KR20130002922A - 재조합 생물촉매를 이용한 이산화탄소의 탄산염으로 전환 및 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탄산무수화효소(carbonic anhydrase)를 발현시킨 재조합 전세포 생물촉매 등을 이용하여 이산화탄소를 포집 및 탄산염을 제조하는 기술에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 재조합 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체의 전세포, 상기 전세포의 세포 파쇄액 또는 이의 분액, 또는 상기 전세포에서 분리한 재조합 탄산무수화 효소를 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물 및 이를 이용한 이산화탄소 포집 방법에 관한 것이며, 나아가 상기 조성물을 이용한 탄산염 제조용 조성물 및 탄산염 제조 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 생물촉매를 이용한 이산화탄소의 탄산염으로 전환 및 제조 방법 {Method for converting and producing carbonate minerals from carbon dioxide using recombinant biocatalyst}

본 발명은 탄산무수화효소(carbonic anhydrase)를 발현시킨 재조합 전세포(whole cell) 생물촉매 등을 이용하여 이산화탄소를 탄산염으로 전환하여 제조하는 기술에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환되어 세포질(cytoplasm), 세포간극(periplasmic space) 또는 세포표면(cell surface)에서 탄산무수화효소를 발현하는 재조합 전세포, 상기 전세포의 세포 파쇄액(cell lysate) 또는 이의 분액, 또는 상기 전세포에서 분리한 재조합 탄산무수화 효소를 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물 및 이를 이용한 이산화탄소 포집 방법에 관한 것이며, 나아가 상기 조성물을 이용한 탄산염 제조용 조성물 및 탄산염 제조 방법에 관한 것이다.

지구 온난화 문제와 관련해 대기 중 이산화탄소의 농도를 줄이려는 국제적인 노력이 점점 가속화되고 있다. 신재생 에너지가 개발되고 있기는 하지만 가까운 미래에도 화석 에너지의 사용이 불가피하다는 점을 고려해볼 때, 이산화탄소 저감 기술의 확보는 필수적이다. 이에, 이산화탄소에 대한 여러 가지 화학적, 물리적 흡수 방법들이 개발되고 있지만 대부분 높은 재생 열, 부식, 추가적인 저장 공간 등의 문제점을 안고 있다. 최근에는 생명체의 이산화탄소 고정화에 관여하는 효소를 이용하여 이산화탄소를 생물학적으로 포집하는 방법이 주목을 받고 있다. 이러한 생물학적 포집 방법은 기존의 화학적 및 물리적 방법과 비교해 환경 친화적이고 반응이 빠르다는 점, 그리고 무엇보다 이산화탄소의 전환을 통하여 최종산물로 화합물을 만들 수 있다는 점에서 큰 이점을 갖고 있다.

탄산무수화효소(carbonic anhydrase)는 내부에 아연을 포함하고 있는 금속 효소(metalloenzyme)로서, 포유 동물의 조직이나 식물, 녹조류 등에 존재한다고 알려져 있으며, 이산화탄소의 수화 반응을 촉매화하는 역할을 한다. 지금까지 발견된 탄산무수화효소는 서열 상동성에 따라 α, β, γ, δ, ε 의 다섯 가지 유형으로 나뉜다. 예컨대, 대부분의 포유 동물과 일부 박테리아 및 녹조류에서는 α 타입 형태로 존재하고, 대부분의 원핵 생물과 식물에서는 β 타입으로 존재하며, 그리고 메탄생성 박테리아인 메타노사르시나 써모필라(Methanosarcina thermophila) 에서는 γ 타입으로 존재한다. 최근에 보고된 δ 타입은 규조류에서 발견되었고, ε 타입은 화학 무기 영양 미생물의 일부에서 발견되었다.

대기 중의 이산화탄소는 다음의 반응식과 같이 물에 용해되어 탄산을 형성하고 최종적으로는 탄산 이온(CO₃ ^{2 -})의 형태로 존재하게 되는데, 여기에 금속 양이온이 존재할 경우 침전을 형성하게 된다.

CO₂(g) → CO₂(aq)

CO₂(aq) + H₂O → H₂CO₃

H₂CO₃ → H⁺ + HCO₃ ^-

HCO₃ ^- → H⁺ + CO₃ ^{2 -}

CO₃ ^{2 -} + Ca^{2 +} → CaCO₃

여기서 이산화탄소가 수화되는 반응이 율속 단계(rate-determining step)로 작용하게 되는데 이 반응은 탄산무수화효소의 존재 하에 가속화될 수 있다. 또한, 이렇게 이산화탄소의 포집을 촉매화 한 후 얻어지는 최종 형태인 탄산 이온은 칼슘이온(Ca^{2 +}), 망간이온(Mn^{2 +}), 철이온(Fe^{2 +}) 등의 금속 양이온의 존재 하에 탄산칼슘(CaCO₃), 탄산망간(MnCO₃), 또는 탄산철(FeCO₃) 등 다양한 탄산염으로 전환될 수 있고, 이 화학물질들은 산업적으로 다방면에서 활용할 수 있게 된다.

탄산무수화효소가 존재할 경우, 이산화탄소 수화의 촉매화와 더불어 침전 형성 또한 가속화 시킬 수 있다. 이것은 수화가 촉매화되어 탄산 이온이 더욱 빠르게 생김으로 인해 탄산염 침전 역시 빨라질 수 있기 때문이다.

그러나, 탄산무수화효소의 이러한 촉매 작용에도 불구하고, 탄산무수화효소를 자연계에서 추출하여 사용하는 경우 효소를 정제하는 비용 및 추가적인 효소 고정화 비용 등으로 인하여 산업적으로 이용하기에는 많은 제약이 따르고 있다. 종래에 주로 사용되고 있던 효소로는 소의 혈청에서 추출한 탄산무수화효소 (bovine carbonic anhydrase)가 있는데, g당 약 3백만원 이라는 고비용 문제로 인해 아직 실제적으로는 사용되지 못하고 있는 실정이다. 이와 같이, 종래에는 생물체로부터 탄산무수화효소를 직접 추출 및 정제하여 사용하는 기술만 일부 개발되고 있고 유전적으로 재조합된 탄산무수화효소는 효소의 생화학적 연구를 위하여 연구되고 있을 뿐, 대량생산이 가능한 재조합 탄산무수화효소를 이용하여 이산화탄소를 탄산염을 전환하고자 하는 시도가 없었으며, 나아가 재조합 전세포(whole cell)를 촉매로 사용하고자 하는 시도도 없었다.

이에 본 발명자들은 저비용 및 고효율로 탄산무수화효소를 이용하여 이산화탄소를 탄산염으로 전환하는 기술을 개발하기 위하여 노력한 결과, 실제적으로 활용할 수 있는 재조합 탄산무수화효소와 더불어 재조합 탄산무수화효소가 대량 발현된 형질전환 세포를 이용한 재조합 전세포 생물촉매를 개발하였다. 본 발명자들은 탄산무수화효소 유전자를 포함하는 벡터를 제작한 뒤 이를 대장균(Escherichia coli) 내에서 성공적으로 대량 발현시켰고, 이로부터 생산된 재조합 탄산무수화효소 및 탄산무수화효소가 발현되는 전세포 생물촉매의 높은 이산화탄소 수화 활성을 확인하였으며, 최종적으로 이산화탄소가 탄산염으로 효율적으로 전환됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체의 전세포, 상기 전세포의 세포 파쇄액 또는 이의 분액, 및 상기 전세포에서 분리한 탄산무수화효소 중 1종 이상을 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 이산화탄소 포집용 조성물을 이용하여 이산화탄소를 포집하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 이산화탄소 포집용 조성물 및 금속 양이온을 포함하는, 탄산염 또는 중탄산염 제조용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 이용하여 탄산염 또는 중탄산염을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체의 전세포, 상기 전세포의 세포 파쇄액 또는 이의 분액, 또는 상기 전세포에서 분리한 탄산무수화 효소 중 1종 이상을 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물에 관한 것이다.

본원에서 용어, "탄산무수화효소(carbonic anhydrase, CA)" 란 내부에 아연을 포함하고 있는 금속 효소로서 이산화탄소의 수화 반응(CO₂(aq) + H₂O → H⁺ + HCO₃ ^-) 을 촉매하는 효소를 말한다. 종래에 산업적으로 사용되던 소의 혈청 유래의 탄산무수화효소(bovine carbonic anhydrase)의 경우 정제가 어렵고 고비용이 소요되는 문제가 있어 실제적으로 사용에 제한이 있었는바, 본 발명에서는 유전자 재조합적 방법으로 탄산무수화효소를 대량 발현시켜 전세포 촉매 등으로 사용할 경우 저렴한 비용으로 손쉽게 이산화탄소 포집 및 탄산염 제조에 사용할 수 있으며, 나아가 이들 전세포 촉매 등이 기존의 소 혈청 유래의 효소와 대등한 활성을 보임을 확인하였다.

본 발명에서 탄산무수화효소는 유전자 재조합적으로 발현된 것을 특징으로 하며, 이산화탄소의 수화 반응을 촉매하는 기능을 가지는 한, 어떤 생물에서 유래한 것이라도 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 탄산무수화효소는 원핵 생물 또는 진핵 생물 유래의 것을 포함할 수 있고, 구체적으로는 그람 양성 세균, 그람 음성 세균, 박테리아, 곰팡이류, 효모류, 식물, 동물 또는 사람 유래의 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직한 일예로, 본 발명에서 탄산무수화효소는 시네코시스티스 (Synechocystis PCC6803), 대장균 (Escherichia coli) 또는 나이세리아 고노로에아에 (Neisseria gonorrhoeae) 유래의 것을 유전자 재조합적으로 발현시켜 사용할 수 있다. 나이세리아 고노로에아에는 이산화탄소가 존재하는 조건 하에 성장이 촉진되며, 이의 탄산무수화효소는 기존에 보고된 탄산무수화효소 중 k_cat/K_M 값이 가장 높다고 보고된 인간 탄산무수화효소 II (HCA II)와 비교하여 46%의 높은 값을 가지며, 모노머로 존재하기 때문에 세포 간극 또는 세포 표면으로의 분비가 용이해 촉매의 효율성을 높일 수 있어 바람직하다. 그러나, 이는 본 발명의 대표적인 예시에 해당하며, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 탄산무수화효소는, 바람직하게는 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체의 전세포, 상기 전세포의 세포 파쇄액 또는 이의 분액, 및 상기 전세포에서 분리한 탄산무수화효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 형태로 사용될 수 있다. 여기에서, 상기 분액은 상기 세포 파쇄액의 수용성 분액, 불용성 분액, 세포질 분액, 세포 간극 분액 또는 세포막 분액을 포함한다.

또한, 상기 형질전환 세포는 탄산무수화효소가 세포질(cytoplasm), 세포 간극(periplasmic space) 또는 세포 표면(cell surface)에 발현된 것이 바람직하다.

이를 위하여, 바람직한 일예로, 나이세리아 고노로에아에 유래의 탄산무수화효소로 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 사용할 수 있으며, 이는 세포질에서 발현될 수 있다. 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산은, 대표적인 예로 서열번호 2의 핵산 서열을 가지는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서 나이세리아 고노로에아에 유래의 탄산무수화효소로 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 사용할 수 있으며, 이는 서열번호 1의 N-말단에 대장균 세포 간극에 단백질의 발현을 유도하는 신호 서열인 토르에이(TorA) 서열을 삽입한 것으로 세포 간극에서 발현될 수 있다. 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산은, 대표적인 예로 서열번호 4의 핵산 서열을 가지는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서 나이세리아 고노로에아에 유래의 탄산무수화효소로 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 사용할 수 있으며, 이는 서열번호 1의 N-말단에 대장균 세포 표면으로 분비하기 위한 표면 발현 모체(surface anchoring motif)인 빙핵활성단백질(ice nucleation protein) 서열을 삽입한 것이므로 세포 표면에서 발현될 수 있다. 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산은, 대표적인 예로 서열번호 6의 핵산 서열을 가지는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서 시네코시스티스 유래의 탄산무수화효소로 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 사용할 수 있으며, 이는 세포질에서 발현될 수 있다. 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산은, 대표적인 예로 서열번호 8의 핵산 서열을 가지는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서 탄산무수화효소로 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 사용할 수 있으며, 이는 서열번호 7의 N-말단에 대장균 세포 간극에 단백질의 발현을 유도하는 신호 서열인 토르에이 서열을 삽입한 것으로 세포 간극에서 발현될 수 있다. 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산은, 대표적인 예로 서열번호 10의 핵산 서열을 가지는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서 대장균 유래의 탄산무수화효소로 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 사용할 수 있으며, 이는 세포질에서 발현될 수 있다. 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산은, 대표적인 예로 서열번호 12의 핵산 서열을 가지는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서 탄산무수화효소로 서열번호 13의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 사용할 수 있으며, 이는 서열번호 11의 N-말단에 대장균 세포 간극에 단백질의 발현을 유도하는 신호 서열인 토르에이 서열을 삽입한 것으로 세포 간극에서 발현될 수 있다. 서열번호 13의 아미노산 서열을 가지는 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산은, 대표적인 예로 서열번호 14의 핵산 서열을 가지는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

유전자 재조합적 방법으로 본 발명의 생물 촉매를 생산하는 과정은 다음 단계를 포함할 수 있다.

첫째, 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제조하는 단계이다.

상기 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산은, 바람직하게는 나이세리아 고노로에아에, 시네코시스티스 또는 대장균 유래의 것을 예시할 수 있으며, 숙주세포의 세포질, 세포 간극 또는 세포 표면 등 원하는 부위에 발현할 수 있도록 당업계에 알려진 통상적인 방법에 따라 적절히 변형될 수 있다. 구체적으로는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11 또는 서열번호 13의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산이며, 대표적으로 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12 또는 서열번호 14의 핵산 서열을 가지는 것을 예시할 수 있다.

상기 핵산을 삽입하기 위한 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 재조합 벡터를 사용할 수 있다. 본원에서 용어, "재조합 벡터"는 통상 외래 DNA의 단편이 삽입된 캐리어로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 본원에서 용어, "외래 DNA"란 외래종으로부터 기원되는 DNA를 의미하거나, 동일한 종으로부터 기원되는 경우에는 본래의 형태로부터 실질적으로 변형된 형태를 의미하며, 외래 유전자는 전사될 특정 목적 핵산으로 폴리펩타이드를 코딩한다. 본 발명의 목적상, 본원에서 상기 외래 DNA 는 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 의미한다.

재조합 벡터는 숙주세포에서 형질전환된 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결될 수 있다. 상기 재조합 벡터는 개체의 세포 내에서 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물로서, 이러한 유전자 작제물을 제조하기 위해 표준 재조합 DNA 기술을 이용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포 등의 각종 숙주세포에서 목적하는 유전자를 발현하고, 목적하는 단백질을 생산하는 기능을 하면 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다. 재조합 벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자, 종결코돈 및 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 그 외에 시그널 펩타이드를 코드하는 DNA, 인핸서 서열, 목적하는 유전자의 5’ 말단 및 3’ 말단의 비해독영역, 선별 마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 나이세리아 고노로에아에, 시네코시스티스 및 대장균 유래의 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 벡터 pET22b(+) 또는 pTrcHis에 삽입한 발현 벡터를 제작하였으며, 이는 도 1의 개열지도를 가지는 벡터이다.

둘째, 상기 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환 세포를 제조하는 단계이다.

재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법은 당업계에서 핵산을 세포 내로 도입하는 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있으며, 예컨대 인산칼슘법 또는 염화캄슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), 열충격법, PEG 등의 화학적 처리 방법, 유전자총(gene gun), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀법(cationic liposome) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주세포는 원핵 세포와 진핵 세포를 모두 포함하며, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 세균, 예를 들어 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC40, BMT 10 등의 동물 세포 등이 사용될 수 있는 숙주세포의 예이다. 바람직하게는 대장균이 사용될 수 있다

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 제작된 벡터, 즉 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 pET22b(+) 또는 pTrcHis에 삽입한 발현 벡터를 대장균 BL21 (DE3) 균주에 42℃에서 2분간 방치하는 열충격 방법에 의해 도입하여, 탄산무수화효소를 대량 발현하는 형질전환체를 제조하였다.

셋째, 상기 형질전환체를 배양하여 탄산무수화효소의 발현을 유도 및 축적하는 단계이다.

상기 재조합 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양하면 유용한 단백질을 대량으로 제조 및 분리할 수 있다. 배지와 배양조건은 숙주세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택하여 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양 시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다. 발현유도인자로 IPTG(isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside)를 사용하여 단백질 발현을 유도할 수 있고 유도시간은 단백질의 양이 최대화될 수 있도록 조절할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 형질전환된 대장균을 엠피실린이 첨가된 LB 배지에 접종하여 배양하고, 배양액의 흡광도(OD₆₀₀)가 600 nm에서 0.6 내지 0.8이 되었을 때 단백질의 발현 유도물질인 IPTG 및 단백질의 활성 부위(active site)에 아연을 도입하기 위해 ZnSO₄을 첨가한 후, 추가로 25℃에서 20시간 동안 배양하여 발현시켰으나, 상기 배양 조건은 당업자가 적절히 변형하여 사용할 수 있다.

상기의 방법으로 발현시킨 탄산무수화효소의 발현 여부는, 회수된 형질전환체 세포를 버퍼 수용액에 부유시킨 다음 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄하고, 파쇄된 세포의 일부를 수용성 분액 및 불용성 분액으로 나누어 통상의 SDS-PAGE 상에서 확인할 수 있다.

또한, 발현이 확인된 효소를 갖는 형질전환체를 전세포 생물촉매로 이용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 형질전환체 자체(전세포), 상기 형질전환 세포의 세포 파쇄액 또는 이의 분액, 및 상기 형질전환 세포에서 분리한 탄산무수화효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 형태를 생물촉매로 사용할 수 있다.

바람직한 양태로서, 탄산무수화효소를 분리 및 정제하는 과정 없이 재조합 탄산무수화효소가 세포질, 세포간극 또는 세포표면에 발현된 전세포 생물 촉매로 사용할 수 있다.

또 하나의 바람직한 양태로서, 탄산무수화효소를 발현하는 형질전환 세포는 동결-해동 반복, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파쇄할 수 있으며, 이러한 세포 파쇄물을 포함하는 세포 파쇄액을 생물 촉매로 바로 사용할 수 있다.

또 하나의 바람직한 양태로서, 상기와 같은 세포 파쇄물을 포함하는 세포 파쇄액을 수용성 분액과 불용성 분액으로 나눌 수 있으며, 이들 수용성 분액 또는 불용성 분액을 생물 촉매로 사용할 수 있다. 나아가, 세포질 분액, 세포 간극 분액 또는 세포막 분액 역시 생물 촉매로 사용할 수 있다.

또 하나의 바람직한 양태로서, 상기 형질전환체 내에서 발현에 의하여 생산된 탄산무수화효소를 분리 및 정제하여 생물 촉매로 사용할 수 있다. 발현된 탄산무수화효소는 형질전환 세포 파쇄 후 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리 및 정제 가능하다. 예를 들어, 이러한 분리 및 정제 방법으로 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 면역흡착 친화력 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 침투 HPLC), 등전성 포커스 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 나이세리아 고노로에아에 유래의 탄산무수화효소의 경우 회수된 형질전환 세포를 초음파 분쇄기로 파쇄한 후 파쇄된 세포의 수용성 분액을 니켈 레진이 충진된 컬럼을 이용한 친화도 크로마토그래피를 실시하여 탄산무수화효소를 분리 및 정제하였다. 정제된 단백질은 Tris-sulfate (pH7.6)를 이용한 투석을 통해 단백질 수용액에 남아있는 염(이미다졸)을 제거하였으며, 최종적인 탄산무수화효소의 정제여부는 통상의 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏을 통하여 확인하였다 (도 7 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 먼저 정제된 효소를 사용하여 이산화탄소 수화에 관한 활성을 확인한 후, 전세포와 초음파 분쇄기로 파쇄해서 얻은 수용성 분액의 이산화탄소 수화 활성을 확인하였다. 이 때, 양성 대조군으로는 소의 혈청에서 추출해 상업적으로 판매가 되고 있는 효소(bovine carbonic anhydrase)를 사용하였고, 음성 대조군으로는 이산화탄소 수화에 관한 활성을 갖지 않는 소혈청 알부민(bovine serum albumin)을 사용하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 형질전환 전세포와 이의 수용성 분액, 그리고 이로부터 분리한 탄산무수화 효소 모두 양성 대조군과 대등한 우수한 이산화탄소 포집 활성을 보여주었다 (도 8 참조).

따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 이산화탄소 포집용 조성물을 이용하여 이산화탄소를 포집하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명은 상기 이산화탄소 포집용 조성물을 제조하는 단계; 및 상기 이산화탄소 포집용 조성물에 이산화탄소를 공급하는 단계를 포함하는, 이산화탄소를 포집하는 방법에 관한 것이다.

이산화탄소 포집용 조성물을 제조하는 단계는, 상기에서 기술한 바와 같이, (1) 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제조하는 단계; (2) 상기 벡터로 형질전환된 형질전환 세포를 제조하는 단계; (3) 상기 형질전환체를 배양하여 탄산무수화효소의 발현을 유도 및 축적하는 단계; 및 (4) 상기 형질전환체 자체, 상기 형질전환 세포의 세포 파쇄액 또는 이의 분액, 및 상기 형질전환 세포에서 분리한 탄산무수화효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 제조하는 단계로 구체화할 수 있다.

상기 이산화탄소 포집용 조성물에 이산화탄소를 공급하는 방법으로는 특별한 제한이 없으며, 이산화탄소를 다량 함유하고 있으며 이산화탄소를 제거할 필요가 있는 공급원, 예를 들면 폐수 또는 연도가스 등의 형태로 공급할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이와 같이 본 발명의 이산화탄소 포집용 조성물을 이용하여 이산화탄소를 포집한 다음에는, 금속 양이온 공급원을 추가하여 포집된 이산화탄소를 최종적으로 탄산염 또는 중탄산염 침전물로 전환하여 산업적으로 다양하게 사용할 수 있다.

따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 이산화탄소 포집용 조성물 및 금속 양이온을 포함하는 탄산염 또는 중탄산염 제조용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 탄산염 또는 중탄산염을 제조하는 방법에 관한 것이다.

바람직하게, 본 발명은 상기 이산화탄소 포집용 조성물을 제조하는 단계; 및

상기 이산화탄소 포집용 조성물에 금속 양이온 및 이산화탄소를 공급하는 단계를 포함하는, 탄산염 또는 중탄산염을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본원에서 용어, "탄산염" 또는 "탄산염 침전물"은 일반적으로 탄산염 그룹 CO₃ 를 함유하는 무기물 성분을 의미한다. 당해 용어는 탄산염과 중탄산염의 혼합물 및 탄산염 이온만을 함유하는 종 둘 다를 포함할 수 있다. 또한, 용어 "중탄산염" 또는 "중탄산염 침전물"은 일반적으로 중탄산염 그룹 HCO₃ 를 함유하는 무기물 성분을 의미한다. 당해 용어는 탄산염과 중탄산염의 혼합물 및 중탄산염 이온만을 함유하는 종 둘 다를 포함할 수 있다.

이산화탄소와 반응하여 탄산염 또는 중탄산염을 생성하기 위하여 공급되는 금속 이온원은, 금속 이온을 포함한다면 특별히 제한되지 않으며, 용도에 따라 적절히 선택될 수 있지만, 바람직하게는 탄산원과 반응할 수 있고 방해석(칼사이트) 결정형, 아라고나이트 결정형, 배터라이트 결정형, 또는 비정질 결정형을 갖는 탄산염을 형성할 수 있는 것들이 사용될 수 있다.

예를 들어, 금속 이온원으로 Na⁺ 이온, Ca^{2 +} 이온, Fe^{2 +} 이온, Mn^{2 +} 이온, Sr^{2 +}이온, Ca^{2 +}이온, Ba²⁺이온, Zn^{2 +}이온, 또는 Pb^{2 +}이온 등을 사용할 수 있고, 이들을 포함하는 질산염, 염산염, 수산화물 또는 염기성 용액 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 금속 이온원을 사용하여 제조된 탄산염 침전물은, 예를 들어 탄산나트륨, 탄산칼슘, 탄산철, 탄산망간, 탄산스트론튬, 탄산바륨, 탄산아연 또는 탄산납일 수 있으나, 이는 예시에 불과할 뿐 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 이산화탄소 포집용 조성물에 금속 양이온 및 이산화탄소를 공급하는 단계에 있어서, 금속 양이온 및 이산화탄소는 순차적으로 또는 동시에 공급될 수 있다. 예를 들어, 금속 양이온을 먼저 공급한 후 이산화탄소를 순차적으로 공급하거나, 이산화탄소를 먼저 공급한 후 금속 양이온을 순차적으로 공급하거나, 또는 금속 양이온 및 이산화탄소를 동시에 공급할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 본 발명에 따라 정제된 탄산무수화효소, 수용성 분액 및 전세포를 이용하여 포집된 이산화탄소에 칼슘 이온을 공급하여, X-선 회전계 및 주사 전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)를 통하여 탄산칼슘이 형성된 것을 최종적으로 확인하였다(도 11 및 도 12 참조).

이와 같이 금속 양이온과 반응하여 최종적으로 생성된 탄산염 또는 중탄산염은 산업적으로 유용하게 활용될 수 있다. 예를 들어, 고무, 플라스틱, 제지, 페인트, 도료, 접착제, 화장품, 의약품 등 다양한 산업에서 무기 충전제로 광범위하게 응용이 가능하다.

특히, 탄산칼슘의 경우 자연계에 존재하는 가장 풍부한 광물의 하나이며, 이 중 침강성 탄산칼슘(Precipitated calcium carbonate)은 순수한 물에서는 잘 녹지 않고 적당한 비중을 가지며 고백색도, 불연성 등의 특징을 가지고 있는 무기분체로서 다양한 산업에서 무기 충전제로 광범위하게 사용된다. 또한, 아라고나이트형 침강성 탄산칼슘은 장경비(결정의 크기에 대한 길이의 비, Aspect Ratio)가 매우 큰 침상형으로서 고무, 플라스틱, 도료의 충전제나 제지용의 안료 등 공업 원료로 이용했을 때, 강도 증진은 물론 침상형의 복잡한 표면구조로 인해 백색도 향상 및 불투명도 조절이 가능해져 기계적 기능성 및 광학적 기능성을 부여할 수 있는 새로운 기능성 무기분체로서 대용 가능하다는 점에서, 본 발명은 최종적으로 탄산칼슘을 제공하는 데에도 유용함을 제공할 수 있다.

본 발명은 효소를 따로 추출하지 않고도 세포 파쇄 상등액을 직접 또는 탄산무수화효소가 발현된 형질전환 세포 자체를 전세포 생물촉매로 이용하여 이산화탄소를 포집할 수 있으므로 경제적인 측면에서 많은 이점을 가져다 줄 수 있다. 또한 최종 산물을 고부가가치 탄산염으로 전환함으로써 페인트, 플라스틱, 고무, 제지, 도료, 접착제, 화장품, 의약품 산업 등에서 다양한 용도로 활용이 가능하다.

도 1은 탄산무수화효소 유전자를 포함하는 발현 벡터 즉, (A) 세포질에서 발현하기 위한 벡터, (B) 세포 간극에서 발현하기 위한 벡터, 및 (C) 세포 표면에서 발현하기 위한 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 나이세리아 고노로에아에 유래의 탄산무수화효소를 세포질에서 발현시킨 경우, 전세포 분액(T), 수용성 분액(S) 및 불용성 분액(IS)을 (A) SDS-PAGE와 (B) 웨스턴 블랏으로 분석한 결과를 나타낸다
도 3은 시네코시스티스 유래의 탄산무수화효소를 세포질(SCA)과 세포 간극(TSCA)에서 발현시킨 경우, 수용성 분액(S), 불용성 분액(IS) 및 세포 간극 분액(PP)을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 대장균 유래의 탄산무수화효소를 세포질(ECA)과 세포 간극(TECA)에서 발현시킨 경우, 전세포 분액(T), 수용성 분액(S), 불용성 분액(IS) 및 세포 간극 분액(PP)을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 나이세리아 고노로에아에 유래의 탄산무수화효소를 세포 간극에서 발현시킨 경우, 전세포 분액(T), 세포파쇄액(CL), 수용성 분액(S), 불용성 분액(IS) 및 세포 간극 분액(PP)을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 나이세리아 고노로에아에 유래의 탄산무수화효소를 세포표면에서 발현시킨 경우, 세포 파쇄액(CL), 수용성 분액(S), 불용성 분액(IS), 세포질 분액(CP) 및 세포막 분액(TM)을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 7은 나이세리아 고노로에아에 유래의 탄산무수화효소가 세포질에서 발현된 형질전환체의 전세포(W), 수용성 분액(S) 및 정제 분액(P)을 (A) SDS-PAGE와 (B) 웨스턴 블랏으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 8은 나이세리아 고노로에아에 유래의 탄산무수화효소가 세포질에서 발현된 형질전환체의 전세포(W), 수용성 분액(S) 및 정제 분액(NCA)에 대하여 이산화탄소 수화 활성을 측정한 결과를 나타낸다. BSA는 음성 대조군으로 소혈청 알부민(bovine serum albumin)을 나타내며, BCA는 양성 대조군인 소 유래 탄산무수화효소(bovine carbonic anhydrase)를 나타낸다.
도 9는 나이세리아 고노로에아에 유래의 탄산무수화효소가 세포질에서 발현된 형질전환체의 전세포, 수용성 분액, 정제 분액, 양성대조군(BSA) 및 음성대조군(BCA)을 사용하여 탄산칼슘 침전 형성 시, 초기반응 2분 후 침전 형상 및 건조된 탄산칼슘 파우더 사진을 나타낸다.
도 10은 나이세리아 고노로에아에 유래의 탄산무수화효소가 세포질 또는 세포 간극에서 발현된 전세포를 사용하여 탄산칼슘 침전 형성 시, 초기 반응 1분 후 건조된 탄산칼슘 파우더 사진을 나타낸다.
도 11은 도 9에서 얻은 각 탄산칼슘 파우더를 X선 회절을 통해 결정의 종류를 확인한 결과이다.
도 12는 도 9에서 얻은 각 탄산칼슘 파우더를 주사전자현미경(SEM)을 통해 결정의 형태를 확인한 결과이다.
도 13은 재조합 탄산무수화효소를 형질전환 세포의 세포질, 세포 간극 및 세포 표면으로 각각 발현 할 수 있는 재조합 전세포 생물촉매를 이용하여 이산화탄소를 포집하고 최종적으로 탄산염으로 전환하는 과정을 나타낸 모식도이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 탄산무수화효소 발현 벡터의 제조

1-1. 세포질에서의 발현을 위한 벡터의 제조

나이세리아 고노로에아에의 게놈 DNA 를 두 개의 프라이머 forward primer: 5'-CATATGCACGGCAATCACACC-3' (서열번호 15) 및 backward primer: 5' AAGCTTTTCAATAACTACACGTGCATT-3' (서열번호 16)와 Taq DNA 중합효소, dNTP 혼합액 및 PCR 버퍼를 이용하여 나이세리아 고노로에아에의 탄산무수화효소 유전자를 증폭하였고 (변성단계 95℃, 30초, 결합단계 55℃, 30초, 중합단계 72℃, 1분 과정을 30 사이클 반복 후, 4℃에서 식힘), 이를 NdeI, XhoI 제한 효소를 이용하여 pET-22b(+) 벡터에 도입하여, 나이세리아 고노로에아에 유래 탄산무수화효소의 세포질 발현용 벡터를 제조하였다.

시네코시스티스 게놈 DNA 를 두 개의 프라이머 forward primer: 5'-CATATGGCCGAAGTTTCATTGATATCC-3' (서열번호 17) 및 backward primer: 5'-CAAGCTTACGGGAGCCTCGATAAATGCGC-3' (서열번호 18)와 Taq DNA 중합효소, dNTP 혼합액 및 PCR 버퍼를 이용하여 시네코시스티스의 탄산무수화효소 유전자를 증폭하였고 (변성단계 95℃, 30초, 결합단계 55℃, 30초, 중합단계 72℃, 1분 과정을 30 사이클 반복 후, 4℃에서 식힘), 이를 NdeI, HindIII 제한 효소를 이용하여 TorA-GFP를 제거한 pTTG 벡터(대한민국특허출원 제2005-0099758호)에 도입하여, 시네코시스티스 유래 탄산무수화효소의 세포질 발현용 벡터를 제조하였다.

대장균 게놈 DNA 를 두 개의 프라이머 forward primer: 5'-CATATGAAAGAGATTATTGATGGATTCC-3' (서열번호 19) 및 backward primer: 5' CAAGCTTCGCTGCGGTCGGTTGGCGTAG-3' (서열번호 20)와 Taq DNA 중합효소, dNTP 혼합액 및 PCR 버퍼를 이용하여 대장균의 탄산무수화효소 유전자를 증폭하였고 (변성단계 95℃, 30초, 결합단계 55℃, 30초, 중합단계 72℃, 1분 과정을 30 사이클 반복 후, 4℃에서 식힘), 이를 NdeI, HindIII 제한 효소를 이용하여 TorA-GFP를 제거한 pTTG 벡터에 도입하여, 대장균 유래 탄산무수화효소의 세포질 발현용 벡터를 제조하였다.

1-2. 세포 간극에서의 발현을 위한 벡터의 제조

나이세리아 고노로에아에의 게놈 DNA 를 두 개의 프라이머 forward primer: 5'-CCATGGGACACGGCAATCACACC-3' (서열번호 21) 및 backward primer: 5'-AAGCTTTTCAATAACTACACGTGCATT-3' (서열번호 16)와 Taq DNA 중합효소, dNTP 혼합액 및 PCR 버퍼를 이용하여 나이세리아 고노로에아에의 탄산무수화효소 유전자를 증폭하였고 (변성단계 95℃, 30초, 결합단계 55℃, 30초, 중합단계 72℃, 1분 과정을 30 사이클 반복 후, 4℃에서 식힘), 이를 NdeI, XhoI 제한 효소를 이용하여 pET-22b(+) 벡터에 도입하여, 이를 NcoI, HindIII 제한 효소를 이용하여 GFP를 제거한 pETG 벡터(대한민국특허출원 제2005-0099758호)에 도입하여, 나이세리아 고노로에아에 유래 탄산무수화효소의 세포 간극 발현용 벡터를 제조하였다.

시네코시스티스 게놈 DNA 를 두 개의 프라이머 forward primer: 5'-CCATGGGAGCCGAAGTTTCATTGATATCC-3' (서열번호 22) 및 backward primer: 5'-CAAGCTTACGGGAGCCTCGATAAATGCGC-3' (서열번호 18)와 Taq DNA 중합효소, dNTP 혼합액 및 PCR 버퍼를 이용하여 시네코시스티스의 탄산무수화효소 유전자를 증폭하였고 (변성단계 95℃, 30초, 결합단계 55℃, 30초, 중합단계 72℃, 1분 과정을 30 사이클 반복 후, 4℃에서 식힘), 이를 NcoI, HindIII 제한 효소를 이용하여 GFP를 제거한 pTTG 벡터(대한민국특허; 특허번호 2005-0099758, 출원일 2005년 10월 21일)에 도입하여, 시네코시스티스 유래 탄산무수화효소의 세포 간극 발현용 벡터를 제조하였다.

대장균 게놈 DNA 를 두 개의 프라이머 forward primer: 5'-CCATGGGAAAAGATTATTGATGGATTC-3' (서열번호 23) 및 backward primer: 5'-CAAGCTTCGCTGCGGTCGGTTGGCGTAG-3' (서열번호 20)와 Taq DNA 중합효소, dNTP 혼합액 및 PCR 버퍼를 이용하여 대장균의 탄산무수화효소 유전자를 증폭하였고 (변성단계 95℃, 30초, 결합단계 55℃, 30초, 중합단계 72℃, 1분 과정을 30 사이클 반복 후, 4℃에서 식힘), 이를 NcoI, HindIII 제한 효소를 이용하여 GFP를 제거한 pTTG 벡터에 도입하여, 대장균 유래 탄산무수화효소의 세포 간극 발현용 벡터를 제조하였다.

1-3. 세포 표면에서의 발현을 위한 벡터의 제조

나이세리아 고노로에아에의 게놈 DNA 를 두 개의 프라이머 forward primer: 5'-AGATCTCACGGCAATCACACCCATTGG-3' (서열번호 24) 및 backward primer: 5'-AAGCTTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG-3' (서열번호 25)와 Taq DNA 중합효소, dNTP 혼합액 및 PCR 버퍼를 이용하여 탄산무수화효소 유전자를 증폭하였고 (변성단계 95℃, 30초, 결합단계 55℃, 30초, 중합단계 72℃, 1분 과정을 30 사이클 반복 후, 4℃에서 식힘), 이를 BglII, HindIII 제한 효소를 이용하여 pINPNC-OPH 벡터(Li L, Kang DG, Cha HJ. 2004, Biotechnol Bioeng 85:214-221)에 도입하여, 나이세리아 고노로에아에 유래 탄산무수화효소의 세포 표면 발현용 벡터를 제조하였다.

실시예 2. 세포질, 세포 간극, 세포 표면에서의 발현을 위한 벡터를 포함하는 형질전환체의 제조

상기 실시예 1-1, 1-2 및 1-3에서 각각 제조한 세포질, 세포 간극, 및 세포 표면 발현용 벡터를 포함하며 재조합 탄산무수화효소를 발현하는 형질전환체를 제조하기 위하여, 42℃에서 2분간 열충격을 가하여 각각의 벡터를 각각 대장균 BL21(DE3)에 도입하였다. 벡터가 도입된 각각의 형질전환체는 앰피실린이 첨가되어 있는 LB 배지에서 선별하였다.

실시예 3. 각 형질전환체를 이용한 단백질의 발현과 전세포 생물촉매의 제조

상기 실시예 2에서 제조한 형질전환체를 50 μg/mL의 앰피실린이 첨가된 통상의 37℃, LB 배지에서 배양하여 배양액의 흡광도(OD₆₀₀)가 0.6~0.8 정도가 되었을 때 유도물질인 IPTG(isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside, 1mM)을 첨가하여 단백질의 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후 추가로 20시간 동안 25℃에서 배양한 후, 배양된 세포를 4000 rpm에서 10분간 원심 분리한 다음 상등액을 제거하고 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 세포 파쇄를 위한 용액 (50 mM sodium phosphate buffer, 300mM NaCl, pH 8)에 부유시킨 다음 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄하였다.

3-1. 세포질 발현 확인

나이세리아 고노로에아에 유래 탄산무수화효소의 세포질 발현 벡터를 포함하는 파쇄된 세포는 전세포 분액(T)과 이의 수용성 분액(S) 및 불용성 분액(IS)으로 나누어 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 재조합 탄산무수화효소는 약 25 kDa의 분자량을 가지며 대장균에서 성공적으로 발현되었으며 이는 이론적으로 계산된 탄산무수화효소 분자량인 25.3kDa과 잘 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 발현된 단백질의 대부분은 올바른 접힘(folding)이 일어나 활성을 보일 수 있는 수용성 분액(lane S)으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

시네코시스티스 유래 탄산무수화효소의 세포질 발현 벡터를 포함하는 파쇄된 세포(SCA)는 수용성 분액(S) 및 불용성 분액(IS)으로 나누어 웨스턴 블랏을 이용하여 분석하였다. 도 3에 나타난 바와 같이 재조합 탄산무수화효소는 약 34 kDa과 잘 일치하는 것을 확인할 수 있었고 발현된 단백질의 상당부분은 수용성(lane S)으로 발현되었다.

대장균 유래 탄산무수화효소의 세포질 발현 벡터를 포함하는 파쇄된 세포(ECA)는 전세포 분액(T), 수용성 분액(S) 및 불용성 분액(IS)으로 나누어 웨스턴 블랏을 이용하여 분석하였다. 도 4에 나타난 바와 같이 재조합 탄산무수화효소는 23 kDa과 잘 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 하지만, 발현된 단백질의 상당부분은 불용성(lane IS)으로 발현되었다.

3-2. 세포 간극 발현 확인

나이세리아 고노로에아에 유래 탄산무수화효소의 세포 간극 발현 벡터를 포함하는 파쇄된 세포는 전세포 분액(T), 세포파쇄액(CL), 수용성 분액(S), 불용성 분액(IS) 및 세포 간극 분액(PP)으로 나누어 웨스턴 블랏를 이용하여 분석하였다. 여기서 세포 간극 분액을 수득하기 위하여, 세포 파쇄액을 4000rpm에서 10분간 원심 분리 한 후, 상등액을 버리고 TEX 버퍼(50mM Tris, 3mM EDTA, 0.1% Triton X-100,pH 8.0) 로 부유시킨 다음 1 시간 동안 교반하였다. 이를 다시 4000rpm에서 10분간 원심 분리 하면 상등액은 세포 간극 분액(PP)이 된다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 발현된 재조합 탄산무수화효소는 이론적으로 계산한, 신호서열과 함께 발현된 경우 (28kDa) 그리고 신호서열 없이 발현된 경우 (25.3kDa)와 모두 잘 일치함을 확인할 수 있었다. 또한, 세포 간극 분액에서의 밴드 검출을 통하여 재조합 탄산무수화효소가 세포 간극으로 성공적으로 분비 되었음을 확인할 수 있었다(lane PP).

시네코시스티스 유래 탄산무수화효소의 세포 간극 발현 벡터를 포함하는 파쇄된 세포(TSCA)는 수용성 분액(S), 불용성 분액(IS) 및 세포 간극 분액(PP)으로 나누어 웨스턴 블랏를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 발현된 재조합 탄산무수화효소는 세포 간극으로 분비가 효율적으로 되지 않음을 확인하였다.

대장균 유래 탄산무수화효소의 세포 간극 발현 벡터를 포함하는 파쇄된 세포(TECA)는 전세포 분액(T), 수용성 분액(S), 불용성 분액(IS) 및 세포 간극 분액(PP)으로 나누어 웨스턴 블랏를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 발현된 재조합 탄산무수화효소는 세포 간극으로 많은 양이 분비가 되었음을 확인할 수 있었다(lane PP).

3-3. 세포 표면 발현 확인

나이세리아 고노로에아에 유래 탄산무수화효소의 세포 표면 발현 벡터를 포함하는 파쇄된 세포는 세포 파쇄액(CL), 수용성 분액(S), 불용성 분액(IS), 세포질 분액(CP) 및 세포막 분액(TM)에서의 발현 확인을 위해 추가적으로 세포질 분액과 세포막 분액으로 나누었다. 여기서 세포질과 세포막 분액의 준비 과정은 다음과 같다. 배양된 세포를 원심 분리 하여 회수한 후, PBS(130mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM Na₂HPO₄,1.7mM KH₂PO₄) 에서 세척하고 9000rpm에서 30분간 원심 분리하였다. 상등액을 버리고 PBS에 1mM EDTA, 10ug/ml이 첨가된 용액을 넣고 2시간 반응을 시킨 후 초음파 분쇄기를 사용하여 세포 파쇄액을 준비하였다. 이렇게 얻은 세포 파쇄액은 초원심분리기를 이용해 39000rpm에서 1시간 원심 분리 하면 가라앉은 분액은 전체 세포막 분액(TM), 상등액은 세포질 분액(CP)이 된다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 전체 세포막 분액에 이론적으로 계산한 INPNC (25kDa)와 탄산무수화효소(25.3kDa)가 함께 발현된 크기인 50.3 kDa와 유사한 단백질 밴드(약 55 kDa)가 검출됨으로써 재조합 탄산무수화효소가 세포표면에 발현되는 것을 확인 할 수 있다(lane TM). 실제로, INPNC와 함께 단백질을 발현시켰을 경우 계산된 크기보다 더 크게 발현됨이 보고되었다 (J. Biotechnol., Vol.118(4), pp.339-470).

실시예 4. 세포질에서 발현이 확인된 탄산무수화효소의 정제

실시예 3-1에서 제조한, 세포질에서 탄산무수화효소의 발현이 확인된 대장균 전세포 생물촉매의 수용성 분액으로부터 니켈 컬럼 크로마토그래피에 의하여 단백질을 분리 정제하였다. 구체적으로, 단백질 수용성 분액을 니켈 레진이 충진된 컬럼에 적용하여 단백질과 컬럼이 결합하도록 하고, 세척 버퍼(50 mM sodium phosphate buffer, 300mM NaCl, 40mM imidazole, pH 8.0)로 컬럼에 결합하지 않은 단백질을 씻어 냈다. 컬럼으로부터 단백질의 용출은 50 mM 인산나트륨 버퍼, 300mM NaCl 및 250mM 이미다졸 (pH 8.0)을 이용하여 진행하였고, 상기 정제된 용액은 100mM Tris-sulfate (pH7.6) 을 이용한 투석을 통해 포함되어 있는 염을 제거하였다.

도 7은 이와 같이 정제된 단백질(P), 그리고 전세포 분액(W) 및 수용성 분액(S)에서의 (A) SDS-PAGE와 (B) 웨스턴 블랏 사진을 나타낸다. 도 7에 나타난 바와 같이, 재조합 탄산무수화효소는 99% 이상의 높은 순도를 갖고 분리정제되었음을 확인할 수 있다(lane P). 또한, 전체 단백질(151.7 mg/L) 중 70%가 탄산무수화효소 단백질로 발현된 106.2 mg/L의 탄산무수화효소 단백질을 얻었고 정제 수율 62.8%을 통해 총 66.7 mg/L의 정제한 탄산무수화효소를 얻었다.

실시예 5. 분리 정제된 탄산무수화효소와 재조합 전세포 생물촉매를 이용한 이산화탄소 수화 활성 확인

실시예 4에서 정제한 단백질(NCA)과, 실시예 3에서 제조한, 세포질에서 탄산무수화효소의 발현이 확인된 대장균 전세포 생물촉매의 수용성 분액(S) 및 전세포(W)를 각각 사용하여 이산화탄소의 수화에 관한 활성을 확인하였다. 양성 대조군으로는 소의 혈청에서 추출해 상업적으로 판매가 되고 있는 효소(bovine carbonic anhydrase, BCA)를 사용하였고, 음성 대조군으로는 이산화탄소 수화에 관한 활성을 갖지 않는 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 사용하였다. 활성 측정 과정은 준비한 각 분액과 20mM Tris-sulfate 버퍼(pH8.3), CO₂ 포화된 H₂O 용액을 함께 사용하였고 pH가 8.0 으로부터 7.0으로 감소하는 시간을 모니터링하여 비교하였다. pH가 빨리 떨어질수록 이산화탄소 포집에 관한 활성이 높은 것을 의미한다.

그 결과 도 8에 나타난 바와 같이, 정제된 탄산무수화효소(NCA; ~2,200 U/mg)는 상업적으로 판매되고 있는 BCA(3,090 U/mg)에 비해 약 71%의 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었고, 정제하지 않은 수용성 분액(S; ~920 U/mg)과 전세포(W; ~730 U/mg) 또한 높은 이산화탄소 수화 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 칼슘 이온 공급을 통한 탄산칼슘 침전 형성

실시예 5에서 사용했던 음성 대조군(BSA), 양성 대조균(BCA), 세포질 발현 세포의 세 가지 샘플(정제한 탄산무수화효소, 수용성 분액, 전세포) 및 세포 간극 발현 전세포를, 200mM Tris-sulfate 버퍼 (pH 10.5) 그리고 칼슘 이온의 공급을 위해 100mM CaCl₂ 용액을 사용하여, 탄산칼슘 침전의 형성 여부를 확인하였다. 구체적으로 버퍼와 CaCl₂ 용액 각 20ml 그리고 각 샘플과 함께 섞어 교반시키는 상태에서 기체 CO₂ 를 일정한 유량으로 흘려주면서 침전 양상을 관찰하였다.

도 9는 기체 CO₂ 공급을 시작한지 2분 후 생긴 침전을 0.2 μm 막여과기를 사용하여 여과한 후, 80℃ 에서 약 30분간 건조하여 얻은 침전 가루의 양을 비교한 것이다. 그 결과 BSA를 제외한 BCA, 정제 분액, 수용성 분액, 세포질 발현 전세포의 경우에는 탄산무수화효소의 작용으로, 이산화탄소 수화 작용의 촉매화와 더불어 침전 형성 또한 빨라짐을 확인 할 수 있었으며 이로부터 얻어진 침전물을 건조하여 다량의 탄산칼슘 파우더를 얻을 수 있었다.

또한, 세 가지 전세포 (음성 대조군, 세포질 발현 전세포, 세포간극 발현 전세포)와 200mM Tris-Cl 버퍼 (pH 10.8) 그리고 칼슘 이온의 공급을 위해 500mM CaCl₂ 용액을 사용하여, 탄산칼슘 침전의 형성 여부를 확인하였다. 음성 대조군 전세포로는 pET22(+) 벡터만이 포함된 대장균 세포를 사용하였다. 구체적으로 버퍼 23mL와 CaCl₂ 용액 6ml 그리고 각 전세포를 함께 섞어 교반시키는 상태에서 기체 CO₂를 일정한 유량 (2 L/min)으로 흘려주면서 침전 양상을 관찰하였다.

도 10은 기체 CO₂ 공급을 시작한지 1분 후 생긴 침전을 0.2 μm 막여과기를 사용하여 여과한 후, 80℃ 에서 약 30분간 건조하여 얻은 침전 가루의 양을 비교한 것이다. 그 결과 세포 간극 발현 전세포의 경우 음성 대조군에 비해서 약 6.3배, 그리고 세포질 발현 전세포에 비해서 2.6배의 많은 탄산칼슘 파우더를 얻을 수 있었다. 따라서, 세포 간극으로의 발현은 세포막의 물질전달 저해를 줄임으로써 전세포를 생물촉매로 효과적으로 이용할 수 있는 전략임을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 생성된 탄산칼슘의 분석

실시예 6에서 얻어진 각각의 파우더는 X 선 회절(X-ray diffraction)과 주사전자현미경(SEM)을 사용하여 탄산칼슘 결정임을 확인하였다. 그 결과 도 11에 나타난 바와 같이, X 선 회절 피크 패턴의 분석을 통해, 침전물은 칼사이트(calcite)와 배터라이트(vaterite)가 공존하는 탄산칼슘 결정임을 확인할 수 있었고, 양성 대조군 탄산무수화효소(BCA), 정제한 탄산무수화효소, 수용성 분액, 전세포의 경우에는 침전형성의 가속화와 더불어 배터라이트의 칼사이트로의 전이 또한 촉진되었음을 확인할 수 있었다. 효소가 작용하지 않은 음성대조군 BSA의 경우는 침전 형성이 느려 칼사이트로의 전이는 아직 이루어지지 않은 것을 확인할 수 있었다. 그리고 도 12에 나타난 바와 같이, 주사전자현미경을 통해 육면체의 칼사이트와 구형의 배터라이트가 공존하는 탄산칼슘 결정임을 확인할 수 있었고, 마찬가지로 탄산무수화효소가 작용한 경우, 침전형성의 가속화와 더불어 배터라이트의 칼사이트로의 전이 또한 촉진되었음을 확인할 수 있었다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Method for converting and producing carbonate minerals from carbon dioxide using recombinant biocatalyst <130> DPP20120950KR <160> 25 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 240 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(240) <223> carbonic anhydrase (cytoplasmic expression) <400> 1 Met His Gly Asn His Thr His Trp Gly Tyr Thr Gly His Asp Ser Pro 1 5 10 15 Glu Ser Trp Gly Asn Leu Ser Glu Glu Phe Arg Leu Cys Ser Thr Gly 20 25 30 Lys Asn Gln Ser Pro Val Asn Ile Thr Glu Thr Val Ser Gly Lys Leu 35 40 45 Pro Ala Ile Lys Val Asn Tyr Lys Pro Ser Met Val Asp Val Glu Asn 50 55 60 Asn Gly His Thr Ile Gln Val Asn Tyr Pro Glu Gly Gly Asn Thr Leu 65 70 75 80 Thr Val Asn Gly Arg Thr Tyr Thr Leu Lys Gln Phe His Phe His Val 85 90 95 Pro Ser Glu Asn Gln Ile Lys Gly Arg Thr Phe Pro Met Glu Ala His 100 105 110 Phe Val His Leu Asp Glu Asn Lys Gln Pro Leu Val Leu Ala Val Leu 115 120 125 Tyr Glu Ala Gly Lys Thr Asn Gly Arg Leu Ser Ser Ile Trp Asn Val 130 135 140 Met Pro Met Thr Ala Gly Lys Val Lys Leu Asn Gln Pro Phe Asp Ala 145 150 155 160 Ser Thr Leu Leu Pro Lys Arg Leu Lys Tyr Tyr Arg Phe Ala Gly Ser 165 170 175 Leu Thr Thr Pro Pro Cys Thr Glu Gly Val Ser Trp Leu Val Leu Lys 180 185 190 Thr Tyr Asp His Ile Asp Gln Ala Gln Ala Glu Lys Phe Thr Arg Ala 195 200 205 Val Gly Ser Glu Asn Asn Arg Pro Val Gln Pro Leu Asn Ala Arg Val 210 215 220 Val Ile Glu Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His 225 230 235 240 <210> 2 <211> 723 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <220> <221> gene <222> (1)..(723) <223> carbonic anhydrase (cytoplasmic expression) <400> 2 atgcacggca atcacaccca ttggggctat accggacacg actctcccga aagctggggc 60 aatctgtcag aagaattccg tttgtgctcc accggcaaaa accaatctcc ggtaaacatt 120 accgaaaccg tttccggcaa actgcccgcc atcaaagtca attacaaacc gagtatggtt 180 gacgtggaaa acaacggcca caccattcag gtcaattatc ccgaaggcgg caataccctg 240 accgtgaacg gccgcaccta taccctgaaa cagttccact tccacgtgcc gagcgaaaac 300 caaatcaaag gccgcacttt cccgatggaa gctcacttcg tccacttaga cgaaaacaaa 360 cagcctttag tattagccgt gctgtatgaa gccggcaaaa ccaacggccg cctgtcttcc 420 atctggaacg tcatgccgat gaccgcagga aaagtgaaac tcaaccaacc gttcgacgca 480 tccaccctac tgccgaaacg gttgaaatac taccgctttg ccggttcgct gaccacgccg 540 ccgtgcacag agggcgtatc atggttggtg ttgaaaactt atgaccacat cgaccaagcg 600 caagcggaaa aattcacccg cgccgtcggt tcggaaaaca accgccccgt acagcctctg 660 aatgcacgtg tagttattga aaagcttgcg gccgcactcg agcaccacca ccaccaccac 720 tga 723 <210> 3 <211> 284 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(284) <223> carbonic anhydrase (periplasmic expression) <400> 3 Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala 1 5 10 15 Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu 20 25 30 Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala Ala Gln Ala Ala Met Gly His Gly Asn 35 40 45 His Thr His Trp Gly Tyr Thr Gly His Asp Ser Pro Glu Ser Trp Gly 50 55 60 Asn Leu Ser Glu Glu Phe Arg Leu Cys Ser Thr Gly Lys Asn Gln Ser 65 70 75 80 Pro Val Asn Ile Thr Glu Thr Val Ser Gly Lys Leu Pro Ala Ile Lys 85 90 95 Val Asn Tyr Lys Pro Ser Met Val Asp Val Glu Asn Asn Gly His Thr 100 105 110 Ile Gln Val Asn Tyr Pro Glu Gly Gly Asn Thr Leu Thr Val Asn Gly 115 120 125 Arg Thr Tyr Thr Leu Lys Gln Phe His Phe His Val Pro Ser Glu Asn 130 135 140 Gln Ile Lys Gly Arg Thr Phe Pro Met Glu Ala His Phe Val His Leu 145 150 155 160 Asp Glu Asn Lys Gln Pro Leu Val Leu Ala Val Leu Tyr Glu Ala Gly 165 170 175 Lys Thr Asn Gly Arg Leu Ser Ser Ile Trp Asn Val Met Pro Met Thr 180 185 190 Ala Gly Lys Val Lys Leu Asn Gln Pro Phe Asp Ala Ser Thr Leu Leu 195 200 205 Pro Lys Arg Leu Lys Tyr Tyr Arg Phe Ala Gly Ser Leu Thr Thr Pro 210 215 220 Pro Cys Thr Glu Gly Val Ser Trp Leu Val Leu Lys Thr Tyr Asp His 225 230 235 240 Ile Asp Gln Ala Gln Ala Glu Lys Phe Thr Arg Ala Val Gly Ser Glu 245 250 255 Asn Asn Arg Pro Val Gln Pro Leu Asn Ala Arg Val Val Ile Glu Lys 260 265 270 Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His 275 280 <210> 4 <211> 855 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <220> <221> gene <222> (1)..(855) <223> carbonic anhydrase (periplasmic expression) <400> 4 atgaacaata acgatctctt tcaggcatca cgtcggcgtt ttctggcaca actcggcggc 60 ttaaccgtcg ccgggatgct ggggccgtca ttgttaacgc cgcgacgtgc gactgcggcg 120 caagcggcca tgggacacgg caatcacacc cattggggct ataccggaca cgactctccc 180 gaaagctggg gcaatctgtc agaagaattc cgtttgtgct ccaccggcaa aaaccaatct 240 ccggtaaaca ttaccgaaac cgtttccggc aaactgcccg ccatcaaagt caattacaaa 300 ccgagtatgg ttgacgtgga aaacaacggc cacaccattc aggtcaatta tcccgaaggc 360 ggcaataccc tgaccgtgaa cggccgcacc tataccctga aacagttcca cttccacgtg 420 ccgagcgaaa accaaatcaa aggccgcact ttcccgatgg aagctcactt cgtccactta 480 gacgaaaaca aacagccttt agtattagcc gtgctgtatg aagccggcaa aaccaacggc 540 cgcctgtctt ccatctggaa cgtcatgccg atgaccgcag gaaaagtgaa actcaaccaa 600 ccgttcgacg catccaccct actgccgaaa cggttgaaat actaccgctt tgccggttcg 660 ctgaccacgc cgccgtgcac agagggcgta tcatggttgg tgttgaaaac ttatgaccac 720 atcgaccaag cgcaagcgga aaaattcacc cgcgccgtcg gttcggaaaa caaccgcccc 780 gtacagcctc tgaatgcacg tgtagttatt gaaaagcttg cggccgcact cgagcaccac 840 caccaccacc actga 855 <210> 5 <211> 462 <212> PRT <213> Neisseria gonorrhoeae <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(462) <223> carbonic anhydrase (cell surface expression) <400> 5 Met Ala Leu Asp Lys Ala Leu Val Leu Arg Thr Cys Ala Asn Asn Met 1 5 10 15 Ala Asp His Cys Gly Leu Ile Trp Pro Ala Ser Gly Thr Val Glu Ser 20 25 30 Arg Tyr Trp Gln Ser Thr Arg Arg His Glu Asn Gly Leu Val Gly Leu 35 40 45 Leu Trp Gly Ala Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ser Val His Ala Asp Ala 50 55 60 Arg Trp Ile Val Cys Glu Val Ala Val Ala Asp Ile Ile Ser Leu Glu 65 70 75 80 Glu Pro Gly Met Val Lys Phe Pro Arg Ala Glu Val Val His Val Gly 85 90 95 Asp Arg Ile Ser Ala Ser His Phe Ile Ser Ala Arg Gln Ala Asp Pro 100 105 110 Ala Ser Thr Ser Thr Ser Thr Ser Thr Ser Thr Leu Thr Pro Met Pro 115 120 125 Thr Ala Ile Pro Thr Pro Met Pro Ala Val Ala Ser Val Thr Leu Pro 130 135 140 Val Ala Glu Gln Ala Arg His Glu Val Phe Asp Val Ala Ser Val Ser 145 150 155 160 Ala Ala Ala Ala Pro Val Asn Thr Leu Pro Val Thr Thr Pro Gln Asn 165 170 175 Leu Gln Thr Arg Ser Arg Leu Trp Asp Gly Lys Arg Tyr Arg Gln Leu 180 185 190 Val Ala Arg Thr Gly Glu Asn Gly Val Glu Ala Asp Ile Pro Tyr Tyr 195 200 205 Val Asn Glu Asp Asp Asp Ile Val Asp Lys Pro Asp Glu Asp Asp Asp 210 215 220 Trp Ile Glu Val His Gly Asn His Thr His Trp Gly Tyr Thr Gly His 225 230 235 240 Asp Ser Pro Glu Ser Trp Gly Asn Leu Ser Glu Glu Phe Arg Leu Cys 245 250 255 Ser Thr Gly Lys Asn Gln Ser Pro Val Asn Ile Thr Glu Thr Val Ser 260 265 270 Gly Lys Leu Pro Ala Ile Lys Val Asn Tyr Lys Pro Ser Met Val Asp 275 280 285 Val Glu Asn Asn Gly His Thr Ile Gln Val Asn Tyr Pro Glu Gly Gly 290 295 300 Asn Thr Leu Thr Val Asn Gly Arg Thr Tyr Thr Leu Lys Gln Phe His 305 310 315 320 Phe His Val Pro Ser Glu Asn Gln Ile Lys Gly Arg Thr Phe Pro Met 325 330 335 Glu Ala His Phe Val His Leu Asp Glu Asn Lys Gln Pro Leu Val Leu 340 345 350 Ala Val Leu Tyr Glu Ala Gly Lys Thr Asn Gly Arg Leu Ser Ser Ile 355 360 365 Trp Asn Val Met Pro Met Thr Ala Gly Lys Val Lys Leu Asn Gln Pro 370 375 380 Phe Asp Ala Ser Thr Leu Leu Pro Lys Arg Leu Lys Tyr Tyr Arg Phe 385 390 395 400 Ala Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys Thr Glu Gly Val Ser Trp Leu 405 410 415 Val Leu Lys Thr Tyr Asp His Ile Asp Gln Ala Gln Ala Glu Lys Phe 420 425 430 Thr Arg Ala Val Gly Ser Glu Asn Asn Arg Pro Val Gln Pro Leu Asn 435 440 445 Ala Arg Val Val Ile Glu Leu Glu His His His His His His 450 455 460 <210> 6 <211> 1389 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <220> <221> gene <222> (1)..(1389) <223> carbonic anhydrase (cell surface expression) <400> 6 atggctctcg acaaggcgtt ggtgctgcgt acctgtgcaa ataacatggc cgatcactgc 60 ggccttatat ggcccgcgtc cggcacggtg gaatccagat actggcagtc aaccaggcgg 120 catgagaatg gtctggtcgg tttactgtgg ggcgctggaa ccagcgcttt tctaagcgtg 180 catgccgatg ctcgatggat tgtctgtgaa gttgccgttg cagacatcat cagtctggaa 240 gagccgggaa tggtcaagtt tccgcgggcc gaggtggttc atgtcggcga caggatcagc 300 gcgtcacact tcatttcggc acgtcaggcc gaccctgcgt caacgtcaac gtcaacgtca 360 acgtcaacgt taacgccaat gcctacggcc atacccacgc ccatgcctgc ggtagcaagt 420 gtcacgttac cggtggccga acaggcccgt catgaagtgt tcgatgtcgc gtcggtcagc 480 gcggctgccg ccccagtaaa caccctgccg gtgacgacgc cgcagaattt gcagaccaga 540 tcaagactct gggacgggaa gaggtacagg caactggtcg ccagaacggg tgagaacggt 600 gttgaggccg acataccgta ttacgtgaac gaagatgacg atattgtcga taaacccgac 660 gaggacgatg actggataga ggtacacggc aatcacaccc attggggcta taccggacac 720 gactctcccg aaagctgggg caatctgtca gaagaattcc gtttgtgctc caccggcaaa 780 aaccaatctc cggtaaacat taccgaaacc gtttccggca aactgcccgc catcaaagtc 840 aattacaaac cgagtatggt tgacgtggaa aacaacggcc acaccattca ggtcaattat 900 cccgaaggcg gcaataccct gaccgtgaac ggccgcacct ataccctgaa acagttccac 960 ttccacgtgc cgagcgaaaa ccaaatcaaa ggccgcactt tcccgatgga agctcacttc 1020 gtccacttag acgaaaacaa acagccttta gtattagccg tgctgtatga agccggcaaa 1080 accaacggcc gcctgtcttc catctggaac gtcatgccga tgaccgcagg aaaagtgaaa 1140 ctcaaccaac cgttcgacgc atccacccta ctgccgaaac ggttgaaata ctaccgcttt 1200 gccggttcgc tgaccacgcc gccgtgcaca gagggcgtat catggttggt gttgaaaact 1260 tatgaccaca tcgaccaagc gcaagcggaa aaattcaccc gcgccgtcgg ttcggaaaac 1320 aaccgccccg tacagcctct gaatgcacgt gtagttattg aactcgagca ccaccaccac 1380 caccactga 1389 <210> 7 <211> 324 <212> PRT <213> Synechocystis PCC6803 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(324) <223> carbonic anhydrase (cytoplasmic expression) <400> 7 Met Ala Glu Val Ser Leu Ile Ser Gln Thr Asn Cys Pro Ala Val Leu 1 5 10 15 Asp Pro Pro Pro Gln Val Phe Asn Asp Thr Met Glu Gly Trp Asn Ser 20 25 30 Ile Asn Gly Asp Arg Met Gln Arg Leu Ile Glu Gly Leu Gln Lys Phe 35 40 45 Arg Glu Gly Tyr Phe Ser Ser His Arg Asp Leu Phe Glu Gln Leu Ser 50 55 60 His Gly Gln His Pro Arg Ile Leu Phe Ile Cys Cys Ser Asp Ser Arg 65 70 75 80 Val Asp Pro Asn Leu Ile Thr Gln Ser Glu Val Gly Asp Leu Phe Val 85 90 95 Ile Arg Asn Ala Gly Asn Ile Ile Pro Pro Tyr Gly Ala Ala Asn Gly 100 105 110 Gly Glu Gly Ala Ala Met Glu Tyr Ala Leu Val Ala Leu Glu Ile Asn 115 120 125 Gln Ile Ile Val Cys Gly His Ser His Cys Gly Ala Met Lys Gly Leu 130 135 140 Leu Lys Leu Asn Ser Leu Gln Glu Lys Leu Pro Leu Val Tyr Asp Trp 145 150 155 160 Leu Lys His Thr Glu Ala Thr Arg Arg Leu Val Leu Asp Asn Tyr Ser 165 170 175 His Leu Glu Gly Glu Asp Leu Ile Glu Val Ala Val Ala Glu Asn Ile 180 185 190 Leu Thr Gln Leu Lys Asn Leu Gln Thr Tyr Pro Ala Ile His Ser Arg 195 200 205 Leu His Arg Gly Asp Leu Ser Leu His Gly Trp Ile Tyr Arg Ile Glu 210 215 220 Glu Gly Glu Val Leu Ala Tyr Asp Gly Val Leu His Asp Phe Val Ala 225 230 235 240 Pro Gln Ser Arg Ile Asn Ala Leu Glu Pro Glu Asp Glu Tyr Ala Pro 245 250 255 His Pro Asn Ser Pro Leu Ile Ser Tyr Asp Ala Phe Lys Val Pro Gly 260 265 270 Lys Glu Arg Pro Gly Arg Glu Lys Ala Thr Glu Ser Pro Ala Pro Gln 275 280 285 Leu Ser Pro Leu Pro Gly Phe Gly His Leu Pro Arg Glu Gln Ala Glu 290 295 300 Arg Ile Tyr Arg Gly Ser Arg Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His 305 310 315 320 His His His His <210> 8 <211> 975 <212> DNA <213> Synechocystis PCC6803 <220> <221> gene <222> (1)..(975) <223> carbonic anhydrase (cytoplasmic expression) <400> 8 atggccgaag tttcattgat atcccagaca aattgccccg ctgtcctaga ccccccgccg 60 caagtcttca atgatacaat ggaaggctgg aattccatca acggcgatcg tatgcaaaga 120 ctcatcgagg gactacaaaa atttcgagaa ggttatttct cttcccaccg tgacctcttt 180 gagcaacttt ctcacggcca acatccccgc attctcttca tctgttgttc cgattcccgg 240 gtggacccca atttaatcac ccaatcggaa gtgggcgacc tgtttgttat tcgcaacgct 300 ggcaatatta ttccccccta tggagcagcc aacggtgggg aaggggcagc catggaatat 360 gccctagtgg cgctggaaat taatcagatc atcgtctgtg gccattccca ctgcggagcc 420 atgaaaggtc tgctcaaact caactctctc caggaaaaac ttcctctggt gtacgattgg 480 ctcaaacata cggaagccac ccgccgtcta gttctagaca attacagcca tctggaaggg 540 gaagatttga ttgaagttgc tgtggcagaa aatattctca cccaactcaa aaacctccag 600 acctatcccg ccatccattc ccggttacat cggggagacc tttccctcca cggctggatt 660 tatcgcattg aagagggtga agtactggcc tacgacggtg tactccatga ttttgtcgcc 720 ccccaaagtc gcatcaatgc cctggagccg gaggatgagt acgctcccca tcccaactca 780 cccctgattt cctacgatgc gtttaaggtt cccggcaagg aacgtcctgg tcgtgagaaa 840 gcaacagaat ccccagctcc ccaactgtct cctttacctg gttttggcca tttgcccagg 900 gaacaggcgg agcgcattta tcgaggctcc cgtaagcttg cggccgcact cgagcaccac 960 caccaccacc actga 975 <210> 9 <211> 368 <212> PRT <213> Synechocystis PCC6803 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(368) <223> carbonic anhydrase (periplasmic expression) <400> 9 Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala 1 5 10 15 Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu 20 25 30 Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala Ala Gln Ala Ala Met Gly Ala Glu Val 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Gln Thr Asn Cys Pro Ala Val Leu Asp Pro Pro Pro 50 55 60 Gln Val Phe Asn Asp Thr Met Glu Gly Trp Asn Ser Ile Asn Gly Asp 65 70 75 80 Arg Met Gln Arg Leu Ile Glu Gly Leu Gln Lys Phe Arg Glu Gly Tyr 85 90 95 Phe Ser Ser His Arg Asp Leu Phe Glu Gln Leu Ser His Gly Gln His 100 105 110 Pro Arg Ile Leu Phe Ile Cys Cys Ser Asp Ser Arg Val Asp Pro Asn 115 120 125 Leu Ile Thr Gln Ser Glu Val Gly Asp Leu Phe Val Ile Arg Asn Ala 130 135 140 Gly Asn Ile Ile Pro Pro Tyr Gly Ala Ala Asn Gly Gly Glu Gly Ala 145 150 155 160 Ala Met Glu Tyr Ala Leu Val Ala Leu Glu Ile Asn Gln Ile Ile Val 165 170 175 Cys Gly His Ser His Cys Gly Ala Met Lys Gly Leu Leu Lys Leu Asn 180 185 190 Ser Leu Gln Glu Lys Leu Pro Leu Val Tyr Asp Trp Leu Lys His Thr 195 200 205 Glu Ala Thr Arg Arg Leu Val Leu Asp Asn Tyr Ser His Leu Glu Gly 210 215 220 Glu Asp Leu Ile Glu Val Ala Val Ala Glu Asn Ile Leu Thr Gln Leu 225 230 235 240 Lys Asn Leu Gln Thr Tyr Pro Ala Ile His Ser Arg Leu His Arg Gly 245 250 255 Asp Leu Ser Leu His Gly Trp Ile Tyr Arg Ile Glu Glu Gly Glu Val 260 265 270 Leu Ala Tyr Asp Gly Val Leu His Asp Phe Val Ala Pro Gln Ser Arg 275 280 285 Ile Asn Ala Leu Glu Pro Glu Asp Glu Tyr Ala Pro His Pro Asn Ser 290 295 300 Pro Leu Ile Ser Tyr Asp Ala Phe Lys Val Pro Gly Lys Glu Arg Pro 305 310 315 320 Gly Arg Glu Lys Ala Thr Glu Ser Pro Ala Pro Gln Leu Ser Pro Leu 325 330 335 Pro Gly Phe Gly His Leu Pro Arg Glu Gln Ala Glu Arg Ile Tyr Arg 340 345 350 Gly Ser Arg Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His 355 360 365 <210> 10 <211> 1107 <212> DNA <213> Synechocystis PCC6803 <220> <221> gene <222> (1)..(1107) <223> carbonic anhydrase (periplasmic expression) <400> 10 atgaacaata acgatctctt tcaggcatca cgtcggcgtt ttctggcaca actcggcggc 60 ttaaccgtcg ccgggatgct ggggccgtca ttgttaacgc cgcgacgtgc gactgcggcg 120 caagcggcca tgggagccga agtttcattg atatcccaga caaattgccc cgctgtccta 180 gaccccccgc cgcaagtctt caatgataca atggaaggct ggaattccat caacggcgat 240 cgtatgcaaa gactcatcga gggactacaa aaatttcgag aaggttattt ctcttcccac 300 cgtgacctct ttgagcaact ttctcacggc caacatcccc gcattctctt catctgttgt 360 tccgattccc gggtggaccc caatttaatc acccaatcgg aagtgggcga cctgtttgtt 420 attcgcaacg ctggcaatat tattcccccc tatggagcag ccaacggtgg ggaaggggca 480 gccatggaat atgccctagt ggcgctggaa attaatcaga tcatcgtctg tggccattcc 540 cactgcggag ccatgaaagg tctgctcaaa ctcaactctc tccaggaaaa acttcctctg 600 gtgtacgatt ggctcaaaca tacggaagcc acccgccgtc tagttctaga caattacagc 660 catctggaag gggaagattt gattgaagtt gctgtggcag aaaatattct cacccaactc 720 aaaaacctcc agacctatcc cgccatccat tcccggttac atcggggaga cctttccctc 780 cacggctgga tttatcgcat tgaagagggt gaagtactgg cctacgacgg tgtactccat 840 gattttgtcg ccccccaaag tcgcatcaat gccctggagc cggaggatga gtacgctccc 900 catcccaact cacccctgat ttcctacgat gcgtttaagg ttcccggcaa ggaacgtcct 960 ggtcgtgaga aagcaacaga atccccagct ccccaactgt ctcctttacc tggttttggc 1020 catttgccca gggaacaggc ggagcgcatt tatcgaggct cccgtaagct tgcggccgca 1080 ctcgagcacc accaccacca ccactga 1107 <210> 11 <211> 231 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(231) <223> carbonic anhydrase (cytoplasmic expression) <400> 11 Met Lys Glu Ile Ile Asp Gly Phe Leu Lys Phe Gln Arg Glu Ala Phe 1 5 10 15 Pro Lys Arg Glu Ala Leu Phe Lys Gln Leu Ala Thr Gln Gln Ser Pro 20 25 30 Arg Thr Leu Phe Ile Ser Cys Ser Asp Ser Arg Leu Val Pro Glu Leu 35 40 45 Val Thr Gln Arg Glu Pro Gly Asp Leu Phe Val Ile Arg Asn Ala Gly 50 55 60 Asn Ile Val Pro Ser Tyr Gly Pro Glu Pro Gly Gly Val Ser Ala Ser 65 70 75 80 Val Glu Tyr Ala Val Ala Ala Leu Arg Val Ser Asp Ile Val Ile Cys 85 90 95 Gly His Ser Asn Cys Gly Ala Met Thr Ala Ile Ala Ser Cys Gln Cys 100 105 110 Met Asp His Met Pro Ala Val Ser His Trp Leu Arg Tyr Ala Asp Ser 115 120 125 Ala Arg Val Val Asn Glu Ala Arg Pro His Ser Asp Leu Pro Ser Lys 130 135 140 Ala Ala Ala Met Val Arg Glu Asn Val Ile Ala Gln Leu Ala Asn Leu 145 150 155 160 Gln Thr His Pro Ser Val Arg Leu Ala Leu Glu Glu Gly Gly Ser Leu 165 170 175 His Gly Trp Val Tyr Asp Ile Glu Ser Gly Ser Ile Ala Ala Phe Asp 180 185 190 Gly Ala Thr Arg Gln Phe Val Pro Leu Ala Ala Asn Pro Arg Val Cys 195 200 205 Ala Ile Arg Leu Arg Gln Pro Thr Ala Ala Lys Leu Ala Ala Ala Leu 210 215 220 Glu His His His His His His 225 230 <210> 12 <211> 696 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(696) <223> carbonic anhydrase (cytoplasmic expression) <400> 12 atgaaagaga ttattgatgg attccttaaa ttccagcgcg aggcatttcc gaagcgggaa 60 gccttgttta aacagctggc gacacagcaa agcccgcgca cactttttat ctcctgctcc 120 gacagccgtc tggtccctga gctggtgacg caacgtgagc ctggcgatct gttcgttatt 180 cgcaacgcgg gcaatatcgt cccttcctac gggccggaac ccggtggcgt ttctgcttcg 240 gtggagtatg ccgtcgctgc gcttcgggta tctgacattg tgatttgtgg tcattccaac 300 tgtggcgcga tgaccgccat tgccagctgt cagtgcatgg accatatgcc tgccgtctcc 360 cactggctgc gttatgccga ttcagcccgc gtcgttaatg aggcgcgccc gcattccgat 420 ttaccgtcaa aagctgcggc gatggtacgt gaaaacgtca ttgctcagtt ggctaatttg 480 caaactcatc catcggtgcg cctggcgctc gaagagggcg gatcgctgca cggctgggtc 540 tacgacattg aaagcggcag catcgcagct tttgacggcg caacccgcca gtttgtgcca 600 ctggccgcta atcctcgcgt ttgtgccata cgcctacgcc aaccgaccgc agcgaagctt 660 gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac cactga 696 <210> 13 <211> 275 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(275) <223> carbonic anhydrase (periplasmic expression) <400> 13 Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala 1 5 10 15 Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu 20 25 30 Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala Ala Gln Ala Ala Met Gly Lys Glu Ile 35 40 45 Ile Asp Gly Phe Leu Lys Phe Gln Arg Glu Ala Phe Pro Lys Arg Glu 50 55 60 Ala Leu Phe Lys Gln Leu Ala Thr Gln Gln Ser Pro Arg Thr Leu Phe 65 70 75 80 Ile Ser Cys Ser Asp Ser Arg Leu Val Pro Glu Leu Val Thr Gln Arg 85 90 95 Glu Pro Gly Asp Leu Phe Val Ile Arg Asn Ala Gly Asn Ile Val Pro 100 105 110 Ser Tyr Gly Pro Glu Pro Gly Gly Val Ser Ala Ser Val Glu Tyr Ala 115 120 125 Val Ala Ala Leu Arg Val Ser Asp Ile Val Ile Cys Gly His Ser Asn 130 135 140 Cys Gly Ala Met Thr Ala Ile Ala Ser Cys Gln Cys Met Asp His Met 145 150 155 160 Pro Ala Val Ser His Trp Leu Arg Tyr Ala Asp Ser Ala Arg Val Val 165 170 175 Asn Glu Ala Arg Pro His Ser Asp Leu Pro Ser Lys Ala Ala Ala Met 180 185 190 Val Arg Glu Asn Val Ile Ala Gln Leu Ala Asn Leu Gln Thr His Pro 195 200 205 Ser Val Arg Leu Ala Leu Glu Glu Gly Gly Ser Leu His Gly Trp Val 210 215 220 Tyr Asp Ile Glu Ser Gly Ser Ile Ala Ala Phe Asp Gly Ala Thr Arg 225 230 235 240 Gln Phe Val Pro Leu Ala Ala Asn Pro Arg Val Cys Ala Ile Arg Leu 245 250 255 Arg Gln Pro Thr Ala Ala Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His 260 265 270 His His His 275 <210> 14 <211> 828 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(828) <223> carbonic anhydrase (periplasmic expression) <400> 14 atgaacaata acgatctctt tcaggcatca cgtcggcgtt ttctggcaca actcggcggc 60 ttaaccgtcg ccgggatgct ggggccgtca ttgttaacgc cgcgacgtgc gactgcggcg 120 caagcggcca tgggaaaaga gattattgat ggattcctta aattccagcg cgaggcattt 180 ccgaagcggg aagccttgtt taaacagctg gcgacacagc aaagcccgcg cacacttttt 240 atctcctgct ccgacagccg tctggtccct gagctggtga cgcaacgtga gcctggcgat 300 ctgttcgtta ttcgcaacgc gggcaatatc gtcccttcct acgggccgga acccggtggc 360 gtttctgctt cggtggagta tgccgtcgct gcgcttcggg tatctgacat tgtgatttgt 420 ggtcattcca actgtggcgc gatgaccgcc attgccagct gtcagtgcat ggaccatatg 480 cctgccgtct cccactggct gcgttatgcc gattcagccc gcgtcgttaa tgaggcgcgc 540 ccgcattccg atttaccgtc aaaagctgcg gcgatggtac gtgaaaacgt cattgctcag 600 ttggctaatt tgcaaactca tccatcggtg cgcctggcgc tcgaagaggg cggatcgctg 660 cacggctggg tctacgacat tgaaagcggc agcatcgcag cttttgacgg cgcaacccgc 720 cagtttgtgc cactggccgc taatcctcgc gtttgtgcca tacgcctacg ccaaccgacc 780 gcagcgaagc ttgcggccgc actcgagcac caccaccacc accactga 828 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward (No signal) : NCA-C-FP <400> 15 catatgcacg gcaatcacac c 21 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Common reverse : NCA-BP <400> 16 aagcttttca ataactacac gtgcatt 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward (No signal) : SCA-C-FP <400> 17 catatggccg aagtttcatt gatatcc 27 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Common reverse : SCA-BP <400> 18 caagcttacg ggagcctcga taaatgcgc 29 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward (No signal) : ECA-C-FP <400> 19 catatgaaag agattattga tggattcc 28 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Common reverse : ECA-BP <400> 20 caagcttcgc tgcggtcggt tggcgtag 28 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward (Signal): NCA-T-FP <400> 21 ccatgggaca cggcaatcac acc 23 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward (Signal) : SCA-T-FP <400> 22 ccatgggagc cgaagtttca ttgatatcc 29 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward (Signal) : ECA-T-FP <400> 23 ccatgggaaa agattattga tggattc 27 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward (signal) : NCA-INPNC-FP <400> 24 agatctcacg gcaatcacac ccattgg 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse : NCA-INPNC-BP <400> 25 aagctttcag tggtggtggt ggtggtg 27

Claims (16)

1. 재조합 탄산무수화효소(carbonic anhydrase)를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체의 전세포(whole cell);
   상기 전세포의 세포 파쇄액 또는 이의 분액; 및
   상기 전세포에서 분리한 탄산무수화효소
   로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 형질전환체의 전세포는 탄산무수화효소가 세포질(cytoplasm), 세포 간극(periplasmic space) 또는 세포 표면(cell surface)에 발현된 것인 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 분액은 상기 세포 파쇄액의 전세포 분액, 수용성 분액, 불용성 분액, 세포질 분액, 세포 간극 분액 또는 세포막 분액인 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 재조합 탄산무수화효소는 나이세리아 고노로에아에 (Neisseria gonorrhoeae), 시네코시스티스 (Synechocystis PCC6803) 또는 대장균 (Escherichia coli) 유래의 것인 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 탄산무수화효소는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11 또는 서열번호 13의 아미노산 서열을 가지는 것인 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12 또는 서열번호 14의 핵산 서열을 가지는 것인 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 도 1의 개열지도를 가지는 것인 조성물.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균인 조성물.
   
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물 및 금속 양이온을 포함하는, 탄산염 또는 중탄산염 제조용 조성물.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 금속 양이온은 Na⁺ 이온, Ca^{2 +} 이온, Fe^{2 +} 이온, Mn^{2 +} 이온, Sr^{2 +}이온, Ca^{2 +}이온, Ba^{2 +}이온, Zn^{2 +}이온, Pb^{2 +}이온, 또는 이들의 질산염, 염산염, 수산화물 또는 용액인 조성물.
    
11. 제9항에 있어서, 상기 탄산염은 탄산나트륨, 탄산칼슘, 탄산철, 탄산망간, 탄산스트론튬, 탄산바륨, 탄산아연 또는 탄산납인 조성물.
    
12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 이산화탄소 포집용 조성물을 제조하는 단계; 및
    상기 이산화탄소 포집용 조성물에 이산화탄소를 공급하는 단계를 포함하는, 이산화탄소를 포집하는 방법.
    
13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 이산화탄소 포집용 조성물을 제조하는 단계; 및
    상기 이산화탄소 포집용 조성물에 금속 양이온 및 이산화탄소를 공급하는 단계를 포함하는, 탄산염 또는 중탄산염을 제조하는 방법.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 이산화탄소 포집용 조성물에 금속 양이온 및 이산화탄소를 공급하는 단계는, 금속 양이온을 먼저 공급한 후 이산화탄소를 순차적으로 공급하거나, 이산화탄소를 먼저 공급한 후 금속 양이온을 순차적으로 공급하거나, 또는 금속 양이온 및 이산화탄소를 동시에 공급하는 것인 방법.
    
15. 제13항에 있어서, 상기 금속 양이온은 Na⁺ 이온, Ca^{2 +} 이온, Fe^{2 +} 이온, Mn^{2 +} 이온, Sr^{2 +}이온, Ca^{2 +}이온, Ba^{2 +}이온, Zn^{2 +}이온, Pb^{2 +}이온, 또는 이들의 질산염, 염산염, 수산화물 또는 용액인 방법.
    
16. 제13항에 있어서, 상기 탄산염은 탄산나트륨, 탄산칼슘, 탄산철, 탄산망간, 탄산스트론튬, 탄산바륨, 탄산아연 또는 탄산납인 방법.

Images