KR102658830B1 - 내열성 탄산무수화효소 변이체 및 이를 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 80℃의 고온에서 내열성을 가지면서 높은 이산화탄소 포집 활성을 가지는 탄산무수화효소 변이체 및 이를 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 내열성 탄산무수화효소 변이체는 고온에서의 안정성이 높고 이산화탄소 수화 속도가 빨라 고온의 이산화탄소 포집 공정에 적용 가능하다.
Description
본 발명은 내열성 탄산무수화효소 변이체 및 이를 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 80℃의 고온에서 내열성을 가지면서 높은 이산화탄소 포집 활성을 가지는 탄산무수화효소 변이체 및 이를 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물에 관한 것이다.
탄산무수화효소는 Zinc 이온을 포함하고 있는 금속 효소 (metalloenzyme)로써 이산화탄소의 수화 반응을 빠르게 촉진시킨다. 탄산무수화 효소는 하기와 같이 이산화탄소와 친핵반응을 하여 bicarbonate를 형성한 후 물에 의해 교환되는 방법으로 bicarbonate의 생성을 크게 촉진한다(G Puxty et al Environ Sci Technol 43: 6427, 2009; A Veawab et al Ind Eng Chem Res 38:3917, 1999).
E,ZnH2O ↔E,ZnOH- + H+
E,ZnOH- + CO2 ↔E,ZnHCO3 2-
E,ZnHCO3 2- + H2O ↔E,ZnH2O + HCO3 2-
상기 반응을 자연적인 반응 속도보다 최대 천만 배 더 빠르게 촉진시키지만 실제 공정 적용에 있어서 생산성 단가를 낮추는 것과 재생탑 고온에서의 효소 안정성을 높여야 하는 문제점이 있다.
따라서, 통상적으로 업계에서 사용하는 40 ~ 60℃정도에서의 내열성을 가지는 탄산무수화효소가 아니라, 실제 재생탑에서 적용 가능한 80℃ 이상에서 안정한 효소의 개발이 절실히 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 80℃ 이상의 고온에서 높은 이산화탄소 포집 활성을 장기간 유지하는 탄산무수화효소를 개발하기 위하여, 예의 노력한 결과, 설폴로발레 아케온(Sulfolobales archaeon) AZ1 유래 KJR78985.1 단백질의 변이체를 제작하고, 상기 변이체가 80℃ 이상의 고온에서 높은 이산화탄소 포집 활성을 장기간 유지하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 80℃ 이상의 고온에서 높은 이산화탄소 포집 활성을 장기간 유지하는 탄산무수화효소 변이체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 탄산무수화효소 변이체를 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 A58G 변이를 포함하는 탄산무수화효소 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 탄산무수화효소 변이체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 탄산무수화효소 변이체를 생산하는 단계; 및 (b) 상기 생산된 탄산무수화효소 변이체를 수득하는 단계를 포함하는 탄산무수화효소 변이체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 탄산무수화효소 변이체를 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 탄산무수화효소 변이체를 이용하여 40~90℃에서 이산화탄소를 포집하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 내열성 탄산무수화효소 변이체는 고온에서의 안정성이 높고 이산화탄소 수화 속도가 빨라 고온의 이산화탄소 포집 공정에 적용 가능하다.
도 1은 야생형 탄산무수화효소를 세포질에 발현한 후 세포파쇄액 및 정제 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 정제된 야생형 탄산무수화효소의 이산화탄소 포집 활성을 농도별 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 탄산무수화효소 변이체를 세포질에 발현한 후 세포파쇄액 및 정제 단백질의 SDS-PAGE를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 정제된 탄산무수화효소 변이체의 SDS-PAGE분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 정제된 탄산무수화효소 변이체 1.0의 이산화탄소 포집 활성을 농도별 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 정제된 탄산무수화효소 변이체 13.0의 이산화탄소 포집 활성을 농도별 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 정제된 야생형 탄산무수화효소의 이산화탄소 포집 활성을 농도별 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 탄산무수화효소 변이체를 세포질에 발현한 후 세포파쇄액 및 정제 단백질의 SDS-PAGE를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 정제된 탄산무수화효소 변이체의 SDS-PAGE분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 정제된 탄산무수화효소 변이체 1.0의 이산화탄소 포집 활성을 농도별 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 정제된 탄산무수화효소 변이체 13.0의 이산화탄소 포집 활성을 농도별 측정한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명에서는 이산화탄소 포집 공정에 적용하기 위하여, 이산화탄소 포집 후 탈착 온도인 80℃의 고온에서 안정성이 높고 활성도 높으며 대장균 발현 시스템을 이용하여 대량생산이 가능한 탄산무수화효소를 개발하였다.
본 발명의 일 양태에서는 Sulfolobales archaeon AZ1 유래 KJR78985.1 단백질을 발현하는 재조합 대장균을 제작하여, S.archaeon AZ1 유래 야생형 탄산무수화효소를 제조하고, 이의 내열성 및 이산화탄소 포집활성을 확인하였으며, 상기 야생형 탄산무수화효소의 활성부위를 확인하여 Site-Directed Mutagenesis를 통해 활성부위 아미노산을 치환한 탄산무수화효소 변이체를 제작하였으며, 제작된 탄산무수화효소 변이체가 야생형보다 높은 이산화탄소 포집활성을 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 A58G 변이를 포함하는 탄산무수화효소 변이체에 관한 것이다.
본 발명의 일양태에서는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 A58G 변이를 포함하는 변이체 1.0을 제작하였으며, 변이체 1.0에서 P53G 변이를 추가로 포함하는 탄산무수화효소 변이체 13.0을 제작하였다.
야생형 탄산무수화효소 변이체 아미노산 서열(서열번호 1)
MRVIMSCMDYRLTEEIMKKMDQNTIVLRNAGANVNEFKDILKSLNPDEVVYLPHTDCAAMKLVLSSVKQGEQVTPKIESSLVSQFRGRQFNDLKELEELNLKLGLETIKQVVPKAKVISELIDVNKLKWPERKPVVYLLKSTSKYTNEMIGGYVIQSMNKTSIEADLEIASKLNLKVVKDEFSNARD
변이체 1.0 아미노산 서열(서열번호 2)
MRVIMSCMDYRLTEEIMKKMDQNTIVLRNAGANVNEFKDILKSLNPDEVVYLPHTDCGAMKLVLSSVKQGEQVTPKIESSLVSQFRGRQFNDLKELEELNLKLGLETIKQVVPKAKVISELIDVNKLKWPERKPVVYLLKSTSKYTNEMIGGYVIQSMNKTSIEADLEIASKLNLKVVKDEFSNARD
변이체 13.0 아미노산 서열(서열번호 3)
MRVIMSCMDYRLTEEIMKKMDQNTIVLRNAGANVNEFKDILKSLNPDEVVYLGHTDCGAMKLVLSSVKQGEQVTPKIESSLVSQFRGRQFNDLKELEELNLKLGLETIKQVVPKAKVISELIDVNKLKWPERKPVVYLLKSTSKYTNEMIGGYVIQSMNKTSIEADLEIASKLNLKVVKDEFSNARD
상기 2종류의 탄산무수화효소 변이체는 모두 야생형 효소보다 초기 반응속도가 포화되는 효소량이 적었으며, 변이체 1.0이 가장 높은 이산화탄소 포집 활성을 나타내었다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 탄산무수화효소 변이체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 탄산무수화효소 변이체는 재조합 미생물을 통하여 대량 생산할 수 있으며, 본 발명의 일양태에서는 탄산무수화효소 변이체를 코딩하는 핵산이 도입된 pET 벡터 시스템으로 형질전환된 재조합 대장균을 이용하여 탄산무수화효소 변이체를 생산하였다.
본 발명에서, 용어 “벡터 (vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드 (plasmid)” 및 “벡터 (vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.
“발현 조절 서열 (expression control sequence)”이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결 (operably linked)”된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 “발현 벡터”는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
본 발명의 목적 단백질의 DNA 서열을 발현시키기 위해 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열을 포함한다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 E. coli에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2μ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941이다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질전환”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질감염”은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
발명의 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 본 발명의 단백질을 코딩하는 cDNA를 클로닝할 때에는 동물세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 어류 기원의 CHSE-214, FHM, RTG-2 및 EPC를 예시하였으나 물론 이에 제한되는 것은 아니다. COS 세포를 이용하는 경우에는 COS 세포에서 SV40 라지 T안티겐(large T antigen)이 발현하고 있으므로 SV40의 복제개시점을 갖는 플라스미드는 세포중에서 다수 카피(copy)의 에피솜(episome)으로 존재하도록 되고 통상보다 고 발현이 기대될 수 있다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종으로부터 얻을 수 있거나, 숙주 세포와 다른 종의 것일 수 있거나, 또는 그것은 어떠한 이종 또는 상동성 DNA를 포함하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 단백질의 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다
또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 탄산무수화효소 변이체를 생산하는 단계; 및 (b) 상기 생산된 탄산무수화효소 변이체를 수득하는 단계를 포함하는 탄산무수화효소 변이체의 제조방법에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 탄산무수화효소 변이체를 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물 및 상기 탄산무수화효소 변이체를 이용하여 40~90℃에서 이산화탄소를 포집하는 방법에 관한 것이다.
상기 이산화탄소 포집용 조성물은 상기 탄산무수화효소 변이체, 상기 효소 변이체를 코딩하는 핵산으로 형질전환된 재조합 미생물, 상기 미생물의 파쇄물，또는 미생물 파쇄물의 추출물을 포함할 수 있다.
본 발명의 탄산무수화효소 변이체는 이산화탄소 포집 후 탈착 온도인 80ㅀ 고온에서 안정성이 높고 활성도 높으며 대장균 발현 시스템을 이용하여 대량생산이 가능하여 이산화탄소 포집 공정에 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 야생형 탄산무수화효소를 생산하는 재조합 대장균 제작
NCBI 데이터베이스의 유전정보를 토대로 설폴로발레 아케온(Sulfolobales archaeon) AZ1 유래 탄산무수화효소인 KJR78985.1 단백질을 코딩하는 핵산을 대장균에 발현되도록 코돈 최적화한 핵산을 합성 후 pUCIDT-AMP 벡터(Integrated DNA Technologies, 미국)에 삽입하였다. NdeI/XhoI 제한 효소를 이용하여 상기 탄산무수화효소 유전자를 코딩하는 핵산을 pET-28b(+) 벡터(Novagene, 미국)에 도입하여 재조합 발현벡터를 제조하였으며, pET-28b(+) 벡터에서 탄산무수화효소 유전자는 C-말단에 Ni 이온과 결합이 가능한 히스티틴 태그를 갖는다. 42℃에서 45초 열충격 방법으로 상기 재조합 벡터를 숙주세포인 대장균 BL21 (DE3)에 도입하였고, 재조합 벡터가 도입된 대장균은 kanamycin이 첨가된 LB 배지에서 선별하여 탄산무수화효소 유전자로 형질전환된 재조합 대장균을 제작하였다.
실시예 2: 야생 탄산무수화효소의 발현 및 정제
실시예 1에서 제작된 야생형 탄산무수화효소 유전자로 형질전환된 재조합 대장균을 100ml LB(+Kan) 배지에 접종하여, 37℃에서 18시간 배양하고, OD 0.4-0.6일 때 IPTG 1 mM을 첨가하여 37℃에서 5시간 추가로 배양하면서, 탄산무수화효소를 발현시켰다. 배양이 끝난 배양액을 수득하여, 4℃, 4500 rpm에서 원심분리하여 균체를 회수한 후 50mM PBS 버퍼(pH7.0)로 세척하고, Binding buffer 30 ml에 균체를 현탁한 후, 초음파 파쇄하였다(초음파 파쇄조건: 펄스 초 on/10초 off 12분 50% amplitude). 파쇄액은 12,000rpm, 4℃에서 20분 원심분리하여 상등액을 회수한 후 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 단백질을 정제하였다. 용출액은 초원심분리기(Amicon ultra)에 넣어 4000g, 30분 원심분리하였으며 20mM Tris-HCl, pH 8.0 버퍼 15 ml로 버퍼를 갈아주었다. 수득된 야생 탄산무수화효소는 BCA법으로 단백질 정량하였으며 정제된 9.3 mg/ml 농도의 효소 300㎕를 얻었다.
효소 정제에 사용한 버퍼시스템은 다음과 같다.
Binding buffer: 20mM Tris-HCl, 300mM NaCl, 20mM imidazole, (pH 8.0)
Wash buffer: 20mM Tris-HCl, 300mM NaCl, 50mM imidazole, (pH 8.0)
Elution buffer: 20mM Tris-HCl, 300mM NaCl, 250mM imidazole, (pH 8.0)
Buffer change용: 20mM Tris-HCl, 300mM NaCl(pH 8.0)
정제 전후의 탄산무수화 효소 발현을 SDS-PAGE를 통하여 분석한 결과를 도 1에 나타내었으며, 탄산무수화효소는 대장균의 세포질에서 성공적으로 발현되며 정제율 및 순도도 높음을 확인하였다. Μ은 분자량 표준 마커, T는 전체 세포파쇄액, S는 세포파쇄 상등액, P는 정제된 탄산무수화 단백질을 나타낸다.
실시예 3: 야생형 탄산무수화효소의 이산화탄소 포집 활성 확인
실시예 2에서 수득한 야생형 탄산무수화효소를 이용하여 이산화탄소 포집활성을 측정하였다. 탄산수 제조기 보틀에 1차 증류수를 넣고 탄산을 주입한 후 얼음을 채운 수조에서에서 2시간 정치하였다. 96웰 플레이트에 버퍼(20mM Tris-sulfate, pH8.3) 120μl, 0.04% BTB Solution (Sigma-Aldrich) 30μl, 증류수 40μl, 탄산무수화효소 용액 10μl를 넣은 후 탄산수 50μl를 첨가하여 610nm에서 흡광도를 2분 동안 측정하였다. 효소는 반응액 당 20μg, 10μg, 5μg, 2.5μg, 1.25μg, 0.625μg이 되도록 첨가하여 농도별로 측정하였으며, 그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이 5μg 첨가시 탄산수와의 반응속도가 늦어지는 것을 확인하였다. Blank는 탄산무수화효소가 들어가지 않은 비교군이다. 탄산무수화효소가 첨가된 실험군은 무첨가 비교군에 비해 pH가 빨리 떨어졌으며, 이는 탄산무수화효소의 이산화탄소 포집에 관한 활성이 높다는 것을 의미한다.
실시예 4. 야생형 탄산무수화효소의 내열성 및 안정성
야생형 탄산무수화효소의 내열성 및 안정성을 확인하기 위해, 실시예 2에서 수득한 탄산무수화효소를 80℃에서 보관하면서 주기적으로 이산화탄소 포집 활성 감소 정도를 측정하였다. 활성 측정방법은 실시예 3에서 사용한 방법을 이용하였다.
그 결과, 표 1에 나타난 바와같이, 효소 활성이 50% 감소하는 t/1/2 값이 20일인 것을 확인하였으며, 현재까지 보고된 탄산무수화효소보다 내열성이 강하며 안정성도 높은 것을 확인하였다.
| 탄산무수화효소 | TaCA | mDvCA | SspCA | SazCA | PmCA | 본 발명의 CA |
| 열안정성 (t1/2, day) |
77 day (60℃) | 42 day (60℃) | 8 day (70℃) | 8 day (70℃) | 3.6 hr (90℃) 1.46 hr (100℃) |
20 day (80℃) |
Reference: Anna Di Fiore et. al. Thermostable Carbonic Anhydrases in Biotechnological Applications; Int J Mol Sci. 2015 Jul 8;16(7):15456-80
실시예 5: 탄산무수화효소 변이체의 제작
실시예 3에서 수득한 Sulfolobales archaeon AZ1 유래 내열성 야생형 탄산무수화효소의 이산화탄소 포집활성을 증가시키기 위하여 효소의 활성부위를 분석한 결과 베타 타입의 탄산무수화효소에 속하며 아미노산 58번 위치의 활성 부위 글리신이 알라닌으로 되어 있음을 확인하여 알라닌을 글리신으로 치환하여 탄산무수화효소 변이체 1.0을 제작하였다. 추가로 58번 위치와 활성부위로 추정되는 53번의 프롤린을 글리신으로 치환환 효소 변이체 13.0을 제작하였다(표 2).
변이체는 QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent, USA)를 사용하여 PCR법으로 변이체를 제작하였으며 돌연변이된 아미노산 정보와 사용된 프라이머는 표 2 및 표 3에 나타내었다.
| |
position |
|||
| 위치 | 58 | 10 | 53 | |
| wild type | A | Y | P | |
| 1.0 | G | G | ||
| 13.0 | GG | G | G | |
| template | Sequence -F | Sequence -R | |
| 1.0 | Wild type | 5'-CAC ACC GAC TGC GGC GCG ATG AAA CTG-3' (서열번호 4) | 5'-CAG TTT CAT CGC GCC GCA GTC GGT GTG-3' (서열번호 5) |
| 13.0 | Mutant 1.0 | 5'-GTTGTGTACCTGGGCCACACCGACTG-3' (서열번호 6) | 5'-CAGTCGGTGTGGCCCAGGTACACAAC-3' (서열번호 7) |
제작된 변이체 유전자가 삽입된 백터를 42℃에서 45초 열충격하는 방법으로 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시킨 후, 백터가 도입된 형질전환 대장균을 kanamycin이 첨가된 LB 배지에서 선별하여 재조합 대장균을 제작하였다.
실시예 6: 탄산무수화효소 변이체의 발현 및 정제
탄산무수화효소 변이체는 실시예 2와 같은 방법으로 대장균에서 발현 및 정제하였고 SDS-PAGE 분석 결과, 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 재조합 대장균의 세포질에서 성공적으로 발현되고 정제율 및 순도가 높음을 확인하였다. Μ은 분자량 표준 마커, T는 전체 세포파쇄액, S는 세포파쇄 상등액을 나타낸다.
실시예 7: 탄산무수화효소 변이체의 이산화탄소 포집 활성
실시예 6에서 정제된 탄산무수화효소 변이체를 이용하여 이산화탄소 포집 활성올 측정하였다. 탄산수 제조기 보틀에 1차 증류수를 넣고 탄산을 주입한 후 얼음을 채운 수조에서 2시간 정치하였다. 96웰 플레이트에 버퍼(20mM Tris-sulfate, pH8.3) 120μl, BTB Solution 30μl, 증류수 40μl, 효소 10μl를 넣은 후 탄산 수 50μl를 넣고 610nm에서 흡광도를 2분 동안 측정하였다. 효소는 반응액 당 각각 20μg, 10μg, 5μg, 2.5μg 및 1.25μg 이 되게 첨가한 후, 농도별로 측정하였으며, 변이체 별 결과를 각각 도 5에 나타내었으며, 표 4에 효소 활성을 요약하여 나타내었다. 2종류 효소 변이체 모두 경우 야생형 효소보다 초기 반응속도가 포화되는 효소량이 적었으며, mutant 1.0이 가장 높은 이산화탄소 포집 활성을 나타내었다.
| Wild type | Mutant 1.0 | Mutant 13.0 | |
| 초기 반응속도 Saturation 효소양 [μg] | 10 | 2.5 | 2.5 |
| Wild type 대비 활성 증가 [배수] | - | 4 | 4 |
실시예 8: 탄산무수화효소 변이체의 내열성 및 안정성
탄산무수화효소 변이체와 야생형 탄산무수화효소의 내열성 및 안정성을 비교하기 위해, 실시예 6에서 수득한 탄산무수화효소를 80℃에서 보관하면서 주기적으로 이산화탄소 포집 활성 감소 정도를 측정하였다. 활성 측정방법은 실시예 3에서 사용한 방법을 이용하였다.
그 결과, 표 5에 나타난 바와같이, 효소 활성이 야생형 탄산무수화효소에 비해 변이체 1.0은 내열성이 31% 증가하고 변이체 13.0는 21% 증가한 것을 확인하였다.
| 탄산무수화 효소 | 야생형 | 변이체 1.0 | 변이체 13.0 |
| 열안정성 증가 [%] | 100 | 131 | 121 |
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SK Inovation
<120> Heat-resisting Carbonic Anhydrase Variants and Composition for
Capturing Carbon Dioxide
<130> P18-B161
<160> 7
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 187
<212> PRT
<213> Sulfolobales archaeon AZ1
<400> 1
Met Arg Val Ile Met Ser Cys Met Asp Tyr Arg Leu Thr Glu Glu Ile
1 5 10 15
Met Lys Lys Met Asp Gln Asn Thr Ile Val Leu Arg Asn Ala Gly Ala
20 25 30
Asn Val Asn Glu Phe Lys Asp Ile Leu Lys Ser Leu Asn Pro Asp Glu
35 40 45
Val Val Tyr Leu Pro His Thr Asp Cys Ala Ala Met Lys Leu Val Leu
50 55 60
Ser Ser Val Lys Gln Gly Glu Gln Val Thr Pro Lys Ile Glu Ser Ser
65 70 75 80
Leu Val Ser Gln Phe Arg Gly Arg Gln Phe Asn Asp Leu Lys Glu Leu
85 90 95
Glu Glu Leu Asn Leu Lys Leu Gly Leu Glu Thr Ile Lys Gln Val Val
100 105 110
Pro Lys Ala Lys Val Ile Ser Glu Leu Ile Asp Val Asn Lys Leu Lys
115 120 125
Trp Pro Glu Arg Lys Pro Val Val Tyr Leu Leu Lys Ser Thr Ser Lys
130 135 140
Tyr Thr Asn Glu Met Ile Gly Gly Tyr Val Ile Gln Ser Met Asn Lys
145 150 155 160
Thr Ser Ile Glu Ala Asp Leu Glu Ile Ala Ser Lys Leu Asn Leu Lys
165 170 175
Val Val Lys Asp Glu Phe Ser Asn Ala Arg Asp
180 185
<210> 2
<211> 187
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant 1.0
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cagtcggtgt ggcccaggta cacaac 26
Claims (8)
- 서열번호 1의 아미노산 서열에서 A58G 변이를 포함하고, 서열번호 2의 아미노산서열로 표시되는 탄산무수화효소변이체.
- 제1항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 P53G 변이를 추가로 포함하고,서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 탄산무수화효소변이체.
- 제1항의 탄산무수화효소 변이체를 코딩하는 핵산.
- 제3항에 있어서, 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
- 제3항의 핵산 또는 제4항의 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
- 다음 단계를 포함하는 탄산무수화효소 변이체의 제조방법:
(a) 제5항의 재조합 미생물을 배양하여 탄산무수화효소 변이체를 생산하는 단계; 및
(b) 상기 생산된 탄산무수화효소 변이체를 수득하는 단계.
- 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 탄산무수화효소 변이체를 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물.
- 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 탄산무수화효소 변이체를 이용하여 40~90℃에서 이산화탄소를 포집하는 방법.
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