WO2015056858A1 - 고온 안정성을 갖는 탄산무수화효소 및 이를 포함하는 이산화탄소 포집제 - Google Patents

고온 안정성을 갖는 탄산무수화효소 및 이를 포함하는 이산화탄소 포집제 Download PDF

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WO2015056858A1
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조병훈
서정현
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포항공과대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a carbonic anhydrase having excellent high temperature stability and a carbon dioxide trapping agent comprising the same, wherein the carbonic anhydrase has high stability at high temperature, thus maintaining carbon dioxide trapping activity even at a high temperature, and thus, Applicable
  • the enzyme is a carbonic anhydrase and a metalloenzyme containing zinc ions therein to quickly and quickly promote the hydration reaction of carbon dioxide.
  • the enzyme has been intensively studied in mammals since the mid-1900s, but it has been found in virtually all living organisms, including bacteria and archaea, and has been shown to play various physiological roles in photosynthesis, respiration, homeostasis, biomineral formation, and the like.
  • the carbonic anhydrase catalyzes the conversion of carbon dioxide and water into hydrogen carbonate (HCCV) and hydrogen ions (H + ), thereby reacting the reaction with a natural reaction rate Up to 10 million times faster.
  • HCCV hydrogen carbonate
  • H + hydrogen ions
  • carbonic anhydrase can rapidly capture carbon dioxide in the liquid phase, and this process involves the capture of bicarbonate ions and the conversion of carbonate minerals, depending on the application.
  • This biomimetic technology using carbonic anhydrase is environmentally friendly
  • the regeneration tower must be maintained at a high temperature to separate dissolved carbon dioxide into a gaseous state.
  • the carbonic anhydrase In order to apply the carbonic anhydrase to the absorption tower process, it should basically be stable at about 40 to 60 ° C, and in order to apply to the regeneration tower process, it should be able to maintain the activity at a higher temperature even longer.
  • the present invention is a carbonic anhydrase
  • a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule, and a host cell transformed with the recombinant vector and the host cell
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a carbonic anhydrase.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a carbonic anhydrase, a nucleic acid molecule encoding the carbonic anhydrase, an equivalent nucleic acid molecule, and a host cell and the host cell transformed with the recombinant vector.
  • One embodiment of the present invention provides a carbonic anhydrase.
  • Another embodiment provides a nucleic acid molecule encoding the carbonic anhydrase. Another embodiment provides a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule. Another embodiment provides a host cell transformed with the recombinant vector.
  • Another embodiment provides a carbon dioxide trapping agent including the carbonic anhydrase.
  • Another embodiment provides a method of preparing carbonic anhydrase using the host cell.
  • the present inventors completed the present invention by searching for carbonic anhydrase genes from genomic information of thermophilic bacteria found in the seabed fissures and constructing a recombinant expression vector based thereon, and successfully mass-expressing them in E. coli.
  • the lysate of cells expressing recombinant carbonic anhydrase has a high carbon dioxide capture activity, and the kinetic parameters of purified carbonic anhydrase are superior to those of known bacterium-derived carbonic anhydrase, and enzyme activity even at 95 ° C. In the high temperature conditions of the carbon dioxide capture process, it has more excellent activity than at room temperature. It was confirmed that it can carry.
  • the expressed carbonic anhydrase retains most of its activity at high temperatures, and is characterized by high stability.
  • the carbonic anhydrase of the present invention has high stability at high temperatures, and thus exhibits carbon dioxide capture activity even at high temperatures, and thus may be applied to a carbon dioxide capture process performed at an actual high temperature. In addition, it is expected to give a lot of advantages in terms of economics because it is possible to mass production using the expression system.
  • Figure 2 shows the results of measuring the activity of the carbonic anhydrase in the capture of carbon dioxide using the lysate of the host cell according to Example 3.
  • Figure 4 shows the results of measuring the high temperature stability of the purified carbonic anhydrase according to Example 5 at 70 ° C.
  • Figures 5a and 5b shows the high temperature of the Persephonella marina-derived carbonic anhydrase and Thermovibrio ammonificans-derived carbonic anhydrase at 40 ° C and 60 ° C over time
  • Figure 6 shows the activity change graph according to the temperature of the purified carbonic anhydrase according to Example 7.
  • One embodiment provides a carbonic anhydrase.
  • the carbonic anhydrase may be derived from a high temperature bacterium, and has a feature of maintaining carbon dioxide capture activity even at a high temperature as it is derived from a high temperature bacterium.
  • the carbonic anhydrase may be derived from T. ammonificans, P. marina, or C mediatlanticus, preferably T.
  • the carbonic anhydrase is a heat-resistant enzyme and maintains its activity at 80 ° C for at least 15 minutes, and maintains the enzyme activity at 95 ° C for several minutes, specifically, based on 100% carbon dioxide capture activity at 4 ° C.
  • the carbon dioxide capture activity may be at least 60%, preferably at least 70%, most preferably at least 80%.
  • the carbon dioxide capture activity is a carbonic anhydrase
  • the carbonic anhydrase derived from T.am according to the present invention was confirmed to have excellent high temperature stability than the carbonic anhydrase derived from P.ma or C.me (FIGS. 4, 5 and 6).
  • the restriction enzyme recognition site may include a variety of sequences to match the restriction enzyme site of the vector used in the production of recombinant enzymes, oligopeptides for purification may use a variety of tags, for example 6X (His) tag can be have.
  • the carbonic anhydrase according to an embodiment of the present invention may be a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, which is a peptide having a restriction enzyme recognition site and / or an oligopeptide for purification at the end of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 have.
  • Carbonic anhydrase consisting of SEQ ID NO: 1 in the present invention is ⁇ . It is derived from amwo cara and is a P. manna-derived carbonic anhydrase consisting of SEQ ID NO: 3, and compared with C. mediatlantic-derived carbonic anhydrase consisting of SEQ ID NO: 4.
  • Another embodiment provides a nucleic acid molecule encoding the carbonic anhydrase.
  • the nucleic acid molecule may be one from which the signal sequence of the carbonic anhydrase of high temperature bacteria is removed. When the signal base sequence is included
  • Carbonic anhydrase is moved into the cell gap, so that the desired amount of expression is not achieved in an expression system such as E. coli.
  • the nucleic acid molecule is a host cell, Preferably it may be appropriately adjusted in consideration of the codon deflection of E. coli.
  • the nucleic acid molecule is represented by the amino acid sequence represented by SEQ.
  • nucleic acid molecule encoded by an amino acid sequence further comprising a restriction enzyme recognition site and / or an oligopeptide for purification at the end of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, for example, by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 It may be a nucleic acid molecule to be encoded.
  • the vector typically includes a delivery DNA into which an external DNA can be inserted, and means that a nucleic acid molecule can be combined with another nucleic acid and transferred to a host cell to express a target protein.
  • the vector includes all common vectors, including plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, viral vectors and the like.
  • Another embodiment provides a host cell transformed with the recombinant vector.
  • the recombinant vector may be introduced into a host cell, and the introduction method may include electroshock gene transfer (electroporation), calcium phosphate (CaP0 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, PEG, textlan sulfate, lipofectamine, and the like. It can be carried out by a known method of.
  • the host cell may be a prokaryotic cell.
  • the prokaryotic cells may be prokaryotic cells that can be transformed with a foreign gene, for example, Escherichia coli, Rhodococcus, Pseudomonas, Streptomyces
  • Thermoplasma may include various microorganisms such as Thermoplasma, Thermoproroteus, preferably Escherichia coli and Saccharomyces
  • E. coli specifically E. coli XLl-blue, E. coli BL21 (DE3), E. coli JM109, E. coli . DH series, E. coli TOP 10, E. coli HB101, and the like. .
  • Another embodiment provides a method of preparing carbonic anhydrase using the host cell.
  • the culture medium is a carbon source, nitrogen source, It may include all nutrients necessary for the growth and survival of microorganisms such as trace element components.
  • the pH of the medium can be adjusted appropriately and may include components such as antibiotics.
  • IPTG isopropyl-D-thiogalactopyranoside
  • IPTG isopropyl-D-thiogalactopyranoside
  • the expressed carbonic anhydrase is recovered and purified by conventional methods.
  • the cells recovered by the centrifugation method can be crushed using a French press, an ultrasonic crusher or the like. If carbonic anhydrase is secreted into the culture, the culture supernatant may be collected. If coagulated by overexpression,
  • a system for oxidizing and reducing cystamine may be used, and refolding agents such as urea, guanidine, and arginine may be used. Some of the salts may be used with the refolding agent.
  • the process of heat treatment for 10 to 60 minutes at 70 to 85 ° C may be added, the production scale of the carbonic anhydrase can be adjusted to suit the purpose.
  • Another embodiment provides a carbon dioxide trapping agent including the carbonic anhydrase.
  • the scavenger is known as carbon dioxide scavenger
  • It may further include, for example, may include ammonia aqueous solution, aqueous solution of mono-ethanol-amine (MEA), aqueous solution of potassium carbonate and the like.
  • ammonia aqueous solution aqueous solution of mono-ethanol-amine (MEA)
  • MEA mono-ethanol-amine
  • potassium carbonate aqueous solution of potassium carbonate
  • Another embodiment provides a method of capturing carbon dioxide using the carbonic anhydrase, and specifically, the method may be a method of capturing using the carbonic anhydrase at 40 to 70 ° C.
  • Nucleic acid encoding mediatlantic S ⁇ carbonic anhydrase was amplified using PCR primers as a template for genomic nucleic acid of each microorganism.
  • carbonic anhydrase can be expressed in the cytoplasm.
  • Ammonificam ⁇ amplified by the nucleotide sequence of the carbonic anhydrase from which the signal sequence was removed, and the nucleotide sequence of the carbonic anhydrase from which the signal sequence of P. war / «a was removed, and C.
  • C. mediatlanticus carbonic anhydrase amplification template Genomic DN A of Caw / w ' 6 ⁇ 3cter mediatlanticus (DSM 16658; gene accession number: WP_007474387)
  • each of the amplified products was pET-22b (+) using NdeI, XhoI restriction enzyme Introduced into the vector, finally three expression vectors were prepared.
  • each carbonic anhydrase gene has a histidine tag capable of binding Ni to silver at the C-terminus.
  • the amino acid sequence of T. ammonificans carbonic anhydrase has SEQ ID NO: 2
  • the amino acid sequence of P. marina carbonic anhydrase has SEQ ID NO: 3
  • the amino acid sequence of C. mediatlanticus carbonic anhydrase is Specifically, the amino acid sequence of T. ammonificans carbonic anhydrase has SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of P. marina carbonic anhydrase has SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of C. mediatlanticus carbonic anhydrase.
  • Each vector prepared by the method of thermal stratification at 42 ° C for 2 minutes was introduced into the host cell E. coli BL21 (DE3), and each host cell into which the vector was introduced was
  • Three types of host cells expressing different carbonic anhydrases were finally selected from LB medium to which ampicillin was added.
  • the host cells prepared in Example 1 were cultured at 37 ° C in 50 g / mL ampicillin-added LB medium, and the absorbance (OD 600 ) of the culture solution was about 0.6 to 0.8. -D-thiogalactopyranoside (1 mM) was added to induce the expression of the protein. After incubation of host cells at 37 ° C. for 12 hours after addition of IPTG, the cultured host cells were centrifuged at 4000 ⁇ g for 10 minutes, and then the supernatant was removed and the host cells were recovered.
  • the recovered host cells were suspended in a solution for disruption (50 mM sodium phosphate buffer, 300 mM NaCl, pH 8, 10 mM imidazole) and then disrupted using an ultrasonic grinder. Since the total protein of the crushed host cell was analyzed by SDS-PAGE, the results are shown in FIG.
  • Figure 1 shows the expression of three kinds of carbonic anhydrase in the cytoplasm and analyzed by SDS-PAGE
  • ⁇ is the molecular weight standard marker
  • C. e is a carbonic anhydrase derived from Caminibacter mediatlanticus
  • .wa is a carbonic acid derived from Persephonella marina Dehydratase
  • r.aw is the molecular weight standard marker
  • the activity of the carbon dioxide capture of the expressed carbonic anhydrase was measured using the lysate of the host cell of Example 2.
  • the reaction was started by adding 100 host cell lysate solution to 3 mL of 20 mM Tris sulfate buffer (pH 8.3) and adding saturated carbon dioxide saturated solution (C0 2 saturated 3 ⁇ 40 solution). A decrease was observed, and the result is shown in FIG. 2.
  • Figure 2 shows the results of measuring the activity of the three types of carbonic anhydrase related to the carbon dioxide capture by using the host cell lysate, Blank is
  • P.ma CA is carbonic anhydrase from Persephonella marina
  • T.am CA is carbonic anhydrase from Thermovibrio ammonificans
  • C.me CA is carbonic anhydrase from Caminibacter mediatlanticus it means.
  • the carbonic anhydrase of the supernatant was isolated and purified. Specifically, the supernatant is applied to the column in which the nickel resin is layered to allow the carbonic anhydrase to bind to the column, and the carbonic acid not bound to the column with the washing buffer (50 mM sodium phosphate buffer, 300 mM NaCl, 30 mM imidazole, pH 8.0). Anhydrase was washed off.
  • the washing buffer 50 mM sodium phosphate buffer, 300 mM NaCl, 30 mM imidazole, pH 8.0
  • Figure 3 shows the results of the separation and purification of each of the three types of carbonic anhydrase by SDS-PAGE
  • P.ma is Persepho lla marina ⁇ ⁇
  • carbonic anhydrase me is Caminibacter mediatlanticus carbonated radish Hydase, T.am, refers to carbonic anhydrase from Thermovibrio ammonificans.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the high temperature stability at 70 ° C of the three types of purified carbonic anhydrase, no treatment (no treatment) control, T.am is a carbon dioxide derived from Thermovibrio ammonificans P. ma is a carbonic anhydrase derived from Persephonella marina, C. me is derived from Caminibacter mediatlanticus
  • Carbonic anhydrase bCA means bovine serum-derived carbonic anhydrase
  • Residual activity shows how much activity is maintained after heat treatment as compared with the initial heat treatment.
  • thermal stability at 40 ° C. and 60 ° C. was tested for 60 days to verify long term thermal stability at substantial collection temperature conditions.
  • 5A and 5B show graphs of high temperature stability of Persephonella marina-derived carbonic anhydrase and Thermovibrio ammonificans-derived carbonic anhydrase with time at 40 ° C. and 60 ° C., respectively.
  • the carbonic anhydrase derived from the vibrio ammonifwa and Persephonella marina showed high thermal stability.
  • Thermovibrio ammonificans-derived carbonic anhydrase had 91% of its initial activity after 60 days at 40 ° C (FIG. 5A), and 6 (C maintained 62% of its initial activity after 60 days (FIG. 5) 5b).
  • the carbonic anhydrase has the ability of an esterase to degrade esters in addition to substrate specificity for C0 2 .
  • the esterase activity was observed by measuring.
  • Table 1 shows kinetic parameters for bCA, T.am CA and P.ma CA.
  • Table 1 shows the reaction rate values of the purified carbonic anhydrase according to Example 6.
  • the esterase activity measuring method used in Example 6 was also applied to a higher temperature other than 25 ° C., thereby measuring the change in activity of carbonic anhydrase according to the temperature.
  • both carbonic anhydrases derived from P. marina and T. ammonificans have a higher activity at high temperatures. The highest activity was seen at 95 ° C. Higher temperatures could not be measured due to experimental characteristics.

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Abstract

본 발명은 탄산무수화효소, 상기 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용하여 탄산무수화효소를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 탄산무수화효소는 고온에서의 안정성이 높아 고온에서도 이산화탄소 포집 활성을 나타내어 실제 고온에서 수행되는 이산화탄소 포집 공정에 적용될 수 있다. 또한 발현 시스템을 이용하여 대량생산이 가능하므로 경제성 측면에서 많은 이점을 줄 것으로 기대된다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
고온 안정성을 갖는 탄산무수화효소 및 이를 포함하는 이산화탄소 포집제 【기술분야】
본 발명은 고온 안정성이 우수한 탄산무수화효소 및 이를 포함하는 이산화탄소 포집제에 관한 것으로, 상기 탄산무수화효소는 고온에서의 안정성이 높아 고온에서도 이산화탄소 포집 활성을 유지할 수 있어, 고온의 이산화탄소 포집 공정에 적용 가능하다.
【배경기술】
화석 에너지 사용의 꾸준한 증가에 의해 대기 중 이산화탄소의 농도가 높아지고, 이러한 결과 나타나는 지구 온난화 문제와 관련해 이산화탄소의 농도를 점차 줄여나가려는 노력이 점점 가속화되고 있다. 환경 친화적인 신.재생 에너지의 개발과 더불어， 끊임없이 증가하는 화석 연료 사용에 의한 이산화탄소의 빠른 증가를 억제하기 위하여 이산화탄소를 포집 .저장하는 기술아크게 주목 받고 있다. 이러한 이산화탄소의 포집 방법에는 여러 가지 화학적 흡수제, 물리적 흡수 방법 등이 있지만, 부식, 높은 열 에너지 등의 문제를 지닌다. 생명체는 이산화탄소를 빠르게 전환시킬 수 있는 효소를 지니고 있는데， 이러한 효소를 이용한 생물 모방 이산화탄소 포집 방법은 친환경적인 이산화탄소 저감 기술로 주목 받고 있다. 상기 효소는 탄산무수화효소이며 내부에 Zinc 이온을 포함하고 있는 금속 효소 (metalloenzyme)로써 이산화탄소의 수화 반응을 빠르,게 촉진시킨다. 상기 효소는 1900년대 중반부터 포유류에서 집중적으로 연구되었으나, 박테리아와 고세균를 포함하여 실질적으로 거의 모든 생명체에 존재하며 광합성, 호흡, 항상성 유지, 바이오미네랄 형성 등에서 다양한 생리적인 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다.
기체 형태의 이산화탄소는 물에 녹고, 이러한 액상의 이산화탄소는 수화 반웅을 통해 탄산을 형성한다. 적정 pH 조건에서는 최종적으로는 carbonate ion (C03 2 )이 형성된다. 이것은 이후 금속 양이은과 반응하여 탄산 미네랄이라는 고체 침전물을 형성할 수 있다ᅳ 전체적인 반웅은 하기 [화학식 1] 내지 [화학식 5]와 같다.
[화학식 1] C02(g)→ C02(aq)
[화학식 2]
C02(aq) + H20→ H2C03
[화학식 3]
H2C03→H+ + HC03 "
[화학식 4]
HC03 "→ H+ + C03 2"
[화학식 5] '
C03 2" + Ca2+→ CaC03
[화학식 2]의 액상 이산화탄소의 수화 반웅이 [화학식 1] 내지 [화학식
5]의 반응의 율속 단계 (rate-limiting step)이며, 탄산무수화효소는 이산화탄소와 물을 탄산수소이온 (HCCV)과 수소이온 (H+)으로 바꾸는 것을 촉매하여, 상기 반웅을 자연적인 반응 속도보다 최대 천만 배 더 빠르게 촉진시킨다. 따라서 탄산무수화효소를 통해 액상에서 이산화탄소를 빠르게 포집할 수 있으며, 이러한 과정은 응용에 따라 중탄산 이온으로의 포집과 탄산 미네랄로의 전환을 포함한다. 탄산무수화효소를 이용한 이러한 생물 모방 기술은 친환경적이고
효율적이지만 실제 공정 적용에 있어서 해결해야 할 부분이 있는데, 그것은 탄산무수화효소의 생산 단가를 낮추는 것과 효소 안정성 (stability)을 확보하는 것이다. 포집 공정에 탄산무수화효소를 적용하려면 탄산무수화효소를 대량으로 값싸게 얻을 수 있어야 한다. 그 동안 연구에서 주로 사용되어 왔던 소 혈청에서 추출한 탄산무수화효소는 g당 약 2백만원이며 이러한 고비용 문제로 실제 공정에는 적용되기 힘들다. 또한, 포집 공정은 대량으로 이산화탄소를 배출하는 발전소, 제철소 등에 적용될 것으로 기대되는데, 이산화탄소를 포함한 배가스가 지닌 열의 넁각 (cooling)과정이 필요하며 흡수탑에서는 녹아 들어가는
이산화탄소에 의해 열이 방출된다. 또한 녹아 들어간 이산화탄소를 기체상태로 분리하기 위해서는 재생탑이 고온으로 유지되어야 한다. 탄산무수화효소를 흡수탑 공정에 적용하기 위해서는 기본적으로 40 내지 60°C 정도에서 안정해야 하며 재생탑 공정에 적용하기 위해서는 이보다 더 높은 온도에서도 활성을 오래도록 유지할 수 있어야 한다.
【발명의 상세한 설명】 【기술적 과제】
고온에서 안정성이 높고 이산화탄소 포집 활성을 나타내는
탄산무수화효소를 생산하기 위하여, 본 발명은 탄산무수화효소, 상기
탄산무수화효소를 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 백터, 및 상기 재조합 백터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용하여
탄산무수화효소를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 국한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
【기술적 해결방법】
상기 목적을 이루기 위한 수단으로, 본 발명은 탄산무수화효소, 상기 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산분자， 상가핵산분자를 포함하는 재조합 백터, 및 상기 재조합 백터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용하여
탄산무수화효소를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예는 탄산무수화효소를 제공한다.
다른 일 구현예는 상기 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산분자를 제공한다. 또 다른 일 구현예는 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 백터를 제공한다. 또 다른 일 구현예는 상기 재조합 백터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또 다른 일 구현예는 상기 탄산무수화효소를 포함하는 이산화탄소 포집제를 제공한다.
또 다른 일 구현예는 상기 숙주세포를 이용하여 탄산무수화효소를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 해저 열구수에서 발견된 고온성 세균의 유전체 정보로부터 탄산무수화효소 유전자를 탐색하고 이를 토대로 재조합 발현 백터를 제작한 뒤, 대장균 내에서 성공적으로 대량 발현함으로써 본 발명을 완성하였다. 재조합 탄산무수화효소가 발현된 세포의 파쇄액은 높은 이산화탄소 포집 활성을 지니고 있으며 정제된 탄산무수화효소의 kinetic parameter는 알려져 있는 고세균 유래의 탄산무수화효소보다 더 뛰어나며, 95 °C 온도에서도 효소활성을 갖는 것으로서, 이산화탄소 포집 공정의 높은 온도 조건에서는 상온에서보다 더욱 뛰어난 활성을 지닐 수 있다는 것을 확인하였다. 또한 발현된 탄산무수화효소는 고온에서 대부분의 활성을 유지하며 상당히 안정성이 높은 것이 특징이다.
【유리한 효과】
본 발명의 탄산무수화효소는 고온에서의 안정성이 높아 고온에서도 이산화탄소 포집 활성을 나타내어 실제 고온에서 수행되는 이산화탄소 포집 공정에 적용될 수 있다. 또한 발현 시스템올 이용하여 대량생산이 가능하므로 경제성 측면에서 많은 이점을 줄 것으로 기대된다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 실시예 2에 따른 탄산무수화효소를 세포질에 발현한 후
SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
• 도 2는 실시예 3에 따른 숙주세포의 파쇄액을 이용하여 이산화탄소 포집에 관한 탄산무수화효소의 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 4에 따른 탄산무수화효소를 각각 분리, 정제한 후
SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 5에 따른 정제된 탄산무수화효소의 70 °C에서의 고온 안정성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a 및 도 5b는 Persephonella marina 유래 탄산무수화효소와 Thermovibrio ammonificans 유래 탄산무수화효소를 40 °C 및 60 °C에서 시간에 따른 고온
안정성을 측정한 그래프를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 7에 따른 정제된 탄산무수화효소의 온도에 따른 활성 변화 그래프를 나타낸 것이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다.
일 구현예는 탄산무수화효소를 제공한다.
상기 탄산무수화효소는 고온성 세균으로부터 유래된 것일 수 있으며, 고온성 세균으로부터 유래됨에 따라 높은 온도에서도 이산화탄소 포집 활성이 유지되는 특징을 가진다. 예컨대， 상기 탄산무수화효소는 T. ammonificans, P. marina, 또는 C mediatlanticus로―부^ 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 T.
ammom Za s로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 탄산무수화효소는 분자량이 약 27 kDa인 효소로서, 반응속도 상수는 Lineweaver-Burk plot을 이용하여 각각 KM= 10 내지 38 mM, Kcat= 2.8x l05 내지 6.8x l 05/s인 것을 특징으로 한다. 또한 이산화탄소 이외에 에스테르를 분해할 수 있는 특이성을 지니며 0.9 내지 3.2 mol ?-nitrophenyl acetate/mol enzyme min≤ 활성을 지닌다.
상기 탄산무수화효소는 내열성 효소로서 80 °C에서도 적어도 15분간 그 활성을 그대로 유지하며, 95 °C 에서도 수분간 효소활성을 유지하며, 구체적으로 4 °C에서의 이산화탄소 포집 활성을 100% 기준으로 하여 40 내지 70 °C에서 이산화탄소 포집 활성이 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 가장 바람직하게는 80% 이상일 수 있다. 이때, 이산화탄소 포집 활성은 탄산무수화효소가
이산화탄소와 물을 탄산수소이온 (HC V)과 수소이온 (H+)으로 바꾸는 활성을 의미한다.
본 발명에 따른 T.am 유래의 탄산무수화효소는 P.ma 또는 C.me 유래의 탄산무수화효소보다 고온 안정성이 뛰어남을 확인하였다 (도 4, 도 5 및 도 6) 상기 탄산무수화효소는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 또는 상기 탄산무수화효소는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 말단에 제한효소인식 부위 및 /또는 정제를 위한 을리고펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제한효소인식 부위는 재조합 효소 생산시 사용하는 백터의 제한효소 부위와 일치되도록 다양한 서열을 포함할 수 있으며， 정제를 위한 올리고펩타이드는 다양한 Tag을 사용할 수 있으며 예를 들면 6X(His) tag일 수 있다. 본 발명의 일예에 따른 탄산무수화효소는 서열번호 1의 아미노산 서열의 말단에 제한효소인식 부위 및 /또는 정제를 위한 올리고펩타이드가 결합된 펩타이드인, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있다. 본 발명에서 서열번호 1로 이루어지는 탄산무수화효소는 Γ. amwo ?cara에서 유래된 것이며, 상기 서열번호 3로 이루어지는 P. manna 유래 탄산무수화효소 이며, 상기 서열번호 4로 이루어지는 C. mediatlantic 유래된 탄산무수화효소와 비교된다. 다른 일 구현예는 상기 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산분자를 제공한다. 상기 핵산분자는 고온성 세균의 탄산무수화효소의 신호 염기서열올 제거한 것일 수 있다. 상기 신호 염기서열을 포함하고 있는 경우
탄산무수화효소가 세포 간극으로 이동하여 대장균과 같은 발현 시스템에서 원하는 양만큼의 발현이 이루어지지 않게 된다. 상기 핵산분자는 숙주세포， 바람직하게는 대장균의 코돈 편향성을 고려하여 적절히 조절될 수 있다.
상기 핵산분자는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 의해서
암호화되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 말단에 제한효소인식 부위 및 /또는 정제를 위한 올리고펩타이드를 추가로 포함하는 아미노산 서열에 의해서 코딩되는 핵산분자 일 수 있으며 예를 들면 서열번호 2의 아미노산 서열에 의해서 코딩되는 핵산분자일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 백터를 제공한다. 상기 백터는 전형적으로 외부 DNA가 삽입될 수 있는 전달 DNA를 포함하며, 핵산분자의 일종으로 또 다른 핵산과 결합하여 숙주세포로 이송되어 목적 단백질을 발현할 수 있는 것을 의미한다. 예컨대, 상기 백터는 플라스미드 백터， 코스미드 백터, 박테리오파지 백터 및 바이러스 백터 등을 포함한 통상의 모든 백터를 포함한다.
또 다른 일 구현예는 상기 재조합 백터로 형질전환된 숙주세포를
제공한다. 상기 재조합 백터는 숙주세포 내부로 도입될 수 있으며, 도입 방법은 전기충격 유전자 전달법 (electroporation), 인산칼슘 (CaP04) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, PEG, 텍스트란 설페이트, 리포펙타민 등의 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 상기 숙주세포는 원핵세포일 수 있다. 상기 원핵세포는 외래 유전자로 형질전환 될 수 있는 원핵세포이면 가능하며, 예를 들어, 대장균 (Escherichia coli), 로도코커스 (Rhodococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 스트렙토마이세스
(Streptomyces), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 시폴러버스 (Syfolobus),
써모플라즈마 (Thermoplasma), 써모프로테우스 (Thermoproteus) 등의 다양한 미생물을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 대장균 및 사카로미세스
세리비시아 (Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는 대장균일 수 있으며, 구체적으로 대장균 XLl-blue, 대장균 BL21(DE3), 대장균 JM109, 대장균. DH 시리즈, 대장균 TOP 10 및 대장균 HB101 등을 포함할 수 있다. .
또 다른 일 구현예는 상기 숙주세포를 이용하여 탄산무수화효소를 제조하는 방법을 제공한다.
배지성분， 배양온도 및 배양시간 등의 조건을 적절히 조절하여, 상기 형질전환된 숙주세포를 배양할 수 있다. 구체적으로, 배양 배지는 탄소원, 질소원, 미량원소 성분 등과 같은 미생물의 성장과 생존에 필수적인 모든 영양소를 포함할 수 있다. 배지의 pH는 적절히 조정할 수 있고, 항생제 등의 성분을 포함할 수 있다.
또한, 이소프로필 베타 디 티오갈락토피라노사이드
(isopropyl- -D-thiogalactopyranoside, 이하 IPTG라고 함) 등의 유도제 (inducer)를 처리하여 탄산무수화효소의 발현을 유도할 수 있다. 처리되는 유도제의 종류는 백터 시스템에 따라 결정될 수 있으며, 유도제 투여시간 및 투여량 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 배지성분, 배양온도 및 배양시간 등의 조건의 선택은 사용하는 숙주세포의 종류에 따라 적절히 결정될 수 있다.
발현된 탄산무수화효소는 통상의 방법으로 회수 및 정제된다. 예를 들어, 원심분리 방법으로 회수한 세포를， 프렌치 프레스, 초음파 파쇄기 등을 이용하여 파쇄 할 수 있다. 배양액으로 탄산무수화효소가 분비되는 경우에는 배양 상등액을 수집할 수 있다. 과발현에 의해 웅집되는 경우, 적절한 용액에서
탄산무수화효소를 용해시키고 및 변성시키고 재폴딩시켜서 얻을 수 있다.
글루타티온, 디티오트레이를 , β-머갑토에탄을 , β-머갑토메탄을， 시스틴 및
시스타민의 산화 및 환원 시스템을 사용하고 요소, 구아니딘， 아르기닌 등의 재폴딩제 등을 이용할 수 있다. 재폴딩제와 함께 염의 일부를 사용할 수 있다. 이 때, 70 내지 85 °C에서 10 내지 60분간 열처리하는 공정을 추가할 수도 있으며, 상기 탄산무수화효소의 제조규모는 목적에 맞도록 조절할 수 있다.
또 다른 일 구현예는 상기 탄산무수화효소를 포함하는 이산화탄소 포집제를 제공한다. 상기 포집제는 이산화탄소 포집제로 알려진 것들올
추가적으로 포함할 수 있으며， 예컨대 암모니아 수용액 , MEA(mono-ethanol-amine) 수용액, 탄산칼륨 수용액 등을 포함할 수 있다.
또 다른 일 구현예는 상기 탄산무수화효소를 이용하여 이산화탄소를 포집하는 방법을 제공하며, 구체적으로 상기 방법은 40 내지 70°C에서 상기 탄산무수화효소를 이용하여 포집하는 방법일 수 있다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다ᅳ 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며， 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다. [실시예]
실시예 1. 형질전환된 숙주세포 제조
NCBI database 유전 정보를 토대로 T. ammonifica , P.
mediatlantic S^ 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 각 미생물의 유전체 핵산을 주형으로 PCR 프라이머를 사용하여 각각 증폭하였다.
구체적으로 탄산무수화효소가 세포질에서 발현될 수 있게 Γ.
ammonificam^ 신호서열이 제거된 탄산무수화효소의 염기서열, P. war/«a의 신호서열이 제거된 탄산무수화효소의 염기서열로 증폭하였고, C.
mediadanticus발현을 위해 신호서열이 제거된 탄산무수화효소의 염기서열로 증폭하였으며, 사용된 프라이머는 다음과 같다 (하기 프라이머 서열에서 밑줄그은 부분은 제한효소인식 부위이다)
T. ammonificans 탄산무수화효소 증폭용 ¾： Genomic DNA of Thermovibrio ammonificans (DSM 15698; gene accession number: WP— 013538320)
T. ammonificans 탄산무수화효소 증폭용 프라이머쌍
정방향 프라이머 (서열번호 5) 5 '-ATAC ATATGGGTGGAGGAGCCC A-31 역방향 프라이머 (서열번호 6)
5'-ATACTCGAGCTTCATAACCTTCCTTGCATT-3'
P. marina 탄산무수화효소 증폭용 주형: Genomic DNA ofPerye/^( e//a marina (DSM 14350; gene accession number: WP— 015898908)
P. wa 탄산무수화효소 증폭용 프라이머쌍
정방향 프라이머 (서열번호 7) 5'-ATACATATGGGTGGTGGCTGGAG-3' 역방향프라이머 (서열번호 8)
5'-ATACTCGAGTTTTTCCATAATCATTCTTGCATTTAAAG-3'
C. mediatlanticus 탄산무수화효소 증폭용 주형: Genomic DN A of Caw/w'6<3cter mediatlanticus (DSM 16658; gene accession number: WP_007474387)
C m^/ /i t/ 탄산무수화효소 증폭용 프라이머쌍
정방향 프라이머 (서열번호 9) 역방향 프라이머 (서열번호 10)
5'-ATACTCGAGTTTTAAAATAACCCTTGCATTAATTGG-3'
상기 각각의 증폭산물을 NdeI, XhoI 제한 효소를 이용하여 pET-22b (+) 백터에 도입하여， 최종적으로 3개의 발현백터를 제조하였으며 , pET-22b(+) 백터에서 각각의 탄산무수화효소 유전자들은 C-말단에 Ni 이은과 결합이 가능한 histidine tag를 갖는다. 구체적으로 , T. ammonificans 탄산무수화효소는 아미노산 서열은 서열번호 2, P. marina 탄산무수화효소의 아미노산 서열은 서열번호 3, C. mediatlanticus탄산무수화효소의 아미노산 서열을 서열번호 4를 갖는다.
42 °C에서 2분간 열층격하는 방법으로 제조된 각각의 백터를 숙주세포인 대장균 BL21 (DE3)에 도입하였고, 백터가 도입된 각각의 숙주세포는
암피실린 (ampidllin)이 첨가된 LB 배지에서 선별하여 최종적으로 유래가 다른 탄산무수화효소를 발현하는 3종류의 숙주세포를 제조하였다.
실시예 2. 단백질 발현 분석
상기 실시예 1에서 각각 제조된 숙주세포를 50 g/mL 암피실린 첨가된 LB 배지에서 37 °C로 배양하여 배양액의 흡광도 (OD600)가 0.6~0.8 정도가 되었을 때 유도물질인 IPTG(isopropyl-13-D-thiogalactopyranoside, 1 mM)을 첨가하여 단백질의 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후 추가로 12시간 동안 37 °C에서 숙주세포를 배양한 후, 배양된 숙주세포를 4000xg에서 10분간 원심 분리한 다음 상등액을 제거하고 숙주세포를 회수하였다. 회수된 숙주세포는 파쇄를 위한 용액 (50 mM sodium phosphate buffer, 300mM NaCl, pH 8, 10 mM imidazole)에 부유시킨 다음 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄하였다. 이후 파쇄된 숙주세포의 단백질 총체를 SDS-PAGE를 통해 분석하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1은 3종류의 탄산무수화효소를 세포질에 발현한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과로서 , Μ은 분자량 표준 마커, C. e는 Caminibacter mediatlanticus 유래 탄산무수화효소 , .wa는 Persephonella marina 유래 탄산무수화효소 , r.aw는
Thermovibrio ammonificans ΎΓ ^ ¾"피 ᅪ 봐.
도 1에 나타난 바와 같이, 탄산무수화효소는 각각의 숙주세포에서 성공적으로 발현됨을 확인하였다.
실시예 3. 이산화탄소 포집 활성 확인
실시예 2의 숙주세포의 파쇄액을 이용하여 발현된 탄산무수화효소의 이산화탄소 포집에 관한 활성올 측정하였다. 3 mL의 20 mM Tris sulfate buffer(pH 8.3)에 100 의 숙주세포의 파쇄액을 첨가한 후 이산화탄소 포화수용액 (C02 saturated ¾0 solution)을 넣어줌으로써 반웅을 시작시켰고, 탄산무수화효소의 pH가 감소하는 것을 관찰하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 숙주세포의 파쇄액을 이용하여 이산화탄소 포집에 관한 3종류의 탄산무수화효소의 활성을 측정한 결과를 나타낸 것으로, Blank는
탄산무수화효소가 들어 있지 않은 비교군 , P.ma CA는 Persephonella marina 유래 탄산무수화효소 , T.am CA는 Thermovibrio ammonificans 유래 탄산무수화효소, C.me CA는 Caminibacter mediatlanticus 유래 탄산무수화효소를 의미한다.
도 2에 나타난 바와 같이， Persephone!!a marina 유래 탄산무수화효소, Thermovibrio ammonificans 유래 탄산무수화효소, 및 Caminibacter mediatlanticus 유래 탄산무수화효소의 pH는 비교군에 비해 pH가 빨리 떨어지는데, 이는
탄산무수화효소의 이산화탄소 포집에 관한 활성이 높다는 것을 의미한다.
실시예 4. 탄산무수화효소의 정제
실시예 2의 숙주세포의 파쇄액을 10,000xg에서 20분간 원심 분리한 후 상등액의 탄산무수화효소를 분리, 정제하였다. 구체적으로, 니켈 레진이 층진된 컬럼에 상등액을 적용하여 탄산무수화효소와 컬럼이 결합하도록 하고, 세척 버퍼 (50 mM sodium phosphate buffer, 300mM NaCl, 30mM imidazole, pH 8.0)로 컬럼에 결합하지 않은 탄산무수화효소를 씻어 내었다. 컬럼으로부터 탄산무수화효소의 용출은 50 mM sodium phosphate buffer, 300mM NaCl, 250mM imidazole (pH 8.0)을 이용하여 진행하였고, 상기 정제된 용액은 투석을 이용하여 20mM Tris-sulfate(300 mM NaCl, pH8.3)으로 바뀌며 imidazole이 제거되었으며, 최종적으로 3종류의 탄산무수화효소를 정제하였다.
상기 정제된 3종류의 탄산무수화효소를 실시예 2와 같은 방법으로
SDS-PAGE를 통해 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 3종류의 탄산무수화효소를 각각 분리, 정제한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것으로 , P.ma는 Persepho lla marina ^캑、 탄산무수화효소, me는 Caminibacter mediatlanticus 유래 탄산무수화효소, T.am는 Thermovibrio ammonificans 유래 탄산무수화효소를 의미한다.
도 3에 나타난 바와 같이, SDS-PAGE 분석을 통해 각 탄산무수화효소가 완전하게 정제되었음을 확인하였다.
실시예 5. 고온 안정성 비교
고온에서의 탄산무수화효소의 안정성을 확인하기 위해, 실시예 4에서 분리， 정제된 3종류의 탄산무수화효소를 70 °C에서 16시간 방치한 후 4 °C에 보관해둔 실험군 (No treatment)과 비교하여 활성의 감소 정도를 측정하였고, 대조군으로는 상업적으로 판매되는 소 혈청 유래 탄산무수화효소를 사용하였다. 활성은 실시예 3에서 사용한 이산화탄소 포집 활성으로 측정하였으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4는 3종류의 정제된 탄산무수화효소의 70 °C에서의 고온 안정성을 측정한 결과를 나타낸 것으로, 무처리 (no treatment)는 열처리를 하지 않은 대조군, T.am는 Thermovibrio ammonificans 유래 탄산무수화효소， P. ma는 Persephonella marina 유래 탄산무수화효소, C. me는 Caminibacter mediatlanticus 유래
탄산무수화효소, bCA는 소 혈청 유래 탄산무수화효소를 의미하며 ,
잔류활성 (Residual activity)(%)는 초기 열처리 하지 않았을 때와 비교하여 열처리를 하였을 때 얼만큼 활성을 유지하는지를 나타낸 것이디-.
도 4에 나타난 바와 같0 Thermovibrio ammonifica 유래 탄산무수화효소는 80% 이상의 Residual activity를 나타내어 고온에서도 안정성이 유지됨을
확인하였다.
또한, 실질적인 포집 온도 조건에서 오랜 시간 동안의 열 안정성을 확인하기 위하여 40 °C와 60 °C에서의 열 안정성을 60일간 테스트하였다.
마찬가지로 각 온도에서 일정시간 효소를 방치한 뒤 4 °C에 보관해둔 실험군과 비교하여 활성의 감소정도를 측정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5a 및 도 5b는 Persephonella marina 유래 탄산무수화효소와 Thermovibrio ammonificans 유래 탄산무수화효소를 각각 40 °C 및 60 °C에서 시간에 따른 고온 안정성을 측정한 그래프를 나타낸다ᅳ
도 5a 및 도 5b에 나타난 바와 같이, The vibrio ammonifwa 유래와 Persephonella marina 유래의 탄산무수화효소는 높은 열 안정성을 보였다. 특히, Thermovibrio ammonificans 유래 탄산무수화효소는 40 °C의 경우 60일 후 초기 활성의 91 %를 지녔으며 (도 5a), 6( C의 경우에도 60일 후 초기 활성을 62%를 유지하였다 (도 5b).
실시예 6. Kinetic parameter 즉정
C02에 대한 정밀한 kinetic 측정을 위하여 stopped-flow spectroscopy를 사용하였다. 10 nM에서 100 nM의 탄산무수화효소를 포함하는 l OO mM N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid (TAPS)/NaOH buffer (57.2 mM Na2S04와 97.2 μΜ m-cresol purple를 포함. !^ 8.5)를 다양한 농도의 C02 용액과 섞은 후 초기 pH의 변화를 25 °C에서 578 nm의 흡광도 변화를 통해 관찰하였다. 얻어진 데이터로 Michadis-menten 식을 사용하여 KM, Kcat 값을 구하였다.
상기 탄산무수화효소는 C02에 관한 기질 특이성 이외에 ester를 분해할 수 있는 esterase의 능력을 지닌다 . 100 μΐ 의 30 mM p-nitrophenyl acetate 를 800 μΐ의 buffer (50 mM potassium phosphate; pH 7.0)와 100 μΐ의 탄산무수화효소를 지닌 용액에 넣고 잘 섞은 후 25 °C에서 3분간 348nm에서의 흡광도 변화를 측정함으로써 esterase 활성을 보았다. 표 1은 bCA, T.am CA, P.ma CA에 대한 kinetic parameter를 나타낸다. 표 1은 실시예 6에 따른 정제된 탄산무수화효소의 반응속도 값을 나타낸 것이다.
【표 1】
Figure imgf000014_0001
실시예 6에서 사용한 esterase활성 측정 방법을 25 °C이외의 더 높은 온도에도 적용함으로써， 온도에 따라 탄산무수화효소의 활성 변화를 측정하였다. 도 6에서 볼 수 있듯이 P. marina와 T. ammonificans 유래의 탄산무수화효소는 모두 높은 온도에서 더욱 높은 활성을 지니고 있다. 95 °C에서 가장 높은 활성을 보였으며, 더 높은 온도는 실험 특성상 측정할 수 없었다. 두 미생물의 최적 생장 온도 (70 °C부근)를 고려했을 때 두 탄산무수화효소의 최적 반웅 온도는 95 °C보다 크게 높지 않을 것으로 추측된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는
기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다

Claims

【청구의 범위】
【청구항 11
4 °C에서의 이산화탄소 포집 활성을 100% 기준으로 하여, 40 내지 70 °C에서 이산화탄소 포집 활성이 60% 이상인 것인 Thermovibrio ammonifwans 유래의, 탄산무수화효소.
【청구항 2】
거 U항에 있어서, 상기 탄산무수화효소의 이산화탄소 포집 활성이 70% 이상인 것인 Thermovibrio ammonifwans 유래의, 탄산무수화효소.
【청구항 3】
제 1항에 있어서, 상기 탄산무수화효소는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드인, 탄산무수화효소.
【청구항 4】
제 3항에 있어서, 상기 탄산무수화효소는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 C-말단에 연결된, 제한효소인식부위 및 정제용 올리고펩타이드로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것인, 탄산무수화효소.
【청구항 5】
제 4항에 있어서, 상기 탄산무수화효소는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드인 탄산무수화효소. .
【청구항 6]
게 1항의 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산분자.
【청구항 7】
게 6항에 있어서, 상기 핵산분자는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 암호화되는 핵산서열로 이루어진, 핵산분자.
【청구항 8]
거] 6항 또는 게 7항의 핵산분자를 포함하는 재조합 백터.
【청구항 9]
게 8항에 있어서, 상기 재조합 백터는 플라스미드 백터, 코스미드 백터, 박테리오파지 백터 및 바이러스 백터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 백터.
【청구항 10】
거 1 8항의 재조합 백터로 형질전환된 숙주세포
【청구항 1 1 ]
제 10항에 있어서, 상기 숙주세포는 원핵세포인 것인, 숙주세포
【청구항 12】
제 1항 내지 제 5항중 어느 한항에 따른 탄산무수화효소, 상기 효소를 포함하는 미생물, 그 미생물 파쇄물， 또는 미생물 파쇄물의 추출물을 포함하는 이산화탄소 포집제.
【청구항 13】
제 1항 내지 제 5항중 어느 한항에 따른 탄산무수화효소를 이용하여， 40 내지 60 °C에서 이산화탄소를 포집하는 방법.
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