％的细菌和古细菌物种。

具有碳酸酐酶活性的多肽

在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，这些多肽具有碳酸酐酶活性。在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少70％的碳酸酐酶活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少75％的碳酸酐酶活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少80％的碳酸酐酶活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少85％的碳酸酐酶活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少90％的碳酸酐酶活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少95％的碳酸酐酶活性。

在一个具体的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少100％的碳酸酐酶活性。

在一个实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或者是其具有碳酸酐酶活性的片段。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至226或由其组成。

在另一个实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有碳酸酐酶活性的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交(Sambrook等人,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆实验指南],第2版,Cold Spring Harbor[冷泉港],New York[纽约])。在一个实施例中，该多肽已经被分离。

SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段可以根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的株系的、编码具有碳酸酐酶活性的多肽的DNA。具体地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应的基因。此类探针涵盖于本发明中。

可以筛选从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码具有碳酸酐酶活性的多肽的DNA。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该载体材料。

出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列；该杂交是在低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸1至50、核苷酸50至100、核苷酸100至150、或核苷酸150至200。在另一方面，该核酸探针是编码以下的多核苷酸：SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1。

在另一个实施例中，本发明涉及具有碳酸酐酶活性的多肽，该多肽由与SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸编码。在一个另外的实施例中，该多肽已经被分离。

在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO：2的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-末端或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。通常不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质使得多肽的物理化学特性发生改变。

本发明的碳酸酐酶多肽可以具有以下共有序列基序，并且可以通过以下共有序列基序鉴定：S-E-[HN]-x-[LIVM]-x(4)-[FYH]-x(2)-E-[LIVMGA]-H-[LIVMFA](2)。对应的共有残基对应于SEQ ID NO 2中的位置113至129。在优选的实施例中，所有共有位置存在于碳酸酐酶中。

SEQ ID NO:2的氨基酸残基H108、H110和H127形成对催化很重要的组氨酸三联体。在本发明的一个优选实施例中，碳酸酐酶含有在对应于SEQ ID NO:2的位置108、110和127的氨基酸位置中的组氨酸。

SEQ ID NO:2的氨基酸残基H83、E114、Q106和T193参与质子穿梭机制，该质子穿梭机制也与酶的催化活性有关。在进一步的实施例中，碳酸酐酶含有在对应于SEQ ID NO:2的位置83的氨基酸位置中组氨酸，和/或在对应于SEQ ID NO:2的位置106的氨基酸位置中的谷氨酰胺、和/或在对应于SEQ ID NO:2的位置114的氨基酸位置中的谷氨酸、和/或对应于SEQ ID NO:2的位置193的氨基酸位置中的苏氨酸。优选地，存在至少一个质子穿梭位置，更优选存在至少两个质子穿梭位置，更优选存在至少三个质子穿梭位置，并且最优选所有质子穿梭位置存在于本发明的碳酸酐酶中。

SEQ ID NO:2的氨基酸残基C45和C197参与半胱氨酸桥，并且因此可能对碳酸酐酶的稳定性很重要。在本发明的一个优选实施例中，碳酸酐酶含有在对应于SEQ ID NO:2的位置45和197的氨基酸位置中的半胱氨酸。

可以根据本领域已知的程序来鉴定其他必需氨基酸，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得分子的碳酸酐酶活性以鉴定对于该分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可以通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625中披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。

如实例中所示，本发明的碳酸酐酶可以包含一个或多个在对应于SEQ ID NO:2的D19、K21、R40、G56或I99的一个或多个位置中的取代。此类取代可以选自下组，该组由以下组成：D19F、K21R、R40S、G56L和I99V。

该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。

该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。

融合多肽可以进一步包含两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens，2003，Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。

具有碳酸酐酶活性的多肽的来源

可以从任何属的微生物获得本发明的具有碳酸酐酶活性的多肽。出于本发明的目的，如本文结合给定来源使用的术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经插入了来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，获自给定来源的多肽被分泌到细胞外。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术(参见例如，Sambrook等人,1989，同上)分离或克隆多核苷酸。

宏基因组测序技术是一种通过针对基因序列和/或遗传片段探测一种或多种生物体的库(通常是许多生物体的库)的遗传组成而无需培养克服了培养特定生物体的困难的替代性技术。宏基因组测序技术能够鉴定源自未培养和未分类生物体的CA基因序列，并且还可以通过从遗传混合物中选择重叠的多核苷酸片段来产生非天然合成构建体，以产生编码具有CA活性的多肽的新颖多核苷酸。

多核苷酸

本发明还涉及编码如本文所述的多肽或催化结构域的多核苷酸。在一个实施例中，编码本发明的多肽或催化结构域的多核苷酸已经被分离。

用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，Innis等人,1990,PCR:A Guide to Methods and Application[PCR：方法和应用指南],学术出版社，纽约。可以使用其他核酸扩增程序如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。

编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指多肽的非天然存在的形式。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导该编码序列在适合的宿主细胞中的表达。

可以用多种方式操纵该多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，其介导该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括变体、截短型及杂合型启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,基因69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Useful proteins fromrecombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和Sambrook等人,1989,同上中。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。

在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下酶的基因获得的启动子：构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延长因子、以及NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中未翻译的前导序列已经用来自曲霉属磷酸丙糖异构酶基因的未翻译的前导序列替换；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中未翻译的前导序列已经用来自构巢曲霉或米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的未翻译的前导序列替换)；及其变体、截短型、以及杂合型启动子。其他启动子描述于美国专利号6,011,147中。

在酵母宿主中，从以下酶的基因获得有用的启动子：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。

控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。

细菌宿主细胞的优选终止子从针对以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下酶的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子。

用于酵母宿主细胞的优选的终止子从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人,1992,同上描述。

该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区，它增加该基因的表达。

合适的mRNA稳定子区的实例从以下获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。

该控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区。该前导序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因获得。

酵母宿主细胞的合适的前导序列从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

该控制序列也可以是多聚腺苷化序列，一种与多核苷酸3’-末端可操作地连接并在转录时由宿主细胞识别为向转录的mRNA添加聚腺苷酸残基的信号序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列从以下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

酵母宿主细胞的有用的多聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。

该控制序列也可为编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5'-端可固有地含有在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'-端可含有对于编码序列为外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。其他信号序列由Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews[微生物学评论]57:109-137描述。

用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他有用的信号肽编码序列由Romanos等人,1992,同上描述。

该控制序列也可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻该前肽序列的N-末端。

也可为希望的是添加调节序列，该调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子、以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是那些允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，其可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它被引入宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒，或共同含有待引入宿主细胞基因组中的总DNA的两个或更多个载体或质粒，或者可以使用转座子。

载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标志。选择性标志是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。

细菌选择性标志的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标志。酵母宿主细胞的合适的标志包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞中的选择性标志包括但不限于：adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、以及其等效物。优选地用于曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。优选地用于木霉属细胞的是adeA、adeB、amdS、hph、以及pyrG基因。

选择性标志可以是如描述于WO 2010/039889中的双选择性标志系统。在一方面，双选择性标志是hph-tk双选择性标志系统。

载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到宿主细胞基因组中，该载体可以依赖于编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以含有用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应含有足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与相应的靶序列具有高度序列一致性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体还可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点、以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。多核苷酸的拷贝数的增加可以通过以下方式获得：将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者包括可与该多核苷酸一起扩增的选择性标志基因，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标志基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。

用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如早先所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

该宿主细胞可以是在本发明多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单孢菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、植物解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens plantarum)亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：类马链球菌、化脓性链球菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽疫亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829、或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)、或接合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic AcidsRes.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人，2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可以通过以下来实现：天然感受态(naturalcompetence)(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域中已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

该宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

该宿主细胞可以是真菌细胞。如本文使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi[Ainsworth和Bisby的真菌大词典],第8版,1995,CABInternational[国际CAB],University Press[大学出版社],Cambridge[剑桥],英国中所定义的)。

真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文使用的“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类可在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编辑,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会第9次系列座谈会],1980)中所描述的那样定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母(Saccharomyces diastaticus)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995,同上所定义的)。丝状真菌通常特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵性的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

真菌细胞可以通过以下过程转化，该过程涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及以本身已知的方式的细胞壁的再生。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适的程序描述于以下文献中：EP 238023,Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988，Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的合适的方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,Academic Press,Inc.[学术出版社有限公司],纽约；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和任选地(b)回收该多肽。

宿主细胞是在合适于使用本领域中已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵器中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，该培养在合适的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养介质中。具体地，可以添加无机盐，如氯化锌(ZnCl₂)、硫酸锌(ZnSO₄)等。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果多肽被分泌到营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。

可以使用本领域已知的对于多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成、或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收多肽，这些常规方法包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。在一方面，回收包含多肽的发酵液。

可以通过本领域已知的多种程序纯化多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，ProteinPurification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版公司],纽约,1989)。可以根据需要在酶产生期间、回收过程期间或酶产生之后添加锌的无机盐(如氯化锌(ZnCl₂)、硫酸锌(ZnSO₄))，以确保在酶活性位点中存在足够的Zn(II)以实现最佳的催化活性。

在一个替代性方面，不回收多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。

植物中的产生

本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含本发明的多肽，从而以可回收的量表达和产生多肽或结构域。可以从该植物或植物部分回收该多肽或结构域。可替代地，含有该多肽或结构域的植物或植物部分可以按原样用于改善食品或饲料的质量，例如改善营养价值、可口性及流变学特性，或破坏抗营养因素。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草地早熟禾(蓝草，早熟禾属)；饲用草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷物，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱和玉蜀黍(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草、豆科植物(如羽扇豆、马铃薯、糖甜菜、豌豆、菜豆和大豆)以及十字花科植物(十字花科)(如花椰菜、油菜籽和紧密相关的模式生物体拟南芥)。

植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎以及包含这些部分的独立组织，例如表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。

植物细胞和特定的植物细胞区室(如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质)也被认为是植物部分。

同样包含于本发明范围内的是此类植物、植物部分以及植物细胞的子代。

可以根据本领域已知方法构建表达该多肽或结构域的转基因植物或植物细胞。

本发明还涉及产生本发明的多肽或结构域的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽或结构域的条件下培养转基因植物或植物细胞，该转基因植物或植物细胞包含编码该多肽或结构域的多核苷酸；并且(b)回收该多肽或结构域。

发酵液配制品或细胞组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。该发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。

如本文使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。该发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。通常，该发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，该发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述中的两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述中的两种或更多种的混合物。

在一方面，该组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。

该细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，该细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

如本文所述的全培养液或细胞组合物通常是液体，但是可以含有不溶性组分，如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO2010/096673中所述的方法来产生。

酶组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，这些组合物富含这种多肽。术语“富含”指示该组合物的碳酸酐酶活性已经增加，例如，富集因子为至少1.1。

这些组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包含多种酶活性，如一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡糖基转移酶、脱羧酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

在一个具体的实施例中，本发明的宏基因组Logatchev CA是组合物的主要(多肽)组分，例如单组分组合物。在单组分组合物中，本发明的Logatchev CA优选构成至少80％的碳酸酐酶活性，更优选至少90％、甚至更优选至少95％并且最优选100％的碳酸酐酶活性。包含本发明的宏基因组Logatchev CA的组合物可以进一步包含一种或多种赋形剂。在此上下文中，赋形剂应理解为用于配制组合物的任何辅助剂或化合物，并且包括溶剂(例如水)、有机化合物、糖、无机化合物、无机盐、填充剂、颜料、蜡、载剂、稳定剂、表面活性剂、聚合物、交联剂、封装剂、截留剂、固定剂、粘结剂、磁性化合物、粘合剂、防腐剂、缓冲剂等。

组合物可以根据本领域已知的方法制备并且可以呈液体或固体组合物的形式，或者可以呈半固体组合物，如凝胶的形式。组合物可以呈液体或凝胶的形式，该液体或凝胶在干燥时形成固体，如涂料或油漆等。可以根据本领域已知的方法稳定组合物。例如，酶组合物可以使用本领域已知的配制技术酶和/或药物产品的方法配制，例如配制成包被或未包被的颗粒剂或微颗粒剂或颗粒或可以具有任何适合用于生产、递送或在应用中使用的尺寸的其他固体形状，例如纳米颗粒、微颗粒或更大的颗粒或材料。因此，本发明的多肽可以以颗粒剂(优选非粉化颗粒剂)、液体(特别是稳定化液体)、浆液或受保护的多肽的形式提供。

对于某些应用，多肽的固定化可以是优选的。固定化酶包括两个必需功能，即非催化功能和催化功能，这些非催化功能被设计为辅助分离(例如，将催化剂与施用环境分离，如将催化剂从工艺液体中过滤或分离，再利用催化剂和过程控制)，这些催化功能被设计为将目标化合物(或底物)例如CO₂在希望的时间和空间内转化为产物例如碳酸氢盐(Cao,Carrier-bound Immobilized Enzymes:Principles,Applications and Design[结合载体的固定化酶：原理、应用和设计],Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA[威利-VCH出版公司],Weinheim[魏因海姆],德国,2005)。固定化酶组合物可以被称为生物催化剂。当酶被固定化时，可以更容易地将它与反应介质分离。可以将固定化酶产物从施用环境中分离以便有利于其再利用，或减少所需的酶的量，或在底物连续递送且产物连续从酶附近移除的过程中使用该酶，这例如减少了酶成本。此外，通常通过固定化使酶稳定化。另外，固定化可以改变酶的物理特性，该改变方式使得该酶更容易以最佳方式将酶递送到反应区，或者更容易控制酶在该工艺中的量和位置，例如通过改变生物催化剂的密度以给予漂浮或下沉特性，或给予生物催化剂疏水或亲水特性，或给予生物催化剂磁性。

用于产生固定化酶的过程可以是连续或分批模式，这取决于过程控制的要求。酶固定化的方法可以包括吸附在载体(例如，固体或凝胶)上或该载体内、将酶交联在表面上或载体内、酶分子交联而没有载体、共价结合到载体，以及通过化学或机械手段将酶分子封装或截留在受限空间中。可以将固定化酶产生为具有固体形式，优选具有含水量或存在赋形剂，这些赋形剂在储存和使用期间保持酶活性。可替代地，固定化酶可以以半固体或物理非均相形式产生，如可以通过将一部分水合或溶解的酶化学或机械地限制在受限空间中产生，如通过例如微封装在半渗透膜中，或通过纳入在超滤系统中，这些超滤系统包括例如中空纤维模块、透析袋或封套等。通常还使用在多孔载体上的酶固定化。这包括将该酶例如通过吸附、络合/离子/共价结合而结合到该载体，或使可溶性酶吸附在该载体上，以及随后去除溶剂。酶的交联也可以用作一种固定化的手段。通过包含入载体中来使酶固定化也应用于工业中。(Buchholz等人,Biocatalysts and Enzyme Technology[生物催化剂和酶科技],Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA[威利-VCH出版社公司],魏因海姆,德国,2005)。具体的使酶如碳酸酐酶固定化的方法包括但不限于：将酶连同包含多官能胺的液体介质和包含交联剂的液体介质喷射在微粒多孔载体上，如WO 2007/036235中所述(通过引用并入本文)，用交联剂(例如，戊二醛)将碳酸酐酶连接至卵白蛋白层，该卵白蛋白层进而粘附至在聚合物支持物上的粘合剂层，如WO 2005/114417中所述(通过引用并入本文)，或者将碳酸酐酶偶联至二氧化硅载体上，如美国专利号5,776,741中所述，或偶联至硅烷、或CNBr活化的载体表面(如玻璃)上，将碳酸酐酶与甲基丙烯酸酯共聚合在聚合物珠粒上，如Bhattacharya等人,2003,Biotechnol.Appl.Biochem.[生物技术应用与生物化学]38:111-117中所述(通过引用并入本文)，或使用球状蛋白质和粘合剂，如US2010/0068784中所述。碳酸酐酶也可以使用标签如组氨酸样标签(例如，6x His标签或HQ标签)或纤维素结合模块(CBM)固定化(Liu等人,2008,Biotechnol.Prog.[生物科技进展]25:68-74)。可以将碳酸酐酶与二氧化硅缩合肽融合并通过自动封装而固定在生物二氧化硅纳米复合材料中(Jo等人,2014,Bioinspired silica nanocomposite with autoencapsulated carbonicanhydrase as a robust biocatalyst for CO₂sequestration[作为用于CO₂封存的稳健生物催化剂的生物启发的具有自动封装的碳酸酐酶的二氧化硅纳米复合材料],ACS Catal.[ACS催化]4:4332-4340)。

固定化酶生物催化剂可以采用广泛的物理形式、形状和尺寸，并且可以被适配成满足系统性能要求。固定化酶可以以多种不同形式包装或使用，例如，可以将固定化酶颗粒封闭在多孔片材、筛网、篮子、纸材、布或非织造材料中。可以将包含固定化酶的材料制造成不同的形状和结构，优选优化酶在应用中的性能的形状和结构，例如，将固定化酶颗粒与呈纸、织物或非织造过滤器形式的材料一起制造以截留酶颗粒并增强气-液接触。可以通过静电纺丝工艺固定化酶(Tran和Balkus Jr.,2012,Enzyme immobilization viaelectrospinning[经由静电纺丝的酶固定化],Topics in Catalysis[催化论题],55(16):1057-1069)。在静电纺丝之前，可以将酶与聚合物或预聚物合并，使得酶在静电纺丝过程中由于纤维固化而被聚合物分子链截留，在电纺纤维产生后可以将酶固定在这些纤维上，可以作为包括附加固定化步骤的固定化过程的一个步骤将酶固定在电纺纤维中，以产生稳健的固定化产物，或者可以将酶限制在通过同轴静电纺丝产生的中空纤维内(Cui等人,2014,Bio-sequestration of CO₂using carbonic anhydrase in situ encapsulated insideelectrospun hollow fibers[使用原位封装在静电纺丝中空纤维内部的碳酸酐酶生物封存CO₂],Chemical Journal of Chinese Universities-Chinese Edition[高等学校化学学报-中文版]35(9):1999-2006)。通过静电纺丝产生的含酶纤维可以直接用于本发明的方法中，或者可以与其他材料组合以有利于处理、使用或性能，例如，包被有通过静电纺丝产生的含酶纤维的硬表面，如用于气-液接触器的填充材料，或软表面，如非织造过滤材料。这些固定化方法和组合物可以与本发明的碳酸酐酶组合。

本发明的一个实施例是包含适于固定化的基质和选自下组的具有碳酸酐酶活性的多肽的组合物，该组由以下组成

a)具有对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基1至226或SEQ ID NO:5的氨基酸残基1至226的氨基酸序列的多肽；或

b)与SEQ ID NO:2的氨基酸残基1至226或SEQ ID NO:5的氨基酸残基1至226至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽；或

c)(a)或(b)的具有碳酸酐酶活性的片段；或

d)由以下核酸序列编码的多肽，该核酸序列在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件或高严格条件下与以下杂交：

i)编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的成熟多肽的多核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的多核苷酸序列；或

iii)(i)或(ii)的至少100个连续的多核苷酸的子序列，或

iv)(i)或(ii)的互补链；或

e)由以下核酸序列编码的多肽，该核酸序列由于遗传密码的简并性未与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的多核苷酸序列杂交，但编码具有根据a)或b)的氨基酸序列的多肽；或

f)由以下核酸序列编码的多肽，该核酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

在本发明的实施例中，将碳酸酐酶通过化学结合、离子结合、物理结合或截留或这些的组合固定在基质、表面或材料中、之上或与基质、表面或材料固定在一起。基质、表面或材料的非限制性实例包括来自以下组的那些：聚合物、珠粒、织物、纤维、中空纤维、膜、微粒、多孔表面、棒、结构化填料、和管。适合的基质、表面或基底的具体实例包括氧化铝、膨润土、生物聚合物、碳酸钙、磷酸钙凝胶、碳、纤维素、陶瓷支持物、粘土、胶原、玻璃、羟磷灰石、离子交换树脂、高岭土、尼龙、酚醛聚合物、聚氨苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈(丙烯酸类)、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚氨酯、聚合物水凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、硅胶、硅氧烷、沉淀二氧化硅、以及铁氟龙(TEFLON)-牌PTFE。在实施例中，基质、表面或材料可以在与酶组合后进行干燥。在本发明的一个实施例中，根据描述于Methods in Enzymology[酶学方法]第XLIV卷(在Immobilized Enzymes[固定化酶]章节部分,第118-134页,Klaus Mosbach编辑,学术出版社,纽约,1976)(通过引用并入本文)中的技术，将碳酸酐酶固定在尼龙基质上。

包含在组合物中的多肽可以根据本领域已知的方法来稳定化，例如，通过添加抗氧化剂或还原剂以限制多肽的氧化来稳定化组合物中的多肽，或者可以通过添加聚合物来稳定化多肽，这些聚合物如PVP、PVA、PEG、糖、低聚物、多糖或已知有益于多肽在固体或液体组合物中的稳定性的其他合适聚合物，或者可以通过添加稳定离子，如存在于酶活性位点中的锌(例如氯化锌或硫酸锌)来稳定化多肽。可以添加防腐剂，如Proxel或青霉素，以延长货架期或应用性能。

在另一个实施例中，本发明的组合物是适用于捕获二氧化碳的组合物。

下面给出了本发明的组合物的优选的用途的实例。该组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。

用途

管理和控制二氧化碳(CO₂)浓度对于广泛的工业、农业、医学和其他技术过程非常重要。将CO₂转化为替代化学形式(如碳酸氢盐和碳酸盐)是从含有CO₂的介质中去除、分离或提取CO₂，从而控制该介质中的CO₂浓度的一种方式。将CO₂转化为替代化学形式也可以用于将CO₂在含有CO₂的介质中保留一段时间，例如，该含有CO₂的介质可用于运输CO₂和用于将CO₂用于依赖于CO₂、碳酸氢盐或碳酸盐的化学和生物化学转化。将CO₂转化为替代化学形式(如碳酸氢盐)并且从该替代化学形式再转化回为CO₂是控制和管理过程中CO₂浓度的另一种方式，并且提供了将CO₂分离并且从一个位置运输到另一个位置的手段，并且提供了在一个时间段内将CO₂从介质中分离，并且在稍后的时间段内将CO₂从介质中释放的手段。

二氧化碳排放是全球变暖现象的主要因素。CO₂是燃烧的一种副产物，并且它产生了操作、经济、和环境问题。CO₂排放可以通过在排放到大气中之前捕获CO₂气体来控制。有若干种控制CO₂排放的化学方法(A.Kohl和R.Nielsen,Gas Purification[气体纯化],第5版,Gulf Professional Publishing[海湾专业出版社],Houston[休斯敦],TX[德克萨斯州],1997)。然而，这些方法中的许多方法具有如高能耗、过程慢和使用生态上有问题或有毒的化合物的缺点。

用于使用碳酸酐酶从气体如燃烧气体、燃料气体、大气气体或呼吸气体中提取CO₂的技术方案已描述于例如WO 2006/089423、US 6,524,842、WO 2004/007058、WO 2004/028667、US 2004/0029257、US 7,132,090、WO 2005/114417、US 6,143,556、WO 2004/104160、US 2005/0214936、WO 2008/072979、WO 2008/095057、WO2012/003336、WO 2012/025577、WO 2012/092984、WO 2012/154735、US 7,998,714、WO 2013/151757、US 8,871,008、WO 2015/126925、US 2015/0099289中，以及文献(例如，Russo等人,2013,Post-combustion carbon capture mediated by carbonic anhydrase[通过碳酸酐酶介导的燃烧后碳捕获],Sep.Purif.Technol.[分离纯化技术]107:331-339；S.Salmon和A.House,"Enzyme-catalyzed solvents for CO2separation[用于CO2分离的酶催化溶剂],"在NovelMaterials for Carbon Dioxide Mitigation Technology[用于二氧化碳环境技术的新颖材料]中,F.Shi和B.Morreale编辑,Amsterdam[阿姆斯特丹],Elsevier B.V.[爱思唯尔集团],2015,第23-86页；以及S.Salmon和A.House,“Low-energy solvents for carbondioxide capture enabled by a combination of enzymes and vacuum regeneration[用于通过酶和真空再生的组合实现二氧化碳捕获的低能耗溶剂],”Final Scientific/Technical Report for DE-FE0007741[DE-FE0007741的最后科学/技术报告],U.S.Department of Energy[美国能源部],National Energy Technology Laboratory[国家能源技术实验室],2015,DOI:10.2172/1222645)中，将这些专利和文献通过引用并入本文。

通常，CO₂洗涤技术通过使可溶性或固定化碳酸酐酶与CO₂接触来操作，该CO₂可以是在气相或液相中。在水存在下，碳酸酐酶催化CO₂转化为碳酸氢根离子，这些碳酸氢根离子可以根据介质的pH进一步质子化或去质子化为碳酸和/或碳酸根离子。这些离子可以用于促进利用碳酸氢盐/碳酸盐作为碳源的藻类或微生物的生长、诱导周围介质中的pH变化或供应缓冲能力、提供碳酸氢盐/碳酸盐作为后续化学过程的活性剂，或沉淀为碳酸盐，或转化回为纯CO₂，该纯CO₂然后可以使用(例如在提高油采收率中、用于尿素生产、食品和饮料加工，或向温室或培养池供应CO₂)、释放(例如从容纳式生命支持环境，如潜水艇、航天器或人工肺)、压缩(例如用于通过管道运输)、或储存(如储存在地质或深海地层或盐水含水层中)。

此外，在阳离子(如钠和钾)存在下使用碳酸酐酶催化CO₂转化为碳酸氢盐可以有助于加速后续过程，如将碳酸氢盐转化为碳酸盐，从而更快速地将CO₂转化为有用的替代化学形式。将CO₂转化为碳酸氢盐可以改善利用来自CO2的碳产生化学化合物的生物系统的生产率(例如，Atsumi等人,2009,Direct photosynthetic recycling of carbon dioxideto isobutyraldehyde[二氧化碳至异丁醛的直接光合作用循环利用],自然生物技术27(12):1177-1180)。将CO₂转化为碳酸盐以及将碳酸盐与二价阳离子(如钙和镁)组合例如可用于大量封存、或储存CO₂(例如，Favre等人,2009,Biocatalytic capture of CO₂withcarbonic anhydrase and its transformation to solid carbonate[用碳酸酐酶对CO₂的生物催化捕获及其向固体碳酸盐的转化],J.Molec.Cat.B:Enzymatic[分子催化杂志，B辑：酶催化],60(3-4):163-170)。碳酸盐的产生可用于生产混凝土，或用于将地上或地下CO₂矿化在岩石或地质地层(例如地下石灰岩或玄武岩地层)的内部或矿化为其一部分，也称为“矿物封存”，这有助于缓解CO₂释放对大气的负面影响(例如，US 2014/0234193)。优选地，在矿化位点处可获得足以实现碳酸化反应的阳离子和碱度，然而，这些材料也可以例如以包含阳离子和碱度的海水、工业盐水或水性废物流的形式递送到该位点。

在利用CO₂的系统和工艺中存在碳酸酐酶可以改善反应效率。例如，通过将具有低水溶性的CO₂快速转化为具有高水溶性的碳酸氢盐，CA的存在可以有助于增加用于生长藻类的水系统(尤其是包含钠或钾阳离子的盐水系统)中的碳浓度，从而改善藻类生长和生产率。将CA递送到CO₂封存位点，如富含二价阳离子的地下储存位置中可以通过加速CO₂至碳酸氢盐至碳酸盐反应顺序的第一步骤，并且最终导致沉淀的基于碳酸盐的固体来加速矿化过程。类似地，在CO₂存在下，CA可以通过以下方式加速从水性液体中去除或回收阳离子，尤其是二价阳离子：加速将CO₂转化为其离子形式并且使其可用于与阳离子进行离子络合形成基于碳酸氢盐或碳酸盐的固体产物的速率，这些产物在液体中沉淀或可以通过过滤或其他固-液分离技术回收。将CO₂转化为其离子形式(如碳酸氢盐)有助于将CO₂溶解到含水液体中，并且因此增加了可以加载到这些液体中并由这些液体携带的CO₂量。通过加速CO₂转化为碳酸氢盐的速率，CA可以通过减少运输一定量CO₂所需的水量和促进CO₂的矿化来改善需要大量的水来溶解CO₂的过程，如CarbFix过程(Oelkers等人,2008,Mineral carbonation ofCO₂[CO₂的矿物碳酸化],Elements[元素]4:333-337)。

上文所述的宏基因组Logatchev碳酸酐酶可用于一系列应用，这些将在下文更详细地描述。当在下文提及宏基因组Logatchev碳酸酐酶或碳酸酐酶时，其旨在包括本发明中所述的所有碳酸酐酶，特别是在它们落入所要求的一致性时。

具体地，宏基因组Logatchev碳酸酐酶可以用于从CO₂排放流中提取二氧化碳，这些CO₂排放流例如来自发电厂中基于碳或基于烃的燃烧，或来自此类工厂、工业炉、炉灶、烘箱或壁炉的烟道气烟囱或来自飞机或汽车废气。宏基因组Logatchev碳酸酐酶也可以用于在制备工业气体如乙炔(C₂H₂)、一氧化碳(CO)、氯气(Cl₂)、氢气(H₂)、甲烷(CH₄)、一氧化二氮(N₂O)、丙烷(C₃H₈)、二氧化硫(SO₂)、氩气(Ar)、氮气(N₂)和氧气(O₂)中去除CO₂。宏基因组Logatchev碳酸酐酶也可以用于在加工成天然气期间从原天然气中去除CO₂。从原天然气中去除CO₂将用来富集天然气中的甲烷(CH₄)含量，从而增大每m³的热量单位数。原天然气一般获自油井、气井、以及凝液井。当通过常规方法从地质天然气藏获得时，天然气含有1％至10％之间的CO₂，但是根据所使用的天然来源或回收方法，可以含有高达50％的CO₂或甚至更高的。碳酸酐酶也可以用于纯化天然气，使得其基本上不含CO₂，例如，使得CO₂含量低于1％，优选低于0.5％、0.2％、0.1％、0.05％且最优选低于0.02％。与天然气的甲烷富集相似，碳酸酐酶也可以用于富集沼气中的甲烷含量。沼气总是含有相当大程度的CO₂，因为发酵过程中使用的细菌产生甲烷(60％-70％)和CO₂(30％-40％)。可以使用嗜常温或嗜热微生物进行沼气生产。嗜热菌株使得发酵在升高的温度，例如，从40℃至80℃、或从50℃至70℃、或从55℃至60℃下发生。在此类工艺中，热稳定性碳酸酐酶特别可用于从甲烷中去除CO₂。本发明提供了宏基因组Logatchev碳酸酐酶用于降低沼气中二氧化碳含量的用途，优选地，降低CO₂含量以使得它构成小于25％，更优选小于20％、15％、10％、5％、2％、1％、0.5％且最优选小于0.1％。在优选的实施例中，碳酸酐酶是热稳定的。此外，碳酸酐酶可以应用于合成气的生产中，通过去除由含碳燃料(例如甲烷或天然气)的气化而产生的CO₂，从而富集合成气的CO、H₂含量。当合成气生产在升高的温度下发生时，使用热稳定性碳酸酐酶是有利的。本发明提供了碳酸酐酶用于降低合成气生产中二氧化碳含量的用途。优选地，降低CO₂含量以使得其构成小于25％，更优选小于20％、15％、10％、5％、2％、1％、0.5％且最优选小于0.1％。在优选的实施例中，碳酸酐酶是热稳定的。优选地，如上所述用于CO₂提取的碳酸酐酶在1M NaHCO₃缓冲液pH 8中在高于45℃，优选高于50℃、高于55℃、高于60℃、高于65℃、更优选高于70℃，最优选高于80℃、最优选高于90℃、最优选高于100℃、最优选高于105℃并且甚至最优选高于110℃的温度下孵育至少15分钟，优选至少2小时、更优选至少24小时、更优选至少7天、更优选至少10天、甚至更优选至少14天、最优选至少30天、甚至最优选在升高的温度下孵育至少50天之后，保持至少30％，优选高于40％、更优选高于50％、更优选高于60％、甚至更优选高于70％、最优选高于80％、最优选高于85％，最优选高于90％、最优选高于95％的残余活性并且甚至最优选残余活性不变。碳酸酐酶的温度稳定性和/或寿命可以通过配制，例如通过酶的固定化和/或化学或物理稳定化来在一定程度上增加。

在一个具体实施例中，如上所述可以用于CO₂提取的本发明的碳酸酐酶在1MNaHCO₃溶液(大约pH 8-10)中在25℃-90℃的温度范围内孵育15分钟时保持至少85％的活性。在50℃时，酶在4-11的pH范围内保持一天的完全活性。在50℃下10天后，酶在4-11的pH范围内保持超过50％的活性。

在本发明的一个方面，从含有CO₂的介质中提取CO₂是在基于酶的生物反应器中进行的。在将含有二氧化碳的介质在生物反应器中加工之前，可以将其纯化以使其不含可能干扰酶促反应或以其他方式(例如通过堵塞出口或膜)干扰生物反应器功能的污染物。在从燃烧过程中排放出的气体/多相混合物(例如烟道气或废气)通入生物反应器中之前，优选这些气体/多相混合物被清除掉灰分、颗粒、NO_x和/或SO₂。可替代地，SO₂分离和CO₂提取可以在同一反应器中进行以改善系统效率，因为两种分离典型地在碱性工艺条件下操作。来自不同区域的原天然气可能具有不同的组成和分离要求。优选地，油、冷凝物、水和天然气液体如果存在于原天然气中，则在基于酶的生物反应器中提取CO₂之前将它们去除。可以在与除硫相同的工艺中提取从燃烧过程中排放出或存在于原天然气中的CO₂，或者可以在单独的工艺中提取该CO₂。如果此时的气体超过本发明的碳酸酐酶的温度耐受性，则可能需要一定程度的冷却。优选地，在CO₂提取过程中碳酸酐酶暴露于的最高温度(无论是生物反应器中的工艺温度还是进料气体温度)可以在0℃与120℃之间。优选地，最大工艺温度在40℃与120℃之间，更优选地在45℃与110℃之间、更优选在50℃与100℃之间、更优选在55℃与90℃之间、甚至更优选在60℃与80℃之间，并且最优选在65℃与75℃之间。

用于气体分离(包括CO₂提取)的反应器、系统和工艺在本领域中是熟知的并且在商业上用于各种目的(A.Kohl和R.Nielsen,Gas Purification[气体纯化],第5版,GulfProfessional Publishing[海湾专业出版社],休斯敦,得克萨斯州,1997)。通过选择与酶限制相容的CO₂吸收液体(也称为CO₂吸收溶剂)和操作条件，本发明的CA可以用于任何基于溶剂的CO₂提取反应器中以产生用于从气体如燃烧气体、大气气体、燃料气体或呼吸气体中提取CO₂的生物反应器(包含生物材料如酶的反应器)。CA可以以水溶性形式存在于这些系统中，可以作为悬浮的基于蛋白质的固体存在，并且可以以用其他材料化学或生物化学修饰或与其他材料组合的形式存在。这些不同的形式统称为生物催化剂。

图1至图6示出了用于CO₂分离系统和工艺的若干种常见反应器(或气-液接触器)的示意图。这些反应器可以用于从气体到液体的CO₂吸收和从液体到气体的CO₂解吸。反应器可以用于单个单程单元操作，或者气体流或液体流或两者可以从出口再循环到反应器的入口，以提供气体流和液体流多次通过反应器。可以将多个反应器以顺序或并联安排、或两者安排在CO₂气体洗涤系统中，以能够处理大量的气体和液体或提供高效率的CO₂去除。不同类型的反应器可以用于形成具有许多不同构造的气体洗涤系统。例如，可以将逆流填充反应器(由图1所例示)用于将CO₂气体吸收到液体中，并且可以与用于从液体中去除(解吸)CO₂的相同类型或另一种类型的反应器(例如基于膜的反应器(由图4所例示))一起安排在再循环系统中，并且当将缺乏CO₂的液体返回至逆流反应器时，重复该过程。许多组合和变化均是可能的。在图1至6中所示的示意图中，对于连续流，来自一个反应器的出口液体行进到另一个反应器的入口液体。反应器可以是大或小的。

图7示出了集成式CO₂洗涤系统，其利用CO₂吸收液体在吸收器(2)与解吸器(9)之间的再循环以及用于生物催化剂分离(6和16)和循环利用的任选单元，在解吸阶段任选地利用吹扫气体(10)并且在缺乏CO₂的液体进入吸收器之前任选地利用二级空气吹扫(18)。因为碳酸酐酶改善了CO₂提取速率，所以将碳酸酐酶与CO₂提取反应器组合使得反应器和工艺得以改进，如气-液接触器尺寸更小且花费更少(例如，更短的吸收柱)、使用过程强化方法(例如，水平喷雾式反应器和旋转填充床反应器)，和使用低能耗和低挥发性的CO₂吸收液体，以及与常规方法相比操作温度总体较低。

一种类型的反应器使用液膜。该液膜可以例如是包括含有液膜的中空纤维膜的反应器，如以下文献中所述：Majumdar等人,1988,AIChE[美国化学工程师学会]34:1135-1145；US 4,750,918；US 6,156,096；WO 04/104160中。这种基于中空纤维膜的设计有时也叫作中空纤维液膜(HFLM)，并且基于这些的CO₂分离装置也叫作中空纤维容纳式液膜(HFCLM)渗透器。HFCLM渗透器的一个共同特征是封闭进料和吹扫气体流的中空纤维彼此靠近(即“紧密堆积”或“紧邻”)并且它们被封闭在单个刚性处理室中以形成一个完整的渗透器。在这种设计中，液体围绕紧密堆积的进料和吹扫中空纤维的壳侧。因为一根中空纤维的外壁之间的距离非常接近相邻的中空纤维，所以它们之间的液体层的厚度是如膜一样薄的，并且液体的组合物仅允许某些组分通过，因此术语“液膜”已用于描述中空纤维周围的液体。其中液膜夹置在两个结构支撑膜之间的容纳式液膜渗透器也已在本领域中进行描述(Cowan等人,2003,Ann.NY Acad.Sci.[纽约科学院年报]984:453-469)；该设计基本上以与HFCLM相同的方式起作用。容纳式液膜渗透器也已与碳酸酐酶组合使用，如US 6,143,556；WO2004/104160；Cowan等人,2003,纽约科学院年报984:453-469；以及Trachtenberg等人,2003,SAE international Conference on Environmental Systems[汽车工程师学会环境系统国际会议]案号2003-01-2499中所述。在这些情况下，CO₂解吸步骤在与吸收步骤相同的封闭处理室中进行。另一个实例描述了基于吸收器/解吸器中空纤维膜模块的基于胺的CO₂捕获反应器(Kosaraju等人,2005,Ind.Eng.Chem.Res.[工业与工程化学研究]44:1250-1258)。

另一种类型的反应器使用直接的气-液接触。这可以例如是基于常规溶剂的CO₂捕获反应器，这些反应器是基于吸收柱/解吸柱反应器(US 2008/0056972；Reddy等人,SecondNational Conference on Carbon Sequestration[第二次碳封存全国性会议],NETL/DOE[国家能源技术实验室/美国能源部],Alexandria[亚历山大],VA[弗吉尼亚州],2003年5月5日-8日)。使用链烷醇胺(如单乙醇胺、二乙醇胺和甲基二乙醇胺)进行CO₂提取的商业直接气-液接触器反应器的示例性流程图示于A.Kohl和R.Nielsen,Gas Purification[气体纯化],第5版,Gulf Professional Publishing[海湾专业出版社],休斯敦,得克萨斯州,1997:57-62中。使用碱性盐溶液(如碳酸钾)进行CO₂提取的商业直接气-液接触器反应器的示例性流程图示于A.Kohl和R.Nielsen,Gas Purification[气体纯化],第5版,GulfProfessional Publishing[海湾专业出版社],休斯敦,得克萨斯州,1997:334-340中。

使用碳酸酐酶的直接气-液接触反应器已描述于US 6,524,843；WO 2004/007058；WO 2004/056455；US 7,176,017和US 2004/0059231中。在这些类型的反应器中，气相或多相混合物在其中气相中的CO₂被液相吸收的条件下与液相接触，在液相中该CO₂通过碳酸酐酶转化为碳酸氢盐。富集碳酸氢盐的液体通过连续流从反应器中移取出，以确保CO₂与碳酸氢盐之间的平衡向CO₂的连续转化移动。气相溶解到液相中取决于气体与液体之间的表面接触面积。例如，可以通过以下方式实现大的接触面积：使液体和含有CO₂的气体通过高表面积填充柱、塔板或板式柱或塔，将液体的小液滴喷射通过含有CO₂的气体(即喷雾式接触器)，或将含有CO₂的气体鼓泡通过液体(即鼓泡槽或池)，或这些技术的组合。例如，填充柱可以包括填料，如拉西环、贝尔鞍形填料(berl saddle)、勒辛环(lessing ring)、英特洛克斯金属(intalox metal)、矩鞍行填料(intalox saddle)、鲍尔环(pall ring)或工程填料如Q-PAC(Lantec Products,Inc.[蓝太克环保科技公司],Agoura Hills[阿古拉山],CA[加利福尼亚州]91301)。填充材料可以由聚合物，如尼龙、聚酯、聚乙烯、聚醚醚酮、聚丙烯、聚苯乙烯或含氟聚合物(例如，聚四氟乙烯)，陶瓷如二氧化硅，或金属如铝、碳钢或不锈钢，或基于纤维素的材料，如木材或棉纤维构成。

在连续交换液体的反应器类型中或当希望将碳酸酐酶限制到反应器中的一个或多个位置时，可以通过各种手段将碳酸酐酶保留在反应器中。在填充柱中，可以将碳酸酐酶固定在填充材料上(对于固定化CA的方法，例如参见于WO 2005/114417、WO 2013/151757)或者可以作为颗粒固定化(例如，US 2015/0099289和Yan等人,2007,Fabrication ofsingle carbonic anhydrase nanogel against denaturation and aggregation athigh temperature[制造对抗高温下的变性和聚集的单个碳酸酐酶纳米凝胶],Biomacromolecules[生物大分子]8:560-565)，这些颗粒在随同至少一部分液体流一起并避免行进通过系统的其他部分的情况下从出口再循环到填充柱的入口，或者由于通过酶与固定化基质的组合所赋予的酶稳定性，可以在整个过程即吸收和解吸两者中随同CO₂吸收液体一起循环。当颗粒具有随同液体一起流动的尺寸和物理特性时，可以在含有填充材料、挡板和其他内部构件的气-液接触器中使用这些颗粒。已知包含CA的小颗粒增强CO₂吸收，并且通过碳酸酐酶快速催化CO₂水合反应的能力以及小颗粒在气相与液相之间的薄液膜界面中定位并四处移动，从而使底物(CO₂)迅速与CA催化剂接触的能力来解释(E.Alper和W.D.Deckwer,Some aspects of gas absorption mechanism in slurry reactors[浆态反应器中气体吸收机制的一些方面],在“Mass Transfer with Chemical Reaction inMultiphase Systems[多相系统中伴有化学反应的质量传递]中,”E.Alper(编辑),Springer Science&Business Media[施普林格科学和商业媒体],Dordrecht[多德雷赫特],1983,第199-224页)。

不同尺寸的筛网、过滤器或固-液分离技术可以用于将CA酶、化学或物理修饰的CA酶或固定化CA酶限制到CO₂洗涤系统中的特定操作单元、区域或位置。这些技术也可以用于将一种CA生物催化剂类型或混合物限制在一个反应器中，并且将另一种CA生物催化剂类型或混合物限制在另一个反应器区中。例如，该技术可以用于使不同的CA定位于吸收器和解吸器中。在“鼓泡”反应器中，可以将碳酸酐酶截留在多孔基质中，该多孔基质例如，不溶性凝胶颗粒，如二氧化硅、硅氧烷、氨基甲酸酯、藻酸盐、藻酸盐/壳聚糖、藻酸盐/羧甲基纤维素，或者可以将碳酸酐酶(通过共价键、离子电荷、截留或封装)固定在固定的固体填料上，或者可以固定在液体中悬浮的颗粒上或这些颗粒中，或者可以将碳酸酐酶化学连接在白蛋白或PEG网络中。碳酸酐酶也可以通过截留在聚合物固定化材料中而被限制到反应器中的特定位置，该聚合物固定化材料可以包含胶束或反向胶束材料，如WO 2010/037109中所述，并且可以包括酶的化学修饰作为截留或固定化技术的一部分(例如，WO 2012/122404)。可以通过本领域已知的这些和其他技术来固定化本发明的CA。

喷雾式接触器可以包括垂直或水平喷雾室、逆流喷雾柱、文丘里洗涤器、喷射器或喷射洗涤器、旋风洗涤器和喷雾干燥器(A.Kohl和R.Nielsen,Gas Purification[气体纯化],第5版,Gulf Professional Publishing[海湾专业出版社],休斯敦,得克萨斯州,1997:418-427和604-616)。喷雾式接触器的使用对于避免压降和改善对气体中固体颗粒的耐受性是合乎需要的，如对于大气压燃烧后废气应用可能是重要的。然而，为了最有效，喷雾式接触器中的CO₂吸收速率必须快，并且碳酸酐酶可以提供实现这些快速速率所需的催化。

在直接气-液接触反应器中的CO₂提取可以包括第一吸收阶段，然后是任选地随后的解吸、沉淀、利用、收集、再生或释放阶段。对吸收阶段的一般描述如下。当吸收反应器在操作中时，含有水的液体在一端，优选在顶部进入反应器，并且流到另一端，优选底部，并且含有CO₂的气体流(进料气体)在一端，优选地在液体的相反端(底部)(“逆流”)进入反应器并且气体穿过液体并减去提取到液体中的CO₂通过在相反端(优选地，反应的顶部)的气体出口离开。离开吸收反应器的液体富含碳酸氢盐/碳酸盐(富含CO₂的液体)，并且与进料气体相比，出口气体的CO₂含量降低。可以在随后的反应中处理富含CO₂的液体，例如通过穿过解吸反应器产生纯CO₂，或产生碳酸盐沉淀物如CaCO₃。来自吸收反应器的富含CO₂的液体也可以利用(例如增强藻类生长)、收集(例如通过将富含CO₂的液体泵送到容纳式地质地层中)、释放(例如通过将富含CO₂的液体泵送到环境中，如将碳酸氢盐液体释放到来自潜水艇生命支持系统的海水中)、蒸发或脱盐。含有碳酸氢盐阴离子的富含CO₂的液体可以在工业过程中，如在可用作肥料的碳酸铵和碳酸氢铵的制造过程中，或在去除和中和酸性气体如二氧化硫的过程中使用。

本文所述的反应器可以包括吸收阶段、解吸阶段或一系列吸收和解吸阶段，其中碳酸酐酶可以催化CO₂水合成碳酸氢盐或碳酸氢盐脱水成CO₂或两者。反应器可以彼此组合，其中每个反应器构成一种模块。例如，液膜反应器可以充当吸收模块，并且直接气-液接触反应器可以充当解吸模块，或反之亦然。

术语“缺乏CO₂”和“富含CO₂”的吸收液体是在本发明中用以描述在该吸收液体经由该工艺进行循环时该吸收液体中存在的碳(例如，呈溶解的CO₂、化学反应的CO₂、碳酸氢盐、碳酸和/或碳酸盐的形式)的相对量的术语。如本文所用，术语“缺乏CO₂的液体”通常是指进入吸收单元的吸收液体。术语“富含CO₂的液体”通常是指进入解吸单元的吸收液体。应理解，术语“缺乏CO₂的液体”也可以应用于离开解吸模块的吸收液体，并且术语“富含CO₂的液体”也可以应用于离开吸收单元的吸收液体。在给定时间点，在给定系统内与缺乏CO₂的液体相比，富含CO₂的液体含有更多的碳。如本文所用，术语“富含CO₂的气体”通常是指具有相对高的CO₂含量的气体混合物，或者它可以是纯的CO₂气体流。富含CO₂的气体可以是进料气体。术语“缺乏CO₂的气体”通常是指与富含CO₂的气体相比CO₂含量消耗的气体混合物，其中至少一部分CO₂被去除。缺乏CO₂的气体可以是不包含CO₂的气体，例如纯氮气流。缺乏CO₂的气体可以用作吹扫气体，以有助于从富含CO₂的液体中去除CO₂。

在不限制本发明范围的情况下，提供图7以例示包含吸收单元和解吸单元两者的CO₂提取系统的一般示意图，CO₂吸收液体经由该CO₂提取系统进行循环，期间它在吸收器(2)中从含有CO₂的气相(进料气体，1)中去除CO₂、从解吸器(9)中释放纯化的CO₂气体(14)，并且再循环回至吸收器。术语“进料气体”通常关于CO₂提取反应器使用，其中意味着通过与反应器中的缺乏CO₂的吸收液体接触来从含有CO₂的气相中去除CO₂。进料气体可以是在大气压下，或在高于或低于大气压的压力下。CO₂在吸收液体中的选择性溶解度致使将CO₂从进料气体提取到吸收器中的吸收液体中。在解吸器中，通过以下方式来从富含CO₂的吸收液体中释放CO₂：引入降低CO₂在载体液体中的溶解度的压力差(例如，相比于进料气体中的CO₂的分压，解吸器气相中的CO₂的分压较低，如可以通过在解吸器中施用真空来实现，或者可以通过使吹扫气体通过解吸器如空气或可冷凝吹扫气体来实现)，和/或施用热量(例如经由再沸器、蒸汽或吹扫气体)以驱动CO₂进入解吸器中的气相中。用于解吸的热量也可以通过诱导空化(例如通过应用超声波或其他声学或振动能量)，并且通过向富含CO₂的液体应用微波或红外能量来施加。可以使用一个以上的解吸阶段来优化CO₂释放的效率。例如，可以在解吸器的一个阶段中施用热量以去除和捕获大部分CO₂，然后进行一个或多个二级解吸阶段，例如使用空气吹扫，以去除额外的CO₂并将液体‘抛光’至更缺乏CO₂的负载。可以仅使用热能来驱动解吸，如在基于单乙醇胺的CO₂提取过程中通常使用。例如，典型的基于单乙醇胺的CO₂提取的解吸器中的温度大于100℃(例如，120℃)。可替代地，可以将热能与减压组合以驱动解吸。在这种情况下，可以降低解吸器中的温度。例如，连同与吸收器中的压力(例如，大气压)相比降低的压力(例如真空)，解吸器可以在70℃下操作。pH的差异可以用于促进吸收和解吸，其中在较碱性的pH下有利于CO₂吸收到水性介质中，而在较低碱性(更酸性)的pH下有利于CO₂从水性介质中的解吸。吸收与解吸之间的相关pH差异的范围(“摆动”)取决于特定的过程。例如，出于例示的目的，CO₂吸收到基于碳酸氢盐的载体液体中可以在pH9或之上发生，导致该载体液体的pH降低至低于pH 9。然后可以在低于pH 9的pH下发生CO₂从该载体液体中的解吸。

当穿过吸收器的进料气体的压力高于解吸器中的气相压力时，可以建立/发生吸收器与解吸器之间的压力差。在一些情况下，如对于天然气改质，吸收器中的气体压力高于解吸器中的，并且吸收器和解吸器两者中的气体压力均可以高于大气压。在其他情况下，吸收器中的气体压力高于大气压，并且解吸器中的气体压力处于或低于大气压(即，等于或小于100kPa)。可替代地，当穿过吸收器的进料气体(如燃煤燃烧后烟道气)的压力大致处于大气压并且解吸器中的气相压力低于大气压时，可以建立/发生吸收器与解吸器之间的压力差。在本发明的一个实施例中，吸收器与解吸器之间的总气体压力差为至少约35kPa。可替代地，可以使用不含CO₂或含低浓度的CO₂(如空气)的吹扫气体来提供在富含CO₂的液体通过解吸器时从其中释放CO₂所需的驱动力。可以通过以下方式在单个反应器中以分批模式操作CO₂吸收和解吸：首先将反应器中的缺乏液体暴露于富含CO₂的气体一段时间，然后施用解吸驱动力选项，如热量、真空、声学或空化效应、或吹扫气体、或这些的组合，以从富含CO₂的液体中释放CO₂一段时间，以再生缺乏CO₂的液体。可以加热吹扫气体以提供用于释放CO₂的热驱动力和分压驱动力。该循环可以重复。对于需要进行CO₂分离并且分离的CO₂可以释放到大气中的应用，空气吹扫解吸可能是期望的，例如当释放的CO₂被认为是CO₂中性排放物，如在沼气改质期间从甲烷中分离的CO₂时。

本发明的一个实施例包括在CO₂气体分离反应器的解吸阶段中使用可冷凝吹扫气体化合物。典型的基于溶剂的CO₂气体分离反应器具有两个主要阶段：1)吸收阶段，和2)解吸阶段。在吸收阶段中，来自气相的CO₂被液相吸收。在解吸阶段中，液相中的CO₂被释放到气相中。为了使CO₂从液体释放到气相中，必须存在浓度梯度，其中气相中CO₂的浓度(分压)小于液相中CO₂的浓度(分压)。在解吸阶段中施用的非CO₂气体的“吹扫”流可以有助于CO₂从液体到吹扫气相的质量传递，因为进入的吹扫气体没有CO₂或有低浓度的CO₂，从而导致CO₂从液相沿低CO₂分压的方向移动。一种类型的吹扫气体是水蒸气(气相中的水)，如当使水性液体沸腾时产生的。但是，使水沸腾需要相当大的能量。空气或氮气也可以用作吹扫气体，然而，在解吸步骤之后没有简单的方式将这些气体与CO₂分离，而该分离可能是获得分离的或纯化的CO₂产物所必需的。因此，希望利用这样的化合物，这些化合物可以在没有沸水能量成本的情况下充当吹扫气体，并且还具有允许这些化合物在解吸步骤之后容易地与CO₂分离以提供纯化的CO₂气体流和可以用于后续解吸操作的回收的吹扫气体化合物的特性。

已经描述了在CO₂汽提过程中使用某些不与水混溶的挥发性载体以及CO₂吸收溶剂，如MEA水溶液(R.A.Frimpong,J.E.Remias,J.K.Neathery,M.Liu和K.Liu,Enhancingsolvent regeneration with a high volatility liquid as a stripping carrier[用高挥发性液体作为汽提载体来增强溶剂再生],Tenth Annual Conference on CarbonCapture&Sequestration[第十次碳捕获和封存年会],2011年5月2日-5日,Pittsburgh[匹兹堡],Pennsylvania[宾夕法尼亚州]；Proceedings on CD-ROM[CD-ROM上的会议记录],Exchange Monitor Publications&Forums[交流监测出版物和论坛],4455ConnecticutAve NW,Suite A700,Washington,DC 20008[康涅狄格大道西北区4455号A700室，华盛顿特区20008])。这些系统可以包括CA以通过克服在这些过程中可能存在的碳酸氢盐转化为CO₂的速率限制来提高解吸效率，并且可以选择和工程化CA以与这些过程相容并承受这些过程，而无论它们是否在这些过程中执行特定的催化作用。

可冷凝吹扫气体化合物具有沸点温度(相当于冷凝温度)显著高于CO₂的沸点温度，同时优选低于水的沸点温度的特性。一种这样的化合物是甲醚，其在1个大气压下的沸点(b.p.)为-24℃。该低沸点有利于从反应混合物中去除甲醚。甲醚是在低于水的沸点的温度下的气体，并且甲醚将在显著高于CO₂的升华温度(-78.5℃，1atm)的温度下冷凝成液体。因此，可以将含有CO₂和甲醚的吹扫气体在-78℃至-24℃之间的温度下通过冷却的冷凝器，以致使甲醚冷凝成液体并且被冷凝器捕获，同时允许CO₂作为纯化的气体流穿过冷凝器。可以将甲醚液体循环利用以重新用作吹扫气体。甲醚是一种非毒性、廉价的化合物、与其他烷基醚相比耐自氧化，并且被认为是来自木质纤维素生物质气化的替代燃料或可再生燃料(BioDME)。因此，甲醚易于用于吹扫气体应用。甲醚是可燃的，因此需要工程控制以防止在使用过程中燃烧。可以优化此类控制以利用被去除的CO₂化合物本身是不可燃的特征。可冷凝吹扫气体化合物的其他实例是乙醇(b.p.78.4℃)、甲醇(b.p.64.7℃)、丙酮(b.p.56℃)、丙醇(b.p.97℃-98℃)、异丙醇(b.p.82.6℃)、叔丁醇(b.p.82.2℃)、和乙醚(b.p.34.6℃)。在每种情况下，需要适当的工程控制以防止不希望的燃烧或分解，例如，与乙醚相关的风险是分解成爆炸性过氧化物。在一个优选的实施例中，可冷凝吹扫气体化合物的使用量不会显著减弱用CO₂吸收液体可实现的CO₂负载能力。

在一个优选的实施例中，甲醚是可冷凝吹扫气体，因为CO₂解吸可以在低温下，如在环境温度下，或在0℃-90℃的范围内或在40℃-60℃的范围内进行，以能够在吸收器温度(对于烟道气脱硫后燃烧烟道气或沼气典型地为40℃)与解吸器温度之间实现近等温过程，该解吸器温度可以保持在40℃或升高到适度高的温度，例如以确保富含CO₂的液体的溶解度，直到发生解吸。

可冷凝吹扫气体可以与含有CO₂的液体直接接触，或者可以如通过CO₂可渗透膜与含有CO₂的液体分开，这类似于称为“渗透蒸发”的工业过程，其中通过对所需组分具有选择性的膜将液相进料与蒸气相渗透物分开。任选地在渗透物侧施用真空以提供所需组分的低分压并且驱动该组分跨膜的质量传递。

在一个实施例中，可冷凝吹扫气体化合物直接接触包含待去除的CO₂的液相。在一个优选的实施例中，可冷凝吹扫物的存在对可以通过吸收溶液吸收的CO₂量(或称为“负载能力”)没有影响或影响极小。

在一个实施例中，可冷凝吹扫气体化合物是可溶于水或与水混溶并且具有比水低的沸点，但不与水形成共沸物的挥发性化合物，例如甲醇(b.p.64.7℃)。包含待去除的CO₂的液相可以包含水溶性可冷凝吹扫气体化合物。在进行CO₂解吸的反应区中，将温度升高至高于水溶性可冷凝吹扫气体化合物的沸点，并且吹扫气体化合物从基于水的液体中蒸发，从而将CO₂携带在蒸气相中。可替代地，可以将水溶性可冷凝吹扫气体化合物升高至高于其沸点的温度以将其转化为气态形式，并且可以使气态形式与包含待去除的CO₂的液相接触，优选保持温度高于水溶性可冷凝吹扫气体的沸点。

在一个实施例中，可冷凝吹扫气体化合物是挥发性化合物，其可以与水一起形成共沸混合物并在比水的沸点温度更低的温度下，优选在CO₂吸收化合物的存在下沸腾。在暴露于热量时，挥发性化合物在从混合物中蒸发时充当吹扫气体。在比仅存在水的情况更低的温度下，溶解在液体中的CO₂随同吹扫气体一起携带。这意指从液体中去除CO₂需要更少的能量。例如，水混溶性组合物(如乙醇/水)当加热时将朝向低沸点共沸组合物挥发。在乙醇/水的情况下，共沸组合物是95.629重量％的乙醇，其可以例如通过将95.629g无水乙醇与纯水混合以形成总共100g的溶液(NIST标准参考物质1828)来制备。在共沸组合物中，蒸气相中的组成(例如乙醇和水)与液相中的组成相同。因此，使共沸液体在其共沸组合物下沸腾不会导致液体组成的变化。乙醇在78.4℃下沸腾并且水在100℃下沸腾，而共沸物在78.2℃下沸腾，低于其成分中的任一种。在加热(或蒸馏)时，乙醇和水的组合物(其中乙醇的比例小于共沸组合物)将使乙醇比水相对更多地释放到气相中，并且沸腾液相的组合物将变得乙醇浓度更低并且水的浓度更高。同时，气相中乙醇的比例将增加，并且收集的冷凝物将具有与初始沸腾液体组合物相比更高比例的乙醇。因此，与水相比，乙醇可以通过在较低的温度下蒸发来执行吹扫气体的功能。

在一个实施例中，可冷凝吹扫气体在水中具有低溶解度或易于与水分离，以避免吹扫气体组分在离开解吸阶段时被缺乏CO₂的液体保留。例如，叔丁醇不与水混溶并且具有低于水的沸点的82℃沸点。因此，叔丁醇可以充当吹扫气体，并且随后可以例如在提供液-液分离的冷凝槽中容易地与水分离。可以存在添加剂(如表面活性剂)以在CO₂提取阶段期间增强吹扫气体化合物与水的混溶性，以提高吹扫气体在去除CO₂中的有效性。另外，可以存在添加剂(如表面活性剂)以增强CO₂与吹扫气体的相互作用，或减少CO₂与CO₂吸收溶液的相互作用，在任一情况下均导致CO₂从CO₂吸收溶液中的释放增强。

当与催化剂(如碳酸酐酶)组合以在CO₂解吸在低温下进行时将碳酸氢盐转化为CO₂的速率限制最小化时，用可冷凝吹扫气体进行低温解吸的能力是尤其有益的。

在一个实施例中，碳酸酐酶在液体中的存在或与液体接触意指在溶液中可获得恒定的溶解CO₂供应，这是由于在包含碳酸氢盐的水溶液中CA催化碳酸氢盐转化为CO₂的结果。所得的蒸气相含有CO₂、H₂O和吹扫气体化合物(例如乙醇)。在冷阱中从蒸气相中回收水和乙醇，从而在出口处产生纯的CO₂气体。

图7中示意性地示出的吸收器和解吸器可以处于基本相同(“等温”)的温度或不同的温度。宏基因组Logatchev碳酸酐酶可以仅存在于吸收器或解吸器中或存在于两者中。在其中存在高温碳酸酐酶如宏基因组Logatchev碳酸酐酶的解吸器中使用真空(低压)在低温(例如70℃)下再生CO₂是本发明的另一个实施例。在这种工艺中碳酸酐酶催化CO₂吸收到吸收溶剂和从吸收溶剂解吸CO₂两者。当吸收器和解吸器处于不同温度时，可以使用温度调节器(例如，热交换器)来保存该过程中的能量。

在进一步的例示中，用于H₂S吸收的真空碳酸盐方法(A.Kohl和R.Nielsen,GasPurification[气体纯化],第5版,Gulf Professional Publishing[海湾专业出版社],休斯敦,得克萨斯州,1997:383-388)的变型被描述用于CO₂提取(US 2007/0256559)并且披露出与碳酸酐酶组合(Lu等人,DOE项目号DE-FC26-08NT0005498,NETL[国家能源技术实验室]CO2Capture Technology for Existing Plants R&D Meeting[用于现有工厂的CO2捕获技术研究与开发会议],2009年3月24日-26日,匹兹堡,PA[宾夕法尼亚州])。在该例示中，使大气压发电厂烟道气在40℃至60℃范围内的温度下接触吸收柱中的碳酸钾水溶液和碳酸酐酶，其中碳酸酐酶改善了载体液体中CO₂水合成碳酸氢盐的速率。将富含CO₂的吸收液体泵送至解吸柱(或“汽提塔”)，其中通过低压(例如，14-55KPa)和施用热(例如50℃-70℃)的组合从吸收液体中释放CO₂，该组合通过直接注入来自从发电厂的低压蒸汽轮机的低压、低质量的废蒸汽获得。来自本发明的宏基因组Logatchev的碳酸酐酶特别适用于所述改进的真空碳酸盐方法，因为宏基因组Logatchev CA可以耐受吸收器和解吸器两者中的温度，这意指，宏基因组Logatchev CA可以随同吸收液体一起通过该方法的吸收阶段和解吸阶段两者进行再循环。

另一种类型的反应器使用与CA的CO₂水合催化然后沉淀组合的膜。在一种情况下，通过使气态流通过气体扩散膜进入溶液中来从气态流中去除CO₂，在该溶液中通过使CO₂溶液通过含有CA的基质并且添加矿物质离子引起碳酸盐的沉淀来加速转化为碳酸氢盐且随后转化为碳酸盐(US 7,132,090)。已经显示，CA不仅可以催化CO₂水合/脱水反应，还可以促进碳酸钙的沉淀(Mirjafari等人,2007,Ind.Eng.Che.Res.[工业与工程化学研究],46:921-926)。

另一种类型的反应器从环境空气中去除CO₂。已经报道了设计用于从环境空气中去除CO₂的反应器(Stolaroff等人2008Environ.Sci.Technol.[环境科学与技术],42:2728-2735)，然而该反应器未利用碳酸酐酶。不受所报道的环境空气反应器的设计的限制，如本发明中所披露的与合适的吸收液体组合的CA可以用于这种反应器中或如本文所述的其他反应器设计中。热稳定性碳酸酐酶是尤其有用的，因为将反应器暴露于环境条件(如日光)可能会增加液体温度，需要CA具有良好的热稳定性，从而避免冷却反应器的需要。这例示了如下情况，其中从含有CO₂的介质中提取CO₂的过程需要CA在如下的温度起作用或耐受如下的温度，该温度高于含有CO₂的介质(如环境空气)的初始温度，该含有CO₂的介质可以是夜间冷(低于10℃)且白天期间热的(高于45℃)。

本文所述的不同膜反应器和直接气-液接触反应器以及其他替代形式可以应用于二氧化碳提取过程中，其中吸收过程和解吸过程在至少两个步骤中发生。此类反应器通常包括以下元件：a)至少一个吸收单元，其可包括气体入口区和/或气体出口区；b)至少一个解吸单元，其包括气体出口区；c)CO₂吸收液体；以及d)用于连接一个或多个吸收单元和一个或多个解吸单元以使得吸收液体可以从一个或多个吸收单元通到一个或多个解吸单元的手段。任选地，用于连接吸收单元和解吸单元的手段是回路，一旦吸收液体穿过解吸单元，就允许吸收液体返回至吸收单元。这些单元中的一个或两个可以包括至少一个CO₂可渗透膜，其将气相与液相分开，如WO 2010/014773和WO 2010/014774中所述。这种类型的膜单元也叫作气-液膜(GLM)单元。GLM单元可以例如是呈中空纤维膜、平板膜或螺捲式膜的形式。GLM单元可以充当吸收器单元和/或解吸器单元。可替代地，一个单元可以是GLM单元，并且另一个单元可以被构成为使得气相和液相直接接触，或者换句话说气-液界面未被膜分开。这种类型的单元也叫作直接气-液接触(DGLC)单元或仅直接接触(DC)单元。DGLC单元可以例如是呈填充有允许气-液接触的填充材料的柱，和/或配备有用于将气体暴露于液体的入口的含液体容器(如鼓泡柱)、和/或液体喷雾(例如喷雾塔)和/或充气器单元和/或降膜的形式。DGLC单元可以充当吸收器单元或解吸器单元。泡罩系统、筛板系统、圆盘和圆环柱和填充柱是存在于DGLC单元中的内部构件的实例。

上文所述的反应器类型可以在任何所需温度下操作。在一个实施例中，将反应器以在0℃与120℃或5℃与110℃之间，更优选在10℃与100℃之间、更优选在20℃与95℃之间、更优选在30℃与90℃之间、更优选在40℃与85℃之间、更优选在40℃与80℃之间、更优选在40℃与75℃之间，且更优选在40℃与70℃之间且更优选在40℃与60℃之间的与碳酸酐酶接触和/或包含碳酸酐酶的液体的温度下操作。

CO₂的吸收速率和解吸速率取决于吸收液体中的pH。在关于本发明描述的反应器类型中，缺乏CO₂的吸收液体的pH在pH 4至12之间，优选高于pH 7(如在室温下，例如20℃-25℃测量的)，更优选高于pH 8、更优选在8与12之间、更优选在8与10.5之间、更优选在8.5与10之间，甚至更优选在9与9.5之间。在吸收期间CO₂水合成碳酸氢盐导致质子释放，致使吸收液体的pH随着富含CO₂的吸收液体的碳含量增加而降低。pH降低的程度取决于吸收液体的缓冲能力和吸收的CO₂量。在本发明的一个优选实施例中，吸收液体是基于碳酸氢盐的缓冲液或基于碳酸盐的缓冲液，如碳酸氢锂、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铯、碳酸氢铵或碳酸氢盐的其他合适的盐、或碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸铵或碳酸盐的另一种合适的盐、或碳酸氢盐和碳酸盐化合物的组合，其中，根据pH值，更多或更少量的碳酸盐和/或碳酸将与碳酸氢盐一起存在。

在本发明的一个实施例中，富含CO₂的吸收液体穿过解吸阶段，其中富含CO₂的吸收液体的pH将随着CO₂释放而增加。为了使吸收液体经由通过这种吸收-解吸系统进行再循环，优选的是吸收液体的pH在再次穿过吸收阶段之前返回至缺乏CO₂的吸收液体的pH。

在本发明的一个优选实施例中，反应器配备有用于调节吸收液体的pH的手段。这可以以若干种方式执行。一种方式是使用自动pH调节设备如自动滴定仪将碱性物质添加到吸收液体中，例如，在图7中指示的辅助组分添加点之一(20)处。碱性物质优选具有与系统中循环的吸收液体相似的组成(例如，溶剂浓度、离子强度、碳酸酐酶的量等)，并且可以在吸收之前的任何时间处添加以调节pH。类似地，中性至酸性物质可以在解吸之前的任何时间处添加到吸收液体中，例如，在图7中指示的辅助组分添加点之一(21)处。如果需要，可以从系统中去除额外的吸收液体，例如，在图7中指示的去除点(24和25)之一处。

在本文所述的CO₂捕获过程中，本发明的宏基因组Logatchev CA可以与一种或多种其他CA组合。整个CO₂洗涤过程中的不同工艺步骤可能需要优化操作条件，例如温度、pH、载体液体组成、压力等。本发明的CA可以与在不同最佳条件下操作并且适用于CO₂洗涤过程的其他CA组合。例如，一种CA可以随同吸收液体一起在整个系统中循环，并且不同的CA可以固定在系统中的一个或多个位置处。

本发明的CA和包含本发明的CA的本文所述的基于双催化剂的生物反应器也在如飞行员座舱、潜水艇舰、水生设备、安全和消防设备、宇航员太空服和人工肺装置中发现了更加非常规应用以保持呼吸空气不含毒性CO₂水平。其他应用是从受限空间中去除CO₂(如从啤酒厂和进行发酵的封闭建筑物的内部降低有害CO₂水平)，和从CO₂敏感性环境(如博物馆和图书馆)中去除CO₂，以防止过量的CO₂对书籍和艺术品造成酸性损害。另一种应用是从热的环境空气中(例如在沙漠中)去除CO₂。在这种情况下，碳酸酐酶可以例如包含在适于从环境空气中提取CO₂的反应器中，如Stolaroff等人2008Environ.Sci.Technol.[环境科学与技术],42,2728-2735所述，这种反应器可以例如采用“人造树”或风车的形式，如WO 2008/041920中所述。

宏基因组Logatchev CA可以单独作为CO₂提取生物催化剂与基于水的吸收液体一起使用，或者它可以任选与常规CO₂提取技术，如经由基于胺的溶剂或氨水或物理溶剂如Selexol^TM(联碳公司(Union Carbide))或聚乙二醇醚进行的化学吸收组合。在本发明的另一个实施例中，宏基因组Logatchev CA与一种或多种CO₂吸收化合物组合，该一种或多种CO₂吸收化合物如基于胺的化合物，例如水性链烷醇胺，包括单乙醇胺(MEA)、二乙醇胺(DEA)、N-甲基二乙醇胺(MDEA)、2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇(Tris或AHPD)、二甘醇胺(DGA)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、甲基单乙醇胺(MMEA)、二甲基单乙醇胺(DMMEA)、二乙基单乙醇胺(DEMEA)、二异丙醇胺(DIPA)、三异丙醇胺(TIPA)、N-甲基氨基丙酸或N,N-二甲基氨基乙酸的水溶性盐(例如钠盐或钾盐)、或N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N,N-二甲基甘氨酸、β-丙氨酸(3-氨基丙酸)或其他天然或修饰的氨基酸(例如N-取代的氨基酸衍生物)、2-(2-氨基乙基氨基)乙醇(AEE)、三乙醇胺(TEA)或其他基于伯、仲、叔或受阻胺的溶剂，包括在US4,112,052(通过引用并入本文)的第7至9页描述的那些，或甘氨酸的水溶性盐(例如甘氨酸钠或甘氨酸钾)和牛磺酸，或其他液体CO₂吸收组合物如在不同离子强度、摩尔浓度(范围为从稀溶液至高浓度溶液的范围内，直至盐的溶解度极限(可根据温度而变化))下的包含NaOH、KOH、LiOH、碱金属碳酸盐(例如锂、钠、钾或铵)、碱金属碳酸氢盐、碱金属磷酸盐或硼酸盐，如四硼酸钠十水合物(硼砂)的水性溶液，或水性电解质溶液和促进剂如哌嗪、或聚乙二醇醚，或其共混物，或者它们的类似物或共混物。水溶性盐和溶剂可以彼此组合使用，并且可以与pH缓冲化合物和矿物封存化合物(如磷酸盐、多磷酸盐和硼酸盐)组合，以提供混合盐溶液，如碳酸氢钾或碳酸氢钠与磷酸钾或磷酸钠。水溶性盐和溶剂可以与简单的电解质(例如碱金属卤化物(如NaCl、KCl)和金属卤化物(如ZnCl))和硫酸盐，如硫酸钠和硫酸钾组合。优选地，CO₂吸收组合物包含足够浓度的水溶性盐，例如NaCl，以稳定和优化宏基因组Logatchev CA的催化活性。宏基因组Logatchev CA与CO₂吸收组分的组合可以应用于本文所述的生物反应器中，并且可以基于常规技术应用于已经存在的CO₂洗涤设施。在常规生物反应器中，链烷醇胺的浓度典型地为15-30重量百分比。在本发明的一个实施例中，链烷醇胺的浓度可以在常规范围内或优选在较低浓度下，如优选低于15％(V/V)，更优选低于12％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％，且最优选地低于0.1％(V/V)。

已知某些简单的氨基酸和胺可活化α-CA(Akdemir等人,2013,The extremo-α-carbonic anhydrase(CA)from Sulfurihydrogenibium azorense,the fastest CAknown,is highly activated by amino acids and amines[来自亚速尔群岛食硫氢菌的极端性α-碳酸酐酶(CA)(已知的最快CA)通过氨基酸和胺高度活化],Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学通讯]23:1087-1090)，并且将其通过引用并入本文。它们包括D-Phe、L-DOPA、L-和D-Trp、多巴胺、血清素，L-和D-His、L-Phe、L-Tyr、2-吡啶基-甲胺、L-肾上腺素、D-DOPA、D-Tyr和若干种杂环胺。

在常规方法中，添加腐蚀和氧化抑制剂(如Fluor Daniel专有的EconAmine FG溶剂中所含的)，以增加胺浓度，同时降低腐蚀风险。无机腐蚀抑制剂包括钒(例如偏钒酸钠)、锑、铜、钴、锡和硫化合物。有机腐蚀抑制剂包括硫脲和水杨酸。

其他辅助吸收液体组分可以包括润湿剂、螯合剂(例如乙二胺四乙酸、多磷酸盐)、消泡剂、降粘剂和能够增加CO₂进入或离开载体液体的通量的其他化合物。

在常规方法中，通常采用减少和/或避免泡沫形成的技术。这些包括在CO₂提取之前去除引起泡沫的杂质和使用消泡剂和泡沫抑制剂如硅氧烷化合物或高沸点醇如油醇或辛基苯氧基乙醇(A.Kohl和R.Nielsen,Gas Purification[气体纯化],第5版,GulfProfessional Publishing[海湾专业出版社],休斯敦,得克萨斯州,1997:224-230)。

本发明的另一方面涉及沼气生产，其中作为使沼气穿过如上所述的生物反应器的替代方案，将CO₂提取直接在沼气发酵液中进行。通过将宏基因组Logatchev CA添加到厌氧培养液中以作为沼气发酵培养基中的添加剂，可以将来自气相的更多CO₂转化为碳酸氢盐，碳酸氢盐是产甲烷古细菌(methanogenic Archaea)产生甲烷的底物。特别地，甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)经常存在于嗜热沼气池中(Mladenovska和Ahring,2000,FEMSMicrobiol.Ecol.[欧洲微生物学会联合会微生物学生态学]3:225-229)。对于嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)TM-1已经显示碳酸氢盐可能是甲烷产生的限制因素，例如在低碳酸氢盐溶液(0.6mM)中生长的嗜热甲烷八叠球菌TM-1的培养物与含有高10倍的碳酸氢盐剂量(6mM)的培养物相比显示出相当大的迟滞期(即甲烷产生开始较晚)。另外，在较低碳酸氢盐剂量下甲烷的总产率低25倍(Murray和Zinder,1985,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]50:49-55)。因此，当使用可以利用CO₂/生物碳酸盐作为生长和产甲烷的碳源的一种或多种嗜热微生物，例如产甲烷菌如甲烷八叠球菌属在升高的温度下进行沼气生产时，热稳定性碳酸酐酶是特别有用的。

本发明的另一个实施例是宏基因组Logatchev CA用于增强藻类和其他利用碳酸氢盐作为碳源的水生植物的生长的用途，通过在水生植物环境中或为了递送到水生植物环境将CO₂催化转化为碳酸氢盐来进行。例如，可以使用该方法来同时从燃烧废气(如烟道气)中去除CO₂，并且为转化为碳酸氢盐提供CO₂，其通过使废气与来自培养池的液体接触进行。培养藻类和水生植物的某些方法涉及使用封闭的管或浅槽或池，其中来自阳光的热量使水温升高。因此，热稳定性碳酸酐酶在升高的培养温度下是特别有用的。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。

实例

用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。

实例1

Logatchev碳酸酐酶在枯草芽孢杆菌中的克隆和表达

碳酸酐酶(被称为Logatchev CA；示出为SEQ ID NO:1的DNA，和示出为SEQ ID NO:2的蛋白质)的基因被鉴定为从Logatchev热液喷口获得的宏基因组序列(Perner等人,2013,Environ.Microbiol.[环境微生物学]15:1551-1560)。基于该序列，Logatchev CA是α型碳酸酐酶。

设计编码Logatchev CA的合成多核苷酸(SEQ ID NO:3的核苷酸82至759)并且针对枯草芽孢杆菌优化密码子使用。如WO 2012/025577中所述那样进行密码子优化。

将来自克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶信号肽(由SEQ ID NO:3的核苷酸1至81编码)与经优化的Logatchev CA核苷酸序列以符合读框的形式克隆。

将合成的Logatchev CA基因克隆到合适的表达载体中，产生质粒pLogatchev。

在表达载体中，通过控制三联启动子系统来表达CA基因，如WO 2012/025577中所述。将大肠杆菌TOP10细胞用质粒pLogatchev转化并且使用本领域已知的方法选择一个正确克隆。用从所选择的大肠杆菌克隆分离的质粒转化感受态枯草芽孢杆菌细胞，质粒中的CA基因构建体通过同源重组整合到枯草芽孢杆菌染色体中，进入果胶裂解酶基因座位(在图8中表示为Pel)中。

通过DNA测序分析氯霉素抗性枯草芽孢杆菌克隆，以验证构建体的正确的DNA序列。将翻译的蛋白质序列示出为SEQ ID NO:4，其中氨基酸-27至-1对应于来自克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶信号肽，并且氨基酸1至226对应于预测的成熟肽Logatchev CA(SEQ IDNO:5)。

选择一种表达克隆并且将其在深孔板中在旋转摇床上培养，每个深孔板含有补充有6mg/l氯霉素的2ml富酵母提取物的培养基。将克隆在26℃下培养3天。使用基本上如实例3中所述的CA活性测定来确定培养液溶液中存在非常高的CA活性。

为了从培养液中的内源性枯草芽孢杆菌酶中半纯化热稳定性Logatchev CA，将无细胞培养液在80℃下孵育15分钟，并且将溶液以10.000×g离心10分钟。可溶性的热稳定性Logatchev CA保留在上清液中，而热处理致使共表达的非热稳定性蛋白质沉淀，并且在离心过程中将沉淀的固体分离为球粒。通过SDS-PAGE分析监测重组CA蛋白质表达和成功的纯化。

实例2

Logatchev CA的定点突变体在枯草芽孢杆菌中的克隆和表达

如实例1中所述那样构建表达Logatchev CA骨架的pLogatchev质粒。基于来自实例1的表达构建体，我们在基因中引入了定点突变，以甚至进一步优化CA酶的热稳定性。通过根据表1在大肠杆菌TOP10中进行融合中的多片段克隆将突变引入到Logatchev CA氨基酸序列中，以产生变体1、变体2、变体3和变体4。将所有构建体用碱性蛋白酶信号肽构建，转化到枯草芽孢杆菌中并且如实例1所述那样重组表达。

通过SDS-PAGE分析Logatchev CA及其变体的表达水平。视觉检查凝胶显示突变对CA酶产率有很小影响，但是与SEQ ID NO:5相比，变体SEQ ID NO:9以较低的CA酶蛋白产率表达。

表1.Logatchev CA变体；Logatchev CA氨基酸序列中制得的突变。

碳酸酐酶	氨基酸序列	突变
			Logatchev CA	SEQ ID NO:5	野生型(无突变)
变体1	SEQ ID NO:6	I99V
			变体2	SEQ ID NO:7	R40S+I99V
变体3	SEQ ID NO:8	R40S+G56L+I99V
			变体4	SEQ ID NO:9	D19F+K21R+R40S+G56L+I99V

实例3

碳酸酐酶活性的检测

通过Wilbur和Anderson(Wilbur和Anderson,1948,Electrometric andcolorimetric determination of carbonic anhydrase[碳酸酐酶的电测法和比色法测定],J.Biol.Chem.[生物化学杂志]176:147-154)描述了用于检测CA活性的测试，并且如WO2012/025577中进一步描述的那样进行。简而言之，该测试通过检测并行的质子释放来监测CO₂与水之间的反应速率。例如，通过将溶液的pH变为定义的终点pH所需的时间，或通过测量溶液中的pH指示剂变为定义的终点颜色所需的时间来测量质子的释放速率。在作为催化剂的CA存在下，与未催化的反应相比，到达终点所需的时间更少。一个单位是在Wilbur之后被定义[1U＝(1/tc)-(1/tu)×1000]，其中U是单位并且tc和tu分别代表按秒计对于催化的和未催化的反应的时间。这些单位也叫做Wilbur-Anderson单位(WAU)。

如实例1和其中的参考文献所述，将来自表达野生型Logatchev CA的枯草芽孢杆菌细胞的无细胞培养液和包含表1中所述变体的无细胞培养液的样品在80摄氏度下热处理15分钟。对于每种变体独立地测量酶活性，并且将每种变体的对应酶促CA活性标准化为基于如通过SDS-PAGE测定的蛋白质产率的蛋白质浓度(表2)。每种CA变体显示出显著的WAU活性，这清楚地表明每种变体均具有碳酸酐酶活性。与野生型相比，变体1、变体2和变体3显示出相对WAU活性的增加，这表明改善了催化效率。因为在测量酶活性之前施用热处理，所以变体1、变体2和变体3的改善的相对WAU活性与这些变体与野生型相比改善的热稳定性一致。变体4也具有显著的WAU活性，但是与野生型相比具有稍低的相对WAU活性，这可能是由于与野生型相比，变体4的催化效率稍低或热稳定性较低。

表2.Logatchev CA和变体的碳酸酐酶活性。

碳酸酐酶	WAU	相对WAU
			Logatchev CA(野生型)	750	100％
变体1	790	105％
			变体2	880	117％
变体3	890	119％
			变体4	650	87％

实例4

Logatchev CA及其变体的热稳定性

将重组Logatchev CA及其变体的热稳定性通过热转移测定(TSA)在pH 7下来测定。使用在具有以下组成的缓冲液中稀释至0.3mg/mL的酶样品进行TSA评价：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM甘氨酸，150mM KCl，1mM CaCl₂，0.01％Triton X100，调节pH至7。将SYPRO橙染料(生命技术公司(Life Technologies)S6650)在Milli-Q水中稀释101倍。将稀释的酶样品(10μL)、测定缓冲液(10μL)和染料(10μL)在TSA板(LightCycler 480多孔板96，白色，罗氏公司(Roche))的孔中混合在一起并且用光学密封件(LightCycler 480密封箔，罗氏公司)覆盖。在运行罗氏LightCycler 480软件(版本1.5.0SP4)的罗氏Lightcycler480II机器中，在25℃-99℃下以200℃/h进行蛋白质解链分析。一式两份分析所有样品。报告的读取是T_m，该T_m定义为蛋白质解链曲线的中点值。

Logatchev CA的热稳定性对于变体1和变体2得以保持，而对于变体3和变体4存在降低(表3)。尽管变体3的中点解链温度与野生型相比略低，但相对WAU活性(实例3)更高，这表明取代提供了效率改善，并对热稳定性的影响有限。

表3.通过TSA测定热稳定性；通过TSA测定的在pH 7下野生型和变体的解链温度(T_m)。

碳酸酐酶	Tm
		Logatchev CA(野生型)	91℃
变体1	91℃
		变体2	91℃
变体3	86℃
		变体4	84℃

实例5

Logatchev CA在高离子强度碱性溶剂中的热稳定性

将高离子强度碱性溶剂用于CO₂捕获应用中。通过差示扫描量热法(DSC)测定重组Logatchev CA的热稳定性。将样品在pH 8、9或10的1.5M甘氨酸缓冲液中稀释至大约1mg/mL，并且通过以200℃/小时从20℃-120℃进行扫描测定热中点(T_m)。结果(表4)显示Logatchev CA(SEQ ID NO:5)在测试的完全pH范围内具有非常好的热稳定性，其中T_m>90℃，并且在pH 10下热稳定性最高。

表4.通过DSC测定热稳定性；通过DSC测定在pH 8、9或10下的1.5M甘氨酸中Logatchev CA的解链温度。

实例6

Logatchev CA相比于Persephonella marina DSM 14350CA的比活性

比活性是样品中存在的每物理量的酶的酶活性的量度。为了改善酶量测定的准确度，首先纯化Logatchev CA(SEQ ID NO:5)和WO 2012/025577中描述的Persephonellamarina DSM 14350CA的样品以去除污染物质。然后经由氨基酸分析测定酶量，该氨基酸分析是一种定量样品中存在的氨基酸并将其与基础的酶氨基酸序列比对以便定量酶量的技术。使用类似于实例3中所述的方法测量酶活性，但进行了修改以使用电子制表程序计算针对催化和未催化的反应的反应速率以便测定酶的活性(如US 2016/0010142中所述)。

Logatchev CA的比活性被测定为比P.marina CA高1.4倍，这表明相对于P.marinaCA，实现目标酶活性所需的总Logatchev CA较少。

实例7

在盐存在下Logatchev CA的稳定活性增强

离子的存在可以改善蛋白质的稳定性和活性。将含有Logatchev CA(SEQ ID NO:5)的水性样品在0.3M NaCl中稀释10倍，并且在环境温度(大约20℃)或40℃下孵育一周。在测试期开始(第0天)和在第1、2、5和7天取出样品。使用如实例6中所述的方法测量CA活性。剩余活性百分比是针对每种温度处理相对于第0天样品的活性计算的。结果(表5)显示，与第0天参考相比，在0.3M NaCl存在下孵育的样品实现了稳定的活性增强，通过剩余活性百分比增加明显看出的。因此，在0.3M NaCl存在下，Logatchev CA在不同温度下的活性得到改善。

表5.活性增强。在环境温度和40℃下，在0.3M NaCl添加存在下Logatchev CA随时间的剩余活性百分比。

本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等效方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，对于本领域的技术人员而言本发明的各种修改将从前述的说明书变得显而易见。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

序列表

<110> 诺维信公司

<120> 热稳定性宏基因组碳酸酐酶及其用途

<130> 14215-WO-PCT

<160> 9

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 宏基因组序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(732)

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(54)

<220>

<221> 成熟肽

<222> (55)..(732)

<400> 1

atg aag aaa ctt gca ttt att atc ttc tca ctg aca att gga aca gtt 48

Met Lys Lys Leu Ala Phe Ile Ile Phe Ser Leu Thr Ile Gly Thr Val

-15 -10 -5

att gcg gga gga gta ggc cac tgg agt tat cac gga gaa aca ggt cca 96

Ile Ala Gly Gly Val Gly His Trp Ser Tyr His Gly Glu Thr Gly Pro

-1 1 5 10

cag cac tgg gga gac ctt aaa aat gag tat atc atg tgt aaa atc ggg 144

Gln His Trp Gly Asp Leu Lys Asn Glu Tyr Ile Met Cys Lys Ile Gly

15 20 25 30

aaa aat cag tct cct gtt gac atc tca cga ata gtt gag gca gag ttg 192

Lys Asn Gln Ser Pro Val Asp Ile Ser Arg Ile Val Glu Ala Glu Leu

35 40 45

gaa aaa atc aaa ata aac tac tcc agt ggt gga agc tcc ata aca aat 240

Glu Lys Ile Lys Ile Asn Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ile Thr Asn

50 55 60

aat ggc cac act ata aag gtc agc tac gaa ccg gga agc tat att att 288

Asn Gly His Thr Ile Lys Val Ser Tyr Glu Pro Gly Ser Tyr Ile Ile

65 70 75

gtt gac ggt att cgt ttt gag ctg aaa cag ttt cac ttc cat gca cca 336

Val Asp Gly Ile Arg Phe Glu Leu Lys Gln Phe His Phe His Ala Pro

80 85 90

agt gaa cac aca ata aaa ggt aag tct tat cct ttt gaa gct cac ttt 384

Ser Glu His Thr Ile Lys Gly Lys Ser Tyr Pro Phe Glu Ala His Phe

95 100 105 110

gtt cac gca gac aaa gac ggt aat ctg gct gta att ggt gtg att ttc 432

Val His Ala Asp Lys Asp Gly Asn Leu Ala Val Ile Gly Val Ile Phe

115 120 125

aaa gag gga aag aaa aac cca att att gag aag ata tgg gaa aac ctg 480

Lys Glu Gly Lys Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Ile Trp Glu Asn Leu

130 135 140

cct gaa gct gga aaa aca atc aaa ctt gct cac aaa ata aat gct tat 528

Pro Glu Ala Gly Lys Thr Ile Lys Leu Ala His Lys Ile Asn Ala Tyr

145 150 155

gac ctt tta cct aaa aaa aag aag tac tac aga tac agt ggc tct tta 576

Asp Leu Leu Pro Lys Lys Lys Lys Tyr Tyr Arg Tyr Ser Gly Ser Leu

160 165 170

aca act cct cca tgt tct gaa ggt gta aga tgg att gtg atg gaa gag 624

Thr Thr Pro Pro Cys Ser Glu Gly Val Arg Trp Ile Val Met Glu Glu

175 180 185 190

gaa atg gaa ctt tct aaa gag cag att gag aaa ttc aga aaa ctg atg 672

Glu Met Glu Leu Ser Lys Glu Gln Ile Glu Lys Phe Arg Lys Leu Met

195 200 205

gga gga gat acc aac aga cct gtg caa cca ctg aac gca agg atg att 720

Gly Gly Asp Thr Asn Arg Pro Val Gln Pro Leu Asn Ala Arg Met Ile

210 215 220

atg gaa atg gat taa 735

Met Glu Met Asp

225

<210> 2

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

Met Lys Lys Leu Ala Phe Ile Ile Phe Ser Leu Thr Ile Gly Thr Val

-15 -10 -5

Ile Ala Gly Gly Val Gly His Trp Ser Tyr His Gly Glu Thr Gly Pro

-1 1 5 10

Gln His Trp Gly Asp Leu Lys Asn Glu Tyr Ile Met Cys Lys Ile Gly

15 20 25 30

Lys Asn Gln Ser Pro Val Asp Ile Ser Arg Ile Val Glu Ala Glu Leu

35 40 45

Glu Lys Ile Lys Ile Asn Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ile Thr Asn

50 55 60

Asn Gly His Thr Ile Lys Val Ser Tyr Glu Pro Gly Ser Tyr Ile Ile

65 70 75

Val Asp Gly Ile Arg Phe Glu Leu Lys Gln Phe His Phe His Ala Pro

80 85 90

Ser Glu His Thr Ile Lys Gly Lys Ser Tyr Pro Phe Glu Ala His Phe

95 100 105 110

Val His Ala Asp Lys Asp Gly Asn Leu Ala Val Ile Gly Val Ile Phe

115 120 125

Lys Glu Gly Lys Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Ile Trp Glu Asn Leu

130 135 140

Pro Glu Ala Gly Lys Thr Ile Lys Leu Ala His Lys Ile Asn Ala Tyr

145 150 155

Asp Leu Leu Pro Lys Lys Lys Lys Tyr Tyr Arg Tyr Ser Gly Ser Leu

160 165 170

Thr Thr Pro Pro Cys Ser Glu Gly Val Arg Trp Ile Val Met Glu Glu

175 180 185 190

Glu Met Glu Leu Ser Lys Glu Gln Ile Glu Lys Phe Arg Lys Leu Met

195 200 205

Gly Gly Asp Thr Asn Arg Pro Val Gln Pro Leu Asn Ala Arg Met Ile

210 215 220

Met Glu Met Asp

225

<210> 3

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 具有信号肽的密码子优化基因

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(759)

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(81)

<220>

<221> 成熟肽

<222> (82)..(759)

<400> 3

atg aag aaa ccg ttg ggg aaa att gtc gca agc acc gca cta ctc att 48

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile

-25 -20 -15

tct gtt gct ttt agt tca tcg ata gca tca gca ggc gga gtt ggc cat 96

Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Gly Gly Val Gly His

-10 -5 -1 1 5

tgg tca tat cat ggc gaa aca gga ccg caa cat tgg gga gat ctg aaa 144

Trp Ser Tyr His Gly Glu Thr Gly Pro Gln His Trp Gly Asp Leu Lys

10 15 20

aat gaa tac atc atg tgc aaa atc ggc aaa aat caa tca ccg gtc gat 192

Asn Glu Tyr Ile Met Cys Lys Ile Gly Lys Asn Gln Ser Pro Val Asp

25 30 35

att agc aga att gtt gaa gca gaa ctg gaa aaa atc aaa atc aac tat 240

Ile Ser Arg Ile Val Glu Ala Glu Leu Glu Lys Ile Lys Ile Asn Tyr

40 45 50

tca tca ggc gga agc agc att aca aat aac ggc cat aca atc aaa gtc 288

Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ile Thr Asn Asn Gly His Thr Ile Lys Val

55 60 65

agc tat gaa ccg gga agc tat att atc gtt gat ggc att cgc ttt gaa 336

Ser Tyr Glu Pro Gly Ser Tyr Ile Ile Val Asp Gly Ile Arg Phe Glu

70 75 80 85

ctg aaa cag ttt cat ttt cat gca ccg agc gaa cat acg att aaa ggc 384

Leu Lys Gln Phe His Phe His Ala Pro Ser Glu His Thr Ile Lys Gly

90 95 100

aaa tca tat ccg ttt gaa gcg cat ttt gtt cat gca gat aaa gat ggc 432

Lys Ser Tyr Pro Phe Glu Ala His Phe Val His Ala Asp Lys Asp Gly

105 110 115

aat ctg gca gtt att ggc gtc atc ttt aaa gaa ggc aaa aaa aac ccg 480

Asn Leu Ala Val Ile Gly Val Ile Phe Lys Glu Gly Lys Lys Asn Pro

120 125 130

atc atc gaa aaa atc tgg gaa aat ctg ccg gaa gca ggc aaa aca att 528

Ile Ile Glu Lys Ile Trp Glu Asn Leu Pro Glu Ala Gly Lys Thr Ile

135 140 145

aaa ctg gca cat aaa atc aat gcg tat gac ctg ctg ccg aag aaa aaa 576

Lys Leu Ala His Lys Ile Asn Ala Tyr Asp Leu Leu Pro Lys Lys Lys

150 155 160 165

aaa tat tat aga tat agc ggc agc ctg aca aca ccg cct tgc agc gaa 624

Lys Tyr Tyr Arg Tyr Ser Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys Ser Glu

170 175 180

ggc gtt aga tgg att gtt atg gaa gaa gaa atg gaa ctg agc aaa gaa 672

Gly Val Arg Trp Ile Val Met Glu Glu Glu Met Glu Leu Ser Lys Glu

185 190 195

caa atc gaa aaa ttt cgc aaa ctg atg gga ggc gat aca aat aga ccg 720

Gln Ile Glu Lys Phe Arg Lys Leu Met Gly Gly Asp Thr Asn Arg Pro

200 205 210

gtt caa ccg ctg aat gca aga atg att atg gaa atg gat taa 762

Val Gln Pro Leu Asn Ala Arg Met Ile Met Glu Met Asp

215 220 225

<210> 4

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile

-25 -20 -15

Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Gly Gly Val Gly His

-10 -5 -1 1 5

Trp Ser Tyr His Gly Glu Thr Gly Pro Gln His Trp Gly Asp Leu Lys

10 15 20

Asn Glu Tyr Ile Met Cys Lys Ile Gly Lys Asn Gln Ser Pro Val Asp

25 30 35

Ile Ser Arg Ile Val Glu Ala Glu Leu Glu Lys Ile Lys Ile Asn Tyr

40 45 50

Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ile Thr Asn Asn Gly His Thr Ile Lys Val

55 60 65

Ser Tyr Glu Pro Gly Ser Tyr Ile Ile Val Asp Gly Ile Arg Phe Glu

70 75 80 85

Leu Lys Gln Phe His Phe His Ala Pro Ser Glu His Thr Ile Lys Gly

90 95 100

Lys Ser Tyr Pro Phe Glu Ala His Phe Val His Ala Asp Lys Asp Gly

105 110 115

Asn Leu Ala Val Ile Gly Val Ile Phe Lys Glu Gly Lys Lys Asn Pro

120 125 130

Ile Ile Glu Lys Ile Trp Glu Asn Leu Pro Glu Ala Gly Lys Thr Ile

135 140 145

Lys Leu Ala His Lys Ile Asn Ala Tyr Asp Leu Leu Pro Lys Lys Lys

150 155 160 165

Lys Tyr Tyr Arg Tyr Ser Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys Ser Glu

170 175 180

Gly Val Arg Trp Ile Val Met Glu Glu Glu Met Glu Leu Ser Lys Glu

185 190 195

Gln Ile Glu Lys Phe Arg Lys Leu Met Gly Gly Asp Thr Asn Arg Pro

200 205 210

Val Gln Pro Leu Asn Ala Arg Met Ile Met Glu Met Asp

215 220 225

<210> 5

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 成熟的 Logatchev CA序列

<400> 5

Gly Gly Val Gly His Trp Ser Tyr His Gly Glu Thr Gly Pro Gln His

1 5 10 15

Trp Gly Asp Leu Lys Asn Glu Tyr Ile Met Cys Lys Ile Gly Lys Asn

20 25 30

Gln Ser Pro Val Asp Ile Ser Arg Ile Val Glu Ala Glu Leu Glu Lys

35 40 45

Ile Lys Ile Asn Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ile Thr Asn Asn Gly

50 55 60

His Thr Ile Lys Val Ser Tyr Glu Pro Gly Ser Tyr Ile Ile Val Asp

65 70 75 80

Gly Ile Arg Phe Glu Leu Lys Gln Phe His Phe His Ala Pro Ser Glu

85 90 95

His Thr Ile Lys Gly Lys Ser Tyr Pro Phe Glu Ala His Phe Val His

100 105 110

Ala Asp Lys Asp Gly Asn Leu Ala Val Ile Gly Val Ile Phe Lys Glu

115 120 125

Gly Lys Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Ile Trp Glu Asn Leu Pro Glu

130 135 140

Ala Gly Lys Thr Ile Lys Leu Ala His Lys Ile Asn Ala Tyr Asp Leu

145 150 155 160

Leu Pro Lys Lys Lys Lys Tyr Tyr Arg Tyr Ser Gly Ser Leu Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Cys Ser Glu Gly Val Arg Trp Ile Val Met Glu Glu Glu Met

180 185 190

Glu Leu Ser Lys Glu Gln Ile Glu Lys Phe Arg Lys Leu Met Gly Gly

195 200 205

Asp Thr Asn Arg Pro Val Gln Pro Leu Asn Ala Arg Met Ile Met Glu

210 215 220

Met Asp

225

<210> 6

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 具有I99V突变的Logatchev CA变体

<400> 6

Gly Gly Val Gly His Trp Ser Tyr His Gly Glu Thr Gly Pro Gln His

1 5 10 15

Trp Gly Asp Leu Lys Asn Glu Tyr Ile Met Cys Lys Ile Gly Lys Asn

20 25 30

Gln Ser Pro Val Asp Ile Ser Arg Ile Val Glu Ala Glu Leu Glu Lys

35 40 45

Ile Lys Ile Asn Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ile Thr Asn Asn Gly

50 55 60

His Thr Ile Lys Val Ser Tyr Glu Pro Gly Ser Tyr Ile Ile Val Asp

65 70 75 80

Gly Ile Arg Phe Glu Leu Lys Gln Phe His Phe His Ala Pro Ser Glu

85 90 95

His Thr Val Lys Gly Lys Ser Tyr Pro Phe Glu Ala His Phe Val His

100 105 110

Ala Asp Lys Asp Gly Asn Leu Ala Val Ile Gly Val Ile Phe Lys Glu

115 120 125

Gly Lys Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Ile Trp Glu Asn Leu Pro Glu

130 135 140

Ala Gly Lys Thr Ile Lys Leu Ala His Lys Ile Asn Ala Tyr Asp Leu

145 150 155 160

Leu Pro Lys Lys Lys Lys Tyr Tyr Arg Tyr Ser Gly Ser Leu Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Cys Ser Glu Gly Val Arg Trp Ile Val Met Glu Glu Glu Met

180 185 190

Glu Leu Ser Lys Glu Gln Ile Glu Lys Phe Arg Lys Leu Met Gly Gly

195 200 205

Asp Thr Asn Arg Pro Val Gln Pro Leu Asn Ala Arg Met Ile Met Glu

210 215 220

Met Asp

225

<210> 7

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 具有R40S+I99V突变的Logatchev CA变体

<400> 7

Gly Gly Val Gly His Trp Ser Tyr His Gly Glu Thr Gly Pro Gln His

1 5 10 15

Trp Gly Asp Leu Lys Asn Glu Tyr Ile Met Cys Lys Ile Gly Lys Asn

20 25 30

Gln Ser Pro Val Asp Ile Ser Ser Ile Val Glu Ala Glu Leu Glu Lys

35 40 45

Ile Lys Ile Asn Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ile Thr Asn Asn Gly

50 55 60

His Thr Ile Lys Val Ser Tyr Glu Pro Gly Ser Tyr Ile Ile Val Asp

65 70 75 80

Gly Ile Arg Phe Glu Leu Lys Gln Phe His Phe His Ala Pro Ser Glu

85 90 95

His Thr Val Lys Gly Lys Ser Tyr Pro Phe Glu Ala His Phe Val His

100 105 110

Ala Asp Lys Asp Gly Asn Leu Ala Val Ile Gly Val Ile Phe Lys Glu

115 120 125

Gly Lys Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Ile Trp Glu Asn Leu Pro Glu

130 135 140

Ala Gly Lys Thr Ile Lys Leu Ala His Lys Ile Asn Ala Tyr Asp Leu

145 150 155 160

Leu Pro Lys Lys Lys Lys Tyr Tyr Arg Tyr Ser Gly Ser Leu Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Cys Ser Glu Gly Val Arg Trp Ile Val Met Glu Glu Glu Met

180 185 190

Glu Leu Ser Lys Glu Gln Ile Glu Lys Phe Arg Lys Leu Met Gly Gly

195 200 205

Asp Thr Asn Arg Pro Val Gln Pro Leu Asn Ala Arg Met Ile Met Glu

210 215 220

Met Asp

225

<210> 8

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 具有R40S+G56L+I99V突变的Logatchev CA变体

<400> 8

Gly Gly Val Gly His Trp Ser Tyr His Gly Glu Thr Gly Pro Gln His

1 5 10 15

Trp Gly Asp Leu Lys Asn Glu Tyr Ile Met Cys Lys Ile Gly Lys Asn

20 25 30

Gln Ser Pro Val Asp Ile Ser Ser Ile Val Glu Ala Glu Leu Glu Lys

35 40 45

Ile Lys Ile Asn Tyr Ser Ser Leu Gly Ser Ser Ile Thr Asn Asn Gly

50 55 60

His Thr Ile Lys Val Ser Tyr Glu Pro Gly Ser Tyr Ile Ile Val Asp

65 70 75 80

Gly Ile Arg Phe Glu Leu Lys Gln Phe His Phe His Ala Pro Ser Glu

85 90 95

His Thr Val Lys Gly Lys Ser Tyr Pro Phe Glu Ala His Phe Val His

100 105 110

Ala Asp Lys Asp Gly Asn Leu Ala Val Ile Gly Val Ile Phe Lys Glu

115 120 125

Gly Lys Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Ile Trp Glu Asn Leu Pro Glu

130 135 140

Ala Gly Lys Thr Ile Lys Leu Ala His Lys Ile Asn Ala Tyr Asp Leu

145 150 155 160

Leu Pro Lys Lys Lys Lys Tyr Tyr Arg Tyr Ser Gly Ser Leu Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Cys Ser Glu Gly Val Arg Trp Ile Val Met Glu Glu Glu Met

180 185 190

Glu Leu Ser Lys Glu Gln Ile Glu Lys Phe Arg Lys Leu Met Gly Gly

195 200 205

Asp Thr Asn Arg Pro Val Gln Pro Leu Asn Ala Arg Met Ile Met Glu

210 215 220

Met Asp

225

<210> 9

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 具有D19F+K21R+R40S+G56L+I99V突变的 Logatchev CA变体

<400> 9

Gly Gly Val Gly His Trp Ser Tyr His Gly Glu Thr Gly Pro Gln His

1 5 10 15

Trp Gly Phe Leu Arg Asn Glu Tyr Ile Met Cys Lys Ile Gly Lys Asn

20 25 30

Gln Ser Pro Val Asp Ile Ser Ser Ile Val Glu Ala Glu Leu Glu Lys

35 40 45

Ile Lys Ile Asn Tyr Ser Ser Leu Gly Ser Ser Ile Thr Asn Asn Gly

50 55 60

His Thr Ile Lys Val Ser Tyr Glu Pro Gly Ser Tyr Ile Ile Val Asp

65 70 75 80

Gly Ile Arg Phe Glu Leu Lys Gln Phe His Phe His Ala Pro Ser Glu

85 90 95

His Thr Val Lys Gly Lys Ser Tyr Pro Phe Glu Ala His Phe Val His

100 105 110

Ala Asp Lys Asp Gly Asn Leu Ala Val Ile Gly Val Ile Phe Lys Glu

115 120 125

Gly Lys Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Ile Trp Glu Asn Leu Pro Glu

130 135 140

Ala Gly Lys Thr Ile Lys Leu Ala His Lys Ile Asn Ala Tyr Asp Leu

145 150 155 160

Leu Pro Lys Lys Lys Lys Tyr Tyr Arg Tyr Ser Gly Ser Leu Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Cys Ser Glu Gly Val Arg Trp Ile Val Met Glu Glu Glu Met

180 185 190

Glu Leu Ser Lys Glu Gln Ile Glu Lys Phe Arg Lys Leu Met Gly Gly

195 200 205

Asp Thr Asn Arg Pro Val Gln Pro Leu Asn Ala Arg Met Ile Met Glu

210 215 220

Met Asp

225

Claims (28)

1.一种具有碳酸酐酶活性的多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ IDNO:7，SEQ ID NO:8，或SEQ ID NO:9。

2.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1所述的多肽。

3.一种核酸构建体，该核酸构建体包含如权利要求2所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。

4.表达载体，该表达载体包含如权利要求2所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。

5.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如权利要求2所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。

6.一种产生具有碳酸酐酶活性的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求5所述的宿主细胞。

7.如权利要求6所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。

8.细胞培养组合物，该细胞培养组合物包含如权利要求1中所述的多肽。

9.包含如权利要求1中所述的多肽的全培养液配制品。

10.一种组合物，该组合物包含如权利要求1中所述的多肽。

11.如权利要求10所述的组合物，该组合物是液体、固体或半固体组合物。

12.如权利要求11所述的组合物，该组合物进一步包含赋形剂。

13.一种组合物，该组合物包含如权利要求1中所述的多肽，其中该多肽与适于固定化的基质一起被固定。

14.一种组合物，该组合物包含如权利要求1中所述的多肽，其中该多肽被固定在适于固定化的基质上。

15.一种组合物，该组合物包含如权利要求1中所述的多肽，其中该多肽被固定在适于固定化的基质中。

16.如权利要求13-15中任一项所述的组合物，其中该基质是选自下组的基质，该组由以下组成：聚合物、凝胶、胶囊、珠粒、织物、纤维、膜、多孔表面、棒、和管。

17.如权利要求16所述的组合物，其中该基质选自中空纤维和微粒的组。

18.一种用于从含有二氧化碳的介质中提取二氧化碳的方法，该方法包括使该含有二氧化碳的介质与如权利要求1中所述的多肽接触。

19.如权利要求18所述的方法，其中该含有二氧化碳的介质是气体或多相混合物。

20.如权利要求19所述的方法，其中含有二氧化碳的介质是原天然气、合成气、沼气、呼吸气体、大气气体、或从燃烧排放出的气体或多相混合物。

21.如权利要求20所述的方法，其中含有二氧化碳的介质是烟道气。

22.如权利要求18或19所述的方法，其中该含有二氧化碳的介质是含有碳酸氢盐的液体并且该二氧化碳提取是碳酸氢盐向二氧化碳的转化。

23.如权利要求18-19中任一项所述的方法，其中该含有二氧化碳的介质进一步包含基于碳酸盐的化合物或基于胺的化合物。

24.如权利要求23所述的方法，其中基于碳酸盐的化合物或基于胺的化合物是碳酸钠、碳酸钾、氨基酸、Tris或MDEA。

25.如权利要求24所述的方法，其中氨基酸是修饰的氨基酸。

26.一种水性二氧化碳吸收溶液，该溶液包含如权利要求1中所述的多肽、和基于碳酸盐的化合物或基于胺的化合物。

27.权利要求26的水性二氧化碳吸收溶液，其中基于碳酸盐的化合物或基于胺的化合物是碳酸钠、碳酸钾、氨基酸、Tris或MDEA。

28.权利要求27的水性二氧化碳吸收溶液，其中氨基酸是修饰的氨基酸。

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